218 Efecto del estado de estrés oxidativo sobre núcleos

Efecto del estado de estrés oxidativo sobre núcleos interpuestos
del cerebelo en ratas
Autores
Leija-Torres L.; Navarrete-Ramos K.; Ruiz Velasco-Leyva D.; Vázquez-Quintana P.; ZúñigaChacón G.
Asesores
Rivas-Arancibia S.; Gallegos-Ríos C.; García-Valdovino V.
Institución
Escuela Tomás Alva Edison
Área
Ciencias Biológicas, Químicas y de la Salud
(Proyecto con apoyo Externo)
Antecedentes
El estado de estrés oxidativo participa en la fisiopatología de diversas enfermedades
neurodegenerativas como Parkinson, Hungtinton, Esclerosis múltiple y Esclerosis lateral
amiotrófica. Este estado se caracteriza por la pérdida de equilibrio entre sistemas prooxidantes y antioxidantes, lo que se traduce en daño y muerte neuronal. Para detectar el
daño causado por el estrés oxidativo, existen proteínas dentro de la célula de las cuales se
conoce su función específica, como Citocromo C, Neu-N, Doble Cortina y GFAP; éstas que
ayudan a detectar el grado de neurodegeneración causado por este estado.
Por otro lado, los núcleos interpuestos del cerebelo son los encargados de la coordinación y
afinación de la actividad motriz.
Objetivos



Conocer el proceso de neurodegeneración en los núcleos interpuestos cerebelares,
mediante el estudio de la pérdida de morfología celular como consecuencia del
estrés oxidativo.
Cuantificar la muerte neuronal durante el desarrollo de dicho proceso.
Conocer la presencia y concentraciones de ciertas proteínas asociadas a la muerte
celular por estrés oxidativo en el cerebelo de ratas.
Marco Teórico
Al cerebro se le puede dividir en dos hemisferios: derecho e izquierdo. Cada uno de los
hemisferios posee áreas de especialización diferentes, pero ambos se encuentran
relacionados mediante el cuerpo calloso. Al mismo tiempo, también se le puede dividir en
corteza cerebral y la subcorteza, la cual está formada por el tallo cerebral dónde se ubica el
cerebelo.
El cerebelo se relaciona con la postura, tono muscular, coordinación, equilibrio,
control de movimientos oculares y finos, y está encargado del movimiento voluntario y del
buen funcionamiento de los sistemas motores. En caso de lesión en cerebelo, hay pérdida
de precisión espacial y coordinación del movimiento, falta de equilibrio, reducción de tono
muscular y trastornos de aprendizaje motor. (Eccles y Szentagothai, 1967).
Por otro lado, se puede decir que el cerebelo se compone de:
• Una capa exterior o corteza cerebelosa que está cubierta por la sustancia gris (axones
no mielinizados).
• Sustancia blanca interna (axones cubiertos por una capa de mielina).
• 3 pares de núcleos:
1) Fastigial
2) Interpuesto (compuesto por dos núcleos: el globoso y el emboliforme)
3) Dentado
Existen enfermedades relacionadas con la pérdida parcial o total de las funciones de
las neuronas. Éstas son llamadas enfermedades neurodegenerativas, y ocurren cuando
existe una mutación genética, o bien, también pueden tener una índole hereditaria, como el
Huntington. Dichas enfermedades provocan el deterioro de actividades como el equilibrio, el
habla, la respiración, etc., afectando estructuras y zonas específicas del sistema nervioso
central. (Schüssel, 2004, p. 3 – 5). El estrés oxidativo juega un papel importante en el
proceso normal de envejecimiento así como en la fisiopatología de muchas enfermedades
neuro- degenerativas
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y las especies reactivas de nitrógeno
(RNS), dependiendo del balance de óxido-reducción del organismo, pueden desempeñar un
doble papel en el proceso de estrés oxidativo, pues durante el equilibrio redox, sirven como
señalizadores para muchas funciones fisiológicas. Sin embargo, durante un estado de estrés
oxidativo crónico, inducen daño y muerte celular. La sobreproducción de ROS puede ser
compensado por las defensas antioxidantes del organismo y de esta manera mantener el
equilibrio redox. Cuando este mecanismo falla, se genera un estado de estrés oxidativo, el
cual se vuelve crónico e irreversible, ya que los sistemas antioxidantes se encuentran en
bajas cantidades o están ausentes.
Metodología
En el laboratorio de Estrés Oxidativo y Plasticidad cerebral, de la Facultad de Medicina de la
UNAM, se trabajó con cincuenta ratas Wistar macho adultas. Éstas fueron separadas en 6
grupos y expuestas crónicamente a bajas dosis de ozono durante 4 horas diarias por
periodos de: 7, 15, 30, 60 y 90 días; el grupo control fue expuesto a aire libre de ozono. Una
vez terminado el tratamiento, las ratas fueron anestesiadas profundamente, y perfundidas
para poder realizar técnicas inmunohistoquímicas (técnicas de tinción de tejidos). Los
cerebros fueron incluidos en parafina y se hicieron cortes transversales de 5 micras de
grosor con un micrótomo. En las técnicas se utilizaron anticuerpos que expresaron las
siguientes proteínas: Citocromo C, Doble cortina, Neu-N, y GFAP.
Resultados
 Citocromo C
 Doble cortina
Días de
tratamiento
7
días
15
días
30
días
60
días
90
días
Días de
tratamiento
Control
15 días
30 días
60 días
Promedio
de células
marcadas
4.6
6
10.75
8
2.5
Promedio
de células
marcadas
10
7.6
16.75
4
 Neu-N
Días de
tratamiento
Promedio de
células
Control
7 días
15
días
30
días
60
días
90
días
15.6
10.6
12
8
6.7
5
 GFAP
Días de
tratamiento
Promedio de
células
marcadas
Control
15 días
30 días
60 días
90 días
24.25
28.33
35.75
26.66
15.25
Las gráficas, así como las fotografías respectivas de cada marcador, se encuentran en la
sección de Anexos.
Análisis y discusión de Resultados
En la Gráfica 1, correspondiente al anticuerpo Citocromo C, se observa un aumento en el
promedio de células marcadas, alcanzando su punto máximo a los 30 días de exposición a
ozono. A partir de éste último punto, desciende considerablemente la expresión de
Citocromo C, hasta su punto más bajo, a los 90 días. Esto significa una respuesta celular
inflamatoria en la fase inicial del estado de estrés oxidativo, un déficit en la producción de
ATP celular, indicándonos muerte celular programada en los núcleos interpuestos
cerebelares. Al no haber células sanas en los núcleos, y lo que es más, al morir éstas, no se
desarrollan correctamente las funciones de los núcleos interpuestos, hay una deficiencia en
las aferencias procedentes del lóbulo frontal del cerebro, fisiológicamente de importancia
motora. La muerte celular, principalmente neuronal, la podemos correlacionar gracias a la
evidencia que nos proporciona la gráfica de Neu-N. Durante la primera fase del estado de
estrés oxidativo se mantiene relativamente la cantidad de neuronas, y a partir de los 30 días,
hay un declive constante de las mismas. Lo anterior se correlaciona de igual forma a los
resultados mostrados por GFAP donde se indica que a los 30 días hay una sobre expresión
de la proteína glial, dado que los astrocitos buscan reparar el daño neuronal producido por
el estado de estrés oxidativo, pero que resulta insuficiente, pues como todas las gráficas lo
indican, siempre hay disminución de células en el tratamiento más prolongado, pues éstas
ya han sido fagocitadas por la microglía, que finalmente disminuye también como lo indica
GFAP.
Conclusiones:
El estrés oxidativo resulta crucial en el proceso neurodegenerativo de los núcleos
interpuestos, el cual se caracteriza tanto por la muerte neuronal y glial, como por la
incapacidad de los mecanismos de reparación celular para generar nuevas células. Aunado
a lo anterior, se concluye que el organismo no produce los suficientes antioxidantes para
contrarrestar el daño causado por los radicales libres; sin embargo, la contaminación
ambiental, representada por el ozono, juega un papel fundamental, ya que como vemos en
los resultados, afecta considerablemente a la regeneración neuronal y glial.
Bibliografía:
•
Rivas Arancibia, S. (2010). “Oxidative Stress Caused by Ozone Exposure Induces
Loss of Brain Repair in the Hippocampus of Adult Rats” en Toxicological sciences.
Oxford.
•
Ischiropoulos, H., Beckman, J. (2003). Oxidative stress and nitration in
neurodegeneration: cause, effect or asociation? J. Clin. Invest. s/d.
•
Mansilla, A. (2010). Teorías neurocientíficas: del átomo a la molécula y de la
molécula a la función. México: El sevier.
Anexos
El eje de las ordenadas muestra el número de núcleo de células marcadas por
campo y el eje de las coordenadas muestra los tratamientos donde 7, 15, 30, 60 y 90
son los días en que los animales fueron expuestos a ozono, el grupo control fue
expuesto a aire libre de ozono.

