Actualizacion de la Tecnica de Obtencion

Revista Dental de Chile
2002; 93 (2): 25-28
Revisión Bibliográfica
Autores:
Actualización de la Técnica de Obtención y Uso del
Plasma Rico en Factores de Crecimiento (P.R.G.F.)
Extraction Technique and Surgical Use of the Plasma Rich
in Growth Factors (P.R.G.F.) Update
Dr. Mario Reyes M. *
Dra. Sandra Montero R.*
Dr. Julio Cifuentes F.*
Dr. Emilio Zarzar C.*
*Servicio de Cirugía y Traumatología Máxilo
Facial. Clínica Alemana. Santiago
Dirección Postal: Vitacura 5951. Vitacura. Santiago.
Resumen
El uso del plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), en cirugía, tiene beneficios técnicos importantes y puede incrementar la regeneración ósea, al utilizarse junto con injertos de hueso autólogo.
Sus predecesores fueron el adhesivo de fibrina, utilizado como hemostático y adhesivo quirúrgico, el fibrinógeno autólogo, con el que se
preparaba el gel de fibrina autóloga y, posteriormente, el plasma rico en plaquetas o PRP, el cual se mezcla con cloruro cálcico y trombina
bovina para producir la agregación y desgranulación plaquetaria, obteniéndose factores de crecimiento. El PRP requiere grandes volúmenes de sangre, un ambiente intrahospitalario, implementación sofisticada, plantea dos ciclos de centrifugación a altas revoluciones y utiliza
trombina bovina para su activación.
Siguiendo los mismos principios del PRP, surge la técnica de obtención del PRGF, que requiere menores volúmenes de sangre, un equipamiento
simple que permite su uso en la consulta, no utiliza trombina bovina y plantea una sola centrifugación con menos revoluciones, preservando la integridad de la membrana plaquetaria, permitiendo así obtener una mayor concentración de factores de crecimiento; siendo un
procedimiento económico, enormemente eficiente y 100% autólogo.
Summary
The use of PRGF in oral and maxillofacial surgery procedures has technical benefits and may enhance bone regeneration when used in
conjuction with autologous bone grafts. The fibrin adhesive was used as a haemostatic agent and surgical adhesive, before PRGF appeared.
Autologous fibrinogen was widely used to produce the autologous fibrin gel, until platelet rich plasma (PRP) became the best option to
obtain growth factors, after mixing this plasma with calcium chloride and bovine trombine, which causes platelet addition and exocytosis of
these factors. However, PRP requires large volume of blood, hospitalary environment, sophisticated equipment, two high-speed spinning
cycles and utilizes bovine trombine for its activation.
Following the same principle, PRGF appears as an alternative which requires: minimum volume of blood, a plain equipment that allows its
performance at the ambulatory office, a single low-speed spinning cycle -which contributes to obtain a higher concentration of growth
factors- and does not utilize bovine trombine. Therefore, PRGF is an economic, highly efficient and 100% autologous technique.
Introducción
El uso del gel de plasma rico en plaquetas
(PRP) para la colocación de injertos óseos
en cirugía oral y maxilofacial, fue originalmente propuesto por Marx en 1986 y,
en los últimos años, se ha masificado su
uso con excelentes resultados, debido fundamentalmente, a la capacidad que tiene
de incrementar la regeneración ósea al ser
utilizado junto con injertos de hueso
autólogo y a que es un procedimiento relativamente simple.
Ha despertado el interés también en otras
áreas como ortopedia, otorrinolaringología, cirugía plástica, neurocirugía y
periodoncia.
La técnica de obtención y utilización del
PRP ha sufrido algunas variaciones, dado
que se ha seguido investigando al respecto y en la actualidad el procedimiento se
ha simplificado y optimizado a la vez, tanto
así, que hoy se prefiere hablar de plasma
rico en factores de crecimiento (plasma
rich in growth factors o PRGF).
La presente revisión pretende actualizar los
conceptos referentes a este importante recurso y mostrar cómo se realiza hoy, tanto
la técnica de obtención del PRGF, como
su uso clínico.
rúrgicos, sobre todo en aquellos órganos
en los que resulta muy difícil controlar el
sangrado como hígado, riñones, cerebro,
en tejidos infectados, quemados o soportes de injertos(1).
Matras describió este adhesivo como una
sustancia con propiedades selladoras y
hemostáticas que promovía la reparación del
tejido y el cierre de la herida y que fue comercializado con el nombre de Tisucol®(3).
