tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)

CAPÍTULO 2.3.15.
TRIPANOSOMOSIS
(TRANSMITIDA POR LA MOSCA TSE—TSÉ)
RESUMEN
La tripanosomosis1 transmitida por la mosca tse–tsé es una enfermedad compleja producida por
varias especies de protozoos parásitos del género Trypanosoma, transmitida cíclicamente por el
género Glossina (mosca tse–tsé). Esta enfermedad puede afectar a varias especies de mamíferos
pero, desde el punto de vista económico, la tripanosomosis trasmitida por la mosca tse–tsé, es
especialmente importante en el ganado vacuno. Está producida principalmente por Trypanosoma
congolense, T. vivax y, en menor medida, por T. brucei brucei.
Identificación del agente: Se pueden utilizar varias técnicas de detección de parásitos,
incluyendo el examen microscópico de extensiones gruesas o finas de sangre fresca y teñida. La
sensibilidad diagnóstica aumenta de forma significativa concentrando los parásitos antes de
examinarlos, en combinación con el uso de un microscopio de contraste de fases o de campo
oscuro. Las técnicas de concentración de parásitos tienen la ventaja añadida de que el
hematocrito, y por tanto el nivel de anemia, se puede determinar a nivel de animales individuales
y/o a nivel de manada. Una prueba muy sensible, utilizada sobre bases más experimentales, es la
reacción en cadena de la polimerasa.
Pruebas serológicas: Dos pruebas de detección de anticuerpos tripanosomiales, la prueba de
inmunofluorescencia indirecta y la detección de anticuerpos por enzimoinmunoensayo (ELISA), se
utilizan de manera rutinaria para la detección de anticuerpos en el ganado bovino. Presentan una
alta sensibilidad y especificidad pero sólo se pueden utilizar para el diagnóstico preliminar de la
tripanosomosis. En particular, el ELISA para detección de anticuerpos, se presta a la
automatización y permite un alto grado de estandarización cuando se han desarrollado y validado
antígenos recombinantes.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En la actualidad no se utilizan
productos biológicos.
A. INTRODUCCIÓN
La tripanosomosis transmitida por la mosca tse–tsé es una enfermedad compleja producida por varias
especies de protozoos parásitos del género Trypanosoma, transmitida cíclicamente por el género Glossina
(mosca tse–tsé). La mosca tse–tsé ocupa 10 millones de kilómetros cuadrados y afecta a 37 países,
fundamentalmente en África. La enfermedad afecta a varias especies de mamíferos pero, desde el punto de vista
económico, la tripanosomosis transmitida por la tse–tsé es particularmente importante en el ganado vacuno (en
África del Sur se refieren a ella como nagana o enfermedad de la mosca tse–tsé). Está causada
fundamentalmente por Trypanosoma congolense, T. vivax y, en menor grado, T. brucei brucei. Trypanosoma
uniforme, T. simiae y T. suis son otras especies menos comunes transmitidas por la mosca tse–tsé.
Trypanosoma vivax también se transmite mecánicamente por moscas picadoras, como lo pone de manifiesto su
presencia en América del Sur y Central. La tripanosomosis transmitida por la mosca tse–tsé también afecta a los
humanos, produciendo la enfermedad del sueño, por infección tanto por T. brucei gambiense como por T. brucei
rhodesiense.
1
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Nota sobre la nomenclatura de enfermedades por parásitos:
La Asociación Mundial para los avances en Parasitología Veterinaria ha recomendado una nomenclatura estandarizada
en "Standardised Nomenclature of Animal Parasitic Diseases" (Kassai, T., Cordero del Campillo M., Euzeby J., Gaafar
S., Hiepe Th. & Himonas C.A. [1988]. Vet Parasitol., 29, 299–326). En principio, el nombre de la enfermedad se
construye añadiendo el sufijo "–osis" a la raiz del nombre de la taxonomía del parásito. En este Manual se ha seguido
esta terminología, y "trypanosomosis" reemplaza por tanto al término antiguo "trypanosomiasis".
