Bioquímica - Electroforesis 1 Historia El término electroforesis se

Bioquímica - Electroforesis
1
Historia
El término electroforesis se refiere a una técnica separativa que emplea un campo eléctrico
aplicado que actúa sobre partículas cargadas causando su movimiento a través de una matriz.
El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937. Su trabajo
le valió el premio Nóbel en 1948. Fue Tiselius quien desarrolló el concepto de frente móvil
(moving boundary), que más tarde se conoció como electroforesis de zona y se usó para
separar proteínas en solución (1).
Entre 1940 y 1960 sobrevino un desarrollo de la electroforesis, aplicándose a diversas
moléculas, desde proteínas grandes hasta aminoácidos e iones inorgánicos. A la electroforesis
de zona se sumaron además el isoelectroenfoque y la isotacoforesis, basadas en diferentes
propiedades físicas. Esto permitió realizar análisis separados en una misma muestra o bien
realizar combinaciones de métodos.
La distinción entre los tres métodos también se da a nivel de las matrices empleadas en cada
una, que brindan ventajas comparativas dependiendo de la técnica y de la muestra a separar.
Así, se han usado geles de polímeros, papel y capilares. El papel es fácil de usar dado que no
es necesaria una preparación previa, pero con el tiempo se ha privilegiado el uso de matrices
tipo gel. Smithies en 1955 introdujo el uso de geles de almidón (2), y dos años más tarde Kohn
usó acetato de celulosa (3). En 1959 Ornstein y Davis (4) y Raymond y Weintraub (5) usan un
gel de poliacrilamida. Los capilares fueron introducidos por Jorgenson y Lukacs (6,7) a
principios de los 80.
Las técnicas de detección han evolucionado con los años también. Algunas de estas técnicas
incluyen el teñido químico, técnicas inmunoelectroforéticas, análisis bidimensional y varias
técnicas de inmovilización en membranas.
Hoy la electroforesis se aplica principalmente al análisis de muestras biológicas. Es
ampliamente usada en análisis de DNA para química forense y en la investigación biológica.
1. Tiselius, A., A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures, Trans.
Faraday. Soc., 33, 524, 1937.
2. Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of
normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955.
3. Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta,
2, 297, 1957.
4. Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of
Eastman Kodak Co.), 1959.
5. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone
electrophoresis, Science, 130, 711, 1959.
6. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981.
7. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.
Principio general
La electroforesis separa partículas en base al movimiento inducido por un campo eléctrico. El
campo eléctrico resulta en la aplicación de una fuerza sobre las partículas que es proporcional
a su carga o potencial de superficie. La fuerza resultante induce una velocidad diferente en las
distintas macromoléculas. En otras palabras, si se aplica un campo eléctrico durante un
período de tiempo dado a través de una matriz que contiene una mezcla de macromoléculas
con diferentes potenciales de superficie, las moléculas estarán en diferentes lugares al detener
el campo.
El estudio del movimiento electroforético se enfoca en el potencial eléctrico en la superficie de
la macromolécula, y la relación de ese potencial con la velocidad del objeto en el campo
eléctrico. El potencial de superficie está causado por la interacción de la superficie de la
molécula con el medio que la rodea. Una separación de carga entre una capa delgada en la
superfice de la partícula y otra capa delgada en el medio alrededor de ella resulta de una
interfase entre las dos superficies. Esta separación de carga resulta a su vez en una cierta
Bioquímica - Electroforesis
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densidad de carga en cada capa y en consecuencia en un potencial eléctrico entre capas. El
campo eléctrico aplicado a la matriz actúa sobre esta densidad de carga. Así, las moléculas de
la muestra y del solvente se moverán en direcciones opuestas debido a las cargas diferentes.
Las macromoléculas pueden separarse también en base a la carga. Esto es posible debido a
que cuanto más grande sea una molécula mayor será su superficie y también el potencial de
superficie (1,2,3).
Ambas capas delgadas, la de la macromolécula y la del solvente, son denominadas en
conjunto doble capa eléctrica. Usando esta terminología, al aplicar el campo eléctrico las
porciones negativa y positiva de la doble capa de separan.