Desarrollo
El desarrollo del PRGF parte en los años
80 con el adhesivo de fibrina, el cual aparece en el ámbito de la investigación en
respuesta a la necesidad de mejorar los
agentes hemostáticos y los adhesivos qui-
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Como consecuencia del veto a su utilización
por la Food and Drug Administration (FDA),
se ha desarrollado otra modalidad: la obtención del fibrinógeno autólogo, que evita los
riesgos de infección y rechazo. La técnica
sugiere la obtención de sangre del paciente
días antes de la cirugía para aislar el
fibrinógeno en el laboratorio con el que se
prepara el gel o cola de fibrina autóloga.
El mecanismo de acción de la cola de fibrina
mimetiza la última etapa de la coagulación
en la cual el fibrinógeno se convierte en
fibrina por acción de la trombina, la que en
presencia de calcio, rompe los
fibrinopéptidos A y B de la molécula de
fibrinógeno, originando así los monómeros
de fibrina; además, la trombina activa el factor XIII que favorece el entrecruzamiento de
estos monómeros, formando el coágulo.
Debido a la acción proteolítica de la trombina
sobre el fibrinógeno, que es soluble, al convertirlo en fibrina, que es insoluble, se genera esta sustancia viscosa que constituye el
adhesivo de fibrina(1,2).
La alternativa a la preparación del gel de
fibrina autólogo, que requería citar al paciente
días antes de la intervención, ha sido la obtención de un plasma rico en plaquetas (PRP)
mediante plasmaféresis, minutos antes de la
intervención.
El método consiste en obtener 500 ml de sangre del paciente a través de un catéter a una
velocidad de 50 ml/min la que es
recepcionada en tubos citratados. Posteriormente se centrifuga la sangre a 5.600 rpm,
obteniéndose 3 fracciones, de menor a mayor densidad: plasma pobre en plaquetas
(PPP), plasma rico en plaquetas (PRP) y células rojas. El PPP y PRP se aspira y se lleva
a otro recipiente para ser centrifugado nuevamente a 2.400 rpm obteniéndose 2 fracciones: PPP y PRP. Este último, se conserva
hasta que se requiera su uso en la cirugía,
momento en el cual se mezcla con cloruro
cálcico y trombina bovina, produciéndose en
un intervalo de 5 a 30 segundos la coagulación del PRP. Este cambio produce agregación y desgranulación plaquetaria, liberándose las proteínas contenidas en su interior,
entre ellas los factores de crecimiento; la preparación tarda en total 45 minutos(4).
El éxito del gel de fibrina ha llevado a desarrollar una técnica con la misma filosofía,
con menores volúmenes de sangre, que pueda ser utilizada en forma rutinaria incluso en
la consulta ambulatoria. La estrategia se basa
en la utilización de las plaquetas por las siguientes razones: Por un lado, funcionan
como vehículo portador de factores de crecimiento y de otras proteínas que desempeñan un papel importante en la biología ósea,
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como son la fibronectina y otras proteínas
adhesivas. Por otro lado, se controla la liberación de estas proteínas contenidas en los
gránulos alfa de las plaquetas, sustancias que
serán concentradas y depositadas en el lugar
de la herida, exponiendo y orientando un concentrado fisiológico de proteínas que va a
intervenir, acelerando y favoreciendo el proceso de reparación y regeneración. Entre
otras encontramos las siguientes proteínas:
- PDGF: factor de crecimiento derivado de
las plaquetas.
- VEGF: factor de crecimiento endotelial
vascular.
- TGF beta: factor de crecimiento transformado tipo beta.
- EGF: factores de crecimiento epidérmico.
- IGF-I: factores de crecimiento insulínico
tipo I.
La acción e interacciones de estos factores
de crecimiento varían dependiendo del tipo
de célula y de su grado de madurez(1,10).
El TGF beta 1 promueve la síntesis de matriz extracelular e induce la expresión de receptores tipo beta para el PDGF. Junto a este
último, estimula la síntesis de colágeno tipo
I, fibronectina y osteonectina así como la
sedimentación de la matriz extracelular y la
quimiotaxis. También disminuye la síntesis
de metaloproteínas (que degradan la matriz
extracelular) y del factor activador de
plasminógeno, todo lo cual tiene como consecuencia una disminución en la destrucción
de la matriz de tejido conjuntivo. El TGF beta
1, al parecer, inhibe la formación de
osteoclastos, pero por otro lado, promueve
la resorción de hueso por un mecanismo dependiente de las prostaglandinas. Su acción
es muy compleja, pero parece que es uno de
los factores de conexión entre la reabsorción
y formación ósea(5,12).
