Inhibición de la actividad proteolítica del veneno de Bothrops

Resumen: E-015
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Inhibición de la actividad proteolítica del veneno de Bothrops alternatus
por quelantes de metales
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Gay, Claudia C. - Leiva, Laura C. - Ruiz, Raquel M. - Acosta, Ofelia C.
1. Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, UNNE
Campus, Av. Libertad 5400. (3400) Corrientes. e-mail: claudiacgay@exa.unne.edu.ar
2. Departamento de Clínicas. Facultad de Ciencias Veterinarias, UNNE
Sargento Cabral 2139. (3400) Corrientes. e-mail: patmed@vet.unne.edu.ar
Antecedentes
En Argentina hay varios géneros de ofidios venenosos, entre ellos Bothrops (yarará) es el responsable de la mayor parte
de los accidentes ofídicos. Dentro de este género los más frecuentes son los causados por Bothrops neuwiedii diporus,
siguiendo en orden de importancias Bothrops alternatus, la víbora de la cruz ó yarará grande (Esteso, 1985). El veneno
de estos ofidios induce hemorragia sistémica, desórdenes en la coagulación, shock cardiovascular y fallo renal agudo
(Gutiérrez, 1995; Acosta de Pérez et al, 1996a, Teibler et al, 1999). Además provoca efectos locales complejos tales
como hemorragia, mionecrosis y edema (Acosta et al, 1996 b, c; 1997, 1998). Estos efectos son debidos a la presencia
de enzimas, tales como fosfolipasas, trombinas y metaloproteasas, las que mediante acción individual ó sinérgica desencadenan la intoxicación. Entre éstas, las metaloproteasas, enzimas zinc-dependientes, son las principales responsables de la acción fisiopatólogica del veneno tanto local (Gutiérrez and Rucavado, 2000) como sistémica (Kamiguti et al,
1996a, b), contribuyendo además a la difusión de componentes del veneno desde el sitio de inoculación (Anai et al,
2002). Esto ha convertido a las metaloproteasas en un blanco de búsqueda de nuevos inhibidores para el tratamiento de
la intoxicación ofídica. Actualmente, la terapia consiste en la administración i.v. de antiveneno polivalente de caballo.
Si bien este tratamiento es efectivo para la neutralización de los efectos sistémicos, los locales son sólo parcialmente
neutralizados, especialmente la hemorragia, aun cuando el antiveneno es suministrado rápidamente después de la intoxicación (Gutiérrez et al, 1981), además de reacciones alérgicas que ocurren en algunos pacientes (Kornalik and Vorlova, 1990).
Por lo tanto, es de interés hallar compuestos sintéticos (distintos de sales de EDTA, con reconocida acción tóxica) que
puedan neutralizar las proteasas que contiene el veneno botrópico. Dado que tales enzimas son del tipo metaloproteasas,
es objeto de este trabajo ensayar colorantes quelantes de metales, como potenciales inhibidores de la actividad proteolítica que exhibe el veneno de Bothros alternatus sobre la caseína.
Materiales y Métodos
Veneno: se utilizó un pool de veneno de serpientes adultas de Bothrops alternatus obtenido del Serpentario de la ciudad
de Corrientes, el que fue desecado y conservado a -20º C hasta el momento de ser utilizado.
Actividad proteolítica: se evaluó mediante la detección de hidrólisis de caseína por electroforesis sobre gel de poliacrilamida de 12%, según adaptación de técnica descripta por Pardo y Natalucci (2002). Solución de caseína (5 mg/ml) en
buffer Tris – HCl 0,1 M, pH 8,0, fue incubada con veneno (0,125 mg/ml) disuelto en el mismo buffer. A distintos tiempos, alícuotas de 20 µl fueron retiradas de la mezcla de digestión, desnaturalizadas y reducidas por ebullición durante 5
minutos con 20 µl de solución desnaturalizante (SDS 2% y 2- mercaptoetanol 2%). Luego, las muestras se sometieron a
electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).