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Capítulo 2.3.15. − Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)
Los síntomas clínicos de la tripanosomis transmitida por tse–tsé pueden incluir fiebre intermitente, edema, aborto
y extenuación. La anemia se desarrolla generalmente en animales afectados y es seguida por pérdida de peso
corporal, producción reducida y a menudo mortalidad. Los síntomas post–morten incluyen adelgazamiento,
infarto ganglionar, hígado y bazo inflamados, líquido excesivo en las cavidades del cuerpo, y hemorragias
petequiales. En los animales muertos durante la fase crónica de la enfermedad, los órganos linfáticos
generalmente ya no están inflamados y es común encontrar miocarditis grave. Ni los síntomas clínicos ni los
post–morten de la tripanosomosis transmitida por la mosca tse–tsé son patognomónicos. Por tanto, el
diagnóstico debe hacerse con técnicas directas que confirmen la presencia de tripanosomas bien por
visualización microscópica, o por técnicas serológicas indirectas o por la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Existen una gran variedad de pruebas de diagnóstico (25) y los investigadores tratan aún de mejorar las
existentes y de desarrollar nuevas pruebas. Las pruebas de diagnóstico usuales varían en sensibilidad y
especificidad, comodidad de aplicación y coste (23). La elección de una prueba en particular se guiará por
principios económicos y la disponibilidad de expertos, pero especialmente por las necesidades del diagnóstico.
Por ejemplo, se aplican diferentes grados de sensibilidad y especificidad para la confirmación de la infección en
un animal individual en comparación con la detección de la infección a nivel de manada. De forma similar, la
prueba(s) de diagnóstico para establecer la prevalencia parasicológica de tripanosomosis es diferente de la
requerida para establecer la presencia o ausencia de la enfermedad en la zona. Se pueden conseguir
diagnósticos fiables combinando pruebas diagnósticas apropiadas. La interpretación fiable de los resultados de
pruebas diagnósticas dependerá de la validez de las pruebas así como de la selección/recogida apropiada de la
muestra, el tamaño de la muestra, y la forma de realizar las pruebas diagnósticas.
1.
Identificación del agente
Las técnicas de detección de parásitos son muy específicas, pero su sensibilidad es relativamente baja (es decir,
la proporción de resultados negativos falsos es alta). La sensibilidad es especialmente baja cuando se
consideran los resultados a nivel de animal individual más que a nivel de manada. Debido a su baja sensibilidad,
la prevalencia parasitológica aparente de la tripanosomosis es generamente más baja que la prevalencia
parasitológica verdadera. La baja sensibilidad diagnóstica hace que sea difícil detectar tripanosomosis cuando
está presente con baja prevalencia parasitológica, y es imposible establecer la ausencia de la enfermedad con
un grado alto de seguridad. Además, en las áreas donde se usan ampliamente fármacos tripanosomicidas, los
parásitos no pueden ser detectados.
Existen varias técnicas de detección de parásitos, cada una con una sensibilidad distinta. La elección dependerá
de las instalaciones de laboratorio disponibles y del objetivo del diagnóstico.
•
Técnicas de examen directo
Las técnicas más simples son el examen de extensiones de sangre fresca, gruesas o finas, obtenidas
generalmente de la vena de la oreja, vena yugular o vena de la cola. Entre las técnicas directas de examen, las
extensiones finas de sangre teñida se consideran más específicas pero menos sensibles que las otras dos. La
especificidad y la sensibilidad real de estas técnicas es directamente dependiente del volumen de sangre
realmente examinado y de la destreza y experiencia del microscopista.
a)
Extensiones de sangre fresca
Se realizan colocando una gota de sangre (alrededor de 2 µl) sobre una porta limpio de microscopio y se
cubre con un cubreobjetos (22x22 mm). La sangre se examina microscópicamente a un aumento total de
x400 con apertura de condensador, contraste de fase o contraste de interferencia. Se examinan
aproximadamente 50–100 campos. Se puede reconocer a los tripanosomas por su movimiento entre los
eritrocitos (RBCs).
El método es simple, barato y da resultados inmediatos. Dependiendo del tamaño del tripanosoma y de los
movimientos, se puede hacer un diagnóstico preliminar de la especie de tripanosoma. La confirmación final
de la especie se hace mediante el examen de la preparación teñida.