Para poder modelar matemáticamente el fenómeno electroforético, es necesario tratar esta
doble capa eléctrica como un capacitor. Así, la ecuación para la diferencia de potencial a través
de dos placas o capas puede ser expresada como:
ζ = 4πed / D
(1)
La diferencia de potencial entre dos capas es conocida como potencial zeta, de allí el símbolo.
d es la distancia entre las placas en cm, e es la carga por cm2, D es la constante dieléctrica del
medio entre los platos. La ecuación para la velocidad de una partícula en un campo eléctrico
toma en cuenta el balance entre las fuerzas aplicadas a una partícula por un campo eléctrico y
la fuerza de fricción que se opone al movimiento:
V=μE
(2)
En esta ecuación V es la velocidad, E es igual al campo eléctrico en volts/cm, y μ se representa
por la ecuación (3).
μ = [(ε ε 0ζ )/η ] f(κ a)
(3)
En la ecuación (3) ε es la permitividad relativa, ε 0 ζ es la permitividad del espacio libre (8.854 x
10-14 C/(V × cm) y η es la viscosidad en g/(cm × s). En la función f(κ a), a es el diámetro de
partícula en cm y la recíproca de κ (1/ κ) es el espesor de la doble capa. Con esto en mente,
f(κ a) es 1 cuando la partícula tiene un diámetro mucho mayor que la doble capa y 1,5 cuando
el diámetro de la partícula es muy reducido en comparación con la doble capa. Cuando los
diámetros son casi iguales, el comportamiento es complejo (2).
En la electroforesis en capilares deben ser tenidos en cuenta otros fenómenos, en especial el
flujo electroosmótico. La electroosmósis se da cuando el fluido migra con respecto a la carga
inmovilizada, en tanto que la electroforesis se da cuando la partícula migra con respecto al
fluido. El flujo electroosmótico generalmente esta minimizado en una matriz de polímero como
un gel, pero es significativa en canales abiertos como los capilares.
Uno de los problemas más comunes en la electroforesis es la generación de calor debido a la
resistencia eléctrica del medio. Los efectos del calentamiento son un factor limitante en las
separaciones electroforéticas. Cuanto mayor sea el campo eléctrico aplicado, mayor la
resolución. para poder mantener un elevado campo eléctrico, se usan medios resistivos, lo que
resulta en la generación de calor. La fórmula para la generación de calor está dada por la
ecuación:
W=ExI
(4)
en la cual W es la fuerza en watts e I es la corriente en amperios. La corriente y el campo
eléctrico están relacionados por la conductividad del medio según la ley de Ohm
E = I/C
(5)
En esta ecuación C es la conductividad del medio en (W × cm)-1. Es decir, cuanto menos
conductividad mayor campo eléctrico es necesario. Esto significa que para tener mejor
resolución, que se logra con un campo elevado, se necesita menor conductividad.
Bioquímica - Electroforesis
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1. Jacqueline Kroschwitz, ed., Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed., John Wiley &
Sons, 1994, p. 356.
2. Alan Townshend, ed., Encyclopedia of Analytical Science, vol. 2, Harcourt Brace and
Company, 1995, p. 1041.
3. Jorgenson, J. W. Analytical Chem, 1986, 58, 7, 743A.
Tipos de análisis electroforético.
Los diferentes tipos de análisis pueden ser distinguidos por las propiedades físicas de la
muestra que se van a emplear para su separación o por el tipo de matriz usada. Los cuatro
tipos básicos que se fundamentan en diferentes propiedades físicas son: límite móvil (moving
boundary), zona, isoelectroenfoque e isotacoforesis.
Límite móvil (Moving Boundary)
Fue primeramente propuesta por Picton y Linde en 1892, pero fue completamente desarrollada
por Tiselius en 1930 (1). En este método la muestra se coloca en una solución buffer en un
tubo con forma de U. Se aplica un campo eléctrico por medio de electrodos sumergidos en
cada extremo del tubo. Las partículas de la muestra pueden entonces migrar en relación al
campo eléctrico. Este método usa solamente la carga de la partícula y el potencial z resultante
cuando la muestra se encuentra en contacto con el buffer. La dirección y velocidad de
migración está determinada por la movilidad electroforética de cada componente. Una
desventaja de este método es que la mayoría de los componentes no se separan limpiamente
sino que se superponen. Sólo los componentes más rápidos y los más lentos pueden ser
parcialmente purificados. Otra desventaja es que los llamados límites móviles de los
componentes de la mezcla no son visibles al ojo humano y se necesita de un buen equipo
óptico para la detección. Por esta razón esta técnica ha caído en desuso.