Los niveles plasmáticos de EGF no son
detectables, pero las plaquetas contienen
cantidades importantes de este factor de
crecimiento epidérmico. Tras la coagulación, la concentración de EGF en el suero
es aproximadamente de 130 pmol/L, cantidad suficiente para inducir la mitosis y
la migración celular. Este hecho sugiere la
participación de EGF en las primeras fases de la reparación, estimulando la migración y división celular y aumentando
la síntesis de proteínas como la
fibronectina(13) .
El plasma contiene cantidades importantes de IGF-I, el que es sintetizado principalmente en el hígado. También se encuentran cantidades importantes de este factor
en las plaquetas. Una vez liberado por las
plaquetas, el IGF-I es un potente agente
quimiotáctico para las células vasculares
endoteliales, provocando un aumento en
la neovascularización de la herida. El IGFI también estimula la proliferación y diferenciación de osteoblastos y tiene mayor
efecto combinado con otros factores de
crecimiento.
VEGF estimula la proliferación celular en
aquellos vasos sanguíneos que han sido dañados.
De este modo se utilizan las plaquetas
como fuente exógena de factores de crecimiento que, en algunos casos, refuerzan
las concentraciones ya existentes en el
hueso, y en otros actúan en concierto con
éstos, estimulando la actividad de las células óseas y células epiteliales.
El coágulo de PRGF o coágulo blanco,
funciona como vehículo natural de los factores de crecimiento y presenta muchas
ventajas sobre otros diseños más
sofisticados.
Como las plaquetas carecen de núcleo, sus
posibilidades de sintetizar proteínas son
prácticamente inexistentes. Sin embargo,
poseen proteínas, entre ellas el fibrinógeno,
que captan del plasma por un mecanismo
de endocitosis. Este fenómeno utiliza un
sistema canalicular conectado a la superficie e interrelaciona el medio plasmático
externo con los gránulos. Esta es la razón
por la que las plaquetas contienen proteínas plasmáticas(1).
Con técnicas de microscopía electrónica
se ha estudiado la cinética de la agregación plaquetaria en el PRGF activado con
cloruro cálcico, pudiéndose observar
cómo, cuando se activa el PRGF, las
plaquetas cambian su forma y se van agregando desplazándose dentro del coágulo
hasta agruparse por completo a los 30 minutos.
Se ha visto que ocurren cambios no sólo
en la forma de las plaquetas, sino también
en su contenido. A los 3 minutos se aprecian aisladas, esparcidas por el coágulo,
pero ya se observa la formación de
pseudopodos y la centralización de los gránulos. Entre los 3 y los 10 minutos las
plaquetas continúan su activación y se
agregan. A los 30 minutos la morfología
del coágulo es completamente diferente.
Las plaquetas se han agregado y permanecen fuertemente unidas, rodeadas de fibras
de fibrina, se ha liberado el contenido de
todos sus gránulos, observándose las plaquetas
vacías y fibras gruesas de fibrina. Al cabo de
una hora la estructura y morfología del coágulo
es muy regular y estable. A la hora y media las
plaquetas están vacías e incluso se puede observar la rotura de muchas de ellas(6).
Revista Dental de Chile
Técnica de Obtención del PRGF
Hasta 1995, todos los protocolos de obtención de concentrados plaquetarios partían de
cantidades muy elevadas de sangre y se realizaban en ambientes hospitalarios con equipos sofisticados de autotransfusión.
Además, existía una gran controversia, en
Europa sobre todo, con el uso de trombina
bovina, ya que se había detectado anticuerpos
anti trombina en pacientes tratados con los
métodos antes descritos(1).
Se pensó en la obtención de un coágulo rico
en factores de crecimiento mediante un método sencillo y de fácil utilización incluso
en la consulta ambulatoria.
Se inicia entonces la optimización de un pro-
tocolo que permitiera utilizar esta fuente
fisiológica de factores de crecimiento que,
además del beneficio de la liberación de éstos, constituyera un elemento mecánico que
permitiera consolidar los materiales de injerto y facilitara el cierre de la herida favoreciendo el postoperatorio(7).
