EVALUACIÓN DE CALRETICULINA HUMANA VERSUS

EVALUACIÓN DE CALRETICULINA HUMANA VERSUS
CALRETICULINA RECOMBINANTE DE Trypanosoma cruzi
SOBRE LA REGENERACIÓN ÓSEA EN CONEJOS
J. Ignacio Arias1, Caroll Sepulveda1, Patricia Bravo1, Christopher Hamilton-West1,
Ismael Maldonado2 , Arturo Ferreira2
2
1
Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.
Programa Disciplinario de Inmunología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile, Santiago, Chile.
E-mail: joarias@uchile.cl
Resumen. En ortopedia, el uso de factores que mejoran la formación de tejido de granulación y previenen
o retardan la regeneración de hueso nuevo, a veces es deseable. Calreticulin (CRT), una proteina
luminal del retículo endoplasmático de 46 kDa, ampliamente distribuida en las células eucariotas, está
involucrado en muchas funciones celulares como lo son ser una molécula chaperona que, dentro del
retículo endoplásmico, asegura el correcto plegamiento de proteínas, y además actúa en la regulación
del metabolismo del calcio. Entre ellos, la CRT tiene una influencia importante en la cicatrización de
heridas cutáneas y diversos procesos asociados con la reparación cutánea, la inhibición de la
angiogénesis, la promoción de la adhesión celular, y el efecto antitumoral. Una de las moléculas
involucradas en varios aspectos de la interacción huésped-parásito en infecciones por Trypanosoma
cruzi es calreticulina (TcCRT), la que es altamente homóloga a calreticulina humana (HuCRT). Aquí,
HuCRT y TcCRT recombinante se compararon en su capacidad para afectar la regeneración ósea en
conejos. En términos molares, rTcCRT es tres órdenes de magnitud más eficiente que rHuCRT en su
capacidad de afectar a la normal regeneración de defectos óseos in vivo. En términos molares, rTcCRT
es cuatrocientas veces más eficiente que rHuCRT para producir retardo en la regeneración ósea en
conejos con osteotomías circular de 5 mm en hueso cortical.
Palabras clave: Trypanosoma cruzi, calreticulina, fibroblastos, retardo regeneración
ósea, cicatrización.
1.
INTRODUCCIÓN
En cirugía ortopédica veterinaria, el uso de factores tróficos que favorezcan la
formación de tejido de granulación y eviten o retrasen la formación de nuevo hueso es
deseable en ciertas patologías, como es el caso de radius curvus y la osteoartritis en
displasia de cadera.
El tratamiento quirúrgico de la displasia de cadera severa es la ostectomía de
cabeza y cuello femoral. El éxito de la cirugía se logra mediante la formación de una
pseudoartrosis fibrosa en la articulación coxofemoral (1), por lo tanto en casos como
estos es deseable conseguir una rápida formación de tejido fibroso en la articulación y
limitar la formación de hueso.
En este sentido, se ha estudiado el posible uso de una proteína que entre sus
múltiples funciones favorece la formación de tejido de granulación en piel y además,
inhibe la formación de hueso (2).
Calreticulina (CRT) es una proteína chaperona de 46 kDa, que, dentro del retículo
endoplásmico (RE) asegura el correcto plegamiento de proteínas, y además actúa en la
regulación del metabolismo del calcio. Lo anterior influye en una gran variedad de
funciones celulares.
Se localiza también en la superficie celular y fuera de la célula, regulando así una
variedad de procesos biológicos fuera del RE, emergiendo así como un mediador crítico
de procesos fisiológicos y patológicos, tales como la cicatrización de heridas, la
respuesta inmune, la fibrosis y la angiogénesis (3).
CRT induce experimentalmente la migración concentración-dependiente de
queratinocitos, fibroblastos, macrófagos y monocitos, lo que estimula la cicatrización
fibrosa de heridas y la reepitelización de la piel (4), además de inhibir la formación de
nuevo hueso (2).
El gran interés en ésta molécula, se debe a su descubrimiento en Trypanosoma
cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, ya que, considerando que CRT es una
proteína altamente conservada, varias de las características funcionales descritas para
CRT de T. cruzi (TcCRT) se conservan en distintos grados en la CRT de los
vertebrados, incluyendo la molécula humana (HuCRT) (5).
Es así, como ambas CRTs, poseen propiedades antiangiogénicas dosis dependiente,
aunque la molécula parasitaria muestra mayores efectos que la molécula humana a una
misma concentración (6).
