VPH y cáncer de cérvix en Asturias

“VPH y CÁNCER DE CÉRVIX
EN ASTURIAS”
Dra. Cristina Pérez Menéndez
Avilés, Octubre 2011
Introducción
Cáncer de cuello uterino - Epidemiología
2º cáncer + común en mujer a nivel mundial.
Causa principal de muerte a mediana edad en
la mayoría de los países en desarrollo.
Incidencia global:
- 11,3/100.000 en países más desarrollados.
- 18,7/100.000 en países en desarrollo.
- 44,3/100.000 en África.
 493.243 casos por año
 En Europa es el 7º cáncer más común entre las mujeres y el 3º entre aquellas con una
edad comprendida entre los 15 y 44 años.
Introducción
Cáncer de cuello uterino- Epidemiología
Incidencia en España:
Mortalidad en España:
11º cáncer más común entre las mujeres.
 15º cáncer por mortalidad.
 2.103 casos por año
 739 fallecen
WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer (HPV Information Centre). Human Papillomavirus and Related Cancers in Spain. Summary
Report 2010. Date accesed October 2011. Available at www.who.int/hpvcentre.
Introducción
Cáncer de cérvix en España
Asturias
Navarra
Zaragoza
Girona
Incidencia Asturias
año 2000:
11,6/100.000
Tarragona
Mallorca
Cuenca
Albacete
Periodo 1993-1997:
Murcia
Granada
Islas Canarias
Mallorca
Tarragona
Asturias
Islas Canarias
Murcia
Girona
Granada
Zaragoza
Albacete
Navarra
Cuenca
12.05
9.03
8.11
7.94
7.39
7.38
6.13
5.58
5.36
3.74
3.36
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
Introducción
VPH y Cáncer cervical
Estudios de epidemiología apoyados por técnicas moleculares, identificaron la infección
por ciertos tipos de virus del papiloma humano (VPH) como “causa necesaria" para el
desarrollo de cáncer cervical.
Infección más frecuente de todas las enfermedades de transmisión sexual.
Virus del papiloma humano inductor de la carcinogénesis.
El cáncer cervical sólo se desarrollará si existe una presencia persistente del ADN de
VPH.
Introducción
Virus del papiloma humano (VPH)
Más 200 tipos ≠
118 aislados y caracterizados.
40 tipos de VPH afectan al tracto genital.
Clasificación Epidemiológica de los VPH ANOGENITALES:
VPH AR
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59
VPH BR
6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108
VPH probable AR
26, 53, 66, 68, 73, 82
AR: Alto Riesgo; BR: Bajo Riesgo.
. Datos de Muñoz N y cols. HPV in the etiology of human cancer. Vaccine 2006;24:1-10
Cáncer cervical
VPH AR
95% casos
16
50%-60%
18
10-12%
45
5%
31
4%
Introducción
VPH: Estructura
Familia Papillomaviridae
Partículas víricas proteínicas sin envoltura
Ø de 55-60nm
Cápside viral de 72 capsómeros ordenados en icosaedro
Introducción
VPH: Estructura
ADN de doble cadena circular de 7900 pb
E1, E2, E4 y E5: Reproducción virus y contagiosidad.
E6 y E7: Proceso de oncogénesis (“transformación”). Diferentes según los diferentes tipos virales.
L1-L2: Proteínas mayor y menor de la cápside. Región de mayor conservación génica. Inmunogénicos. Vacunas profilácticas.
LCR (Región no codificante): Elementos reguladores.
Introducción
Diagnóstico molecular del VPH
¿Por qué un diagnóstico molecular?
Los modelos de cultivo in vitro son poco adecuados y costosos y los anticuerpos
carecen de valor diagnóstico.
Significado del genotipo en el pronóstico de la infección:
Está demostrado que existen genotipos con una mayor capacidad de establecer
lesiones crónicas y cáncer.
ADN-VPH EN
CÁNCER
CERVICAL
30%-60%
75%
95%
99%
SENSIBILIDAD
-
+
SOUTHERN
TESTS PARA
LA DETECCIÓN
DE ADN-VPH
FISH
TS.PCR; L1.PCR
HC I
GP.PCR
HC II
HC III
realtime-PCR
1980
1990
2000
Bosch et al. J Clin Pathol 2002; 55: 244-65.
Introducción
Técnicas de detección de ADN de VPH
Técnicas de Biología Molecular para la detección de ADN de VPH en muestras FFPE:
-Hybridación in situ
-PCR es la técnica molecular más sensible
E2
E6
E7
E1
E5
L1
L2
E4
1
2
3
4
5
6
7
7,9 kb
primers “degenerados”
CGTCCMARRGGAWACTGATC
MY09/11 PGMY
GCMCAGGGWCATAAYAATGG
GP5+/6+
AMPLICOR® ROCHE
SPF10
450 bp
150 bp
170 bp
65 bp
Introducción
Técnicas de detección de ADN de VPH
PCR
Primers
de consenso
GP5+/6+
PGMY
SPF10
MY09/11
primers
específicos
Hibridación reversa
RFLP
Array
PCR en tiempo real
Secuenciación
Objetivo
Objetivo
Objetivo principal:
o Comparar los resultados de dos sistemas de genotipado del ADN de VPH basados en
PCR, para poder determinar cual presenta mayor sensibilidad y especificidad en el
análisis de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE).
