LAB. BIOLOGIA CELULAR PRACTICA XIII FUNDAMENTO PROTEÍNAS

LAB. BIOLOGIA CELULAR
PRACTICA XIII
PROTEÍNAS
FUNDAMENTO
Las proteínas son compuestas de carbono, oxigeno hidrogeno y nitrógeno. La mayoría de ellas contienen
además azufre, y algunos fósforos. Sus moléculas son de proporciones coloidales, todas son muy complejas
molecularmente y tienen alto peso molecular. La molécula proteica esta compuesta de una combinación de
aminoácidos por condensación. Las pro teosas, peptonas, péptidos y aminoácidos son derivados de las
proteínas formados en síntesis e hidrólisis.
Hay ciertas reacciones coloreadas que dan las proteínas y dependen de los aminoácidos presentes en la
molécula proteica. Todas dan la reacción de BIURET. Esta es debida al grupo NH − CO. Las que contienen
tirosina dan las reacciones Xantoproteica y de Millon, las que contienen triptofano dan la reacción de este
nombre, y las que contienen cistina dan la reacción de la cistina (azufre).
OBJETIVO
Ver la presencia de proteínas y su importancia dentro de los organismos vivos y su mecanismo de acción a
nivel molecular.
GENERALIDADES
Las proteínas Son biomoléculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno.
Pueden además contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros
elementos.
Pueden considerarse polímeros de unas pequeñas moléculas que reciben el nombre de aminoácidos y serían
por tanto la monómera unidad. Los aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídico.
La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido; si la n: de aa. Que forma la molécula no es
mayor de 10, se denomina oligopéptido, si es superior a 10 se llama polipéptido y si la n: es superior a 50 aa.
Se habla ya de proteína.
LOS AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos se caracterizan por poseer un
Grupo carboxilo (−COOH) y un grupo amino (−NH2).
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Las otras dos valencias del carbono se saturan con un átomo de H y con un grupo variable denominado
radical R.
Según éste se distinguen 20 tipos de aminoácidos.
ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS
La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales denominados: estructura
primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria. Cada una de estas estructuras
informa de la disposición de la anterior en el espacio.
ESTRUCTURA PRIMARIA
La estructura primaria es la secuencia de aa. De la proteína. Nos indica qué aas. Componen la cadena
polipeptídica y el orden en que dichos aas. se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia
y de la forma que ésta adopte.
ESTRUCTURA SECUNDARIA
La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el espacio. Los aas., a medida
que van siendo enlazados durante la síntesis de proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces,
adquieren una disposición espacial estable, la estructura secundaria.
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Existen dos tipos de estructura secundaria:
• la a(alfa)−hélice
• la conformación beta
Esta estructura se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la estructura primaria. Se debe a la
formación de enlaces de hidrógeno entre el −C=O de un aminoácido y el −NH− del cuarto aminoácido que le
sigue.
En esta disposición los aas. No forman una hélice sino una cadena en forma de zigzag, denominada
disposición en lámina plegada.
Presentan esta estructura secundaria la queratina de la seda o fibroína.
ESTRUCTURA TERCIARIA
La estructura terciaria informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse
sobre sí misma originando una conformación globular.
En definitiva, es la estructura primaria la que determina cuál será la secundaria y por tanto la terciaria..
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Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así realizar funciones de transporte, enzimáticas,
hormonales, etc.
Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre los radicales R de los
aminoácidos.
Aparecen varios tipos de enlaces:
• el puente disulfuro entre los radicales de aminoácidos que tiene azufre.
• los puentes de hidrógeno
• los puentes eléctricos
• las interacciones hidrófobas.
ESTRUCTURA CUATERNARIA
Esta estructura informa de la unión, mediante enlaces débiles (no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas
con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el
nombre de protómero.
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El número de protómeros varía desde dos como en la hexoquinasa, cuatro como en la hemoglobina, o
muchos como la cápsida del virus de la poliomielitis, que consta de 60 unidades proteícas.
PROPIEDADES DE PROTEINAS
• Especificidad.
La especificidad se refiere a su función; cada una lleva a cabo una determinada función y lo realiza porque
posee una determinada estructura primaria y una conformación espacial propia; por lo que un cambio en la
estructura de la proteína puede significar una pérdida de la función.Además, no todas las proteinas son iguales
en todos los organismos, cada individuo posee proteínas específicas suyas que se ponen de manifiesto en los
procesos de rechazo de órganos transplantados.
• Desnaturalización.
