Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. 1, 2005. Establecimiento de un protocolo experimental para determinar la adherencia in vitro de lactobacilos a las células intestinales Anaís Prats, Ramón Boucourt* y Luis Ducat.** Centro de Investigaciones Clínicas, Calle 34 No. 4501, esquina a Calle 45, Reparto Kohly, Playa, Ciudad de La Habana. *Departamento de Biotecnología, Subdirección de Fisiología y Bioquímica, Instituto de Ciencia Animal. **Departamento de Compuestos Marcados, Centro de Isótopos, Cuba. Recibido: 30 de enero de 2003. Aceptado: 26 de septiembre de 2003. Palabras clave: lactobacilos, adherencia, probióticos, células intestinales, microorganismos. Key words: lactobacillus, adherence, probiotic, intestinal cells, microorganisms. RESUMEN. El objetivo del presente trabajo fue establecer un protocolo experimental para la determinación de la adherencia in vitro a células intestinales, mediante el uso de aminoácidos marcados con tritio. Se conformaron seis combinaciones a partir de dos medios de cultivo, 3H-alanina y 3H-leucina para el marcaje de los lactobacilos, que sirvieron como punto de partida para un diseño completamente aleatorizado con seis repeticiones para seleccionar la variante óptima. Se estudió la estabilidad del marcaje de los lactobacilos, el efecto de la actividad sobre ellos, así como la influencia del tiempo de incubación a 37 °C sobre su adherencia en una suspensión de células intestinales de cerdos sanos. Se desarrollaron ensayos para determinar la dinámica de supervivencia de las células intestinales de cerdo, en los cuales se alcanzó una satisfactoria supervivencia durante 4 h en estabilizador fosfato a pH = 7,2 y 4 °C . El medio semisintético con 50 µL de 3H-alanina, fue el seleccionado como óptimo para el marcaje del lactobacilo con una adecuada incorporación del isótopo. La liberación de la actividad al medio fue de menos del 2 % en 4 h, sin daños significativos para los lactobacilos con los niveles de actividad utilizados. Se fijó un tiempo de incubación de 20 min para el ensayo de adherencia y se utilizó un método indirecto para su determinación. Los resultados permitieron establecer un protocolo experimental para la valoración de la adherencia de lactobacilos a las células intestinales de cerdos utilizado el método de los indicadores radiactivos. 42 ABSTRACT. The aim of the present work was to establish an experimental protocol for the determination of in vitro adherence by means of tritium-labeled compounds. Six combinations of culture media, 3 H-alanine and 3 H-Leucine were studied for lactobacillus labeling, which were employed as points of a completely randomized experimental design with six repetitions to determine the optimal variant. Stability of the label, the effect of activity levels on lactobacillus viability, as well as the influence of incubation time at 37 °C on labeled lactobacillus adherence to healthy swine intestinal cells were studied. Assays to determine the survivor dynamics of intestinal swine cells were performed. Satisfactory levels of survivor of intestinal cells were achieved for 4 h, in phosphate buffer pH = 7.2 at 4 °C . Semisynthetic media with 50 µL of 3 H-alanine was the optimal for lactobacillus labeling, attaining satisfactory levels of isotope uptake. Less than 2 % of activity within 4 h was delivered to the culture media, without any significant damage to lactobacillus for used activity levels. Incubation time was fixed at 20 min for adherence assay and indirect method was used for its determination. Conclusions: An experimental protocol for the assessment of lactobacillus adherence to intestinal cells using the method of radioactive indicators was established. INTRODUCCION En el mundo se está desarrollando en los últimos tiempos una tendencia a utilizar la terapia natural, como alternativa al uso de los antibióticos. Dentro de este marco se inserta el uso de los probióticos, como una forma de combatir las enfermedades sin introducir ninguna sustancia química que no forme parte normal del intestino. 1 En Cuba, como parte de los esfuerzos por desarrollar esta línea, se está trabajando por primera vez en la obtención y uso de compuestos biológicos con características probióticas para cerdos y aves. La capacidad de un microorganismo de adherirse a las células intestinales, es una característica determinante, para que pueda ser utilizado como probiótico. La determinación de la adherencia a las células intestinales in vitro, resulta una vía adecuada en el proceso de selección de microorganismos potenciales probióticos, como paso previo a las pruebas in vivo.2 Hasta el momento, en el país no estaba establecida ninguna variante segura para lograr este propósito. Contar con una forma segura para determinar la adherencia in vitro, significa un ahorro considerable, pues reduce el número de cepas a probar en los estudios in vivo, con el consiguiente gasto de recursos y tiempo. Para la determinación de la adherencia in vitro, se han empleado técnicas de microscopia, tanto de Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. 