La sensibilidad diagnóstica del método es generalmente baja, pero depende de la experiencia del
examinador y del nivel de parasitemia. Se puede mejorar la sensibilidad de forma notable lisando los RBCs
antes del examen utilizando un agente hemolítico como dodecil sulfato sódico (SDS).
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b)
Extensiones gruesas de sangre
Se hacen colocando una gota de sangre (5–10µl) sobre una porta limpio de microscopio y extendiéndola
sobre un área de 2 cm de diámetro, aproximadamente, utilizando el borde de otro porta. El grosor de la gota
resultante debe ser tal que, cuando se seque, se puedan leer a través de ella los números de la esfera de
un reloj de pulsera. La gota se seca complemente agitándola rápidamente en el aire y, sin fijación, se
deshemoglobiniza por inmersión en agua destilada durante unos pocos segundos y se seca antes de
teñirla. Se debería guardar el frotis, seco y protegido del polvo, calor, moscas y otros insectos.
Se tiñe durante 30 minutos con colorante Giemsa diluido al 4% en solución salina tamponada con fosfato,
pH 7.2. El tiempo de tinción y la dilución del colorante pueden variar según el colorante y la técnica
individual. Por consiguiente, es importante comenzar con las instrucciones del fabricante y variar el tiempo
de tinción y la concentración de la tinción hasta obtener los resultados óptimos. El frotis teñido se lava con
agua tamponada y se examina con un aumento total de x500 a x1000.
El método es simple y relativamente barato, pero los resultados son lentos debido al proceso de tinción. Los
tripanosomas se reconocen fácilmente por su morfología general, pero pueden resultar dañados durante el
proceso de tinción. Esto puede hacer difícil la identificación de la especie.
c)
Extensiones finas de frotis de sangre
Los frotis finos de sangre se hacen colocando una gotita de sangre (alrededor de 5 µl), por ejemplo, desde
un tubo capilar para microhematocrito, sobre un porta de microscopio limpio aproximadamente a 20 mm
desde un extremo (dejando espacio para aplicar el frotis grueso) y extendiéndolo con el borde de otro porta.
Este porta se coloca en un ángulo de aproximadamente 30° con el primer porta y se mueve para hacer
contacto con la gota de sangre. Se deja que la sangre corra a lo largo del borde del porta extensor, que se
empuja hacia el otro extremo del porta con un movimiento bastante rápido pero suave. Si se utiliza la
cantidad correcta de sangre, el porta debería cubrirse con una extensión de sangre uniforme antes de
alcanzar el extremo del porta. Idealmente, deberían prepararse gotas finas de forma que los RBCs estén
juntos pero que no se solapen. El porta se seca rápidamente agitándolo en el aire y se protege del polvo,
moscas y otros insectos. El porta se fija durante 3 minutos en metanol, y se tiñe como en los frotis gruesos
de sangre. Después de la tinción, el porta se lava suavemente con agua corriente y se deja secar. Una
variación de este método es fijar en metanol durante 2 minutos, aplicar colorante May–Grünwald durante
2 minutos, y después añadir un volumen igual de agua tamponada, pH 7,2, dejarla 8 minutos y dejar
escurrir. Se examinan aproximadamente 50–100 campos del frotis fino teñido, con una lente de objetivo de
aceite de inmersión de x50 o x100, antes de considerar que la muestra es negativa. Incluso después de
haber detectado un tripanosoma, se investigan aproximadamente 20 campos adicionales para determinar
si está presente más de una especie.
La técnica descrita anteriormente puede utilizarse para muestras de biopsia de la linfa obtenidas de
ganglios linfáticos, después de una punción.
Generalmente, se prepara un frotis grueso y fino de la misma muestra. Los frotis gruesos contienen más
sangre que los finos y, por tanto, tienen una sensibilidad diagnóstica mayor. Los frotis finos, por otra parte,
permiten la identificación de la especie de Trypanosoma. Las especies de tripanosoma se pueden
identificar mediante las siguientes características morfológicas:
Trypanosoma vivax: 20–27 µm de largo, membrana ondulante no evidente, flagelos libres presentes en el
extremo anterior, extremo posterior redondeado, cinetoplasto grande y terminal.