2.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
En cirugía ortopédica los mayores esfuerzos se centran en lograr la regeneración
ósea. Sin embargo, en la ortopedia veterinaria existen algunas técnicas quirúrgicas en
que se requiere justamente lo contrario, es decir, que no se forme nuevo hueso. Para esto
se ha estudiado el uso de factores que favorezcan la formación de tejido de granulación
y eviten o retrasen la formación de nuevo hueso (7).
En este sentido, se ha demostrado mediante modelos de piel in vitro e in vivo que
algunas macromoléculas naturales y sintéticas, inducen y promueven la fibrosis en piel
y la cicatrización de heridas. Este es el caso del factor de crecimiento transformante β
(TGF-β) y el factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), sin embargo, ambos
factores han demostrado tener un efecto indeseable estimulante del crecimiento óseo
(8).
Una molécula que ha demostrado favorecer la formación de tejido de granulación
en piel y además inhibir la formación de hueso es la proteína llamada calreticulina
(CRT) (2).
CRT es una proteína del retículo endoplásmico, ampliamente distribuida en las
células eucariotas. Se encuentra involucrada en muchas funciones celulares, como
chaperona tipo lectina, en el almacenamiento y señalización de Ca2+, en la regulación
de la expresión génica, entre otras (2). Actualmente, se sabe que además de localizarse
al interior de la célula, lo hace también en la superficie celular y en forma extracelular,
regulando así una variedad de procesos biológicos importantes (3).
La CRT se expresa en las células de diferentes mamíferos y sus funciones
extracelulares han sido probadas en diversos estudios in vitro e in vivo, demostrando
que tiene un importante rol en la cicatrización de heridas cutáneas y diversos procesos
asociados con la reparación cutánea (3, 4), en la inhibición de la angiogénesis (6),
promoción de la adhesión celular (2) y también posee un efecto antitumoral (6).
La actividad biológica extracelular de CRT está muy relacionada con la adhesión
celular, la migración celular y la fagocitosis que son aspectos críticos en la reparación
de heridas. Estudios demuestran que CRT induce la migración concentracióndependiente de queratinocitos, fibroblastos, macrófagos y monocitos, estimulando de
esta forma la cicatrización y reepitelización de heridas por medio del aumento de más
del doble de la proliferación celular de cultivos primarios humanos de queratinocitos,
fibroblastos, y células endoteliales microvasculares (4).
También se ha visto, que la CRT aplicada tópicamente aumenta la tasa de
cicatrización de las heridas cutáneas. Las heridas tratadas con CRT muestran una mayor
tasa de epitelización por migración de los queratinocitos y una fuerte inducción de
tejido de granulación (neodermis) producido por un mayor número de fibroblastos en
comparación a los controles en modelos animales porcinos y murinos. Por otra parte, la
CRT in vitro estimula la migración de monocitos y líneas celulares de macrófagos,
explicando el alza de macrófagos tisulares observados en las heridas porcinas tratadas
con CRT en comparación con los controles (3).
La CRT, además inhibe la formación de nuevo hueso, ya que afecta la
diferenciación de condrocitos y osteocitos e inhibe la acumulación de Ca+2 en la matriz
extracelular y la mineralización de neohueso (2).
El creciente interés en ésta molécula, se debe a su descubrimiento en el protozoo
flagelado Trypanosoma cruzi, parásito responsable de la enfermedad de Chagas. A
diferencia de otros tripanosomas de transmisión sanguínea como Leishmania sp. y
Trypanosoma brucei, T. cruzi cicla entre fases extracelulares e intracelulares.
Probablemente, cuando el parásito se encuentra dentro de la célula es menos susceptible
a las drogas y a la respuesta inmune humoral (9).
La identificación de moléculas de T. cruzi implicadas en la modulación inmune y
no inmune de la progresión crónica de esta enfermedad, es importante para comprender
los aspectos biológicos básicos en la interacción hospedero-parásito, y además para
desarrollar posibles intervenciones destinadas a cambiar el equilibrio hacia el beneficio
del hospedero (9).
Una de las moléculas involucradas en varios aspectos de esta interacción
hospedero-parásito es la Calreticulina del parásito (TcCRT). Esta proteína ha sido
reconocida recientemente como una molécula importante que, en virtud de su capacidad
para interactuar con C1 inhibe el sistema del complemento en las primeras etapas de su
activación, así interfiere con la escisión de C4 en C4a y C4b e inhibe la cascada
completa del sistema del complemento (9). Por otro lado, TcCRT interactúa
directamente con las células endoteliales e inhibe la angiogénesis.
