mapeo genético de un nuevo gen de resistencia a la roya

 MAPEO GENÉTICO DE UN NUEVO GEN DE RESISTENCIA A LA ROYA ASIATICA DE LA
SOJA EN LA LÍNEA PI594723.
M.V. Cambursano*, C.O. Gosparini, G. Regules, M.A. Chiesa, E.N. Morandi.
Laboratorio de Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias Agrarias, UNR. Campo Experimental J.
Villarino C.C. N° 14 (S2125ZAA) Zavalla, Santa Fe, Argentina. 0341-4970080 int. 217.
marianacambursano@gmail.com
Introducción
La Roya Asiática de la Soja (RAS) es una enfermedad foliar causada por el hongo Phakopsora
pachyrhizi Syd. & P. Syd. Esta enfermedad, de origen Asiático, se detectó por primera vez en Sud
América en 2001 (Morel, 2001) y rápidamente se extendió a otros países de la región (Rossi, 2003;
Yorinori et al., 2005;) y a los EEUU (Schneider et al., 2005). La misma es considerada como una de
las enfermedades fúngicas de mayor riesgo fitosanitario para el cultivo de la soja [Glycine max (L)
Merr.].
La incorporación de resistencia durable a la RAS en materiales comerciales de soja dependerá del
entendimiento de las bases fisiológicas, genéticas y moleculares de las interacciones plantapatógeno específicas para esta enfermedad. Cinco genes de resistencia a P. pachyrhizi fueron
identificados y localizados molecularmente en cuatro Grupos de Ligamiento Molecular (GLM) del
mapa genético de la soja: Rpp1 y Rpp4 (GLM G), Rpp2 (GLM J), Rpp3 (GLM C2) y Rpp5 (GLM N)
(Hyten et al., 2007; Garcia et al., 2008; Silva et al., 2008; Hyten et al., 2009; Ray et al., 2009;
Chakraborty, et al., 2009). También fueron mapeadas variaciones alélicas de estos loci (Chakraborty
et al., 2009; Ray et al., 2009; Calvo et al., 2008; Garcia et al., 2008). Debido a que las respuestas de
resistencia de los genes Rpp es raza específica, hay numerosos ejemplos de la inefectividad de
estos genes cuando son enfrentados a aislamientos de P. pachyrhizi provenientes de diferentes
regiones geográficas (Bonde et al., 2006; Pham et al., 2009). Por este motivo, es necesario disponer
de nuevas fuentes de resistencia a la RAS.
La PI594723 fue caracterizado como resistente a la RAS en ensayos en plántula de la colección de
germoplasma de soja del USDA-ARS (“United States Department of Agriculture - Agricultural
Research Service”) (Miles et al., 2006) y luego se confirmó su resistencia en plantas adultas en
condiciones de campo con alta presión de inóculo en Paraguay (Miles et al., 2008). Para poder
aprovechar la resistencia a la RAS contenida en la PI594723 es necesario caracterizar el/los genes
involucrados, su heredabilidad, su ubicación en el mapa de ligamiento de la soja, y sus potenciales
similitudes o diferencias con los genes ya conocidos en interacciones específicas con el patógeno. El
objetivo de este trabajo fue determinar la base genética de la resistencia a la RAS en el genotipo
PI594723, en interacción específica con el aislamiento BP-08, e identificar marcadores moleculares
(MM) asociados a la misma.
Materiales y Métodos
Material vegetal: se utilizaron los genotipos RA518 (rpp/rpp) y PI594723 (Rpp[?]/Rpp[?]), como
parentales susceptible y resistente a la RAS, respectivamente. A partir del cruzamiento entre estos
parentales se obtuvieron cinco semillas hibridas (F1), de las cuales cuatro se utilizaron para el
análisis fenotípico de la F1, mientras que la semilla híbrida restante se utilizó para la obtención de
una población segregante F2, constituida por 237 individuos.
Para las evaluaciones fenotípicas se utilizó un aislamiento de P. pachyrhizi recolectado en el
Estado de Paraná, Brasil, durante el año 2008, al que se lo denominó BP-08. Los genotipos
parentales (nueve plantas de RA518 y ocho plantas de PI594723), cuatro individuos F1 y todos los
individuos F2 se inocularon con una suspensión de esporas del aislamiento BP-08 de P. pachyrhizi (8
x 105 esporas/ml). Adicionalmente, se inoculó la Línea Cuasi Isogénica (LCI) W1 del cultivar Williams
82 portadora del gen Rpp1 (Rpp1/Rpp1). Las plantas inoculadas se evaluaron a los 14 días postinoculación. Se evaluó el tipo de reacción: i) reacción inmune (I), sin lesiones visibles; ii) reacción
-1Mejoramiento Genético y Biotecnología
resistente (R), con lesiones marrón rojizas (RB, “Red Brown”); y iii) reacción susceptible (S), con
lesiones bronceadas (TAN, “Tan”). Para confirmar el genotipo de los individuos F2, se evaluó el
comportamiento fenotípico de 46 familias F2:3 seleccionadas a partir de 12 individuos F2 inmunes, 13
susceptibles y 21 resistentes, inoculando 11-14 individuos F3 por familia.
