carpeta de trabajos prácticos de química biológica ii

CARPETA
DE
TRABAJOS PRÁCTICOS
DE
QUÍMICA BIOLÓGICA II
Profesor: Dr. Osvaldo León Córdoba
J.T.P: Bioq. María Andrea Abalos
Aux. 1ra: Bioq. Mónica Beatriz Becerra
REGLAMENTO DE QUIMICA BIOLOGICA II 2010
1- Puntualidad en el horario de los trabajos Prácticos
2- Aprobación del 85% de los Trabajos Prácticos (asistencia, aprobación cuestionario y del
informe).
3-El parcialito se tomara antes de cada TP; los desaprobados podrán recuperarse antes de cada
parcial.
4- Se tomaran 3 exámenes parciales que incluirán cada uno 5 unidades del programa de la
asignatura.
5- Cada unidad se aprueba con el 60%, pudiendo recuperarse hasta dos unidades
6- Al final de la cursada se podrá rendir un recuperatorio final.
7- Como trabajo final los alumnos deberán exponer en un seminario, un trabajo de
investigación, entregado por la cátedra.
CRONOGRAMA QUIMICA BIOLOGICA II
2010
TEORIAS Miércoles 11-14 hs Aula: 101 y Jueves 10-13 hs Aula: 103
TRABAJOS PRACTICOS MARTES 9,30-13 h Laboratorio A
Martes
3/8
Presentación – Teoría
Martes
10/8
Teoría
Martes
17/8
Teoría
Martes
24/8
Teoría
Martes
31/8
I PARCIAL
Martes
7/9
TP 1. Proteínas I
Martes
14/9
SEMANA DEL ESTUDIANTE
Jueves
16 /9
RECUPERATORIO I PARCIAL
Martes
21/9
TP 2. Proteínas II
Martes
28/9
TP 3. Proteínas III
Martes
5/10
TP 4. Proteínas IV
Martes
12/10
TP 5. Inducción
Martes
19/10
TP 6. Glucógeno: cuantificación en tejidos
Martes
26/10
TP 7. Producción de Piruvato y Acetaldehído durante la fermentación de
Glucosa.
Viernes
29/10
II PARCIAL
Martes
02/11
TP 8. Fotosíntesis
Viernes
12/11
RECUPERATORIO II PARCIAL
Martes
16/11
III PARCIAL
Jueves
18/11
SEMINARIO
Jueves
25/11
RECUPERATORIO III PARCIAL
Lunes
29/11
RECUPERATORIO FINAL
Química Biológica II
2010
TRABAJO PRÁCTICO 1
PROTEINAS I
PURIFICACION DE UNA ENZIMA: LA LISOZIMA DE HUEVO
OBJETIVO:
Purificar la enzima lisozima a partir de la clara de huevo por cromatografía de intercambio
iónico. Purificación mediante electroforésis en geles de poliacrilamida
Determinación de la actividad enzimática por espectrofotometría.
INTRODUCCION:
El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que catalizan la
hidrólisis de enlaces glicosídicos β(1→ 4) de los polisacáridos de la pared celular bacteriana. Son
proteínas globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica (129 aminoácidos para la
lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 KDa. Estas
proteínas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad.
La lisozima fue la primera proteína secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso de un
modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos x) y la primera para la que se propuso un
mecanismo de acción detallado.
1)
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
La cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las propiedades ácido-base de las
proteínas. Una proteína, a pH menor de su pI (punto isoeléctrico), tendrá carga positiva y a pH
mayor de su pI presentará carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unirá a una resina con
carga negativa (Carboximetil-celulosa, CM-celulosa) y en el segundo a una resina con carga
positiva (Dietilaminoetil-celulosa, DEAE-celulosa).
4
Química Biológica II
2010
Una vez unida la proteína a las resinas, estas se pueden eluir de dos formas distintas:
1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI
2) mediante un gradiente iónico añadiendo el contraión correspondiente (Na+ en el caso de
intercambio catiónico o Cl- para el intercambio aniónico)
Dado que el pI de la LISOZIMA es de 11, dos unidades de pH superior al del resto de las proteínas
de la clara del huevo, a un pH de 9,5 - 10 la lisozima es prácticamente la única proteína con
carga positiva neta. Ello permite separar esta enzima del resto de proteínas mediante la utilización
de resinas INTERCAMBIADORAS DE CATIONES.
MATERIALES Y METODOS
• Huevos de gallina para la obtención de la enzima.
• Buffer A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10
• Buffer B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl
• Carboximetil-Celulosa
Activación de la CM: previamente a su utilización, la resina se lava con HCl 0.5 M (5 minutos), 2
veces con H2O (hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y finalmente dos veces con H 2O (hasta
pH neutro). Por último se hace una suspensión 1/1 (vol/vol) en tampón glicina/NaOH 100 mM pH
10
• Buffer fosfato sódico 100 mM, pH 6,2
• Suspensión de la bacteria Micrococus, (obtenida de suelo y suspendida en caldo de
enriquecimiento) de D.O entre 0,6-0,7 en el tampón fosfato anterior.
1. a. PURIFICACION DE LA LISOZIMA
1. Recoger la clara procedente de un huevo. Diluirla 1/5 (vol/vol) con Buffer A. Tomar 10 ml de la
muestra anterior en un tubo cónico con tapón de 15 ml.