Trypanosoma brucei es una especie de tripanosoma polimórfico. Se pueden distinguir dos formas
diferentes, es decir, una forma larga fina y una forma corta gruesa. A menudo, se observan formas
intermedias con características tanto de formas finas como gruesas. El citoplasma en muestras teñidas
contiene a menudo gránulos basófílos.
Trypanosoma brucei (forma larga fina): 17–22 µm de largo y alrededor de 2,8 µm de ancho,
membrana ondulante llamativa, flagelo libre presente en el extremo anterior, extremo posterior en
punta, cinetoplasto pequeño y subterminal.
Trypanosoma brucei (forma corta gruesa): 17–22 µm de largo y alrededor de 3,5 µm de ancho,
membrana ondulante llamativa, sin flagelo libre, extremo posterior en punta, cinetoplasto pequeño y
subterminal.
Trypanosoma congolense: 8–25 µm (especie pequeña), membrana ondulante no evidente, sin flagelo libre,
extremo posterior redondeado, cinetoplasto de tamaño mediano y terminal, a menudo situado lateralmente.
Aunque se considera que T. congolense es monomórfico, a veces se observa un grado de variación
morfológica. Dentro de T. congolense, hay diferentes tipos o subgrupos (savannah, forest, kilifi, tsavo) que
tienen diferente patogenicidad (2). Sin embargo, estos tipos se pueden distinguir solamente utilizando PCR.
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Trypanosoma theileri: (especie grande), típicamente 60–70 µm, pero los organismos individuales oscilan
entre 19 y 120 µm (16, 20), la membrana ondulante es llamativa, tiene flagelo largo libre, extremo posterior
en punta, el cinetoplasto es grande y situado cerca del núcleo y en posición marginal. Normalmente el
Trypanosoma theileri no es patógeno, pero su presencia puede confundir el diagnóstico parasitológico. En
Europa del Oeste T. theleiri es la única especie de tripanosoma que se presenta en el ganado vacuno.
•
Técnicas de concentración de parásitos
La probabilidad de detectar tripanosomas en una muestra de un animal infectado depende en gran medida de la
cantidad de sangre examinada y del nivel de parasitemia. La cantidad de sangre examinada con técnicas de
análisis directo es baja y los parásitos a menudo son muy escasos en la sangre de un animal infectado. Estos
dos factores contribuyen a la baja sensibilidad de las técnicas de análisis directo. Se puede mejorar la
sensibilidad aumentando el volumen examinado de sangre y mediante la concentración de tripanosomas.
a)
Técnica de centrifugación del microhematocrito (método de Woo)
La técnica de centrifugación del hematocrito, o el método de Woo (28), se utiliza mucho para el diagnóstico
de tripanosomosis animal. Se basa en la separación de los diferentes componentes de la muestra de
sangre dependiendo de su gravedad específica. El método es de la siguiente forma:
i)
Se recoge sangre fresca generalmente de la vena de la oreja (alrededor 70 µl) en tubos capilares
heparinizados (75 x 1,5 mm).
ii)
Un extremo del tubo capilar se sella con pegamento o mediante calentamiento, asegurándose de que
la columna de sangre no se carbonice por la llama.
iii)
Los tubos capilares sellados se colocan en una centrífuga para microhematocrito con los bordes
sellados apuntando hacia el exterior. Para asegurar un buen equilibrio, los tubos se cargan
simétricamente.
iv)
Se cierra la cubierta del rotor y se cierra la tapadera de la centrífuga.
v)
Los tubos capilares se centrifugan a 9.000 g durante 5 minutos.
vi)
Se prepara un tubo portador de un portaobjetos sobre el que se han fijado dos piezas de vidrio de 25 x
10 x 1,2 mm, separados 1,5 mm, para formar una ranura.
vii)
El tubo se coloca en la ranura, se pone un cubre en la parte superior y la interfase se llena de agua.
viii) Se examina la interfase celular plasma/leucocitos (capa leucocítica) girando el tubo lentamente. El
movimiento del tripanosoma se puede detectar primero utilizando las lentes de objetivo x10 con una
apertura reducida del condensador; los tripanosomas pueden verse más claramente utilizando las
lentes objetivo x40 preferiblemente a una distancia larga de trabajo para permitir una adecuada
profundidad de foco a través del tubo capilar.