Consiste en la pérdida de la estructura terciaria, por romperse los puentes que forman dicha estructura. Todas
las proteínas desnaturalizadas tienen la misma conformación, muy abierta y con una interacción máxima con
el disolvente, por lo que una proteína soluble en agua cuando se desnaturaliza se hace insoluble en agua y
precipita.
CLASIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Se clasifican en:
• HOLOPROTEÍNAS
Formadas solamente por aminoácidos
• HETEROPROTEÍNAS
Formadas por una fracción proteínica y por un grupo no proteínico, que se denomina "grupo prostético
HOLOPROTEÍNAS
Globulares
• Prolaminas: Zeína (maíza),gliadina (trigo), hordeína (cebada)
• Gluteninas: Glutenina (trigo), orizanina (arroz).
• Albúminas: Seroalbúmina (sangre), ovoalbúmina (huevo), lactoalbúmina
(leche)
• Hormonas: Insulina, hormona del crecimiento, prolactina, tirotropina
• Enzimas: Hidrolasas, Oxidasas, Ligasas, Liasas, Transferasas...etc.
Fibrosas
• Colágenos: en tejidos conjuntivos, cartilaginosos
• Queratinas: En formaciones epidérmicas: pelos, uñas, plumas, cuernos.
• Elastinas: En tendones y vasos sanguíneos
• Fibroínas: En hilos de seda, (arañas, insectos)
HETEROPROTEÍNAS
Glucoproteinas
• Ribonucleasa
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• Mucoproteínas
• Anticuerpos
• Hormona luteinizante
Lipoproteínas
• De alta, baja y muy baja densidad, que transportan lípidos en la
sangre.
Nucleoproteínas
• Nucleosomas de la cromatina
• Ribosomas
Cromoproteínas
• Hemoglobina, hemocianina, mioglobina, que transportan oxígeno
• Citocromos, que transportan electrones
FUNCIONES Y EJEMPLOS DE PROTEÍNAS
• Como las
glucoproteinas
que
forman
parte de
las
membranas.
• Las
histonas
que
forman
parte de
los
cromosomas
Estructural
• El
colágeno,
del tejido
conjuntivo
fibroso.
• La
elastina,
del tejido
conjuntivo
elástico.
• La
queratina
de la
epidermis.
Son las más
numerosas y
especializadas.
Enzimatica Actúan como
biocatalizadores
de las reacciones
químicas
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Hormonal
• Insulina
y
glucagón
• Hormona
del
crecimiento
• Calcitota
• Hormonas
tropas
Defensiva
• Inmunoglobulina
• Trombina
y
fibrinógeno
Transporte
• Hemoglobina
• Hemocianina
• Citocromos
Reserva
• Ovo
albúmina,
de la
clara de
huevo
• Gliadina,
del grano
de trigo
• Lacto
albúmina,
de la
leche
METODO
En las siguientes reacciones puede usarse albúmina desecada preparar una solución de ovo albúmina
agitando una pequeña cantidad de polvo con agua.
• REACCIÓN DE BIURET
• Añadir 10 gotas de solución de hidróxido de sodio y luego UNAS gotas de solución débil 3 gotas de
sulfato de cobre. se produce un color violeta (una reacción similar SE obtiene con el Biuret, sustancia
obtenida calentando la urea de ahí el nombre de esta reacción, pero las proteínas no contienen Biuret.
♦ Ejecutar la prueba de Biuret con una solución acuosa de peptona. Se obtiene un color rosado.
• REACCIÓN XANTOPROTEICA
• Añadir 2 gotas de ácido nítrico a 2ml de albúmina. Se obtiene un precipitado blanco. Calentar. Se
vuelve amarillo enfriar bajo el grifo y añadir exceso de 6−10 gotas de hidróxido de amonio de o.88 %
se vuelve naranja.
• REACCIÓN DE MILLON
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• Añadir 2 gotas de de reactivo de MILLON (es una mezcla de nitrato mercuroso y mercurio en ácido
nítrico). Se obtiene un precipitado blanco. Hervir. Se vuelve rojo.
• REACCIÓN DEL TRIPTOFANO
• Añadir en exceso de ácido acético glacial que ha sido expuesto a luz (y por tanto contiene ácido
glioxilico, del que depende la reacción).
• Luego mediante un tubo de ensaye añadir cuidadosamente sulfúrico concentrado. Se forma un anillo
morado en la superficie de separación (el color del anillo es muy leve, observar cuidadosamente).
• REACCIÓN DE ARGININA
• Añadir 2 gotas de de hidróxido de sodio seguido de unas gotas de alfa−naftol alcohólico y luego unas
3 gotas de hipoclorito de sodio. Se forma un color rojo.