Electroforesis de zona
Esta es la forma más practicada de electroforesis. Este método es parecido al de límite de
movilidad dado que cada componente migra de acuerdo con su propia movilidad. La gran
diferencia es que se realiza sobre un medio soporte para lograr la completa separación de cada
componente. Otra de las diferencias es que la muestra es aplicada en una banda angosta o
zona. En la electroforesis de límite móvil los componentes tienden a mezclarse debido a
convección causada por gradientes de densidad o temperatura o por vibraciones mecánicas. A
través del uso de soportes estos problemas son minimizados. Los medios más comunes son
geles, papel o capilares.
En la electroforesis de zona los componentes son aplicados en una banda angosta rodeada por
buffer. Se aplica un campo eléctrico y cada banda migra con una velocidad característica
determinada por su movilidad electroforética. Cada componente se separa de su vecino para
formar una zona pura. Las zonas puras se estabilizan por medio del soporte, que previene el
mezclado debido a corrientes de convección. Es un buen método separativo dado que
efectivamente aísla los componentes de la mezcla. Combinado con el uso de estándares
puede ser tan valioso como algunos tipos de cromatografía. El uso de un soporte poroso con
características de filtro permite la separación debido a otra propiedad física, el tamaño.
Los medios pueden estar contenidos dentro de un tubo o entre dos placas de vidrio. Los
extremos del tubo o de las placas se sumergen en un buffer apropiado y luego se aplica el
campo eléctrico para comenzar el proceso separativo. este método da una rápida idea de la
cantidad de componentes que tiene una mezcla biológica.
Isoelectroenfoque
Bioquímica - Electroforesis
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El isoelectroenfoque separa componentes usando un gradiente de pH. El gradiente va desde
un pH bajo en el ánodo hasta un pH alto en el cátodo. Cuando se aplica un campo eléctrico la
muestra migra según su carga hasta que encuentra un pH igual a su punto isoeléctrico, donde
la carga neta es 0 y en consecuencia se detiene. Cuando todos los componentes se detienen
se llega a un estado estacionario. Se usan geles como soporte, lo que minimiza la difusión una
vez que se llega al estado estacionario y el campo eléctrico es eliminado. La clave del método
es lograr un buen gradiente de pH. Se utilizan anfolitos cuyos pI rodean el rango de pH
deseado, p. ej. de 5 a 7. Se utilizan moléculas anfotéricas sintéticas en mezclas complejas.
Estas moléculas migran al aplicarse un campo eléctrico hasta su pI, creando un gradiente de
pH. Los anfolitos pueden ser inmovilizados en el gel dando aún mayor resolución al método. el
aparato es el mismo que se describiera para electroforesis de zona. el poder resolutivo del
método es muy elevado, permitiendo la separación de sustancias que difieran en su pI en
0,001 unidades de pH. Es un método que lleva bastante tiempo, dado que cuanto más se
acercan los componentes a su pI más lentamente migran (poseen menos carga). La aplicación
de voltajes elevados durante largo tiempo requiere refrigeración
Referencias
Alan Townshend, ed., Encyclopedia of Analytical Science, vol. 2, Harcourt Brace and Company,
1995, p. 1041.
Jacqueline Kroschwitz, ed., Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed., John Wiley & Sons,
1994, p. 356.
Jorgenson, J. W. Analytical Chem, 1986, 58, 7, 743A.
Bioquímica - Electroforesis
Soportes
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Agarosa
Los geles de agarosa diluidos son bastante rígidos y fáciles de manejar. Su tamaño de malla
alto hacen que se empleen para separar macromoléculas grandes como proteínas o DNA. Los
geles de poliacrilamida sirven para separar ac. nucleicos de 25 a 2000 bp mientras que los
geles de agarosa pueden separar fragmentos hasta 10 veces más grandes. Así, se pueden
separar DNAs de tamaño desde 1 Kbp a 20 kbp.
El agar se aísla de algas rojas del
género Rhodophycae y consiste en dos
componentes, agarosa y agaropectina.
