© Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Problema del rellenado de los extremos 5’ 3’ 5’ 3’ ∂ 5’ RNAsa H1 Fen1p 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ a RNA 5’ 3’ 3’ 5’ Acortamiento del DNA tras una ronda de replicación RNAsa H1 Fen1p 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ e 3’ 5’ © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Extensión de los extremos 5’ 3’ 5’ 3’ Telomerasa Síntesis de repeticiones teloméricas (C. Greider, 1984) Repeticiones teloméricas Síntesis de fragmentos de Okazaki a 5’ 3’ e, Rellenado y cierre © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Organización del DNA del telosoma: DNA telomérico 3’ Centrómero Secuencias asociadas a los telómeros (TAS) o “subteloméricas” Repeticiones teloméricas Protuberancia G La longitud del DNA telomérico varía según las especies: 12-50 pb en ciliados 200-400 pb en levaduras (fase S) 20.000-75.000 pb en plantas 150.000 pb en ratón 300.000 pb en células vegetales en cultivo La longitud del DNA telomérico puede variar en un organismo multicelular: etapa de desarrollo (edad) tejidos transformación celular (tumor) © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Composición del DNA telomérico 5’ TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG 3’ 3’ AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC • Está sesgada: rica en C y G • Las G se encuentran en la cadena 5’->3’ desde el centrómero hacia el extremo (cadena G) • La cadena complementaria es rica en C (cadena C) • Las G se encuentran juntas en la secuencia y no dispersas • Los motivos principales están muy conservados ¿Razones funcionales o estructurales? © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ DNA-G4: la estructura base Cuarteto de G H H R N R N N N N N N H N O O N H H N O N N R H N H H N H N N N O H N N H H N R © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Comparación de DNA-G4 paralelo y antiparalelo Paralelo Antiparalelo anti syn Ribosa Cuartetos G Na+ Ribosa Cuartetos G © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Lazos t Protuberancia G 2-50 kb de repeticiones teloméricas DNA no telomérico Gran lazo bicatenario asociado a proteínas © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Proteínas telosómicas de levaduras © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Proteínas telosómicas de mamíferos © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Unión del dominio telocaja al DNA telomérico 90° © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Formación de lazos-t (I) : Trf1p y Trf2p © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Formación de lazos-t (II) : tanquirasa © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Importancia de la integridad del telosoma Parada transitoria • Reparación de dsDNA dañado • Reparación por recombinación Fusiones cromosómicas Activación telomerasa Pérdida del cromosoma Muerte celular prematura © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Subunidad TR Estructura secundaria Translocación de TERT III V IV I 5’ Actividad catalítica de TERT 3’ II Fin Molde para repetición telomérica Molde Tetrahymena/Glaucoma Paramecium 3' UCUAAAAACCCCAA 3'UUACCAAAGACCCCAA Euplotes aediculatus Euplotes crassus Oxytricha/Stylonychia 3' 3' 3' CCAAAA CCAAAA CCAAAA Fin CUUacugA 5' CAUacugA 5' CCCCAAAACGAacugUC 5' CCCCAAAACAAacugUC 5' CCCCAAAA NAacugUC 5' © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Probable estructura de TERT T 12 HIV Pulgar Dedos Sitio catalítico Motivo T Palma A B’ CD E © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Modelo tridimensional propuesto para la estructura mínima de la telomerasa Telomerase protein (TERT) (TR) © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Especificidad de sustrato y sitios de reconocimiento 3’ 5’ TERT TR ssDNA 5’ Sitio de anclaje (-20) Sitio -12 3’-OH 2’-H Sitio catalítico © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Mecanismo de reacción Unión Elongación TERT TR AA AA AC TT CC CA G C CC CAA TTG C GG C DNA 5’ AA C A TT CC CA G C Relajación sitio -20 AA C A CC CA C T TTGGGG Función sitio -12 Translocación AA A AC TTGGGGT AC A TG C C C dGDP dGTP C CC CAATG C T GG TTGG © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Síntesis de DNA telomérico sin telomerasa • Uso de reparación/recombinación – Habitual • Mosquito Anopheles y cebollas. – Ocasional • Levaduras y tumores de mamíferos – Mecanismo ALT • Uso de retrotransposones – Drosophila y otros dípteros • HeT-A y TERT – Gusano de seda (Bombyx mori) • SART1 y TRAS1 © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Regulación de la longitud Rifp OnTEBP Rap1p n Trf1p Represión Sitio de reconocimiento 3’ Replicación incompleta, degradación, recombinación ... Síntesis de repeticiones teloméricas 5’ Exoucleasas n-2 Activación 3’ 5’ © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Regulación de la actividad telomerasa (especificidad de tejido) –– ++ Gen del cromosoma 3 humano Transcripción de TERT MYC (Activación en tumores) AAAAAA TERT Subunidades de la holoenzima ++ Oligomerización ++ ++ TR ++ Fosforilación © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Otros factores que regulan la telomerasa • Estructura del telosoma – Telomerasa inhibida por DNA-G4 y lazos t (Trf y Tanquirasa) – Est4p (Cdc13p) favorece acceso de la telomerasa • Ciclo celular – TR se expresa constitutivamente – TERT suele expresarse en fase S • Especificidad de tejido – Inactiva en tejidos adultos (tert-, TR+) – Activa en tejidos jóvenes, germinales, o con alto recambio – Activa en células cancerosas Relación con senescencia y transformación celular © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Longitud de los telómeros Relación entre longitud de telómeros y senescencia: reloj biológico Células germinales (TERT+) Células somáticas (tert-) TERT Transformación (malignización) >250 TERT+ / ALT 30 - 50 50 Senescencia Células inmortales Crisis Duplicaciones celulares in vitro © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Telomerasa y cáncer Transformación TERT+ / ALT • Telómeros cortos pero estables • Actividad telomerasa en células cancerosas (>90%) – Inducción tardía y variable – Mecanismo ALT si no hay telomerasa (<10%) • Células sin telomerasa son difíciles de transformar – Sólo hay vía ALT para mantener telómeros La ausencia de telomerasa es una defensa natural contra el cáncer © Gonzalo Claros (Dept. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga) http://www.nitrogeno.uma.es/bmbq/AV_BMA/ Telomerasa y biotecnología: Dr Jekyll y Mr Hyde • Expresión ectópica de TERT – Evita degeneración celular • Diseño de fármacos – Inhibidores de telomerasa • Diagnóstico – Detección de telomerasa en células somáticas • Terapia génica – Cromosomas artificiales Inmortalización de tumores ¿Inducción del oncogén c-myc? Inhibición de células somáticas con telomerasa Ineficaz contra tumores con ALT Presencia de telomerasa en ciertas enfermedades benignas Inducción tardía Estabilidad tras varias duplicaciones celulares