Se eligió como anticoagulante idóneo para
la extracción de sangre el citrato sódico. Esta
sal capta los iones calcio que se encuentran
en la sangre y los neutraliza formando un
compuesto químico llamado quelato, impidiendo de esta forma, la coagulación de la
sangre. Además, el citrato sódico no altera
los receptores de membrana de las plaquetas
y permite la reversibilidad del proceso al
añadir calcio en forma de cloruro de calcio.
La separación del plasma se logra mediante
centrifugación suave, la cual permite concentrar las plaquetas que se encuentran más
próximas a los hematíes.
Las fracciones con mayor contenido de
plaquetas son las que se encuentran inmediatamente por encima de la serie roja (0,1
cc. por encima de los hematíes). Esta fracción contiene un plasma 8 veces más concentrado en plaquetas que la sangre
periférica. La siguiente fracción contiene un
plasma 4 veces más concentrado(1).
Procedimiento de Obtención del PRGF
Se realiza la extracción de la sangre al paciente unos minutos antes de comenzar la
cirugía. La cantidad dependerá del defecto a tratar. Por ejemplo, para una
exodoncia, entre 20 y 30 cc. serán suficientes, mientras que para una elevación de
seno, bastarán 30 cc.
La sangre se recepciona en tubos estériles
con citrato sódico al 3,8% como
anticoagulante. A pesar que el EDTA tiene
un rendimiento mayor que el citrato, se ha
visto por microscopía de luz, a las
plaquetas rasgadas, rodeadas de abundantes restos celulares cuando se ha usado
EDTA como anticoagulante. Se prefiere
por tanto el Fosfato de Dextrosa Citratado
(CDP), debido a que éste preserva la integridad de la membrana plaquetaria, hecho
de vital importancia, ya que los factores
de crecimiento son exocitados activamente. Durante este proceso ocurre la formación de la molécula proteica y la formación de su estructura terciaria, de cuya integridad depende su actividad y efectividad. En este mismo contexto, es importante
considerar también, la velocidad de
centrifugación que va en relación directa
con la fuerza de gravedad (G), ya que se
ha visto que una G excesiva, reduce dramáticamente la cantidad de factores de crecimiento (11).
Se centrifuga el plasma en una centrífuga
digital que permita controlar los
parámetros de tiempo y velocidad. El tiempo de centrifugación será de 8 minutos a
1.800 rpm (280 G), a temperatura ambiente.
El plasma luego es separado mediante
pipeteado muy meticuloso para no crear
turbulencias en las fracciones obtenidas.
Los primeros 500 microlitros (0,5 cc.)
(fracción 1) es un plasma pobre en
plaquetas y por lo tanto pobre en factores
de crecimiento. Los siguientes 500
microlitros (fracción 2) corresponderán a
un plasma con un número de plaquetas similar al que tiene la sangre periférica.
La fracción de plasma más rico en
plaquetas y factores de crecimiento
(PRGF) son los 500 microlitros que se encuentran encima de la serie blanca (fracción 3).
Con una pipeta de 500 microlitros se aspira la fracción 1 y se traslada a un tubo
estéril, previamente etiquetado, donde se
reunirá todo el PPGF, repitiéndose el
proceso con todos los tubos procedentes
de la centrifugación. Con la misma pipeta
(diferente punta estéril), se aspira la fracción 2 de todos los tubos y al igual que
con la fracción 1, se lleva a otro tubo estéril etiquetado, que contendrá entonces, un
plasma con una concentración de plaquetas
similar a la de la sangre periférica (PGF).
Para la fracción 3 se realiza un pipeteado
más cuidadoso, con una pipeta de 100
microlitros, para evitar las eventuales turbulencias que se puedan producir, y de
este modo no aspirar los hematíes ni la
serie blanca. Se repite este proceso 5
veces, colectándose lo obtenido en un tercer tubo estéril y etiquetado, el cual
contendrá el PRGF.
El volumen de plasma que se obtiene tras
la centrifugación varía ligeramente de un
individuo a otro, obteniéndose volúmenes
diferentes de cada fracción. Por lo tanto,
se debe contar siempre desde la serie blanca hacia arriba, y de obtenerse más plasma, éste será PPGF, cuyo volumen puede
variar entre 1 y 2 cc. Así, si tenemos 4,5
cc de sangre, 1 cc. será PRGF, 1 cc. de PGF
y el resto PPGF. Lo importante es el concepto de que se comienza a pipetear desde
arriba, pero la fracción más importante es
la última.