La agarosa es apropiada para
electroforesis porque es prácticamente
neutra. La cadena se compone de
residuos alternantes de D-galactosa y
3,6-anhidro-L-galactosa, con cadenas
laterales de 6-metil-D-galactosa.
La
agarosa adopta una estructura tridimensional de doble hélice cuya cavidad central es
suficientemente grande como para acomodar agua (hasta un 99.5%). Estas cadenas forman un
gel estable usado como matriz. Al preparar el gel, la agarosa y el buffer se calientan hasta
disolver la agarosa. La solución se vuelca en un contenedor hasta que se enfría y se gelifica.
Luego de cargada la muestra el gel entero se sumerge en una solución buffer y se aplica un
campo eléctrico para realizar la corrida.
enfriado
En solución
Preformado del gel
Agarosa gelificada
Generalmente se usa agarosa al 0.5% a 2% (p/v). La agarosa es muy fácil de trabajar porque
no necesita de un entrecruzante u otros agregados para formar la matriz y es barata. La
electroforesis en agarosa se puede combinar con la transferencia de Southern, PCR, y
fluorescencia.
La introducción de estándares de peso molecular en calles adjuntas a la muestra permite la
estimación del tamaño de los ácidos nucleicos separados.
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Armado del gel de agarosa
Volcado de la agarosa fundidad
Inserción del peine: formación del pocillo
donde se siembra la muestra
Gel listo para sembrar y correr
Esquema de la separación de una
mezcla de ADN en un gel de
agarosa
+
Polo negativo
(ánodo)
ADN grande
ADN pequeño
Polo positivo
(cátodo)
-
Fotografía de una mezcla de ADN
separada en un gel de agarosa. A la
derecha el tamaño de los marcadores
de masa.
Bioquímica - Electroforesis
Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
7
Estos geles separan la mayoría de proteínas y oligonucleótidos de peso menor a aprox. 200
kDa. Están formados por monómeros de acrilamida (CH2=CHCONH2) polimerizados en largas
cadenas por un reactivo entrecruzante (crosslinker) que mantiene la estructura estable. El más
común es la N,N'-metilenbisacrilamida[(CH2CHCONH)2CH2]. Otros reactivos útiles a este fin
son el etilendiacrilato y N,N'-dialiltartardiamida (DATD).
El entrecruzamiento del monómero de acrilamida con el comonómero es lo que determina el
tamaño de poro de la matriz, a través del ajuste del porcentaje de éste en el gel. La
composición del gel puede ser expresada de dos maneras: %T y %T,%C. %T es el porcentaje
en peso de monómero total, acrilamida más el entrecruzante. Un gel al 15% tendrá 15% p/v de
acrilamida más bisacrilamida. Cuanto mayor el porcentaje, menor el tamaño de poro. %T,%C
es una manera de expresar en porcentaje de entrecruzante en relación con el %T. 15%T,
5%Cbis significa que hay un 15% p/v acrilamida más bisacrilamida, y que la bisacrilamida es el
5% del peso total de acrilamida presente. Hay entonces dos maneras de controlar el tamaño de
poro, variando %T o %C. Para cualquier %T, un 5% de entrecruzamiento da el menor tamaño
de poro.
A diferencia de la agarosa, los geles de poliacrilamida requieren aditivos para ayudar a
polimerizar el gel. El persulfato de amonio es un iniciador, y el tetrametilendiamina (TEMED) es
el catalizador de la reacción. El TEMED causa que el persulfato de amonio produzca radicales
libres que a su vez causan la polimerización. La mezcla debería ser desgaseada dado que el
O2 interfiere con la reacción.
Cuanto mayor sea el tamaño de poro, menor resistencia al avance encontrarán las moléculas,
para un mismo tamaño de poro, entonces, migrarán más rápido aquellas moléculas más
pequeñas y/o las más cargadas. es decir, la velocidad de movimiento depende de la relación
carga/masa (q/m). El tipo de gel descripto en las figuras anteriores corresponde al tipo
discontinuo, en el que existen dos tipos de geles, el de concentración y el de separación. El gel
Bioquímica - Electroforesis
de concentración es un gel de malla
abierta, que tiene como finalidad
concentrar la muestra en una banda
angosta antes de que entre en el gel
de separación. Así, el ancho de cada
banda se mantiene en un mínimo y se
optimiza la separación.