La extracción del ADN genómico de los genotipos parentales y de los individuos F2 se realizó por el
método CTAB modificado (Saghai-Maroof et al., 1984). Para la obtención de MM polimórficos entre
los genotipos analizados y para el análisis del ligamiento de los mismos a la resistencia a la RAS, se
utilizó la técnica de SSR (Repeticiones de Secuencias Simples o Microsatélites, Akkaya et al., 1995).
Los MM-SSR utilizados se seleccionaron teniendo en cuenta su ubicación en los GLM donde se
localizaron los genes Rpp conocidos (Tabla 1). Los productos de amplificación se analizaron en
geles de poliacrilamida (6%) y las bandas se visualizaron mediante tinción con nitrato de plata. Para
los análisis de ligamiento se utilizó el programa de mapeo JoinMap (Stam, 1993), considerando
como valor de corte un LOD > 3,0 y una frecuencia de recombinación de 0,3.
Resultados y Discusión
En la interacción con el aislamiento BP-08, el cv. RA518 se comportó como susceptible,
presentando lesiones TAN en las nueve plantas inoculadas, mientras que el genotipo PI594723 se
comportó como inmune. Los híbridos presentaron abundante cantidad de lesiones RB en todos los
folíolos inoculados. La LCI W1 se comportó como susceptible presentando lesiones TAN.
Dentro de los 237 individuos F2, se evidenció la presencia de tres clases fenotípicas: plantas S (con
lesiones TAN), plantas R (con lesiones RB) y plantas I (sin lesiones). La segregación del carácter se
ajustó significativamente a una razón de 1(I): 2(R): 1(S), correspondiente a la de un gen con
dominancia incompleta (χ2 = 0,35; P = 0,84).
Adicionalmente, se realizó un test de progenie inoculando entre 10 y 14 plantas F3 provenientes de
46 familias F2:3, a fin de corroborar los datos fenotípicos obtenidos para los individuos F2. Todas las
plantas de cada una de las 12 familias F2:3 provenientes de individuos F2 inmunes (Rpp/Rpp)
resultaron 100% inmunes (127 plantas). Dentro de las 13 familias F2:3 provenientes de individuos F2
susceptibles (rpp/rpp), el 88,3% (121 de 137 plantas) de los individuos F3 presentaron lesiones TAN.
Respecto a las familias F2:3 provenientes de individuos F2 resistentes (Rpp/rpp), la segregación
observada no ajustó a la esperada (25% I: 50% R: 25% S) ya que se obtuvieron: 41,7% de plantas
inmunes (96 de 230 plantas), 34,3% de plantas con lesiones RB (79 de 230 plantas) y 23,9% de
plantas con lesiones TAN (55 de 230 plantas). En este último caso, de las 21 familias F2:3
provenientes de individuos F2 heterocigotas, 18 familias presentaron las tres clases fenotípicas (I, RB
y TAN), indicando que los individuos F2 fueron bien clasificados fenotípicamente como resistentes.
Las tres familias restantes solo presentaron dos clases fenotípicas (I y RB o I y TAN). Los desvíos
observados tanto en las familias susceptibles como resistentes se debieron probablemente a
escapes en la inoculación.
En la búsqueda de polimorfismo entre los parentales de la población, se seleccionaron 34 MM de
SSR polimórficos distribuidos entre los cuatro GLM donde fueron mapeados los genes Rpp (Tabla 1).
Tabla 1. Marcadores moleculares de SSR analizados en la población segregante.
GLM
C2
G
a
MM de SSR polimórficos
Satt457, Sat_213, Satt460, Staga001
Satt309, Satt610, GMES0638, Satt288, GMES4156, Satt612, GMES1587, Satt191, Sat_372, GMES3925,
CSSR81, GMES3918, Sat_064, GMES4619, GMES1110, GMES1567, Sctt010
J
Sct_065, Satt215, Sat_361, Sct_001, Sat_366, Satt547, Satt431, GMES4751
N
Satt159, Satt485, Sat_236, Satt080, GMABAB
a
Localización de los MM en los GLM según el mapa público de la soja (Song et al., 2004) y el mapa transcriptómico
(Hisano et al., 2007).
Todos los MM analizados segregaron de la forma esperada y fueron incluidos en el análisis. El
orden de los MM-SSR y el grado de ligamiento al gen Rpp[?] se muestra en la Figura 1.B. Por
-2Mejoramiento Genético y Biotecnología
razones operativas, la búsqueda de ligamiento al locus Rpp[?] en el genotipo PI594723 se realizó
analizando cada uno de estos MM en 123 individuos, elegidos al azar, de la población F2..