1, 2005. contraste de fase3,4 como electrónica,5,6 técnicas de ELISA,7 marcaje de los microorganismos con biotina y compuestos quimioluminiscentes.8,9 Estos procedimientos presentan como desventajas la elevada dependencia de la habilidad del técnico que realice el ensayo; el ser sólo útiles en un reducido número de microorganismos y el efecto dañino del marcaje sobre la célula bacteriana, respectivamente.10 En los últimos años, el marcaje metabólico de las bacterias usando radioisótopos, para determinar el valor absoluto de la adhesión bacteriana a las células, se convirtió en una variante muy útil y popular.10 Su limitación responde a cuestiones de seguridad en el trabajo con radiaciones. Tiene la ventaja que el resultado es independiente del técnico que realice el ensayo. Ibrahim AS y colaboradores11 plantean que para elevadas concentraciones de microorganismos, es preferible emplear esta variante, en lugar de otras que dependan de la apreciación humana. Entre los radionucleidos más empleados para el marcaje de células bacterianas se encuentra el tritio, como radioisótopo del hidrógeno. Su incorporación a una molécula orgánica no altera las propiedades químicas de ésta, por lo que como trazador, su presencia física no varía las características del sistema que se estudia. Los métodos de marcaje radioisotópico de aminoácidos con este radionucleido son ampliamente conocidos, y es posible obtener una elevad actividad específica sin grandes complicaciones desde el punto de vista de la protección radiológica.12 Dentro de los aminoácidos esenciales para los lactobacilos, la leucina y la alanina están entre los de mayores requerimientos para este tipo de microorganismo. 13 El objetivo de este trabajo fue establecer un protocolo experimental para la determinación de la adherencia in vitro de lactobacilos a células intestinales utilizando aminoácidos marcados con tritio. MATERIALES Y METODOS Cepa de lactobacilo utilizada en el estudio Cepa B/103-1-5: Lactobacillus acidophilus (Universidad OLZTYM, Polonia). Esta cepa presenta características de crecimiento, estabilidad adecuada frente a ácidos y bi- lis, que condicionan su potencialidad como probióticos. La cepa fue incubada a 37 °C, temperatura óptima para su crecimiento. Se empleó como inóculo un cultivo con un contenido de lactobacilos de 108 UFC/mL . El volumen utilizado, correspondió a la décima parte del volumen total de medio de cultivo empleado. Marcaje de lactobacilos utilizando aminoácidos tritiados Se conformaron seis combinaciones de medio de cultivo y aminoácidos tritiados: 1. Medio semisintético14 + 25 µL 3Halanina + 25 µL 3H- leucina 2. Medio semisintético14 + 50 µL 3Hleucina 3. Medio semisintético14 + 50 µL 3Halanina 4. Medio Rogosa + 25 µL 3H- alanina + 25 µL 3H- leucina 5. Medio Rogosa + 50 µL 3H- leucina 6. Medio Rogosa + 50 µL 3H- alanina Alanina: actividad específica de 4 662 MBq/mmol (98 % de pureza radioquímica). Leucina: actividad específica de 3 330 MBq/mmol (96 % de pureza radioquímica). Se inoculó un mililitro de cada medio y se incubó durante 18 h a 37 °C . Se centrifugó a 3 700 r/min durante 10 min . Se separó el sobrenadante y el precipitado se lavó con disolución estabilizadora de fosfato (pH = 7,2) y se resuspendió en esta disolución. Se midió la actividad de 5 µL de muestra en 5 mL de líquido de centelleo Scintran (BDH) sobre base dioxano. La determinación se realizó en contador de centelleo líquido durante 60 s . Se empleó un diseño completamente aleatorizado con seis repeticiones por tratamiento. Se realizó un análisis de varianza simple, según la dócima de Duncan, p < 0,05 empleando el programa SPSS V. 5.02 para Windows. Determinación de la liberación de la actividad al medio en el tiempo El pellet del lactobacilo suspendido en estabilizador fosfato fue centrifugado a 3 700 r/min y se midió la actividad del sobrenadante en el tiempo con intervalos de media hora durante 4 h . Efecto de las radiaciones sobre el crecimiento de los lactobacilos Se determinó el valor de densidad óptica como criterio del crecimiento de los lactobacilos desarrollados en medio de cultivo con 0,93; 7,70 y 13,88 MBq de actividad total, producida por los aminoácidos tritiados. Se utilizó como control el crecimiento de los lactobacilos en medio sin radiactividad. Toma de muestras y tratamiento de las células intestinales del cerdo Los animales utilizados fueron cerdos sanos de 10 semanas de edad, que se encontraban en ayuno durante 24 h . El ayuno se llevó a cabo para eliminar restos de alimentos que hacen más difícil la manipulación del tracto digestivo, pero sobre todo, para eliminar los lactobacilos que estuvieran adheridos a las células intestinales, como parte de la flora normal del intestino. El