Material y Métodos
Metodología
Diseño de la muestra:
-Estudio retrospectivo de casos consecutivos de CCI, diagnosticados mediante biopsia
desde Enero de 1998 hasta Diciembre del 2007.
-Servicios de Anatomía Patológica de todas las Áreas Sanitarias de Asturias (8 Áreas):
San Agustín de Avilés, HUCA, Jove, Cabueñes, Mieres, Riaño, Jarrio, Cangas de Narcea y
Arriondas.
-235 biopsias con diagnóstico histopatológico de CCI, fijadas en formol e incluidas en
parafina.
-Las Hematoxilinas fueron re-evaluadas.
-Estudio aprobado por el Comité Ético del HUCA.
Resultados y Discusión
1er Estudio de estas características en casos de CCI en Asturias:
Nº Importante de muestras: 235 casos de CCI
Técnicas de detección viral altamente sensible
Marco Internacional de investigación: Retrospective International Survey of Human
Papillomavirus Types in Cervical Cancer (RIS HPVTT).
Material y Métodos
Metodología
SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).
Técnica
Sandwich
Material y Métodos
Metodología
SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).
Técnica Sandwich
Material y Métodos
Metodología
SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).
SPF10 PCR
Técnica
Sandwich
Material y Métodos
Metodología
SPF10 PCR
SPF10
Molijn A y cols. J Clin Virol 2005;32:43-51.
 Control positivo:
 Controles negativos:
HeLA
Parafina blanco
Mix PCR sin muestra
 Lesión no dependiente de VPH
Material y Métodos
Metodología
SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).
Técnica
Sandwich
Enzyme Inmuno Assay
DNADNA
Enzyme
Inmuno Assay
-54 Genotipos VPH:
AR, PAR,BR.
-25 Genotipos VPH:
AR, PAR, BR.
-No diferencia
VPH 68/73
- DO 450
LiPA25
LiPA
25
Material y Métodos
Metodología
SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).
Técnica
Sandwich
-globina (-) y VPH(-)
Muestras descartadas
del estudio
Material y Metodos
Metodología
PCR más hibridación en microarray
- 35 genotipos de VPH : AR, PAR, BR.
Biopsia
Extracción de ADN
AmplificaciónADN
ADN
Amplificación
HibridaciónEspecífica
Específica
Hibridación
MY09/11
Molijn A y cols. J Clin Virol 2005;32:43-51.
 Controles de calidad internos:
Control de ADN de la muestra: gen humano CFTR de 892 pb
Control de la reacción de la amplificación: Plásmido de 1200pb
Interpretación
Interpretación
Resultados y Discusión
Concordancia de la positividad a ADN de VPH
Microarray
LiPA
Positivas Negativas
Nº Total de
muestras
Concordancia de detección del VPH del 77,8%.
Positivas
160*
6
166
Índice de Kappa: 0, 24
Negativas
43
12
55
Concordancia baja
Nº Total de
muestras
203
18
221
*3 casos MicroArray y LiPA positivos son : VPH 61 por Microarray.
Diferencias estadísticamente significativas
p <0,05
De las 221 muestras que conforman el estudio 160 resultaron positivas con ambas técnicas.
Prevalencia del VPH para LiPA:
Prevalencia del VPH para Microarray:
(166/221) 91,9 %
(203/221) 75,1 %
Resultados y Discusión
Concordancia de la positividad a ADN de VPH
Las muestras fijadas en formol e incluidas en parafina pueden tener el ADN dañado1,2,3.
Frecuencias de casos positivos de VPH relativamente bajos en estos tejidos al utilizar los
cebadores consenso MY09/112,4
Amplifican segmentos relativamente largos en muestras con el ADN dañado.
La eficacia de la PCR decrece con el incremento del tamaño del fragmento a amplificar, ya que la
fijación en parafina dificulta una amplificación de secuencias mayores de 200pb 2,5
Las técnicas que amplifican pequeños fragmentos de ADN de VPH mayor sensibilidad
con especímenes degradados
menos resultados falsos negativos6.
1- Kleter B y cols.Am J Pathol 1998; 153:1731-9;2-Biedermann K y cols.J Clin Mirobiol 2004;42:3758-65;3-Greer C y cols.Clinical Pathol 1991;95:117-24;
4-Baay MFD y cols.J Clin Microbiol 1996;34:745-47;5- Karlsen F y cols.Lab Invest 1994:71-604-11.6- IARC Handbooks on cancer prevention,IARC Press;
2005.
Resultados y Discusión
Concordancia tipo específica
Concordancia tipo específica en los casos positivos para al menos una técnica:
Concordancia total
N
88
%
42,1
Concordancia parcial
59
28,2
Discordante
62
29,7
Total
209
100,0
-”Concordancia total”: Ambas técnicas detectan el mismo/mismos tipos virales en una muestra determinada.