2. Antes de comenzar la purificación de la lisozima separar una alícuota de 1 ml (Fracción O, Fo),
para medir la actividad de la enzima en la fracción de partida.
3. A los 9 ml restantes añadir 4 ml de CM-celulosa previamente activada y agitar suavemente
durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina.
4. Al finalizar la incubación, centrifugar la muestra a 600 rpm durante 3 min. Guardar el
sobrenadante (Fracción 1, F1).
5. Añadir a la resina (precipitado) 10 ml de Buffer A. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo.
Recoger el sobrenadante (Fracción 2, F2).
5
Química Biológica II
2010
6. Repetir el lavado anterior y desechar el sobrenadante.
7. Elución. Resuspender la CM-celulosa con 3 ml de Buffer B e incubar, agitando suavemente,
durante 10 minutos. Centrifugar y recoger el eluido (Fracción 3, F3, lisozima purificada).
Medir, exactamente, en tubo cónico graduado el volumen total de cada fracción
B. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensión de agregados de pared
celular del microorganismo:
Al incubar esta suspensión con lisozima, los fragmentos de pared celular se hidrolizan, originando
otros más pequeños, lo que reduce la dispersión de la luz, que se manifiesta en una reducción en la
absorbancia a
una longitud de onda fija de 450 nm. La actividad enzimática es proporcional a la disminución de la
absorbancia a 450 nm.
1. En una cubeta de espectrofotómetro, añadir 3 ml de suspensión de pared bacteriana. Meterla en
el espectrofotómetro y anotar la densidad óptica (D.O.). Esta medida constituye el tiempo cero y
hay que hacerlo para cada medida.
2. Añadir 25 μl de la fracción correspondiente a ensayar, tomar el tiempo por el reloj, agitar e
introducir la cubeta en el espectrofotómetro y anotar la absorbancia observada al primer minuto y al
segundo minuto. Calcular la variación de absorbancia al primer minuto (ΔA1/min) y al segundo
(ΔA2/min). Hacer la media de las dos medidas.
Anotar los resultados en la tabla siguiente:
Volúmenes
(ml)
Absorbancia
a tº 0´
Absorbancia a
tº 1´
Absorbancia
a tº 2´
ΔA1/min
ΔA2/min
_
ΔA/min
Actividad
(U)
F0
F1
F2
F3
CALCULOS:
1. Actividad de cada fracción
2. % Retención de la resina:
Actividad F0 – Actividad F1
X
100
Actividad F0
3. % de Recuperación:
Actividad F3
Actividad F0
X
100
GUARDAR TODAS LAS FRACCIONES PARA USARLAS EN LAS PRÓXIMAS
PRÁCTICAS
-Recurso bibliográfico: Practicas de Bioquímica General, Departamento de Bioquímica,
Universidad de Sevilla .Curso 2005/2006.
6
Química Biológica II
2010
TRABAJO PRÁCTICO 2
PROTEINAS II
A) ELECTROFORESIS: Separación de proteínas en geles de poliacrilamida
OBJETIVO: utilizar la técnica de la electroforesis en gel para analizar la purificación de la
enzima LISOZIMA. Se analizará la composición proteica de las distintas fracciones y se constatará
el grado de pureza de la lisozima.
FUNDAMENTO
La electroforesis es la migración de iones en un campo eléctrico. Es una de las técnicas analíticas
más importantes dentro de la Bioquímica. Las moléculas biológicas (ADN, proteínas, vitaminas,
etc.) poseen cargas eléctricas, y por tanto poseen esta propiedad de movilidad en un campo
eléctrico. La movilidad dependerá de la carga que presentan al pH que trabajemos. La
electroforesis en gel es el método más conveniente para realizar separaciones de macromoléculas
(ADN y Proteínas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un entramado tridimensional que
impide o reduce la difusión. Este gel ha de ser compatible con los tampones usados y debe permitir
la entrada del líquido en los poros (reticulados hidratables).
Los soportes pueden ser más o menos restrictivos según que el tamaño de poros limite o impida el
paso de las moléculas. Los más restrictivos, como los geles de acrilamida-bisacrilamida, oponen
impedimento al paso de las moléculas, participando así en el proceso de separación. Entre los menos
restrictivos está la agarosa. El tamaño de poro que da unas dimensiones moleculares de criba de los
geles puede ser establecido previamente. El gel en la electroforesis retarda, en mayor o menor
medida, a las moléculas mayores respecto a las de menor tamaño. Las separaciones moleculares
están pues basadas en el tamizado molecular junto a la movilidad electroforética de las moléculas
que van a ser separadas.
Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de Tensión que proporciona el campo
eléctrico, mediante dos electrodos, positivo (ánodo) y negativo (cátodo), entre los que se establece
la diferencia de potencial. B) una cubeta o recipiente, en cuyos extremos se sitúan los electrodos.
C) un soporte electroforético. D) el buffer de electroforesis: durante la electroforesis se produce
electrolisis del agua, generándose protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilos en la
proximidad del cátodo; el tampón evitará que el entorno anódico se acidifique y el catódico se haga
más básico a lo largo de la electroforesis.