La técnica de centrifugación del microhematocrito es más sensible que las técnicas de examen directo (15).
En el caso de las infecciones de T. vivax, la sensibilidad de los métodos Woo se acerca al 100% cuando la
parasitemia es >700 tripanosomas/ml de sangre. La sensibilidad se reduce hasta 50% cuando la
parasitemia varía entre 60 y 300 tripanosomas/ml de sangre. Los tripanosomas se vuelven más difíciles de
detectar cuando la parasitemia es menor de 60 tripanosomas/ml de sangre (8). La identificación de las
especies de tripanosomas es difícil. Como la gravedad específica de T. congolense es similar a la de los
RBCs, los parásitos a menudo se encuentran bajo la capa leucocítica en la capa de RBCs. Para mejorar la
separación de RBCs y parásitos, y aumentar la sensibilidad para T. congolense, se puede aumentar la
gravedad específica de RBCs mediante la adición de glicerol.
Una modificación del método de Woo es el método de la capa leucocítica cuantitativa (QBC) (1). El método
se ha usado para el diagnóstico de las infecciones de T.b.gambiense. El método es probablemente
demasiado caro para el uso rutinario a gran escala en inspecciones de tripanosomosis animal.
b)
Técnica de la capa leucocítica en campo oscuro/contraste de fase
La técnica de la capa leucocítica o método de Murray (21) representa una técnica mejorada para la
detección de tripanosomas y se usa ampliamente. Se lleva a cabo siguiendo los pasos i) a v) anteriores,
después de los cuales se corta el tubo capilar, con un lapicero con punta de diamante, 1 mm por debajo de
la capa leucocítica, para incluir la capa superior de RBCs. La capa leucocítica y la capa superior de RBCs
se extraen sobre un porta limpio de microscopio y se cubren con un cubreobjetos (22 x 22 mm). Se
examinan aproximadamente 200 campos de la preparación para detectar la presencia de tripanosomas
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móviles con un microscopio de campo oscuro o de contraste de fase con una lente objetivo x40. Las
especies de tripanosoma se pueden identificar con referencia a los siguientes criterios:
Trypanosoma vivax: Grande, extremadamente activo, atraviesa el campo completo muy rápidamente,
deteniéndose ocasionalmente.
Trypanosoma brucei: Varios tamaños, movimiento rápido en áreas limitadas.
Trypanosoma congolense: Pequeño, lento, se adhiere a los RBCs por el extremo anterior.
Trypanosoma theileri: Más del doble del tamaño de los tripanosomas patógenos, tiende a rotar.
Igual que con la técnica de centrifugación del microhematocrito, la técnica de la capa leucocítica es más
sensible que las técnicas directas de examen. La sensibilidad del método de la capa leucocítica se puede
mejorar utilizando la técnica de la centrifugación doble de la capa leucocítica (15). Se centrifuga una
cantidad total de 1.500–2.000 µl de sangre, después de lo cual se aspira la capa leucocítica en un tubo
capilar de microhematocrito y se centrifuga de nuevo. Se examina la capa leucocítica. Comparada con la
técnica de la centrifugación del microhematocrito, la técnica de la capa leucocítica tiene la ventaja añadida
de que las preparaciones se pueden fijar y teñir para una identificación más precisa de especies y
mantener como un registro permanente.
Tanto la centrifugación del microhematocrito como las técnicas de la capa leucocítica dan resultados
directos y pueden utilizarse para investigar grandes números de animales. Requieren equipo especializado
y suministro de electricidad, lo que hace la prueba más cara en comparación con el examen de la extensión
de sangre fresca. Sin embargo, esto se compensa con el aumento en la sensibilidad. Ambas técnicas de
detección de parásitos descansan en la detección de tripanosomas móviles y vivos. Debido a que los
tripanosomas pueden perder su vigor y morir bastante rápidamente una vez que se extrae la muestra de
sangre, las muestras recogidas en tubos capilares deberían enfriarse inmediatamente y no dejar que se
sobrecalienten en la centrífuga para microhematocrito o en la fase de microscopio. Las muestras deberían
examinarse tan pronto como se pueda después de recogerlas, preferiblemente en las dos horas siguientes.