Estas dos propiedades aparentemente no relacionadas, pueden haber prevalecido a
favor de ésta molécula prolongando las interacciones hospedero-parásito (9).
Teniendo en cuenta que CRT es una proteína altamente conservada, tanto en su
organización genómica como en la secuencia de aminoácidos a lo largo de la evolución,
varios aspectos funcionales de esta molécula son operativos en una variedad de
vertebrados e invertebrados. Es así, como la calreticulina recombinante de T.cruzi
(rTcCRT) es idéntica aproximadamente en un 50% a su contraparte humana (HuCRT)
(10).
TcCRT, además de localizarse en el retículo endoplásmico, también se expresa en
la membrana celular y fuera de la célula. En base a su capacidad para unirse a la
laminina y para inhibir la proliferación de células endoteliales, tanto HuCRT y TcCRT,
han demostrado poseer propiedades antiangiogénicas dosis dependiente, tanto in vitro e
in vivo (6).
Por otro lado, el papel de la angiogénesis en la progresión de tumores sólidos ha
sido de larga data en una variedad de modelos experimentales. Por ésta razón, un
reciente estudio puso a prueba la capacidad de TcCRT y HuCRT para inhibir in vivo el
crecimiento de un tumor mamario en ratón. El estudio mostró que sólo TcCRT tiene
importantes efectos anti-tumorales. Por otra parte, la molécula del parásito muestra
mayores efectos que la molécula humana a una misma concentración (6).
Los efectos antiangiogénicos de TcCRT pueden estar implicados en los procesos
inflamatorios y antineoplásicos, con beneficios para el parásito en sus interacciones con
el hospedero vertebrado. Estos hallazgos pueden abrir interesantes posibilidades para el
desarrollo de nuevas estrategias antineoplásicas, sobre todo si tenemos en cuenta que la
molécula del parásito presenta efectos antiangiogénicos y antitumorales más fuertes que
su contraparte humana (6, 11).
Con lo expuesto anteriormente y teniendo en cuenta que no existen estudios in vivo
sobre el efecto de CRT en la inducción de tejido de granulación en un ambiente
favorable a la producción de hueso, resulta muy interesante poner a prueba esta
proteína, para comprobar su posible efecto estimulante del proceso de fibrosis en tejido
óseo. Además, es de gran interés comparar la eficiencia de calreticulina recombinante
humana versus la de origen parasitario a diferentes concentraciones.
3.
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1
Obtención de calreticulina
Se utilizó moléculas recombinantes de rTcCRT y rHuCRT sintetizadas y
proporcionadas por el Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (LIAM)
dirigido por el Dr. Arturo Ferreira (Instituto de Cs. Biomédicas, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile).
3.2
Obtención de esponjas de quitosano
Con el fin de controlar la entrega de CRT, ésta fue asociada a una esponja de
polímero biodegradable de quitosano, en una adaptación de lo que se ha utilizado para
otras drogas de liberación controlada (12).
Para obtener las esponjas, se preparó una solución de quitosano al 2% en ácido
acético (5%), luego se le agregó glutaraldehído (0,1% v/v) el que actuó como factor
entrecruzante. La solución fue sumergida en nitrógeno líquido para luego ser sometida a
liofilización. Posteriormente se realizaron enjuagues sucesivos de la esponja con agua
bidestilada, esto con el fin de eliminar el resto de solvente ácido. Finalmente se realizó
una nueva liofilización. Como resultado se obtuvo un material implantable de quitosano
con un trabeculado poroso semejante al de una esponja. La porosidad e
interconectividad de la esponja fueron evaluadas por Microscopía Electrónica de
Barrido con un equipo Tesla BS343A (SEM). La esponja se cortó en trozos de 0,4 cm2,
los que fueron esterilizados en forma individual con óxido de etileno.
3.3
Implantación in vivo de esponja de quitosano con CRTs en ostectomía
circular en conejos
El procedimiento se llevó a cabo en el pabellón quirúrgico para animales
experimentales del Laboratorio de Biomateriales de la Facultad de Cs. Veterinarias y
Pecuarias de la Universidad de Chile.