-”Concordancia parcial”: La concordancia no es total, pero ambas técnicas detectan al menos un mismo tipo
de virus
-”Discordante”: Cuando los tipos detectados con cada técnica no coinciden.
Resultados y Discusión
Concordancia tipo específica
DISCORDANTES
(N=62)
43
6
N
16
5
4
4
3
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
MICROARRAY
LiPA
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
16
18
52
16 y 83
18y61
16
16
16
16
16
61
58
61
61
16 y 58
16y61
6y31
33y59
16
45
18
33
31
39
52
51
35
x
16y18
68o73
16y52
11y39
35,68o73
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
52
33
x
68o73
45
16
56
31
18,52y68o73
45
18
16
35
CONCORDANTES
PARCIAL (N=59)
N
10
5
5
4
3
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
MICROARRAY
16y61
16y18
16y58
16y84
16y53
11y16
16y33
16
16
16
16
16
16
18
45
11,16
16y33
16y35
16y35
16y39
16y45
16y45
16y51
16y59
16y66
18y58
33y58
35y58
33y58
45y61
58y66
11,16,81
16,58 y 61
11,18,58y61
18,33 y 61
LiPA
16
16
16
16
16
16
33
16y51
16y45
16y52
16y53
16y56
16y33
18y52
35y45
11,16 y35
16
16
35
39
16
45
16
59
16
18
33
35
58
16y45
16y58
16
16
18
16y33
Resultados y Discusión
Concordancia tipo específica
Se observan diferencias en los genotipos de VPH:
- Diseño de los cebadores MY09/11
consenso degenerados
amplifica amplio espectro
de genotipos de VPH pero con varios niveles de sensibilidad entre ellos1, podría dar falsos
negativos para ciertos tipos virales por su menor sensibilidad2.
- Diseño de los cebadores SPF
de determinados VPH3.
consenso no degenerados
más sensible en la detección
Detectan fragmentos más pequeños de la región L1 viral,
detección ultrasensible de un ancho espectro de genotipos VPH aunque tengan baja carga
viral3,4.
1- Gravitt PE. y cols. J Clin Microbiol 2000;38:357-61; 2- Depuydt CE y cols. J Cell Mol Med 2007;11:881-91; 3- Kleter B y cols. Am J Pathol 1998;
153:1731-9; 4- Kleter B y cols. J Clin Mirobiol 1999; 37:2508-17;
Resultados y Discusión
Concordancia de detección de infecciones múltiples
Microarray detecta un 35% de infecciones múltiples (58/166 muestras positivas por Microarray)
LiPA detecta un 8,9% de infecciones múltiples (18/203 muestras positivas por LiPA)
Índice de concordancia para la detección de infecciones simples o múltiples: se consideran
sólo las muestras positivas para ambas técnicas (N=160).
LiPA
MICROARRAY
Infección
Simple
Nº Total de
Infección Múltiple muestras
Infección Simple
95
9
104
Infección Múltiple
51*
5
56
Nº Total de
muestras
146
14
160
*10 casos Microarray VPH 16 y 61- LiPA VPH 16
4 casos Microarray VPH 16 y 84- LiPA VPH 16
Concordancia 62,5%
Índice de Kappa: 0,003
Concordancia insignificante
Diferencia No significativa p › 0,05
Resultados y Discusión
Concordancia de detección de infecciones múltiples
22 % de los muestras tanto precancerosas como frescas no parafinadas con Microarray1.
4.4% en parafinadas con SPF10 PCR-LiPA252
- Diseño de los cebadores MY09/11
consenso degenerados
detecta amplio espectro
de genotipos de VPH pero cadecen de alta especificidad en la detección de los mismos.
Reacción cruzada de los cebadores3.
Tras consultar la bibliografía se podría decir, que este es el primer gran estudio
comparativo entre ambas técnicas para muestras parafinadas.
-La dificultad de la realización de la técnica es similar para ambos métodos, siendo la
interpretación de los resultados más sencilla con el Microarray.
-El riesgo de contaminación es alto para ambas técnicas al estar basadas en PCR.
1- Gomez-Roman JJ y cols. APMIS 2009;117:22-7. 2- Kleter B y cols. J Clin Microbiol 1999;37:2508-17. 3- Gravitt PE. y cols. J Clin Microbiol
2000;38:357-61.
Conclusiones
Conclusiones
En nuestras muestras de archivo, fijadas en formol e incluidas en parafina, se ha
demostrado que la técnica LiPA tiene un 20% más de sensibilidad para la detección
del ADN de VPH que la técnica basada en Microarays.
El uso de la técnica basada en microarrays, con material parafinado, no aporta un grado
de sensibilidad suficiente para considerarlo una técnica útil cuando se utiliza este
tipo de material. Es posible que su menor sensibilidad sea debida a que los
cebadores utilizados amplifiquen una región genómica demasiado larga al tratarse
de muestras con el ADN probablemente dañado.
La técnica basada en microarrays detecta un mayor porcentaje de infecciones múltiples
que LiPA, posiblemente debido al diseño de sus cebadores degenerados, lo que
permite detectar un amplio espectro de genotipos de VPH, sin embargo carecen de
una alta especificidad en la detección de los mismos.
“Muchas gracias por su atención”