7
Química Biológica II
2010
El polímero utilizado para la formación del gel es la acrilamida y la bis-acrilamida, los cuales se
polimerizan mediante la adición de catalizadores (persulfato amónico, TEMED).
En nuestro caso, la separación de las proteínas se verá condicionada sólo por su tamaño y no por su
carga ya que previamente las proteínas serán desnaturalizadas utilizando un detergente (SDS), el
cual despliega a las proteínas y se queda pegado a su superficie confiriéndole una gran carga
negativa. Esa gran carga negativa enmascara la carga intrínseca de la proteína, y las proteínas una
vez tratadas con SDS presentan todas las mismas cargas, y la separación será debida
solamente a la masa molecular de la proteína.
PROTOCOLO
La separación electroforética se lleva a cabo según el método descrito por Laemmli en geles de
poliacrilamida en presencia de SDS.
Reactivos
- Monómero: (30% T; 2,67% C)
Acrilamida : 29,2 g
Bis-acrilamida: 0,8g
Agua (d) c.s.p. 100 ml
-Buffer de muestra:
Tris HCL 0,5M pH 6,8: 1 ml
Mercaptoetanol: 0,4 ml
Glicerol: 0,8 ml
SDS 10%: 1,6 ml
Bromofenol Blue 0,05 %: 0,2ml.
- Buffer cátodo:
Tris base: 6,055 g
Tris HCL : 8,36 g
SDS: 0,5 g
Agua (d) c.s.p. 500 ml
- Buffer ánodo:
Tris base: 25,17 g
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Química Biológica II
2010
Tris HCL : 3,84 g
Agua (d) c.s.p. 1000 ml
- Gel buffer:
Tris base: 25,17 g
Tris HCL: 14,55 g
SDS: 0,3 g
Agua (d) c.s.p. 100 ml
- Colorante: Coomasie Blue R250 0,1% en MeOH-acido acético-agua (d) (4:1:6)
- Decolorante: MeOH-acido acético-agua (d) (3:1,2:5,8)

Preparación de la muestra: La proteína se diluye 1:1 con sample buffer, y se calienta a
90°C por 3 minutos.

Preparación del gel : Gel 10% ,para un gel.
Monómero: 2 ml
Agua (d): 1,2 ml
Gel buffer: 2 ml
Glicerol: 0,8 g (0,65 ml)
TEMED: 5 μl
APS 10%: 50 μl
Siembra: Se siembran 5 μl del marcador de peso molecular elegido (seminario) en la calle número
1. Se deja libre una calle y a continuación se siembran 20 μl de cada muestra preparada.
Agitar bien y armar el gel rápidamente antes de que comience a notarse la polimerización
del
mismo.
Desarrollo: Se arma la cuba electroforética. Se introduce el gel en su interior, el buffer ánodo por
fuera y el buffer cátodo por dentro. Se conecta la corriente eléctrica y se deja correr a un voltaje de
60 V por 10 minutos para concentrar, luego 10 minutos a 80 V y el resto 100 V.
Coloración y decoloración: Una vez terminada la corrida, se colorean las proteínas por 30 minutos
con Coomassie Brilliant Blue y luego se decolora el gel con decolorante durante toda la noche.
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Química Biológica II
2010
B.- EFECTO DE LA TEMPERATURA Y DE LA REDUCCIÓN DE LOS PUENTES
DISULFURO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA LISOZIMA
OBJETIVO: estudiar la contribución de los enlaces disulfuro y puentes de hidrógeno a la
conformación del centro activo de la lisozima y su efecto sobre la actividad de la enzima.
El DTT (ditiotreitrol) es un reductor de puente disulfuro. Por tanto, su adición en concentración
suficiente, reducirá los -S-S- de la lisozima y producirá cambios en la estructura terciaria de la
proteína. Estos cambios pueden afectar a la actividad enzimática de la lisozima.
Por otra parte, los puentes de hidrógeno también están implicados en el mantenimiento de la
estructura de las proteínas. Estos puentes de hidrógenos se pueden romper fácilmente por
tratamiento con calor. Del mismo modo al caso anterior, la modificación de la estructura de la
proteína por rotura de los puentes de hidrógeno puede modificar la actividad del enzima.
PROTOCOLO
El estudio se lleva a cabo en la fracción F3 purificada en la práctica anterior.
1. Preparar 4 tubos eppendorf numerados del 1 al 4 y pipetear las cantidades adecuadas según se
indica en la tabla siguiente
Tubo
1
2
3
4
Fracción F3
200 μl
200 μl
200 μl
200 μl
DTT (0.5 M)*
20 μl
20 μl
50°C/30min
+
+
10
Química Biológica II
2010
* La concentración de DTT de 0.5M es concentración inicial (75 mg/1000 ml)
Los tubos 1 y 2 se mantienen a temperatura ambiente
Los tubos 3 y 4 se calientan a 50ºC durante 30 min.
2. Medir la actividad como se indicó en la práctica anterior.
Anotar los resultados en la tabla siguiente
Tubo
Absorba
ncia a tº
0´
Absorba
ncia a tº
1´
Absorba
ncia a tº
2´
ΔA1/mi
n
ΔA2/
min
_
ΔA/mi
n
Activi
dad
(U)/20
0 ml
1
2
3
4
Recurso bibliográfico:
- Practicas de Bioquímica General, Departamento de Bioquímica, Universidad de
Sevilla .Curso 2005/2006.