sacrificio se llevó a cabo por conmoción e inmediatamente, se les extrajo el aparato digestivo. El intestino delgado fue abierto con tijeras y lavado con disolución salina fisiológica (NaCl, 0,9 %) para evitar la muerte de las células. Se raspó superficialmente la mucosa intestinal con un portaobjetos en un ángulo de 45 ° y la muestra se suspendió en 50 mL de estabilizador fosfato (pH = 7,2). Todo el trabajo y la transportación de las células se llevó a cabo a 4 °C . La suspensión celular se obtuvo con agitación suave en homogenizador. La obtención de poco material celular por el método utilizado, se compensó centrifugando la suspensión obtenida en condiciones de refrigeración. El número de células se determinó por la técnica para el conteo celular reportada por Bird y Forrester. 15 Se realizó cada dos horas el conteo a la suspensión celular original, mantenida a 4 °C y se determinó la viabilidad (%) en el tiempo. Ensayo de adherencia Se incubaron 500 µL de la suspensión de microorganismos marcados con 3H-alanina en estabilizador fosfato con 500 µL de la suspensión de células a 37 °C . Se probaron tiempos de incubación entre 5 y 30 min, para obtener el óptimo de incubación. Después de centrifugar las muestras a 600 r/min durante 1 min, se midió la actividad del sobrenadante al inicio y al cabo de estos tiempos. Se determinó la disminución de la actividad en el sobrenadante. El porcentaje de microorganismos adheridos fue proporcional a esta disminución de la actividad. 43 Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. 1, 2005. RESULTADOS Y DISCUSION Marcaje de lactobacilos utilizando aminoácidos tritiados Los resultados obtenidos durante el marcaje de los lactobacilos con aminoácidos tritiados permitieron detectar la radioactividad sin una lisis previa de estos (Tabla 1). No se obtuvieron diferencias significativas entre la variante 1 y 3 (p < 0,05), debido a la menor actividad específica alcanzada durante el proceso de marcaje de la leucina-3H respecto a la alanina-3H. Las diferencias entre la utilización de la alanina-3H o la leucina-3H solas, se deben, en primer lugar, a la actividad alcanzada para esta última durante el marcaje, pero además, encuentran explicación en las concentraciones de estos aminoácidos presentes en la pared de estos microorganismos. El contenido de leucina presente en la pared de los lactobacilos, es menor que el de alanina13 y se corresponde con la actividad encontrada para cada uno. Las características de las partículas ß− del tritio permiten afirmar que la radioactividad hallada en los microorganismos, sin previa ruptura de su estructura, corresponde a la parte más externa de estos, pues la pared actúa como blindaje de la actividad contenida en su interior. El comportamiento de las variantes 4, 5 y 6 viene dado, porque en el medio Rogosa, al ser más completo nutricionalmente, se tiene una mayor dilución del isótopo radiactivo, además, el crecimiento es mayor. Utilizar alguna de estas variantes, implicaría trabajar con menores actividades específicas en el resto del ensayo, lo que atentaría contra los niveles de detección en los pasos siguientes del método. El número de conteos obtenidos al medir el pellet de lactobacilos sin lisar, permite que la determinación de la actividad, se lleve a cabo sin ese paso. Si se tiene en cuenta que en este caso, el isótopo está siendo utilizado como señalización para de- tectar la adherencia a las células intestinales, resulta una gran ventaja para el desarrollo de la técnica, el que no haya necesidad de lisar para determinar actividad en el sistema. Los mejores resultados en el marcaje de los lactobacilos, se obtuvieron con las variantes 1 y 3. Desde el punto de vista económico, resulta menos costoso utilizar un solo aminoácido tritiado, por lo que con estas condiciones de actividad de los compuestos tritiados, resulta más factible emplear la variante del medio semisintético con 50 µL de alanina-3H para el marcaje de los lactobacilos. En estos estudios, donde el microorganismo va a hacer la función de sonda, resulta de extraordinaria importancia, garantizar que la marca radiactiva permanezca en él, al menos durante el tiempo que demore el ensayo. Las variaciones de actividad durante los tiempos probados fueron de menos del 2 %, por lo que es posible concluir, que no hay una pérdida considerable de actividad en el pellet de lactobacilos. Conway y col.16 obtuvieron resultados similares para bacterias ácido lácticas marcadas con aminoácidos tritiados en un intervalo de 3 h . No se encontraron afectaciones en la supervivencia de estos lactobacilos frente a los niveles de actividad probados en los experimentos. El resultado obtenido corrobora lo reportado para este género, que los considera como microorganismos muy resistentes a las radiaciones. Se ha reportado que a partir de 2 690 MBq empiezan a morir algunos lactobacilos a las 24 h .17 Este nivel de actividad, se