Efecto de quelantes de metales sobre la actividad proteolítica: se ensayaron los siguientes quelantes de metales: EDTA Na2 (10 mM), alizarina, arsenazo III y calción (10 mg/ml). Se incubaron en partes iguales, volúmenes de solución
de quelante y de veneno (0,25 mg/ml), durante una hora a 37º C. Alícuotas de la mezcla fueron incubadas con solución
de caseína (10 mg/ml) durante una hora a 37º C, posteriormente desnaturalizadas y reducidas con mezcla desnaturalizante, y sometidas a SDS-PAGE. Una muestra de caseína en buffer Tris – HCl 0,1 M, pH 8,0, se empleó como control
de caseína. Se procesó además caseína preincubada con veneno en las mismas condiciones mencionadas, como control
positivo de degradación proteolítica. Para testear el efecto de la dosis se ensayó alizarina y EDTANa2 a bajas concentraciones (1 mg/ml y 1 mM respectivamente).
Discusión de resultados
Actividad proteolítica
Se evaluó la capacidad del veneno de Bothrops alternatus de hidrolizar la caseína por SDS-PAGE. A los 5 minutos de
incubación ya se aprecia degradación del sustrato con la concomitante aparición de productos de bajo peso molecular
(23 kDa). A los 15 minutos, prácticamente son degradadas cadenas típicas de caseína (αs1, αs2; β y κ) del orden de 30
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kDa (Pardo y Natalucci, 2002). Alos 60 minutos sólo se detectan cadenas de alto peso molecular, una banda neta de 50
kDa, aparentemente no atacada por las enzimas proteolíticas del veneno, y productos de degradación de 23 kDa.
Trabajos de Ruiz de Torrent y col. (2001) cuantificaron la actividad proteolítica de este veneno por método espectrofotométrico, empleando el mismo sustrato (caseína), sin embargo no es un método apropiado para evaluar el efecto de
colorantes quelantes de metales dada la elevada absortividad que presentan tales compuestos en las concentraciones
estudiadas.
Los perfiles electroforéticos resultantes de la técnica empleada (Figura 1), permiten detectar, en forma cualitativa, la
acción hidrólitica de las proteasas presentes en el veneno.
Figura 1: Electroforesis SDS-PAGE: degradación de caseína por acción del veneno de Bothrops alternatus. A: marcadores de peso molecular. B: caseína. C-F: degradación a diferentes tiempos.
Efecto de los quelantes
Las mezcla de reacción en presencia de EDTA disódico (Figura 2 a, línea C) mostró un patrón electroforético similar al
de la caseína (Figura 2a, línea A), esta evidencia corrobora resultados publicados por otros autores (Borkow et al, 1997)
acerca de la naturaleza metal-dependiente de estas proteasas. De igual modo se comportó la alizarina (Figura 2 a, línea
D) resultando así un quelante efectivo para inhibir tales enzimas. Sin embargo el veneno en presencia de arsenazo III
como así también de calción exhibió una degradación parcial de la caseína en la dosis y tiempo ensayados (Figura 2a,
líneas E y F), evidenciándose menor eficacia como inhibidores de las proteasas por parte de estos quelantes.
Para evaluar el efecto de la dosis se ensayó EDTA disódico y alizarina a bajas concentraciones (1 mM y 1 mg/ml respectivamente). A estos niveles, se observó que la inhibición de la degradación no es completa tanto en el EDTA disódico como en la alizarina (Figura 2b, líneas C y E).
Figura 2. Electroforesis SDS-PAGE: efecto de quelantes sobre degradación de caseína por acción del veneno de Bothrops alternatus. a. A: caseína. B: degradación de caseína por acción del veneno de Bothrops alternatus. C-F: caseína y
veneno de Bothrops alternatus preincubado con quelante de metal EDTA (10 mM); alizarina (10 mg/ml), arsenazo III
(10 mg/ml) y calción (10 mg/ml) respectivamente. b. A: caseína. B-C: caseína y veneno de Bothrops alternatus preincubado con EDTA 10 y 1 mM respectivamente. D: degradación de caseína por acción del veneno de Bothrops alternatus. E-F: caseína y veneno de Bothrops alternatus preincubado con alizarina 1 y 10 mg/ml respectivamente.
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Conclusiones
La metodología empleada permitió detectar la capacidad del veneno de Bothrops alternatus de hidrolizar la caseína, y a
la vez evaluar la capacidad inhibitoria, de proteasas , por parte de los colorantes ensayados.
La alizarina, en la dosis ensayada (10 mg/mL) resultó ser un inhibidor de metaloproteasas tan efectivo como el EDTA
disódico. Esto la vuelve como un potencial agente de uso farmacológico, para el tratamiento local de lesiones provocadas por mordeduras de serpientes del género Bothrops, complementario al suministro del suero antiofídico. Ensayos en
animales de experimentación se están llevando a cabo a fin de evaluar tal aplicación.
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