Los geles de poliacrilamida pueden
realizarse en condiciones tales que se
conserve la estructura nativa de las
proteínas, denominados geles “nativos”
o
no
desnaturalizantes;
o
en
condiciones desnaturalizantes. en cuyo caso se conoce
como geles con SDS o SDS-PAGE, en alusión al detergente
usado como agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de
sodio. Las diferencias son importantes. En un gel no
desnaturalizante se puede observar a una proteína migrando
con su forma nativa y es importante cuando luego se van a
hacer ensayos de actividad en el mismo gel o luego de eluir
a la proteína que se ha purificado del gel. En ocasiones este
método puede ser
usado con fines preparativos cuando no existen otros
recursos para purificar la proteína. también se puede
estimar la masa nativa de la proteína, pero es un proceso
largo y trabajoso que bien puede ser sustituido por
técnicas cromatográficas. Por otra parte, no puede
usarse a menos que todos las proteínas posean una
relación q/m más o menos parecida. En caso de ser
necesario usar PAGE, se debe correr la muestra junto a
patrones de masa conocida como referencia y esto debe
ser hecho a varias concentraciones de poliacrilamida, lo
que implica correr otros tantos geles. Luego se grafica el
log de Rf de cada estándar contra el porcentaje del gel
obteniendo una pendiente para cada proteína de peso
conocido. El Rf, o relación de frente, es la relación entre
el camino recorrido por la molécula y el frente de solvente
o un soluto (normalmente coloreado para una mejor
visualización) de muy bajo peso molecular. El tamaño de
la proteína se conoce extrapolando el valor obtenido para
la pendiente de la misma en el gráfico B.
8
Bioquímica - Electroforesis
9
22
200
20
A
180
B
18
Ferritina (pend = -18.6)
16
160
14
140
-Pendiente
Log Rf
12
Ovotransferrina (pend = -7.2)
120
100
10
8
6
4
80
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0
13
100
200
300
400
500
600
Masa molec (kDa)
Gel (%)
La electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) es una de las
técnicas más usadas en el laboratorio moderno. El SDS se une a las proteínas a razón de dos
moléculas por aminoácido, desplegando la cadena y confiriéndole una carga negativa que
aumenta proporcionalmente al largo (peso molecular) de la cadena polipeptídica. de esta
manera, la migración depende ya no de la relación q/m sino sólo de la masa, y esta técnica
puede así ser usada ventajosamente para determinar tamaños moleculares de polipéptidos.
resulta necesario además reducir los puentes disulfuro de las proteínas a fin de lograr el
desplegado toral de la cadena. Nuevamente, una vez corrido y teñido el gel se determina la
posición en el gel de cada banda de las proteínas estándar, de la muestra en cuestión y se
calcula el Rf. Finalmente, se grafica el log del peso molecular versus el Rf de cada estándar y
por extrapolación se obtiene el tamaño de la proteína desconocida.
Origen
116
97,4
66
48,5
PM estándar
116
97.4
66
48.5
29
Rf
0.34
0.38
0.46
0.56
0.69
89
68
110
100
90
80
70
60
50
40
30
29
Frente
Bandas
desconocidas
a
b
20
0.40
0.47
10
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Electroforesis en papel
El papel fue uno de los primeros soportes usados en electroforesis. En contraste con los geles,
el papel (p. ej. Whatman 3MM (0.3mm) y Whatman No. 1 (0.17 mm) no requiere preparación. El
papel tampoco tiene cargas que interfieran con la separación de las muestras. La muestra se
aplica directamente al papel. En cada extremo hay una solución buffer a la que se aplica el
campo eléctrico. Se pueden aplicar además moléculas patrón y pigmentos marcadores para
controlar la migración de las muestras. Los mejores resultados se obtienen cuando la dirección
de movimiento de las muestras es paralela al eje de las fibras del papel. El voltaje aplicado es
mayor que en el caso de los geles de acrilamida dado que la resistencia del papel es mayor.
una desventaja es que el tamaño de poro no puede ser fácilmente controlado como en el caso
de los geles, y la técnica es poco sensible y difícil de reproducir.