Figura 1. Localización de los marcadores moleculares (MM) de SSR ligados al gen Rpp[?] en el GL generado
con el programa Joinmap 4.0 (Stam, 1993), a partir de los datos feno y genotípicos provenientes de los
individuos F2 de la población segregante. A. Orden de los MM en el mapa público de soja (Song et al., 2004). B.
Orden de los MM y localización del gen Rpp[?] obtenido para la población segregante utilizada en este trabajo.
C. Orden de los MM en el mapa transcriptómico descripto por Hisano et al. (2007). Los MM CSSR78, CSSR79 y
CSSR81 pertenecen al mapa transcriptómico publicado por Xia et al. (2007) y su localización es relativa a la de
los MM en el mapa de Hisano et al. (2007). En los tres mapas los valores sobre la izquierda corresponden a las
distancias genéticas, expresadas en centiMorgans (cM).
Los MM Sat_372, GMES3925, CSSR81, Sat_064, GMES4619, GMES1110, GMES1567 y
GMES3918 pertenecientes al GLM G, están altamente ligados al gen Rpp[?] en la PI594723. Los
MM más cercanos, GMES1110 y GMES1567, flanquean al gen, a distancias de 0,8 y 2,4cM,
respectivamente. El orden de los MM-SSR en el GL construido a partir de los datos fenotípicos y
genotípicos de la población utilizada coincide con el orden de los MM para el GLM G del mapa
consenso de la soja (Song et al., 2004) (Figura 1). Para los MM-SSR provenientes del mapa
transcriptómico (Hisano et al., 2007) el orden también se mantiene, excepto por la inversión de los
MM CSSR81, GMES0638 y GMES4156. Adicionalmente, las distancias entre los MM resultaron
similares a las distancias entre los mismos en los mapas publicados. El ligamiento de los MM-SSR
polimórficos al gen Rpp[?], fue corroborado analizando los datos fenotípicos de las 46 familias F2:3.
Los resultados de este análisis de ligamiento coincidieron con los informados para la población F2
(datos no mostrados).
Los MM de SSR Satt288, Satt612, Satt191, Satt372 y Sat_064 que resultaron ligados al gen
Rpp[?] presente en la PI594723 fueron previamente identificados como ligados al locus Rpp1 en el
GLM G (Hyten et al., 2007; Ray et al., 2009; Chakraborty et al., 2009) en otros fondos genéticos.
Nuestros resultados indican que el locus Rpp[?] en la PI594723 corresponde a un gen simple de
dominancia incompleta localizado en, o muy cercano a, el locus Rpp1, pudiendo ser un alelo del
mismo o un nuevo gen altamente ligado. Esta conclusión estaría reforzada por el hecho que la LCI
W1 (Rpp1/Rpp1) se comportó como susceptible al aislamiento BP-08, mientras que la línea
PI594723 resultó inmune a este aislamiento.
-3Mejoramiento Genético y Biotecnología
Conclusiones
Considerados conjuntamente, los resultados presentados sugieren que la segregación geno y
fenotípica del gen Rpp[?] contenido en la línea PI594723, en su interacción específica con el
aislamiento BP-08 de P. pachyrhizi, es la esperada para un gen de herencia simple con dominancia
incompleta. El mismo podría ser un alelo del locus Rpp1 o un nuevo gen fuertemente ligado a ese
locus. Esta línea podría ser potencialmente utilizada para ampliar las opciones de resistencia a
distintos aislamientos o razas fisiológicas de un patógeno altamente variable como P. pachyrhizi en
programas de mejoramiento genético orientados a la incorporación de resistencia a la RAS.
Bibliografía
AKKAYA, M.S., BHAGWAT, A.A. y CREGAN, P.B. (1992). Length polymorphism of Simple Sequence Repeat DNA in Soybean.
Genetics 132: 1131-1139.
BONDE, M.R., NESTER, S.E., AUSTIN, C.N., STONE, C.L., FREDERICK, R.D., HARTMAN, G.L. y MILES, M.R. (2006).
Evaluation of virulence of Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae isolates. Plant Disease 90: 708-716.
CALVO, E.S., KIIHL, R.A.S., GARCIA, A., HARADA, A. y HIROMOTO, D.M. (2008). Two major recessive soybean genes conferring
soybean rust resistance. Crop Science. 48: 1350-1354.
CHAKRABORTY, N., CURLEY, J., FREDERICK, R.D., HYTEN, D.L., NELSON, R.L., HARTMAN, G.L. y DIERS, B.W. (2009).