- Curso de posgrado: PURIFICACION DE PROTEINAS. UNPSJB 2008
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Química Biológica II
2010
TRABAJO PRÁCTICO 3
PROTEINAS III
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS
OBJETIVO: Calcular la concentración total de proteínas contenida en una disolución. Con este fin,
utilizaremos las muestras obtenidas en la práctica de Purificación de la Lisozima y seguiremos el
método de Lowry.
FUNDAMENTO
El método de Lowry se basa en la reacción de las proteínas con el reactivo de Folin dando un
complejo coloreado. Este reactivo es una disolución de tungstato sódico y molibdato sódico en
ácido fosfórico y ácido clorhídrico. El mecanismo del proceso es el siguiente: el Cu2+, en medio
alcalino, forma un complejo con los enlaces peptídicos de las proteínas reduciéndose a Cu +. Este
ion, así como los grupos R de los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas, reaccionan con
el reactivo de Folin, produciendo inicialmente un producto inestable, que se reduce para formar un
compuesto coloreado.
La intensidad del color depende de la cantidad presente en las proteínas de estos aminoácidos
aromáticos y será proporcional a la concentración de proteínas en la disolución.
La concentración de una disolución problema puede calcularse interpolando el valor obtenido de
absorbancia en una recta de calibrado trazada con valores conocidos de concentración de una
proteína y sus respectivas absorbancia.
MATERIAL Y REACTIVOS
• Reactivo 1: Na OH 0,1 N. Preparar 50 ml.
• Reactivo 2: 50 ml de Sn 1 y 1 ml de Sn 2
• Solución 1: Na2CO3 al 2% en reactivo 1
• Solución 2: 5 ml Tartrato de sodio al 2% + 5 ml SO4Cu 1% + 0,25 ml de NaOH
1 N.
• Reactivo 3: de Folin-Ciocalteus( tungstato Na y molibdato sódico en PO4H3 y ClH) 1 ml + 1 ml de
H2O.Preparado en el momento de usar y guardado en oscuridad!!!!!!!!!!!!! .
• Albumina: 500 μg /ml .
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Química Biológica II
2010
PROTOCOLO
1.- Diluir las muestras a las cuales vamos a determinarles la concentración de proteínas:
• F0 y F1, como tendrán una mayor concentración de proteínas se diluyen 100 veces
(dilución 1/100) (0.1 ml fracción + 9.9 ml H2O)
• F2, fracción que procede de lavar la columna de CM y que tendrá una menor cantidad
de proteínas se diluye 10 veces (dilución 1/10) (0.1 ml fracción + 0.9 ml H2O)
• F3, fracción de lisozima pura se diluye 50 veces (dilución 1/50) (0.1 ml fracción + 4.9
ml H2O)
2.- Rotular tubos de transparente del 1 al 10 y seguir el esquema.
Mezclar con Vortex y dejar 15 minutos a Tº ambiente
Rvo 3 (μl) 200
200
200
200
200
200
200
Mezclar inmediatamente y dejar reposar 30’ en oscuridad. Leer en espectrofotómetro a
750 nm. Llevar a cero con el blanco.
La reacción es estable por una hora
CALCULOS:
Representar los valores de absorbancia a 750 nm frente a los μg/ml de albúmina.
Extrapolar los valores correspondientes a las distintas fracciones de la purificación
para el cálculo de la concentración de proteínas en mg/ml. Tener en cuenta el factor de
dilución empleado.
13
Química Biológica II
2010
Nº TUBO
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Fracciones
[Proteínas]
25 μg/ml
75 μg/ml
125 μg/ml
250 μg/ml
500 μg/ml
F0 (1/100)
F1 (1/100)
F2 (1/10)
F3 (1/50)
Volúmenes de las
fracciones de la
práctica 1
(ml)
Proteínas
(mg/ml)
Absorbancia a 750
Proteínas
totales
(mg)
F0
F1
F2
F3
Recurso bibliográfico:
-Practicas de Bioquímica General, Departamento de Bioquímica, Universidad de Sevilla
Curso 2005/2006.
- Curso de posgrado: PURIFICACION DE PROTEINAS Universidad Nacional de la
Patagonia San Juan Bosco. 2008.
- Guía de Trabajos Prácticos Química Biológica II 2007/2008.UNPSJB.
14
Quimica Biologica II
2010
TRABAJO PRÁCTICO 3
HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography)
OBJETIVO
Realizar el análisis cualitativo de una mezcla de compuestos mediante HPLC
INTRODUCCIÓN
La cromatografía de líquidos a alta presión es una de las técnicas más utilizadas tanto con fines
analíticos como preparativos. Su uso está muy extendido debido a las ventajas que presenta frente a
otras técnicas, entre las que se destacan su aplicación al análisis y a la separación de mezclas de
cualquier clase de compuestos, independientemente de su polaridad, estabilidad térmica o
volatilidad.