La centrifugación del microhematocrito y las técnicas de la capa leucocítica son especialmente útiles porque
se puede evaluar el hematocrito (PCV) a la misma vez. Para determinar el PCV después de la
centrifugación, el tubo capilar del microhematocrito (conteniendo sangre de la vena de la oreja o de la
yugular) se coloca en un lector de hematocrito. La longitud de la columna del concentrado de eritrocitos se
expresa como un porcentaje del volumen total de sangre. Es útil medir el PCV para determinar el grado de
anemia. La anemia puede ser causada por factores diferentes de la tripanosomosis transmitida por mosca
tse–tsé. Permanece, sin embargo, como uno de los indicadores más importantes de tripanosomosis en el
ganado vacuno. Como la tripanosomosis es un problema de manada, el perfil de PCV de una manada está
influido por el número de animales infectados con tripanosomosis y puede utilizarse para indicar diferencias
en el desafío de la enfermedad. El PCV medio está también influido por la edad y el nivel de susceptibilidad
genética del ganado vacuno.
c)
Intercambio de aniones
La técnica de cromatografía de intercambio aniónico a microescala (m–AECT) se utiliza ampliamente para
el diagnóstico en humanos de la enfermedad del sueño producida por T.b. gambiense (18). La sangre se
pasa a través de una columna de dietil amino–etil (DEAE)–celulosa equilibrada con una solución salina
tamponada con fosfato (PBS) de una fuerza iónica ajustada a la sangre de la especie examinada de animal.
Como las RBCs están cargadas más negativamente que los tripanosomas, se mantienen en la columna y
los tripanosomas pasan a través con el eluído, que se recoge, se centrifuga para concentrar los
tripanosomas y se examina al microscopio.
Se pueden examinar grandes volúmenes de sangre de cada animal y por tanto, el método tiene una alta
sensibilidad. Sin embargo, la técnica es lenta y no es adecuada para el examen de un gran número de
animales.
d)
Cultivo in—vitro
Se ha descrito un procedimiento para el cultivo in–vitro de T. brucei, pero durante muchos años el éxito ha
sido irregular. Además, el método necesita un equipamiento sofisticado, produce resultados después de un
considerable retraso y no es ciertamente adecuado para su uso a gran escala. Un equipo (KIVI) para el
aislamiento in–vitro de tripanosomas ha demostrado ser prometedor en el aislamiento y amplificación de
todas las especies de T. brucei en humanos, animales domésticos y de juego (26). El valor de la prueba en
el aislamiento de T.congolense y T. vivax es aún desconocido. Como se basa en el cultivo de formas
procíclicas de tripanosomas, no es posible la diferenciación de especies (14).
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Capítulo 2.3.15. − Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)
•
Inoculación en animales
La subinoculación de sangre en roedores, generalmente ratones o ratas, es particularmente útil para revelar
infecciones subclínicas. Los animales de laboratorio se inyectan intraperitonealmente con 0,2–5 ml (dependiendo
del tamaño del roedor) de sangre recogida recientemente. La inmunosupresión artificial de animales receptores
por irradiación o tratamiento farmacológico aumentará de forma importante las oportunidades de aislamiento del
parásito. Se sangran tres veces a la semana durante al menos 2 meses. La sangre recogida se examina
mediante el método de la extensión en fresco.
La inoculación en animales es más sensible que el examen directo de extensiones en fresco. Sin embargo, el
método no es práctico; es caro y el diagnóstico no es inmediato. El método es muy sensible para detectar las
infecciones de T.b.brucei. Sin embargo, algunas cepas de T. congolense no se transmiten fácilmente y T. vivax
raramente infecta a roedores de laboratorio. También debería evitarse la inoculación animal ya que perturba
gravemente al bienestar animal.
•
Prueba para detectar antígeno tripanosomal
Se ha descrito un enzimoinmunoensayo (ELISA) de detección del antígeno para tripanosomosis (22). Las
evaluaciones de campo de la prueba no han dando resultados repetitivos (5). Por consiguiente, se necesita
trabajo adicional para descubrir y superar la causa de estas inconsistencias antes de que la prueba pueda
utilizarse en el diagnóstico rutinario de tripanosomosis.