Mapping and confi rmation of a new allele at Rpp1 from soybean PI594538A conferring RB lesion type resistance to soybean rust.
Crop Science 49:783–790.
GARCIA, A., CALVO, E.S., KIIHL, R.A.S., HARADA, A., HIROMOTO, D.M. y VIEIRA, L.G.E. (2008). Molecular mapping of soybean
rust (Phakopsora pachyrhizi) resistance genes: discovery of a novel locus and alleles. Theoretical and Applied Genetics. 117: 545553.
HISANO, H., SATO, S., ISOBE, S., SASAMOTO, S., WADA, T., MATSUNO, A., FUJISHIRO, T., YAMADA, M., NAKAYAMA, S.,
NAKAMURA, Y., WATANABE, S., HARADA, K. y TABATA, S. (2007). Characterization of the soybean genome using EST-derived
microsatellite markers. DNA Research 14: 271-281.
HYTEN, D.L., HARTMAN, G.L., NELSON, R.L., FREDERICK, R.D., CONCIBIDO, V.C., NARVEL, J.M. y CREGAN, P.B. (2007).
Map location of the Rpp1 locus that confers resistance to soybean rust in soybean. Crop Science 47: 837–840.
HYTEN, D.L., SMITH, J.R., FREDERICK, R.D., TUKER, M.L., SONG, Q. y CREGAN, P.B. (2009). Bulk segregate analysis using
the GoldenGate assay to locate the Rpp3 locus that confers resistance to soybean rust in soybean. Crop Science. 49:265–271.
MILES, M.R., FREDERICK, R.D. y HARTMAN G.L. (2006). Evaluation of soybean germplasm for resistance to Phakopsora
pachyrhizi. Plant Health Progress. Online doi: 10.1094/PHP-2006-0104-01-RS.
MILES, M.R., MOREL, W., RAY, J.D., SMITH, J.R., FREDERICK, R.D. y HARTMAN, G.L. (2008). Adult plant evaluation of soybean
accessions for resistance to Phakopsora pachyrhizi in the field and greenhouse in Paraguay. Plant Disease 92: 96-105.
MOREL PW (2001) Roya de la Soja. Comunicado Técnico-Reporte Oficial, Serie Fitopatología, 1, Junio. Ministerio de Agricultura y
Ganadería, Subsecretaria de Agricultura, Dirección de Investigación Agrícola, Centro Regional de Investigación Agrícola – CRIA,
Capitán Miranda, Itapúa, Paraguay.
PHAM, T.A., MILES, M.R., FREDERICK, R.D., HILL, C.B. y HARTMAN, G.L. (2009). Differential responses of resistant soybean
entries to isolates of Phakopsora pachyrhizi. Plant Disease 93(3): 224-228.
RAY, J.D., MOREL, W., SMITH, J.R., FREDERICK, R.D. y MILES M.R. (2009) Genetics and mapping of adult plant rust resistance
in soybean PI 587886 and PI 587880A. Theoretical Applied Genetetics 119: 271–280.
ROSSI, R.L. (2003). First report of P. pachyrhizi in Argentina. Plant Disease 87: 102.
SAGHAI-MAROOF, M.A., SOLIMAN, K.M., JORGENSEN, R.A. y ALLARD, R.W. (1984). Ribosomal DNA spacer-length
polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA 81: 8014—8018.
SONG, Q.J., MAREK, L.F., SHOEMAKER, R.C., LARK, K.G., CONCIBIDO, V.C., DELANNAY, X., SPECHT, J.E. y CREGAN, P.B.
(2004). A new integrated genetic linkage map of the soybean. Theoretical and Applied Genetics 109: 122-128.
STAM, P. (1993). Construction of integrated genetic linkage map by means of a computer package: Joinmap. The Plant Journal 5:
739-744.
-4Mejoramiento Genético y Biotecnología
XIA, Z., TSUBOKURA, Y., HOSHI, M., HANAWA, M., YANO, C.; OKAMURA, K., AHMED, T.A., ANAI, T., WATANABE, S.,
HAYASHI, M., KAWAI, T., HOSSAIN, K.G., MASAKI, H., ASAI, K., YAMANAKA, N., KUBO, N., KADOWAKI, K., NAGAMURA, Y.,
YANO, M., SASAKI, T. y HARADA, K. (2007). An Integrated high- density linkage map of soybean with RFLP, SSR, STS, and AFLP
markers using a single F2 population. DNA Research 14: 257-269.
YORINORI, J.T., PAIVA, W.M., FREDERICK, R.S., COSTAMILAN, L.M., BERATGNOLLI, P.F., HARTMAN, G.E., GODOY, C.V. y
NUNES, J.Jr. (2005). Epidemics of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) in Brazil and Paraguay from 2001 to 2003. Plant Disease
89: 675-677.
-5Mejoramiento Genético y Biotecnología