Citocromo C:
Gráfica 1. Efecto de la exposición a ozono sobre la expresión de Citocromo C
traslocado al núcleo de la célula para marcar muerte celular en los núcleos
interpuestos del cerebelo.
Nº de células inmunoreactivas
a Citocromo C
Citocromo C
12
10
8
6
4
2
0
7d
15d
30d
60d
90d
Tratamientos de exposición a ozono (días)
7 días
15 días
60 días
30 días
90 días
 Neu-N
Nº de céulas inmunoreactivas
a Neu-N
Gráfica 2. Efecto de la exposición crónica a ozono sobre la expresión de la proteína
nuclear Neu-N, la cual es específica para marcar núcleos neuronales.
Neu-N
20
15
10
5
0
control
7d
15d
30d
60d
90d
Tratamientos de exposición a ozono (días)
Nótese los cambios en la expresión de Neu-N en los diferentes tratamientos, donde
podemos observar una disminución progresiva de las neuronas a medida que
aumenta el tiempo de exposición a ozono en los núcleos interpuestos.
Control
7 días
15 días
30 días
60 días
90 días
 Doble cortina:
Gráfica 3. Efecto de la exposición crónica a ozono sobre la expresión de la proteína
microtubular doble cortina, la cual es específica para marcar neuroblastos.
Nº de células inmunoreactivas
a Doble Cortina
Doble Cortina
20
15
10
5
0
Control
15d
30d
60d
Tratamientos de exposición a ozono (días)
Nótese los cambios en la expresión de Doble Cortina en los diferentes tratamientos,
donde podemos observar una disminución progresiva de las neuronas a medida que
aumenta el tiempo de exposición a ozono en los núcleos interpuestos.
Control
30 días
15 días
60 días
 GFAP
Gráfica 4. Efecto de la exposición a ozono sobre la expresión de GFAP, la cual es
específica para marcar en la glía de los núcleos interpuestos de cerebelo,
particularmente astrocitos.
Nº de células inmunoreactivas a
GFAP
GFAP
40
30
20
10
GFAP
0
control
7d
30d
60d
90d
Tratamientos de exposición a ozono (días)
Nótese los cambios en la expresión de GFAP en los diferentes tratamientos, donde
podemos observar un aumento desde el grupo control hasta el grupo de 30 días, y
una disminución a partir de dicho punto a medida que aumenta el tiempo de
exposición a ozono en los núcleos interpuestos.
Control
7 días
30 días
60 días
90 días