Bioquímica - Electroforesis
10
Electroforesis capilar
Se emplean tubos capilares de vidrio rellenos con buffer o gel. Los capilares son un medio
apropiado ya que poseen una gran relación de superficie a volumen que permite el uso de
elevados voltajes sin tanto calentamiento como en el caso de las matrices de gel. Sin embargo,
debido al tamaño de los geles existen problemas con la cantidad de muestra a aplicar y los
límites de detección.
En un capilar de 1 mm de diámetro interno, la capacidad es de 0.03 ml/cm de largo de capilar,
y se carga aproximadamente entre 1/100 a 1/1000 de volumen de muestra. Se han diseñado
detectores en línea que detectan cantidades muy pequeñas a medida que la muestra va
corriendo en el gel. Estos detectores emplean conductividad, efectos de Doppler basados en
láser, o lásers que detectan absorbancia o fluorescencia.
La completa eliminación de la muestra luego de la corrida es un problema en esta
electroforesis. Algunos capilares están recubiertos en su superficie interna y otros están llenos
de gel. Debido a su costo, no son descartables y en consecuencia toda la muestra debe ser
eliminada del capilar luego de la corrida. Esto puede ser un problema severo en capilares que
a veces miden hasta 100 cm de longitud y en los que a veces la muestra puede resultar
adsorbida en la superficie interna. El recubrimiento de las superficie con películas especiales
ayuda a resolver este problema al aumentar la velocidad de electroosmosis a lo largo de las
paredes con lo que el tubo se limpia más fácilmente.
La electroforesis capilar se
está volviendo una técnica
ampliamente usada. Las
separaciones son rápidas,
se realizan a alto voltaje y
requieren
una
automatización
mínima.
Esta matriz es ventajosa
además porque evita los
efectos de calentamiento
que pueden ocurrir en geles
y porque los datos están en
forma de un registro, un
perfil en papel en vez de en
un gel teñido. En la figura adjunta se muestra esquemáticamente el diseño básico de la
electroforesis capilar. La muestra se aplica en un extremo del tubo y la aplicación de voltaje
causa la migración de las moléculas, que al ir pasando por un detector envían una señal que se
registra en un trazo luego de ser procesada.
Análisis del gel
Luego de separar una muestra por electroforesis, los compnentes son usualmente invisibles a
simple vista. Se requiere entonces el empleo de técnicas de teñido con colorantes o
autoradiografía para cuantificar los componentes. también se puede realizar densitometría o
transferencia a una membrana.
Teñido
La tinción de proteínas puede realizarse con diferentes reactivos: negro amido (Amido Black),
azul brillante de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue), rojo Ponceau o teñido con plata. El
negro amido y el rojo Ponceau interaccionan con proteínas a las que se pueda acceder
fácilmente, como aquellas que han sido transferidas a una membrana de nitrocelulosa. El azul
de Coomassie y la tinción con plata son ampliamente usados por su reacción con una amplia
gama de proteínas y su alta sensibilidad, mucho mayor que el negro amido (5 veces más para
Bioquímica - Electroforesis
11
Coomassie). La tinción con plata es hasta 100 veces más sensible que la tinción de
Coomassie, pero es un método más laborioso, requiere cuidados especiales y se usa sólo
cuando se requiere un tratamiento especial o la concentración de proteína es muy baja.
Luego del teñido, las bandas pueden ser cuantificadas por densitometría. Se digitaliza la
imagen del gel o se fotografía y luego se analiza con un densitómetro y se procesan los datos
con programas especiales.
La autoradiografía es otra técnica que utiliza la densitometría para cuantificar el contenido de
proteína o ác. nucleicos. Las muestras radiactivas son corridas en el gel. Luego el gel es
secado y puesto en contacto con una película de rayos X. Las bandas radiactivas velan las
porciones de película en contacto con ellas y así el patrón de bandas es visible luego del
revelado.
Transferencia (Blotting)
En las transferencias, las proteínas o ác. nucleicos son transferidos a una membrana. La
transferencia puede ser realizada mediante la aplicación de un campo eléctrico o por difusión
con un buffer.
Estructura básica de una transferencia de Western
Western blotting. En el caso
de proteínas, se usan
membranas de nitrocelulosa
(NC)
o
poliviniliden
difluoruro
(PVDF).