•
Pruebas de amplificación de ADN
Se ha desarrollado un método PCR como un instrumento para el diagnóstico de infecciones con tripanosomas
africanos en humanos y en animales, así como en moscas tse–tsé. Se puede amplificar secuencia de ADN
nuclear repetitivo y específico para T. vivax y tres tipos de T. congolense (4, 6, 19); sin embargo, los cebadores
actuales para T. vivax parecen no ser capaces de amplificar algunos genotipos dentro de esta especie. Existe un
conjunto de cebadores genéricos para la detección de las tres subespecies de T. brucei. Los conjuntos de
cebadores disponibles para los diferentes subgéneros de tripanosoma, especies y tipos son los
siguientes: T. brucei subgenus – TBR1 y TBR2; T. congolense (tipo savannah) – TCN1 y TCN2; T. congolense
(tipo forest) – TCF1 y TCF2; T. congolense (tipo Kenya coast) – TCK1 y TCK2; y T. vivax – TVW1 y TVW2.
Recientemente se han desarrollado pruebas de PCR de fragmentos polimórficos de restricción (RFLP) que
permiten la identificación de todas las especies de Trypanosoma como infecciones simples o mixtas utilizando
una única prueba (3, 7, 9).
Las amplificaciones de PCR estándar se llevan a cabo en una mezcla de reacción que contiene Tris/HCl, MgCl2,
KCl, cada uno de los cuatro trifosfatos de deoxyribonucleótico, cebadores, ADN molde y ADN polimerasa Taq.
Las muestras se incuban durante varios ciclos a diversas temperaturas. Los productos de la PCR se someten a
electroforesis en agarosa. Los geles se tiñen con bromuro de etidio.
El procedimiento es extremadamente sensible, pero pueden producirse resultados positivos falsos como
consecuencia de contaminación de las muestras con otro ADN. La prueba requiere equipo especializado y
personal muy entrenado, de forma que no es adecuada para utilización en muchos laboratorios. Pueden
producirse resultados negativos falsos cuando la parasitemia es muy baja (< 1 tripanosoma/ml de sangre), lo que
sucede con frecuencia en infecciones crónicas; también pueden producirse cuando la especificidad de los
cebadores es demasiado alta, de forma que no se reconozcan todos los aislados de una especie particular de
tripanosoma. La recogida de muestras se ha simplificado adaptando la prueba mediante la utilización de sangre
o capa leucocítica depositada sobre papel de filtro (9, 12). Se puede procesar un gran número de muestras a la
vez, lo que la convierte en potencialmente adecuada para reconocimientos a gran escala. Sin embargo, por el
momento, el coste de los análisis por PCR es prohibitivo para la utilización rutinaria de la prueba.
2.
Pruebas serológicas
Se han desarrollado varias técnicas de detección de anticuerpos para detectar anticuerpos tripanosomales para
el diagnóstico de tripanosomosis animal, con sensibilidad y especificidad variable. Los métodos preferidos son la
prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) (13) y el ELISA para detección de anticuerpos tripanosomales
(11, 17). La identificación de los principales antígenos de tripanosomas, y su producción como moléculas
recombinantes o péptidos sintéticos, conduce actualmente al desarrollo y validación de nuevas pruebas basadas
en el empleo de moléculas definidas. Por tanto, en un futuro próximo, podría mejorarse la especificidad de las
pruebas serológicas hasta permitir la detección de anticuerpos específicos de especie, y alcanzar un alto nivel de
estandarización que no se logra actualmente mediante la utilización de extractos totales de parásitos.
