READ HIGHLIGHTED CHANGES syphagen TPHA Indirect hemagglutination test for the detection of specific antibodies to Treponema pallidum in human serum or plasma. Principle Stabilized chicken erythrocytes are sensitized with an antigenic extract of Treponema pallidum (Nichols strain). These cells will agglutinate with specific antibodies present in either the serum or plasma of syphilitic patients. Non-specific reactions are detected by the unsensitized control reagent. Non-pathogenic treponemal antibodies are absorbed by an extract of Reiter’s treponemes included in the diluent solution. Components REF 300615700. a) b) c) d) e) Antigen reagent: 1 x 15 ml. Suspension of sensitized chicken erythrocytes. Ready to use. Contains < 0.1% sodium azide. Control reagent: 1 x 15 ml. Suspension of unsensitized chicken erythrocytes. Ready to use. Contains < 0.1% sodium azide. Diluent solution: 1 x 50 ml. Phosphate buffered saline solution containing soluble components of T. Reiter and stabilizing agents. Contains < 0.1% sodium azide. Positive control: 1 x 2.5 ml. Immune rabbit serum. Prediluted to 1:20. Refer to the vial label for titer and acceptable range. Contains < 0.1% sodium azide. Negative control: 1 x 2.5 ml. Normal rabbit serum. Prediluted to 1:20. Contains < 0.1% sodium azide. Precautions syphagen TPHA is intended for IN VITRO diagnostic use. The reagents contain sodium azide as a preservative. Azides may react with metal plumbing forming explosive components. Upon disposal, please flush abundantly with water. Dispose all used materials in a suitable biohazardous waste container. Hazard class Not classified. Hazard statements None. Precautionary statements P280: Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. P305+351+338: IF IN EYES rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. Storage The reagents will remain stable until the expiration date shown on the label if stored at 2-8°C. Do not freeze. Material required not provided BIOKIT, S.A. - www.biokit.com Can Malé s/n - 08186 Lliçà d'Amunt - Barcelona - Spain Round-bottom microtiter plates (U-shapped), automatic pipettes. Sample collection Serum: 3800-1645 R01 04/15 28 Use fresh serum. Serum may be stored at 2-8°C for 5 days. For longer periods serum samples should be frozen (-20°C). 1 Plasma: Although serum is the specimen of choice for all tests for syphilis, for screening purposes in blood banks, EDTA plasma samples may be used. Other anticoagulants should be evaluated before use. Plasma can be stored at 2-8°C and tested within 72 hours of blood collection. PROCEDURE Quality control: Before performing a set of determinations it is advisable to test the reagents with each of the controls included in the kit, following the steps outlined in the corresponding section. If expected results are not obtained, do not use the kit. QUALITATIVE TEST Allow the reagents to reach room temperature. Ensure that antigen and control reagents are throughly resuspended. Each test requires 4 wells, 2 of which will be used for sample dilution. See Table 1. 1. Add 25 µl of diluent to well 1, 100 µl to well 2 and 25 µl to each of wells 3 and 4. 2. Add 25 µl of sample to well 1. Mix the contents of well 1 and transfer 25 µl to well 2. Mix and transfer 25 µl from well 2 to well 3, mix and discard 25 µl from well 3. Transfer a further 25 µl from well 2 to well 4, mix and discard 25 µl from well 4. 3. Add 75 µl of control reagent to well 3 and 75 µl of antigen reagent to well 4. 4. Mix the contents of the wells by tapping the sides of the plate or by using a plate shaker for at least 30 seconds. 