Los animales fueron preparados prequirúrgicamente con ayuno de 12 horas para
minimizar los requerimientos anestésicos. Luego, en la sala de preparación anestésica,
fueron inducidos mediante anestesia inhalatoria de Isofluorano al 5% hasta lograr
profundidad anestésica, la que fue evaluada mediante la pérdida de reflejo palpebral.
Durante la cirugía, se mantuvo en circuito abierto con isofluorano al 3 a 3,5 % mediante
mascarilla y un litro de oxígeno por hora. Previo a la cirugía, se depilaron ampliamente
las áreas quirúrgicas y fueron desinfectadas con clorhexidina al 2% por 10 minutos.
A cada conejo se le realizó una ostectomía circular de húmero, tibia y fémur en
ambos miembros utilizando un taladro de alta revolución, equipado con una trefina de 5
mm de diámetro externo. Los sitios de la ostectomía fueron la epífisis proximal craneal
del húmero, la superficie cortical medial de la cresta tibial y el cóndilo lateral en la
epífisis distal del fémur. En el sitio de la ostectomía, se implantaron los trozos de 0,4
cm2 de esponja de quitosano cargados con diferentes soluciones de CRT humana o
parasitaria, como lo indica la Tabla 1.
Tabla 1: Ubicación de las osteotomías circulares y su tratamiento
IZQUIERDO
DERECHO
HÚMERO
TcCRT (1 µg/µl)
HuCRT (1µg/µl)
FÉMUR
Sólo esponja
Control negativo
TIBIA
TcCRT (2,5 ng/µl)
HuCRT (2,5 ng/µl)
El cierre de cada incisión se realizaró con patrón subcutáneo simple discontinuo
(4-0 poliglactina 910) y con patrón de piel simple discontinuo (nylon 4-0). Como
manejo posquirúrgico, cada conejo recibió ketoprofeno (1mg/kg cada 24 horas) durante
tres días, enrofloxacino (5mg/kg cada 24 horas) durante cinco días y tramadol (0,2
mg/kg cada 12 horas) durante siete días. Los conejos de cada grupo fueron sacrificados
a una, dos y cuatro semanas post implantación mediante una sobredosis de tiopental
sódico vía intravenosa.
3.4
Evaluación histológica
Los huesos implantados y el control negativo se recuperaron con el tejido
circundante y se fijaron en una solución de formaldehido al 10% durante dos horas.
Posteriormente, el hueso fue cortado con una sierra diamantada, con el fin de obtener
sólo el trozo de hueso que contiene el implante.
Las muestras fueron fijadas en formaldehído al 10% durante una semana y luego
lavadas con agua corriente durante dos días. A continuación, fueron descalcificadas en
Ana Morse (ácido fórmico 10% y citrato de sodio 5%, en proporción 1:1) (13) durante
una semana y luego nuevamente lavadas durante dos días, para luego ser procesadas por
técnica histológica de rutina. Finalmente, se realizaron cortes transversales de 5 μm que
fueron teñidos con hematoxilina-eosina (H&E) y tinción tricrómica de Mallory
Heidenhain.
Cada muestra fue examinada por microscopía óptica para la evaluación histológica
de la respuesta tisular. Se determinó: neoformación de hueso, continuidad de corticales
y presencia de tejido fibroso.
3.5
Análisis histomorfométrico
Bajo microscopio óptico se tomaron fotografías (en magnitud de 40x) a sectores
adyacente de cada muestra histológica teñida con Mallory Heidenhain, las que luego
fueron integradas utilizando el programa Corel® Paint Shop Pro v12 con la finalidad de
obtener una visión completa de la lesión ósea en cada muestra. Posteriormente, y
mediante el mismo programa, se medió la distancia entre ambos extremos óseos, la cual
fue expresada en micrómetros.
3.6
Consideraciones bioéticas
Todos los procedimientos con animales fueron supervisados por personal
veterinario. Además, los procedimientos se realizaron de acuerdo con lo establecido por
la Sociedad Americana para Pruebas y Materiales (ASTM) y la International Guiding
Principles for Biomedical Research Involving Animals. El protocolo experimental para
el uso de los animales que aquí se propone ha sido aprobado por el Comité de Bioética
de la Facultad de Medicina Universidad de Chile.
4.