Requiere de la utilización de un cromatógrafo de líquidos en el que la fase móvil (disolvente) es
líquida, y se bombea a través de la columna a alta presión (1000 a 6000 psi) y velocidad de flujo
constante. La columna contiene la fase estacionaria. La muestra a analizar se inyecta en la columna
y sus componentes se van separando a medida que el disolvente eluye la muestra, en función de sus
afinidades relativas por la fase estacionaria y la fase móvil. Una vez finalizada la elusión, cada
componente de la muestra pasa por un detector que convierte la información en una señal eléctrica y
la envía a un integrador y a un registro gráfico, obteniéndose el correspondiente cromatograma, que
consiste en una gráfica de la concentración de las fracciones eluídas en función del tiempo, junto
con la medida del área de cada uno de los picos.
El cromatograma informa:
-
complejidad de la muestra en base al número de picos observados
-
identificación cualitativa de los componentes de la muestra, en base a la posición
precisa de cada pico (tiempo de retención) en condiciones cromatográficas concretas
-
concentración de cada pico, en base a su área relativa
Fase móvil:
El disolvente se almacena en un depósito, pasa por un filtro y luego a la bomba y debe:
-
ser calidad HPLC
-
disolver la muestra a analizar
-
no degradar la fase estacionaria
-
ser miscible con otros disolventes si se pretende utilizar mezclas
-
tener baja viscosidad
15
Quimica Biologica II
2010
Columnas:
Se construyen en acero inoxidable para resistir la elevada presión, con un diámetro interno de
0,3 a 0,5 cm. Este determina la capacidad de carga, dilución de los picos y velocidad de flujo.
La longitud varía entre 3 a 30 cm y al aumentar mejora la eficacia.
Fase estacionaria:
Constituída por un sólido o un líquido soportado en un sólido inerte. La diferencia con la
cromatografía convencional reside en el empaquetado de la columna con micropartículas
porosas esféricas (5 a 10 um). El tamaño de partícula determina el número de platos teóricos
por unidad de longitud por lo que la mayor eficacia se logra con partículas muy pequeñas. Al
seleccionar la columna se deben tener presentes dos objetivos:
-
obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempo
posible.
-
asegurar alta precisión y exactitud.
Bomba:
La más utilizada es la bomba de pistón de retroceso que se compone de un pequeño motor que
mueve linealmente un pistón con una cámara hidráulica de 40-400 ml. La velocidad de flujo
puede modificarse alterando el volumen que el pistón bombea en cada ciclo o modificando la
velocidad de bombeo. El bombeo del disolvente puede ser:
-
isocrático: se bombea una fase móvil de composición constante
-
en gradiente: sistema automatizado que permite cambiar la composición de la fase
móvil, mezclando dos o más disolventes en proporciones variables.
Inyector:
La muestra se disuelve en el mismo solvente o mezcla de la misma fase móvil. Debido a la
alta presión la muestra se inyecta en un sistema de inyección con una válvula de giro (loop)
que no interrumpe el flujo del disolvente. Antes de introducir la muestra, la válvula se coloca
en posición de carga y luego de la inyección de la muestra se gira a la posición de inyección
para permitir que la fase móvil la introduzca en la columna. La mejor resolución se obtiene
con poca cantidad de muestra y bajo volumen de inyección.
Detector:
Es el componente que emite una respuesta cuando se produce la elusión de cada componente
16
Quimica Biologica II
2010
de la mezcla y la convierte en un pico del cromatograma. Se coloca inmediatamente después
de la columna. Puede ser de varios tipos:
-
basado en una propiedad de la fase móvil como el índice de refracción.
-
basado en la propiedad de la sustancia a analizar como detector de UV o fluorescencia.
Aplicación de HPLC: análisis cualitativo de una mezcla de compuestos.
Cada compuesto tiene un tiempo de retención característico utilizando condiciones y
parámetros determinados. Este hecho permite su identificación por comparación con un
patrón de referencia.
Procedimiento:
Optimizar parámetros para obtener una buena resolución de los componentes de interés.
Determinar los tiempos de retención de los patrones que vayan a utilizarse en las mismas
condiciones cromatográficas.
Preparar una disolución de la mezcla problema junto con los patrones de referencia.
Realizar la cromatografía de dicha disolución en las condiciones previamente optimizadas.
Un aumento en el área relativa de uno de los picos permite la identificación de uno de los
componentes de la mezcla con el patrón correspondiente a dicho tiempo de retención,
mientras que la aparición de un nuevo pico será señal de que la mezcla original no contiene
dicho patrón.
PARTE EXPERIMENTAL
Muestra a sembrar: Fracciones F3, F0 en ese orden. Obtenidas de la cromatografía de
intercambio iónico.
Volumen a sembrar: 50 μl
Columna: C18
Fase móvil: Solvente A: TFA 0,1%
Solvente B: TFA 0,08% y Acetonitrilo 80%
Detector: medición de absorbancia a 254 nm y a 280 nm.
Observar y señalar en el cromatograma el tiempo de elución y la absorbancia a 254 nm.
17
TRABAJO PRACTICO 5
INDUCCION ENZIMATICA
OBJETIVO
Comprender el mecanismo de inducción enzimática y su inhibición.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias son organismos versátiles y de respuesta rápida. Perciben los niveles de muchos
metabolitos y utilizan una amplia variedad de mecanismos de regulación de sus patrones
metabólicos.