5. Cover the plate and incubate for 45-60 minutes at room temperature. Avoid any source of vibration and keep away from heat. 6. Read results. Use of controls: Include the positive and negative controls in each series of samples taking into account that the controls are prediluted to 1:20. Add 25 µl of each control directly into wells 3 and 4. Do not add any diluent solution. Well no. 1 2 3 Control 4 Test Diluent solution µl 25 100 25 25 Sample µl 25 25 Mix and Transfer µl Sample dilution 25 25 25 25 1:2 1:10 1:20 1:20 Control reagent µl - - 75 - Antigen reagent µl - - - 75 1:80 1:80 Final dilution INCUBATE FOR 45-60 MINUTES AT ROOM TEMPERATURE Table 1 2 27 QUANTITATIVE TEST Qualitative test Wells 1-4 standard procedure Each test requires 8 wells. Use the 1:10 sample dilution prepared for the initial qualitative test (well 2). See Table 2. Wells 1-3 optional procedure Well no. 1 2 3 4 Well no. Diluent solution µl 25 100 25 25 Diluent solution µl 190 Sample µl 25 Sample µl 10 Mix and transfer 25 µl 1 2 3 1:20 1:20 75 Mix and transfer 25 µl Sample dilution 1:2 1:10 1:20 Control reagent µl 1:20 Sample dilution 75 Control reagent µl Antigen reagent µl 75 Final dilution 1:20 1:80 Final dilution 1:80 Wells 1-4 Qualitative test Wells 5-12 Quantitative test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Diluent solution µl 25 100 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Sample µl 25 1:40 1:80 75 75 Mix and transfer 25 µl Control reagent µl 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 75 Antigen reagent µl 75 Final dilution 75 75 3. Add 75 µl of antigen reagent to wells 1-8. 4. Mix the contents of the wells by tapping the sides of the plate or by using a plate shaker for at least 30 seconds. 5. Cover the plate and incubate for 45-60 minutes at room temperature. Avoid any source of vibration and keep away from heat. 6. Read results. Use of positive control: Well no. 1:160 1:320 Transfer 25 µl of the 1:10 sample dilution made in the qualitative test to well 1. Mix the contents of well 1 and transfer 25 µl to well 2. Mix and continue this preparation of serial two-fold dilutions through well 8. Discard 25 µl from well 8. NOTE: If the qualitative test has not been performed, perform dilutions as in the qualitative test. Then, add 25 µl of diluent to wells 5 to 12. Mix and transfer 25 µl from well 4 to 5 and continue this preparation of serial two-fold dilutions through well 12. Discard 25 µl from well 12. Add 75 µl of control reagent to well 3 and 75 µl of antigen reagent to wells 4-12. Perform next steps as in the quantitative test. Qualitative (4 wells) / Quantitative test 1:2 1:10 1:20 1:20 2. 1:80 Table/Tabla/Tabelle/Table/Tabella/Tabela 1 Sample dilution Add 25 µl of diluent to wells 1 to 8. 75 Antigen reagent µl 1:80 1. 75 75 75 75 1:80 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 1:20480 Include the positive control in each series of samples taking into account that it is prediluted to 1:20. See Table 3. Add 25 µl of diluent to wells 2 to 8. Add 50 µl of control directly into well 1. Do not add any diluent in this well. Transfer 25 µl from well 1 to well 2, mix and continue as in the quantitative test. Reading of the results 4+ : Smooth mat of agglutinated cells covering the entire bottom of the well, sometimes with folded edges. 3+ : Smooth mat of agglutinated cells partially covering the bottom of the well. 2+ : Smooth mat of agglutinated cells surrounded by a ring of cells. Table/Tabla/Tabelle/Table/Tabella/Tabela 2 1+ : Smooth mat of agglutinated cells surrounded by a heavy ring of cells. Positive control - Quantitative test ± : Button of cells with a small central opening. : Button of cells with or without a very small hole in the center. Well no. 1 2 3 4 5 6 7 8 25 25 25 25 25 25 25 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 75 75 75 75 Diluent solution µl Positive control 1:20 Positive : from 4+ to 1+ Borderline : ± Negative : 50 NOTE: Any agglutination seen in the control well (well 3) indicates the presence of non-specific agglutinins. Although non-specific reactions are very rare using chicken erythrocytes, a sample giving this result can not be interpreted with this kit. Mix and transfer 25 µl Sample dilution Antigen reagent µl Final dilution 1:80 1:160 75 1:320 1:640 1:1280 1:2560 75 1:640 1:1280 1:2560 75 75 1:5120 1:10240 Interpretation of the results The negative control should give a negative result. The positive control should give a positive result in the qualitative test. For the quantitative test, refer to the vial label for titer and acceptable range. Table/Tabla/Tabelle/Table/Tabella/Tabela 3 Qualitative test: A positive result (1:80 final dilution or higher) indicates the presence of antibodies to T. pallidum, resulting from a past or present infection. 