• REACCIÓN DE CISTINA
• Añadir 2 gotas de solución de acetato de plomo. Se obtiene un precipitado. Añadir suficiente solución
de hidróxido de sodio para disolver este y luego hervir. La solución se torna pardo obscura (debido a
la formación de sulfuro de plomo).
• REACCIÓN DE MOLISCH
• Añadir unas gotas de alfa− naftol alcohólico y agitar. Luego echar cuidadosamente con un embudo de
separación (el color del anillo formado es muy leve, observar cuidadosamente). Esta es una reacción
debida a la presencia de un grupo hidrocarbonato en la molécula proteica.
MATERIAL REACTIVOS
Tubos de ensayo Sol. De ovo albúmina
Baño Maria Hidróxido de sodio
Sulfato de cobre 1%
Ac. Nítrico conc.
Hidróxido de amonio de 0.88%
Reactivo de Millón
Ac. Acético glacial
Beta − naftol alcohólico
Hipoclorito de sodio
Acetato de plomo
Ac, sulfúrico conc.
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OBSERVACIONES
• REACCIÓN DE BIURET
La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace
peptídico (− CO− NH −) que se destruye al liberarse los aminoácidos.
Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja
denominada Biuret, de fórmula:
Debido a dicha reacción fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas ovo albúmina
precipito a una coloración violeta. Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva.
A los 2 ml de peptona se le agregaron 2 gotas del reactivo de Biuret
Precipitando a una coloración amarilla la reacción nos torna negativa al no haber presencia de proteínas.
B) REACCIÓN XANTOPROTEICA
Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son
tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con
aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada
la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro.
En el caso de esta reacción nuestro tubo arrojo un precipitado blanco con grumos.
C) REACCIÓN DE MILLON
Los compuestos mercúricos en medio fuertemente nítrico (reactivo de Millon) se condensan con el grupo
fenólico del aminoácido tirosina, formando complejos de color rojizo.
El precipitado se torno blanco lechoso y se separo la parte blanca que dando bajo del tubo y arriba de el
reactivo de Millon.
D) REACCIÓN DEL TRIPTOFANO
El grupo indol del aminoácido triptófano se condensa con el ácido glioxílico del reactivo, formando
compuestos coloreados. El agregado de una pequeña cantidad de ácido sulfúrico concentrado puro, aumenta la
sensibilidad de la reacción.
En este caso el precipitado fue la formación de un anillo color morado en la superficie de separación,
reacción positiva.
E) REACCIÓN DE ARGININA
El grupo guanidino del aminoácido arginina se condensa con el alfa−naftol del reactivo, y luego forma un
complejo coloreado con el hipoclorito de sodio. La reacción nos precipito a un rojo ladrillo. Reacción
positiva.
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F) REACCIÓN DE LA CISTINA
Esta reacción dará positiva con aquellos aminoácidos que presenten azufre en su estructura, como son la
cistina, la cisteina y la metionina. La reacción consiste en someter la muestra a una hidrólisis alcalina con
hidróxido de sodio.
R−SH + 2 NaOH −
R−OH + SNa2 + H2O
De esta manera el sulfuro de sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo
SNa2 + (CH3−COO)2 Pb − 2 CH3−COONa + SPb (precipitado)
Al contacto con el acetato de plomo se forma una precipitación lechosa al agregar hidróxido de sodio la
precipitación formada desaparece. Al contacto del baño Maria la coloración cambia a pardo.
G) REACCIÓN DE MOLISCH
Todos los Glúcidos por acción del ácido sulfúrico concentrado se deshidratan formando compuestos
furfúricos (las pentosas dan furfural y las hexosas dan hidroximetilfurfural). Estos compuestos furfúricos
reaccionan positivamente con el reactivo de Molish (solución alcohólica de alfa−naftol).
Al contacto con la albúmina se obtuvo un precipitado blanco sin juntarse las sustancias al contacto con el
agua caliente empieza a tornarse una coloración amarillo huevo en forma de una bolita amarilla dejamos
en baño Maria hasta lograr el precipitado rojizo reacción positiva.
ESQUEMAS
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CONCLUSIONES
Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas
soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los
700C o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc.
La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes
indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por la destrucción de su estructura terciaria y
cuaternaria.
BIBLIOGRAFÍA
• −Murray, R. Et al (1997): BIOQUIMICA DE HARPER; Editorial El Manual Moderno. México.
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• −Curtís− Barnes (1994): BIOLOGIA. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.
• −De Robertis−Hib (1998): FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR. El ateneo.
Buenos Aires
• −Castro et al (1996): Actualizaciones en Biología. Eudeba. Buenos Aires.
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