encuentra muy por encima de los alcanzados en este trabajo. Establecimiento de las condiciones para el mantenimiento celular Resulta difícil que las cepas indígenas sean desplazadas de las células por las cepas administradas. Tabla 1 Actividad específica detectada en el pellet de lactobacilo sin lisar. No. 44 Tratamientos Actividad específica (cpm/UFC) · 10-5 1 Medio semisintético + 3H-Ala + 3H-Leu 81,1 ± 2,0 2 Medio semisintético + 3H-Leu 16,1 ± 0,3 3 Medio semisintético + H-Ala 82,6 ± 3,0 4 Medio Rogosa + 3H-Ala + 3H-Leu 9,31 ± 0,20 5 Medio Rogosa + 3H-Leu 1,44 ± 0,05 6 Medio Rogosa + 3H-Ala 9,89 ± 0,08 3 Jonson E y col.18 obtuvieron resultados negativos en las cepas de lactobacilos administradas a cerdos sanos canulados en el intestino, los que fueron atribuidos a la incapacidad de dichas cepas para desplazar a la flora autóctona. Según estos autores en animales con disturbios en la flora intestinal, la situación es diferente.18 El ayuno prolongado provoca estos disturbios y aumenta la probabilidad de que las células colectadas, no tengan ocupados los sitios de adhesión. A 4 °C se han obtenido buenos resultados en el mantenimiento de la viabilidad celular, sobre todo, para trabajar en condiciones que no requieran un mantenimiento celular prolongado.2 Se determinó la supervivencia en el tiempo de las células intestinales a las condiciones de mantenimiento. Dentro de las cuatro primeras horas más del 88 % de ellas se mantienen viables, lo que permite utilizar esta suspensión durante este tiempo sin mayores contratiempos. Determinación de la adherencia del lactobacilo a las células intestinales del cerdo En los diferentes ensayos de determinación de adherencia in vitro, se utilizaron tiempos de incubación entre 5 y 30 min .10 A partir de los resultados obtenidos para estos tiempos, se estableció un tiempo de incubación de 20 min como el más adecuado. En la separación de las bacterias no adheridas de las que sí lo están a las células, se emplea filtración o soporte sólido. En el caso de los ensayos en los que se utilizan suspensiones celulares, la filtración ha sido la variante más utilizada.2 Para hacer efectiva esta separación, se recurrió a la centrifugación. El proceso de centrifugación logra la separación en función de la diferencia en los pesos específicos. La diferencia entre el peso específico de los lactobacilos y las células es grande, lo que en principio haría posible la separación por esta vía. Esta alternativa le imprime mayor dinamismo a la determinación cuando el número de muestras es grande y además, disminuye los costos, pues los filtros adecuados pueden ser utilizados una sola vez. Se estableció que centrifugando a 600 r/min durante un minuto se logra esta separación. Se utilizó un criterio indirecto en la determinación de la adherencia, Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. 1, 2005. a partir de la disminución de la actividad en el sobrenadante. Esta disminución es proporcional a la actividad adherida a las células. Este procedimiento fue utilizado con éxito por Ibrahim y col.,11 al tener dificultades para determinar directamente el número de microorganismos adheridos. Al analizar la cepa B/103-1-5, cuando se determinó la adherencia a las células intestinales del cerdo con las condiciones seleccionadas: tiempo de incubación de 20 min y separación por centrifugación a 600 r/ min durante 1 min, la disminución de la actividad en el sobrenadante fue de un 37 %, proporcional al número de lactobacilos adheridos. De esa forma, puede decirse que esta cepa presenta un 37 % de adherencia de los lactobacilos a las células intestinales. Holzapfel WH y col.19 consideran que aquellas bacterias que presenten una adherencia positiva de, al menos, el 10 %, son las deseadas para los estudios posteriores como probióticos. No es éste el único criterio que existe al respecto, pero sí el más estricto. De acuerdo con este criterio, la cepa de Lactobacillus acidophilus B/103-1-5 se presenta como promisoria para llevar a cabo los estudios in vivo y comprobar así, sus potencialidades como probiótico. Como resultado del presente trabajo, se obtuvo un procedimiento relativamente sencillo que puede ser aplicado para determinar la adherencia in vitro de lactobacilos a las células intestinales. Este método, que no existía con anterioridad en el país, brindaría la posibilidad de probar in vitro las cepas bacterianas, para determinar las de mejores condiciones para los ensayos in vivo como probióticas, lo cual implica ahorro de tiempo y recursos. CONCLUSIONES Los resultados han permitido establecer un protocolo experimental para la valoración de la adherencia in vitro de lactobacilos a las células intestinales de cerdos utilizado el método de los indicadores radiactivos con gran ahorro de tiempo y recursos, a la hora de determinar cepas probióticas. 9. 10. BIBLIOGRAFIA 1. 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