26 3 A negative result (1:80 final dilution) indicates the absence of antibodies to T. pallidum (see limitations of the procedure). A borderline result in the qualitative test may correspond to a low level of antibodies in early stages of syphilis or to residual antibodies in treated syphilis. In this case a further sample should be tested to demonstrate a rise in the antibody titer. Quantitative test: The approximate titer will correspond to the highest final dilution giving a positive reaction. Teste qualitativo: Um resultado positivo (diluição final 1:80 ou superior) indica a presença de anticorpos anti-T. Pallidum, que resultam de uma infecção passada ou presente. Um resultado negativo (diluição final 1:80) indica a ausência de anticorpos anti-T. Pallidum (ver as limitações da técnica). Um teste qualitativo com resultado duvidoso pode corresponder a um baixo nível de anticorpos próprio dos estados iniciais da sífilis ou a anticorpos residuais de uma sífilis já tratada. Neste caso, deve-se testar uma amostra posterior para demonstrar um possível aumento no título de anticorpos. Limitations of the procedure Teste quantitativo: - O título aproximado corresponderá ao da diluição final mais alta que ainda apresente um resultado claramente positivo. - Although serum is the specimen of choice for all tests for syphilis, for screening purposes in blood banks, EDTA plasma samples may be used. However, some incidence of false positive reactions has been reported. Therefore, serum must be used for all repeat testing of initial positive or borderline results obtained from plasma samples. Specific antibodies may persist for a long period of time, even after successful treatment of the disease. In order to assess the response to treatment, the use of a reagin test (RPR reditest) is recommended. The TPHA technique can give cross reactions with other forms of treponemal infections and false positive reactions with samples from patients with infectious mononucleosis, leprosy, autoimmune diseases and drug addiction. Occasionally, in early primary syphilis, the specific antibodies could not be detected by the TPHA technique. Limitações do procedimento - - Performance characteristics Several evaluations have been performed with the syphagen TPHA kit. In one evaluation performed in Germany, the specificity found was 99.6% in front of 695 negative samples (serum and plasma) including samples from patients of different ages, of pregnant women, and also samples that can cause false positive reactions such as lipemic and icteric samples, samples with auto-antibodies and from patients with different infections. In the same evaluation the sensitivity was 100% in front of a panel of 191 known positive samples. In a second evaluation performed in France, 100% of sensitivity and 100% specificity was found in front of 55 positive and 201 negative serum samples, also including samples with heterophile antibodies, rheumatoid factor, EBV and Borrelia. In another evaluation, four commercially available TPHA assays and one TPPA assay were evaluated to determine their ability to detect anti-treponemal antibodies. Of the 235 initially positive specimens used for the sensitivity calculation of syphagen TPHA, 10 gave unspecific reaction with the control reagent, 4 gave indeterminate and 2 negative. The syphagen TPHA gave an initial sensitivity of 99.1% (223/225; 95% confidence interval: 96.8 - 99.9) once excluded the unspecific specimens. After retesting, 7 