Otro detalle importante es que si después
de centrifugar se observara un tubo con
plasma turbio, por la presencia de
hematíes, éste debe ser descartado, ya que
esta pequeña hemólisis se debe a una falla
en el momento de extraer la sangre del
paciente, por una mayor lesión de la pared
vascular. Esta lesión ha provocado la liberación de una gran cantidad de
tromboplastina tisular, comenzando la formación del coágulo.
Figura
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Activación y Agregación Plaquetaria
Una vez obtenido el PRGF, para provocar
la formación del coágulo se pueden emplear los siguientes protocolos:
- Añadir 50 microlitros de cloruro cálcico
al 10% por cada cc. de PRGF. Luego de 5
a 8 minutos se obtendrá el coágulo, tiempo que variará en relación inversa al número de plaquetas. Para acelerar el proceso se puede elevar la temperatura del plas-
ma a 37º C, antes de activarlo, disminuyendo de 2 a 3 minutos el tiempo de formación del coágulo.
- Si se va a mezclar el plasma con algún
material de injerto, primero se añade el
cloruro cálcico y luego el injerto. Después
de 2 a 5 minutos se obtendrá un agregado
que contendrá el injerto, con una consistencia gomosa fácil de manipular. También
se puede disminuir el tiempo de formación
aumentando a 37º C la temperatura(8).
- Si se desea obtener un efecto “barrera”,
se pueden mezclar 2 cc. de sulfato cálcico
con 1 cc. de PRGF para, luego de 5 minutos, obtener un material gomoso de fácil
manipulación. Este material además posee
propiedades osteoconductoras(1).
Este coágulo, englobando o no un injerto,
sigue experimentando cambios para finalmente retraerse. Este, ha eliminado parte
de su contenido en factores de crecimiento, y ya presenta fibras gruesas de fibrina,
bien organizadas. Esta última fase se puede
catalizar manteniendo el coágulo a 37º C. El
tapón de fibrina así obtenido puede servir
como cierre en una exodoncia para proteger
el coágulo de PRGF de ser aspirado o movilizado por la lengua.
También se puede obtener fibrina en for-
ma de membrana biológica que sirva para
cubrir un injerto compactado con PRGF.
El coágulo de fibrina tiene una consistencia tal, que casi permite ser suturado.
Para la obtención de fibrina podemos, obviamente, utilizar el PRGF, resultando una
malla de gran volumen, pero también podemos utilizar las fracciones menos concentradas, con las que se obtienen, sí, volúmenes menores. Por ello, se deben conservar todas las fracciones de plasma obtenidas.
- Elevación de seno maxilar.
- Relleno de cavidades quísticas post
quistectomía.
- En exodoncias múltiples, para conservar
la altura del reborde alveolar.
- En defectos óseos generados por la
desinclusión de caninos o terceros molares.
- En defectos óseos periapicales, luego de
una apicectomía, por ejemplo.
- Regeneración ósea alrededor de implantes osteointegrados, rellenando el defecto
inmediatamente luego de haber colocado
el o los implantes.
- En injertos óseos en bloque, para rellenar la zona donante, estimulando su regeneración y para cubrir y ayudar a remodelar
el bloque a utilizar, compactándose las zonas limítrofes del injerto, evitando así los
escalones óseos(8).
- Reconstrucción de grandes defectos óseos
post cirugía oncológica(9) .
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Obtención de Fibrina Autóloga
Al mezclar el PRGF con cloruro cálcico
se activa la trombina endógena y se transforma el fibrinógeno en fibrina. En un principio, se forma la malla de fibrina y se activan las plaquetas, las que inicialmente
dispersas, poco a poco se van agregando
uniéndose entre sí, provocando cambios en
su citoplasma para luego liberar el contenido de sus gránulos alfa.
El coágulo recién formado es una verdadera esponja empapada en factores de crecimiento y otras citoquinas.
Aplicaciones Clínicas
El uso clínico del PRGF es muy variado y,
cada vez, surgen nuevas e insospechadas
aplicaciones en las cuales este recurso
autólogo y económico, soluciona problemas otrora imposibles de enfrentar con
éxito.
Dentro de todas las aplicaciones clínicas,
se mencionarán las utilizadas en el campo
de la cirugía oral y maxilofacial, a saber:
- Reconstrucción de rebordes alveolares
atróficos.
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