La actividad de muchas enzimas puede estar regulada, por control alostérico, modificaciones
covalentes y por el control de la expresión génica, de tal manera que una Escherichia Coli puede
contener 10 copias de una proteína y 100.000 copias de otra, variando incluso la velocidad de
síntesis en respuesta a estímulos externos (nutrientes, condiciones ambientales).
Algunas enzimas se encuentran en cantidades constantes, independientemente del medio y del
estado metabólico de la célula, son las enzimas constitutivas, otras se sintetizan rápidamente y en
mayor cantidad como respuesta a la presencia de un sustrato, son las enzimas inducibles.
En el genoma encontramos los genes para sintetizar todas las enzimas, pero la síntesis de éstas esta
regulada, lo que está de acuerdo con el principio de economía celular.
Jacob y Monod estudiaron el mecanismo de regulación en Escherichia Coli, y propusieron un
mecanismo de regulación para explicar la inducción de enzimas que incluye control a nivel genético,
proponiendo la existencia de un operon para la regulación de la β-galactosidasa por la Lactosa. Si
Escherichia Coli utiliza glucosa como fuente de carbono, no poseerá más de 10 copias de βgalactosidasa, mientras que en presencia de lactosa, se induce la expresión de esta enzima hasta
obtener varios miles de copias, transformando la lactosa en galactosa y glucosa que pueden entrar
por ejemplo al ciclo de Krebs.
18
Jacob y Monod postularon:
- la existencia de un represor específico que se une al DNA, cerca del comienzo del gen de la βgalactosidasa, que impide la acción de la RNA polimerasa que sintetiza el RNA mensajero.
−
la lactosa es un inductor, que al unirse al represor no permite su unión al DNA, de esta forma
la RNA polimerasa puede sintetizar el RNA mensajero de la β-galactosidasa.
En el laboratorio se estudiara el fenómeno de inducción enzimática en Escherichia Coli utilizando
como indicador de la presencia de la enzima el o-nitrofenilgalactósido (ONPG).
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ONPG (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido): es un sustrato de la β-galactosidasa que, al
ser hidrolizado, produce un compuesto (ortonitrofenol) que presenta un intenso
color amarillo. El ONPG es muy utilizado en los ensayos in vitro de β-galactosidasa,
en los que se puede obtener la concentración de β-galactosidasa en función de la
intensidad del color amarillo, medida por absorbancia a una longitud de onda de 420 nm.
También se utilizara el cloranfenicol que inhibe la biosíntesis de proteína.
Materiales y reactivos:
Preparar Caldo LB y autoclavar. (triptona 2,5 g, extracto de levadura 1,25 g, NaCl 3,75 g, agua csp
250 ml).Distribuir una placa de medio EMB.
Sembrar la placa de EMB con E. Coli, dejar 24 h a 37 °. Sembrar una colonia en el caldo nutritivo
LB. Dejar 24 h en estufa a 37°.
Cloranfenicol: 60 μg/ml.
Glucosa 200 mM.
PM 180
Pesar 0,36 g Volumen: 10 ml
Lactosa 200 mM.
PM 360
Pesar 0,72 g Volumen: 10 ml
Buffer fosfato 20 mM, NaCl 0,9 %, pH 7,5. Pesar 0,276 g de fosfato diácido de potasio, llevar a pH
7,5 y con agua a 100 ml. Agregar 0,9 g de NaCl.
Tolueno o xileno.
Discos de ONPG.
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Parte experimental:
Analizar los resultados.
En resumen:
•
En ausencia de lactosa, no hay producción de enzima Lac (LacI está unido al operador).
•
Cuando hay lactosa presente, pero también hay una fuente de carbono preferida en el medio (como
la gluocsa), entonces sólo una pequeña cantidad de enzima se produce (LacI no está unido al
operador).
•
Cuando la lactosa es la fuente preferida de carbono (por ejemplo, en ausencia de glucosa) AMPcCAP se unen al promotor y la producción de la enzima Lac se maximiza.
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TRABAJO PRACTICO 6
CUANTIFICACION DE GLUCOGENO EN TEJIDOS
Objetivos:
Adoptar conocimientos experimentales en la cuantificación de polisacáridos (glucógeno).
Introducción:
El glucógeno es un polímero de glucosa, ramificado, distribuido fundamentalmente en hígado y
músculo, cuya función es la de ser una forma de almacenamiento de glucosa fácilmente movilizable.
El glucógeno actúa como regulador de la glucosa sanguínea, almacenándola como glucógeno durante
una buena alimentación (glucogenogénesis) y liberándola por fosforolisis (glucogenolisis) durante el
ayuno, ya que en esta situación no hay absorción intestinal. La duración del glucógeno hepático en
ayunas es de aproximadamente 24 h. A partir de este momento, la concentración en sangre se mantiene
por síntesis de glucosa a partir de sustancias distintas a los carbohidratos (gluconeogénesis). El método
de extracción del glucógeno de los tejidos (músculo esquelético, corazón e hígado) se realiza previa
homogeneización de los mismos en un potter, mediante calentamiento con un álcali fuerte y
posterior precipitación con etanol. (Realizado en Quimica Biologica I)
La hidrólisis es ácida en caliente, y luego de una posterior neutralización se cuantifica.