of the initially unspecific specimens gave positive and 3 of the indeterminate specimens became negative, giving a final sensitivity of 97.8% (227/232; 95% confidence interval: 95.0 - 99.3). The syphagen TPHA was the most sensitive test among the TPHA kits studied. Of the 235 positive specimens, 114 were from individuals of known disease stage and treatment. One specimen gave unspecific with the control reagent and was excluded. The following table indicates the distribution of the 113 remaining specimens (number of positive by syphagen TPHA / total number of specimens). Primary Secondary Early latent Late latent Untreated Treated Untreated Treated Untreated Treated Untreated Treated 31/33 7/7 37/37 5/5 15/15 4/4 4/4 7/8 - Se bem que o soro é a amostra geralmente escolhida para todos os testes de sífilis, também podem ser utilizadas amostras de plasma EDTA para screening em bancos de sangue. Não obstante e, dado que se observa uma relativa incidência de reações falsamente positivas, debe-se repetir o teste daquelas amostras que, inicialmente, derem resultado positivo ou duvidoso, utilizando, neste caso, o soro do paciente. Os anticorpos específicos podem persistir durante um longo período de tempo, inclusive após o tratamento da doença. Para avaliar a resposta ao tratamento, recomenda-se utilizar testes reagínicos (RPR reditest). A técnica TPHA pode apresentar reações cruzadas com outras formas de infecções treponêmicas e apresentar reações falsamente positivas com amostras de pacientes afetados por mononucleose, lepra e doenças auto-imunes, além de indivíduos adictos às drogas. Ocasionalmente, nos estados iniciais da sífilis, os anticorpos específicos não podem ser detectados pela técnica de TPHA. Características funcionais Foram realizadas várias avaliações com o kit syphagen TPHA. Em uma avaliação realizada na Alemanha, se obteve uma especificidade de 99,6% ao analisar 695 amostras negativas (soro e plasma), incluindo amostras de pacientes de diferentes idades, mulheres grávidas e também amostras que podem produzir reações falso-positivas tais como soros lipêmicos ou ictéricos, com auto-anticorpos e amostras de infecções diversas. Na mesma avaliação foi obtida uma sensibilidade de 100% com um painel de 191 amostras positivas. Numa segunda avaliação realizada na França, com um painel de 55 soros positivos e 201 negativos que incluia também amostras com anticorpos heterófilos, fator reumatóide, EBV e Borrélia, a sensibilidade e a especificidade obtidas foram de 100%. Em outra avaliação, 4 ensaios de TPHA disponíveis comercialmente e um ensaio de TPPA foram avaliados para determinar a sua capacidade para detectar anticorpos anti-treponema. Das 235 amostras inicialmente positivas usadas para o cálculo de sensibilidade do syphagen TPHA, 10 mostraram reação inespecífica com o reativo controle, 4 deram resultado indeterminado e 2 negativo. O syphagen TPHA mostrou uma sensibilidade inicial de 99,1% (223/225; 95% intervalo de confiança: 96,8 - 99,9) uma vez excluídas as amostras inespecíficas. Depois da recomprovação, 7 das amostras inicialmente inespecíficas deram resultado positivo e 3 das amostras indeterminadas foram negativas, resultando uma sensibilidade final de 97,8% (227/232; 95% intervalo de confiança: 95,0 - 99,3). O syphagen TPHA foi o teste mais sensível entre os testes de TPHA estudados. Das 235 amostras positivas, 114 eram de indivíduos com estádio da doença e tratamento conhecidos. Uma amostra deu resultado inespecífico com o reativo controle e foi excluída. O quadro seguinte indica a distribuição das 113 amostras restantes (número de positivas com syphagen TPHA / número de amostras totais). Primária Secundária Latente precoce Latentetardia Não tratada Tratada Não tratada Tratada Não tratada Tratada Não tratada Tratada 31/33 7/7 37/37 5/5 15/15 4/4 4/4 7/8 Bibliografia 4 Ver “References” do texto inglês. 