RESULTADOS
Después de 1 semana, al analizar las microfotografías de los controles negativos
descalcificados teñidos con H&E y Mallory, se pudo observó un cierre parcial de 2 mm
del defecto original. Después de 4 semanas de curación normal de la lesión
experimental de 5 mm de diámetro hecha en las extremidades de conejos, se pudo
observar nuevo tejido óseo rellenando el defecto (Fig. 1; NC).
Tamaño de la Lesión (mm)
Regeneración Ostectomías
Hueso
5
4
NC
3
Ch
2
HuL
1
HuH
TcL
0
1
2
4
TcH
Semanas de tratamiento
Fig. 1 Grafico que representa la progresión de la regeneración de ostectomías corticales de huesos de
conejo a 1, 2 y 4 semanas post cirugía en milímetros (mm). (NC) Control negativo; (Ch) Quitosano;
(HuL) Calreticulina humana en baja dosis; (HuH) Calreticulina humana en alta dosis; (TcL)
Calreticulina parasitaria en baja dosis; (TcL) Calreticulina parasitaria en alta dosis.
Después de 1 semana con la presencia de implantes de quitosano empapados con
dosis elevadas rHuCRT, se puedo observar un cierre mínimo (0,3 mm) del defecto
original. Luego a las 2 semanas, un cierre parcial (± 2,0 mm) del defecto y a las 4
semanas, el defecto no muestra ninguna diferencia apreciable con la semana 2 (Fig. 1;
HuH).
Después de 1 semanas de curación del hueso en la presencia de implantes de
quitosano empapado con dosis bajas de rTcCRT, se observa un cierre mínimo (0,5 mm)
del defecto original, similar a los resultados obtenidos con dosis alta de rHuCRT. A las
2 y 4 semanas se puede evidenciar un cierre similar de ± 1,0 mm del defecto (Fig. 1;
TcL),
Al observar los resultados de lesiones usando sólo esponja de quitosano se
evidencia una reducción paulatina del tamaño original de la ostectomía (5 mm) que va
desde los 4,7 mm la primera semana a los 2,2 mm a las 4 semanas (Fig. 1; Ch).
En conclusión y como ilustra la Figura 1, tanto HuCRT y TcCRT, tienen
propiedades inhibidoras sobre la regeneración del hueso. Sin embargo, CRT de una
especie evolutivamente más primitiva, como lo es el protozoo T. cruzi, muestra ser
notablemente más eficientes en esta función (alrededor de 400 veces más).
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación fue apoyada por los proyectos: 3100021 y 1095095 de
FONDECYT / CONICYT-Chile, PBCT ACT-112, de CONICYT - Chile, y U-Apoya
Línea 1: Ayuda de Viaje de 2011, la Universidad de Chile
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EVALUATION OF HUMAN VERSUS Trypanosoma cruzi
RECOMBINANT CALRETICULIN ON BONE REGENERATION
IN RABBITS
J. Ignacio Arias1, Caroll Sepulveda1, Patricia Bravo1, Christopher Hamilton-West1,
Ismael Maldonado2 , Arturo Ferreira2
1
2
Faculty of Veterinary and Animal Science, University of Chile, Santiago, Chile.
Immunology Disciplinary Program, ICBM, Faculty of Medicine, Universidad de Chile, Santiago, Chile.
E-mail: joarias@uchile.cl
Abstract. In orthopedic practice, the use of growth factors that enhance the formation of granulation
tissue and prevent or retard the regeneration of new bone is sometimes desirable. Calreticulin (CRT), a
luminal protein of the endoplasmic reticulum of 46 kDa that is widely distributed in eukaryotic cells, its
involved in many cellular functions such as to be a chaperone molecule within the endoplasmic reticulum
ensuring the proper folding of proteins, and it is also involved in the regulation of calcium metabolism.
Among the extracellular activities of this protein, CRT has a significant influence on cutaneous wound
healing and various processes associated with skin repair, inhibition of angiogenesis, promoting cell
adhesion, and antitumor effect. One of the molecules involved in various aspects of host-parasite
infection is Trypanosoma cruzi calreticulin (TcCRT), which is highly homologous to human calreticulin
(HuCRT). Here, recombinant TcCRT and HuCRT are compared in their ability to affect the normal
regeneration of bone defects in vivo. In molar terms, rTcCRT is four hundred orders of magnitude more
efficient than rHuCRT to produce inhibition of bone regeneration in rabbits with 5 mm circular
osteotomies of cortical bone.
Key words: Trypanosoma cruzi calreticulin, fibroblasts, delay bone regeneration,
healing.