En este paso la muestra puede guardarse a -20C, para determinarse la concentración en una próxima
clase de laboratorio.
Se calculará el porcentaje de glucógeno en los tejidos, no olvidar que la glucosa en el glucógeno
tiene una masa molecular de 162 y no de 180. El procedimiento permite extraer el 70% del
glucógeno.
Determinación de azúcares reductores: Método de Somogyi - Nelson
Reactivo de Somogyi
Na2HPO4 .7H20 (76) 5,3 g
Tartrato de Na y K (161)
4g
NaOH (197) 1N
10 ml
CuSO4 (157)
0,8 g
Na2SO4
18 g
0,4 g y llevo a 10 ml.
Llevar a 100 ml con AD.
Reposar 5 días, filtrar y conservar en frasco oscuro a T° ambiente.
Reactivo de Nelson
Molibdato de amonio
5g
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Sulfúrico 96%
4,2 ml
Arseniato de sodio.7H20 0,6 g
Llevar a volumen 100 ml con AD. Conservar en frasco oscuro a T° ambiente.
Testigo de glucosa
Pesar 9 mg y llevar a 50 ml con AD. Concentración final de glucosa: 1 mM
Parte Experimental:
Los azúcares reductores, en este caso la glucosa proveniente de la hidrólisis del glucógeno, se trata
con el reactivo de Somogyi (cobre en medio alcalino) en caliente. El grupo aldehído del azúcar
reductor reduce el ion cúprico a cuproso y este óxido cuproso resultante es reoxidado por el reactivo
arsenofosfomolíbdico de Nelson a óxido de molibdeno, de color azul. El color es proporcional a la
cantidad de glúcido presente en la muestra y se compara con un testigo de concentración conocida,
midiendo la absorbancia a 540 nm. La sensibilidad del método es de 0,06 a 0,5 μmoles.
Reacción principal
Glucosa + Cu++ ------------- Ac glucurónico + Cu+
Cu+ + arsenofosfomolibdato ---------- Cu++ + oxido de molibdeno (color azul)
Se trabaja con solución testigo de glucosa 1 mM de tal manera que 1 ml contenga 1 umoles.
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Medir los tubos a 530 nm, llevando a 0 con el blanco. Graficar en papel milimetrado los resultados
de la curva de calibración. Representar absorbancia en función de los μmoles de glucosa agregados.
Determinar la concentración de azúcares reductores antes y después de la hidrólisis ácida.
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TRABAJO PRACTICO 7
PRODUCCION DE PIRUVATO Y ACETALDEHIDO DURANTE LA FERMENTACION DE
GLUCOSA POR LEVADURA
INTRODUCCIÓN
Fermentación: La primera etapa del catabolismo de glucosa es la producción de piruvato. Este
proceso, que se efectúa mediante una serie de reacciones que involucran un número considerable de
intermediarios, se conoce como glucólisis. La reacción total de una molécula de glucosa produce dos
moléculas de piruvato, dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH. Este cofactor se encuentra
en cantidades catalíticas (es necesario reoxidarlo para que el proceso no se suspenda), y es utilizado
por la cadena respiratoria para obtener ATP dando así NAD +. Esto no es posible en condiciones
anaeróbicas y en este caso la reoxidación se efectúa cuando el piruvato se convierte en acetaldehído,
y luego en alcohol.
Intermediarios metabólicos: Los metabolitos piruvato y acetaldehído se encuentran presentes
normalmente en muy baja concentración, por lo tanto, para demostrar su existencia como
intermediarios en el camino metabólico, es necesario impedir que sean transformados en otros
compuestos. Este procedimiento se usa mucho para estudiar caminos metabólicos y se puede
realizar:
- Bloqueando la enzima que cataliza la conversión del compuesto que se esta investigando mediante
inhibidores.
- Cambiando las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por
debajo de su actividad máxima.
Usando un agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda
metabolisarse.
La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el
piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con nitroprusiato de sodio o
2,4 dinitrofenilhidrazina.
OBJETIVO
Experimentar en el metabolismo anaeróbico, especialmente en la producción de piruvato a partir de
la utilización de glucosa como fuente de hidrato de carbono.
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Materiales y reactivos:
- Levadura (1 g en 30 ml de Na2HPO4 700 mM).
- Baño termostatizado.
- Centrifuga.
- Glucosa 500 mM Pesar 4,5 g para 50 ml.
- Acido tricloroacético (100 g/l) Pesar 5 g para 50 ml.
- 2,4 dinitroafenilhidrazina (solución saturada).
- NaOH 2,5 M.
- Nitroprusiato de sodio. Pesar 0,5 g para 10 ml.
- Amoníaco y sulfato de amonio.
Parte experimental:
Formación de piruvato a partir de glucosa:
Glucosa
Levadura
A
5 ml
5 ml
B
5 ml
---
Incubar a 37 °C durante 1 hora.
Añadir a cada tubo 2ml de la solución de ácido tricloroacético, mezcle vigorosamente y centrifugue
a 2500 g durante 10 min.
Separar el sobrenadante para la determinación de piruvato.