25 TESTE QUANTITATIVO References Para cada teste são necessários 8 pocinhos. Utilizar a diluição da amostra a 1:10 preparada no teste qualitativo inicial (pocinho 2). Ver Tabela 2. 1. Biosafety in Microbiological 5th Edition, 2007. 1. Distribuir 25 µl de diluente nos pocinhos de 1 a 8. 2. 2. Transferir 25 µl da diluição a 1:10 da amostra preparada para a técnica qualitativa ao pocinho 1. Misturar o conteúdo do pocinho 1 e transferir 25 µl para o pocinho 2. Misturar e continuar com esta preparação de diluições duplas seriadas até alcançar o pocinho 8. Descartar 25 µl do pocinho 8. Garner MF, Backhouse JL, Daskalopoulos G, Walsh JL. The Treponema pallidum Haemagglutination (TPHA) in Biological False Positive and Leprosy Sera. J Clin Path 26: 258-260, 1973. 3. Hagedorn HJ, Naumann P. Moderne Serodiagnostik der Syphilis. Dtsch med Wschr 104: 209-214, 1979. 4. Larsen SA, Hambie EA, Pettit DE, Perryman MW, Kraus SJ. Specificity, Sensitivity, and Reproducibility Among the Fluorescent Treponemal Antibody-Absorption Test, the Microhemagglutination Assay for Treponema pallidum Antibodies, and the Hemagglutination Treponemal Test for Syphilis. J Clin Microbiol 14: 441-445, 1981. 5. Rathlev T. Haemagglutination Test Utilizing Pathogenic Treponema pallidum for the Sero-diagnosis of Syphilis. Brit J Vener Dis 43: 181-185, 1967. 6. Sequeira PJL, Eldridge AE. Treponemal Haemagglutination Test. Brit J Vener Dis 49: 242-248, 1973. 7. Tomizawa T. Hemagglutination Tests for Diagnosis of Syphilis. A preliminary report. Jap J Med Sci Biol 19: 305-308, 1966. 8. Tomizawa T, Kasamatsu S, Yamaya S. Usefulness of the Hemagglutination Test Using Treponema pallidum Antigen (TPHA) for the Serodiagnosis of Syphilis. Jap J Med Sci Biol 22: 341-350, 1969. 9. Cole M, Dean L, Perry KR, Parry JV. Five Syphilis Agglutination Assays. MHRA Evaluation Report 04007, 2004. 3. Acrescentar 75 µl de reativo antígeno nos pocinhos de 1 a 8. 4. Misturar o conteúdo dos pocinhos dando leves golpes nas laterais da placa, ou utilizar um agitador de placas durante, no mínimo, 30 segundos. 5. Cobrir a placa e incubar durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Evitar qualquer movimento da placa, mantendo-a distante de fontes de calor. 6. Ler os resultados. NOTA: No caso de não se efetuar o teste qualitativo, deve-se preparar as diluições como no teste qualitativo. A seguir, distribuir 25 µl de diluente nos pocinhos de 5 a 12. Misturar e transferir 25 µl do pocinho 4 ao 5 e continuar com esta preparação de diluições duplas seriadas até alcançar o pocinho 12. Descartar 25 µl do pocinho 12. Adicionar 75 µl do reativo controle no pocinho 3 e 75 µl do reativo antígeno nos pocinhos de 4 a 12. Efetuar os passos seguintes, utilizando a teste quantitativo. Utilização do controle positivo: and Biomedical Laboratories. CDC/NIH manual, Incluir o controle positivo em cada uma das séries de amostras tendo em conta que o mesmo já foi previamente diluído a 1:20. Ver Tabela 3. Adicionar 25 µl de diluente nos pocinhos 2 a 8. Adicionar 50 µl de controle diretamente no pocinho 1. Não colocar diluente neste pocinho. Transferir 25 µl do pocinho 1 ao 2, misturar e seguir o processo como na técnica quantitativa. Leitura dos resultados 4+ : Manto homogêneo de células que cobre o fundo do pocinho, as vezes com margens irregulares. 3+ : Manto homogêneo de células que cobre parcialmente o fundo do pocinho. 2+ : Manto homogêneo de células rodeado por um anel de hemácias. 1+ : Manto homogêneo de células rodeado por um evidente anel de hemácias. ± : Botão de hemácias com uma pequena abertura central. : Botão de hemácias com uma abertura central muito pequena ou botão totalmente compacto. Positivo Duvidoso Negativo : de 4+ a 1+ :± : NOTA: Qualquer aglutinação que se observe no pocinho do reativo controle (pocinho 3) indica a presença de aglutininas inespecíficas. Se bem que as reações inespecíficas sejam pouco freqüentes quando se utilizam hemácias de frango, uma amostra que apresente este tipo de reação não deve ser interpretada com este kit. Interpretação dos resultados O controle negativo deve dar resultado negativo. O controle positivo deve dar resultado positivo no teste qualitativo. Para o teste quantitativo, ver título e limite aceitável na etiqueta do frasco. 