La
transferencia
se
hace
poniendo en contacto el gel
con
la
membrana
y
estableciendo
luego
un
campo eléctrico que haga
migrar la proteína hacia la
membrana. Las proteínas Soporte plástico
quedan así expuestas en la
Panel de
superficie de la membrana,
fibr a Papel
a la que se adsorben muy
de filtr o
fuertemente.
De
esta
Papel
Soporte plástico
manera se puede hacer uso
de
filtr o
Membr ana de
Panel de
de moléculas grandes para
nitr ocelulosa
fibr
a o esponja
Gel
revelar su presencia, como
rígida
anticuerpos. La membrana
Armado del sandwich de transferencia
se incuba con los anticuerpos y la
presencia
de
estos
en
lugares
específicos de la membrana se revela
nitrocelulosa
por diversas técnicas. Por ejemplo, se
fibra
pueden utilizar anticuerpos secundarios,
que reaccionan con los primarios, y que
buffer
soporte plástico
llevan unidas enzimas o proteínas que
se
utilizan en la detección final (por
quimioluminiscencia, fluorescencia o densitometría). Esta técnica permite detectar proteínas
presentes en baja cantidad en una muestra compleja. Puede hacerse cuantitativa y de esa
manera permite estimar el nivel de esa proteína in vivo.
Bioquímica - Electroforesis
12
Armado final del
equipo de
transferencia
6
+
7
8
1. Soporte plástico 2. Membrana 3. Gel 4. Fibra 5. Cuba 6. Electrodos 7. Sandwich armado
en su lugar 8. Alambre de platino del ánodo (existe otro en el lado opuesto, no visible
en esta figura)
Bioquímica - Electroforesis
13
Western blotting - Revelado
Producto coloreado
insoluble
Sustrato incoloro
-P
-P
-P
-P
-P
Pi
Molécula conjugada
Anticuerpo 2rio
Anticuerpo 1rio
Membrana
Proteína
Anticuerpo primario: generado en conejo (IgG) contra la proteína de interés
Anticuerpo secundario: generado en cabra contra IgG de conejo
Molécula conjugada: fosfatasa alcalina. En el ejemplo mostrado hidroliza un sustrato
incoloro fosforilado, que al defosforilarse produce una molécula insoluble coloreada
que precipita sobre la membrana en el lugar en que se encuentra la proteína de interés.
Podría ser otra enzima que actúe sobre otro tipo de sustrato o directamente podría llevar
la señal sobre sí, por ejemplo un compuesto fluorescente.
Western blotting
Gel de policrilamida con
varias bandas de proteína
Membrana con las proteínas electrotransferidas y reveladas con un
anticuerpo específico contra una de ellas
Southern blotting. En la técnica de Southern, la membrana que contiene un ADN transferido se
incuba con RNA o DNA complementario al ADN de interés. La técnica de Northern (Northern
blotting) es similar excepto que la molécula transferida es RNA. La transferencia se realiza
luego de separar la muestra que contiene el DNA por electroforesis, poniendo luego en
contacto el gel con la membrana y estableciendo una corriente de buffer a través del gel y
hacia la membrana que arrastra al ac. nucleico y lo deposita sobre la membrana.
Bioquímica - Electroforesis
14
Membrana
Membrana
transferida
Autoradiografía
Gel
Papel de filtro
Hibridización
Solución alcalina
PAGE
La detección se realiza por hibridización con un fragmento de DNA complementario, es decir
que contiene la secuencia complementaria que le permite establecer interacciones tipo Watson
y Crick. Este fragmento llamado sonda puede ser más corto que el DNA a detectar y puede
estra marcado de diversas maneras de forma de facilotar la detección. Puede contener
nucleótidos marcados radiactivamente, con lo cual será necesario realizar una autoradiografía
(en el caso de la figura que se presenta como ejemplo), o poseer otro tipo de marca, como un
fluoróforo (grupo fluorescente) o una enzima.
Bioquímica - Electroforesis
Enzima o
fluoróforo
15
Sonda
marcada
DNA
transferido
Membrana
Enzima o
fluoróforo
Sonda
marcada
DNA
transferido
Hibridización
Membrana
Sustrato
Producto
SEÑAL
Luz
Fluorescencia
Sonda
marcada
DNA
transferido
Membrana
Revelado