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a)
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
El método original de esta prueba (27) ha sido reemplazado por una nueva técnica para la preparación de
antígenos de tripanosomas (13), que implica la fijación de tripanosomas vivos utilizando una mezcla de 80%
de acetona fría y 0,25% formalina en solución salina normal.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Preparar frotis finos de sangre con una gran parasitemia o de una suspensión de tripanosomas. Secar
al aire y fijar en acetona durante 5 minutos.
ii)
Marcar círculos de 5 mm de diámetro sobre portas de vidrio utilizando laca de uñas.
iii)
Utilizando una pipeta, colocar un suero problema, diluido al 1/40, en cada círculo, asegurándose de
que el área en cada círculo esté completamente cubierta.
iv)
Incubar la preparación de suero problema/antígeno a 37°C durante 30 minutos en cámara húmeda.
v)
Lavar la preparación tres veces en PBS durante 5 minutos cada vez a 4°C, con agitación suave. Secar
los portas al aire.
vi)
Aplicar conjugado: IgG anti–bovina de conejo o de cabra
conjugada con isotiocianato de fluoresceína.
vii)
Incubar y lavar como anteriormente. Escurrir en agua destilada. Secar los portas al aire.
(para pruebas con sueros bovinos)
viii) Montar los portas en PBS o glicerol tamponado y examinar la fluorescencia.
b)
Enzimoinmunoensayo de detección de anticuerpos
El ELISA original para anticuerpos (17) se ha desarrollado más recientemente para su utilización en
experimentos a gran escala con tripanosomosis bovina (11). Se han desarrollado ELISAs utilizando placas
de microtitulación preantigenizadas con T. congolense o T. vivax que presentan la ventaja de que se utiliza
un antígeno desnaturalizado estandarizado, y que se pueden almacenar durante largos periodos a
temperatura ambiente (24).
El antígeno estándar para las pruebas de anticuerpos de tripanosomosis se deriva de tripanosomas
tomados del torrente circulatorio. Los antígenos se preparan de una fracción soluble de tripanosomas
purificada por cromatografía de parásitos de sangre entera de ratas infectadas por medio de intercambio
aniónico en DEAE, lisados mediante ciclos de congelación–descongelación y por centrifugación a 10.000 g
durante 30 minutos. También se pueden utilizar antígenos obtenidos de formas de tripanosoma procíclico
propagados in–vitro (10).
Para el análisis de muestras de sangre recogidas sobre papel de filtro se han adaptado tanto el IFAT como
el ELISA de detección de anticuerpos. La sangre contenida en un tubo capilar de centrifuga de
microhematocrito heparinizado se deposita sobre un papel de filtro (Whatman ® No. 4). Las muestras se
secan al aire protegidas de la luz solar y se colocan en una bolsa de plástico con desecador de gel de sílice
con un auto indicador. La bolsa se cierra y debería mantenerse tan fría como sea posible hasta que las
muestras se refrigeren o congelen.
Cada microplaca ELISA se realiza con sueros de referencia fuertemente positivos, débilmente positivos y
negativos, que se requieren para cumplir con los valores predeterminados para asegurar la calidad de la
prueba. La absorbancia de cada muestra probada por ELISA se expresa como un porcentaje (positividad
del porcentaje, PP) del estándar de referencia fuertemente positivo (29). Los resultados son, por tanto,
cuantificables. El valor límite se determina utilizando muestras de campo positivas y negativas conocidas
(5).
Ambas pruebas de detección de anticuerpos tienen alta sensibilidad y especificidad altas. Su especificidad
de especie es baja generalmente. Detectan respuestas inmunes a infecciones actuales y pasadas y
pueden, consecuentemente, proporcionar solamente un diagnóstico preliminar de infección activa.
El inmunodiagnóstico necesita un equipo caro y sofisticado y experiencia, lo que no está siempre
disponible. Ha de llevarse a cabo en laboratorios especializados y hay un retraso sustancial entre el
muestreo real y la disponibilidad de los resultados. Sin embargo, el ELISA para anticuerpos se presta a un
alto grado de automatización y estandarización. La recogida y el almacenamiento de muestras se llevan a
cabo fácilmente mediante el uso de papeles de filtro. Todos estos factores hacen del ELISA para
anticuerpos una prueba muy útil en mediciones a gran escala para determinar la distribución de
tripanosomosis transmitida por la tse–tsé.
632
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.3.15. − Tripanosomosis (transmitida por la mosca tse—tsé)
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
En la actualidad no se utilizan productos biológicos.
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*
* *
N.B. Hay un laboratorio de referencia de la OIE para Trypanosomosis (transmitida por tse–tsé) (ver Cuadro en la
Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para una lista más actualizada:
www.oie.int).
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