Determinación de piruvato mediante 2,4 dinitrofenilhidrazina
Agregar 1 ml de solución saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina a 2 ml de sobrenadante, mezclar
vigorosamente. Dejar 10 minutos a 37 º. Colocar 2 o 3 gotas de la mezcla en un tubo de ensayo.
Agregar 1 ml de la solución de hidróxido de sodio, agitar y agregar 4 ml de agua.
La formación de un color rojo indica la presencia de piruvato.
Realizar en cada caso un control negativo, con agua.
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Química Biológica II
2010
TRABAJO PRACTICO 8
PIGMENTOS FOTOSINTETICOS
Introducción:
Entre todos los caracteres más externos de los vegetales, el más notable y característico es
probablemente el color. El color no es únicamente un carácter llamativo de la vegetación, sino que,
además, algunos de los pigmentos que lo condicionan están estrechamente ligados a las actividades
fisiológicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cómo las plantas viven
y se
desarrollan requiere el previo conocimiento de los pigmentos vegetales.
Si es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices y combinaciones de colores del
espectro, existe un predominio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo, azul. Estos
colores son conferidos a los vegetales por determinados compuestos químicos definidos, llamados
pigmentos. El color particular que presenta un determinado órgano vegetal depende generalmente
del predominio de uno u otro o la combinación de ellos. Se debe tener claro que cuando un vegetal
presenta un color blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ellas
no es absorbida selectivamente como ocurre en las partes coloreadas, sino que es transmitida o
reflejada prácticamente sin sufrir modificación.
El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos
pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b. Se encuentran
prácticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las
raíces, tallos, hojas y frutos a condición de que estos órganos estén situados por encima del suelo y
queden expuestos a la luz. También aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o
amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso allí
la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los demás pigmentos.
Estos pigmentos se encuentran en el interior de la células vegetales específicamente en el
cloroplasto. Los compuestos clorofílicos están ligados químicamente con las estructuras internas
del cloroplasto (membrana tilacoide) y se hallan retenidos en estado coloidal. Asociados con las
clorofilas, existen también en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarilloanaranjados : xantofilas y carotenoides.
Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el solvente universal agua, pero sí son solubles en
solventes orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y acetona. A los solventes que extraen
simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros
solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por
ejemplo el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo.
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Química Biológica II
2010
En el método de extracción simple se utilizará como extractante el alcohol etílico y como separador
el tetracloruro de carbono. Estos dos solventes orgánicos responden en forma diferente a los
pigmentos clorofílicos, como así también a sus diferencias físicas que hacen que sean dos líquidos
no misibles y con diferente peso específico.
En el segundo método por cromatografía se utilizará como extractante la acetona y como separador
el éter de petróleo. Este método se trata de una separación más fina de los pigmentos, y se basa en
la absorción y solubilidad diferenciales de varias sustancias entre las que se incluyen los pigmentos.
Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos granos de carbonato de calcio para
deshidratar la muestra, son los componentes necesarios para desarrollar la técnica.
Métodos de separación de pigmentos:
Separación de pigmentos vegetales por separación simple.
Objetivo:
Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante una técnica sencilla de fases.
Materiales:
Mortero - Embudo cribado -Kitasato - Papel de filtro - Tubos de ensayo - Alcohol - Tetracloruro de
carbono - Hojas de espinaca o Acelga - Bomba de vacío.
Técnica:
Lavar las hojas de espinaca o acelga, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con el
solvente extractante (alcohol).
Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso.
Filtrar con un embudo, papel de filtro y bomba de vacío. Pasar el filtrado a un tubo de ensayo.
Agregar tetracloruro de carbono y luego se lo agitará por unos segundos. Se lo dejará reposar en
una gradilla por 10 minutos. Los pigmentos se irán separando según su adsorción o afinidad con los
solventes. Veremos dos zonas que corresponden a los distintos pigmentos fotosintéticos presentes
en las hojas de espinaca. Según su grado de solubilidad con el alcohol y el tetracloruro de carbono
se reconocen estas zonas heterogéneas y no miscibles en este orden:
Separación de pigmentos vegetales por cromatografía sobre papel.
Objetivo:
Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante una técnica compleja de cromatografía
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Química Biológica II
2010
en papel.
Materiales:
Mortero- Embudo cribado -Kitasato - Papel de filtro - Tubos de ensayo - Acetona - Éter de Petróleo
- Hojas de espinaca o Acelga - Cloruro de Calcio- Bomba de vacío - Capilar o Pipeta Pasteur - Vaso
de precipitado.
Técnica:
Lavar las hojas de espinaca o acelga, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con 4 ml del
solvente extractante acetona. Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente
adquiera un color verde intenso. Filtrar con un embudo, papel de filtro y bomba de vacío. Pasar el
filtrado en un tubo de ensayo, agregar 3 ml de agua y 3 ml de eter de petróleo. Dejar reposar de 5
min. Se observarán 2 fases. Tomar con un capilar la fase superior etérea y sembrar una placa de
TLC, previamente activada, en banda para una cromatografía preparativa. Colocar en una cuba
utilizando como fase móvil acetona: éter de petróleo (25:75).Los pigmentos se irán separando según
su adsorción o afinidad con el solvente.
Observar el desarrollo del cromatograma al UV.
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