24 5 LEER CAMBIOS SOMBREADOS Plasma: syphagen TPHA Test de hemaglutinación pasiva para la detección de anticuerpos específicos anti-Treponema pallidum en suero o plasma humano. Principio Los hematíes de pollo estabilizados se sensibilizan con un extracto antigénico de Treponema pallidum (cepa Nichols). Estos hematíes aglutinarán con los anticuerpos específicos presentes en el suero o plasma de pacientes afectos de sífilis. Las reacciones no específicas se detectan con el reactivo control no sensibilizado. Los anticuerpos del grupo Treponema no específicos de la sífilis se absorben con un extracto de treponema Reiter incluido en la solución diluyente. Se bem que o soro é a amostra geralmente escolhida para todos os testes de sífilis, também podem ser utilizadas amostras de plasma EDTA para screening em bancos de sangue. Outros tipos de anticoagulantes devem ser testados antes de serem usados. O plasma pode ser conservado entre 2-8°C e deveria realizar-se o teste antes de passadas 72 horas da extração. PROCEDIMENTO Controle de qualidade: Antes de efetuar uma série de determinações é aconselhável testar os reativos com cada um dos controles incluídos no kit, seguindo os passos descritos na seção correspondente. Se os resultados esperados não são obtidos, não utilize o kit. TESTE QUALITATIVO Componentes Deixar que os reativos alcancem a temperatura ambiente. Comprovar que o reativo antígeno e o reativo controle estejam bem ressuspendidos. Para cada teste são necessários 4 pocinhos, dos quais 2 serão utilizados para a diluição da amostra. Ver Tabela 1. REF 300615700. 1. Distribuir 25 µl de diluente no pocinho 1, 100 µl no pocinho 2 e 25 µl nos pocinhos 3 e 4. a) 2. Acrescentar 25 µl da amostra no pocinho 1. Misturar o conteúdo do pocinho 1 e transferir 25 µl para o pocinho 2. Misturar e transferir 25 µl do pocinho 2 para o pocinho 3, misturar e descartar 25 µl do pocinho 3. Transferir outros 25 µl do pocinho 2 para o pocinho 4, misturar e descartar 25 µl do pocinho 4. 3. Acrescentar 75 µl de reativo controle no pocinho 3 e 75 µl de reativo antígeno no pocinho 4. 4. Misturar o conteúdo dos pocinhos dando leves golpes nas laterais da placa, ou utilizar um agitador da placas durante, no mínimo, 30 segundos. 5. Cobrir a placa e incubar durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Evitar qualquer movimento da placa, mantendo-a distante de fontes de calor. 6. Ler os resultados. b) c) d) e) Reactivo antígeno: 1 x 15 ml. Suspensión de hematíes de pollo sensibilizados. Listo para su uso. Contiene < 0,1% de azida sódica. Reactivo control: 1 x 15 ml. Suspensión de hematíes de pollo no sensibilizados. Listo para su uso. Contiene < 0,1% de azida sódica. Solución diluyente: 1 x 50 ml. Tampón fosfato salino que contiene componentes solubles de T. Reiter y agentes estabilizadores. Contiene < 0,1% de azida sódica. Control positivo: 1 x 2,5 ml. Suero de conejo inmune. Prediluido a 1:20. Ver el título y rango establecido en la etiqueta del vial. Contiene < 0,1% de azida sódica. Control negativo: 1 x 2,5 ml. Suero de conejo no inmune. Prediluido a 1:20. Contiene < 0,1% de azida sódica. Precauciones syphagen TPHA es sólo para el diagnóstico IN VITRO. Los reactivos contienen azida sódica como conservante. Las azidas pueden reaccionar con tuberías y desagües metálicos dando lugar a compuestos explosivos. Al tirar los restos de reactivos, dejar correr agua suficiente. Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Clase de peligro No clasificado. Indicaciones de peligro Ninguna. Consejos de prudencia P280: Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección. P305+351+338: EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. Utilização dos controles: Incluir os controles positivo e negativo em cada série de amostras, tendo em conta que os mesmos já foram previamente diluídos a 1:20. Adicionar 25 µl de cada um dos controles diretamente nos pocinhos 3 e 4. Não acrescentar solução diluente. Pocinho nº 1 2 3 Controle 4 Teste Solução diluente µl 25 100 25 25 Amostra µl 25 25 25 25 25 Conservación Misturar e transferir µl Los reactivos permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se almacenan entre 2 y 8°C. No congelar. Diluição da amostra 1:2 1:10 1:20 1:20 Material necesario no incluido Reativo controle µl - - 75 - Placas de microtitulación con fondo en U (redondo), pipetas automáticas. Reativo antígeno µl - - - 75 Recolección de la muestra Diluição final 1:80 1:80 Suero: 25 INCUBAR DURANTE 45-60 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE Usar suero fresco. Los sueros pueden ser conservados durante 5 días entre 2 y 8°C. Si es por un período de tiempo más largo los sueros deben ser congelados (-20°C). 6 Tabela 1 23 LER ALTERAÇÕES DESTACADAS syphagen TPHA Teste de hemaglutinação passiva para a detecção de anticorpos específicos anti-Treponema pallidum no soro ou plasma humano. Princípio Hemácias de frango estabilizadas são sensibilizadas com um extrato antigênico de Treponema pallidum (cepa Nichols). Estas hemácias se aglutinarão com os anticorpos específicos presentes no soro ou plasma daqueles pacientes afetados pela sífilis. As reações inespecíficas são detectadas por meio do reativo controle não sensibilizado. Os anticorpos do grupo Treponema não específicos da sífilis são absorvidos com um extrato de treponema Reiter incluído na solução diluente. Componentes REF 300615700. a) b) c) d) e) Reativo antígeno: 1 x 15 ml. Suspensão de hemácias de frango sensibilizadas. Pronto para usar. Contém < 0,1% de azida sódica. Reativo controle: 1 x 15 ml. Suspensão de hemácias de frango não sensibilizadas. Pronto para usar. Contém < 0,1% de azida sódica. Solução diluente: 1 x 50 ml. Tampão fosfato salino que contém componentes solúveis de T. Reiter e agentes estabilizadores. Contém < 0,1% de azida sódica. Controle positivo: 1 x 2,5 ml. Soro imune de coelho. Pré-diluído a 1:20. Ver título e limite aceitável na etiqueta do frasco. Contém < 0,1% de azida sódica. Controle negativo: 1 x 2,5 ml. Soro não imune de coelho. Pré-diluído a 1:20. Contém < 0,1% de azida sódica. Precauções syphagen TPHA é só para o diagnóstico IN VITRO. Os reativos deste kit contém azida sódica como conservante. A azida sódica pode reagir com encanamentos de esgoto que contenham chumbo ou cobre, originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao descartar os restos de reativos, fazê-lo em abundante volume de água para evitar o acúmulo de azidas. Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Classe de perigo Não classificado. Advertências de perigo Nenhuma. Recomendações de prudência P280: Usar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial. P305+351+338: SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contato, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar. Plasma: Aunque el suero es la muestra de elección para todos los tests de sífilis, pueden utilizarse muestras de plasma EDTA para screening en bancos de sangre. Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. El plasma puede ser conservado entre 2-8°C y debe realizarse el test antes de transcurridas 72 horas de la extracción. PROCEDIMIENTO Control de calidad: Antes de realizar una serie de determinaciones es aconsejable controlar los reactivos con cada uno de los controles incluidos en el kit, siguiendo los pasos descritos en la sección correspondiente. Si no se obtienen los resultados esperados, no utilice el kit. TEST CUALITATIVO Dejar que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Asegurarse de que el reactivo antígeno y el reactivo control estén bien resuspendidos. Para cada test se necesitan 4 pocillos, 2 de los cuales se utilizarán para la preparación de la dilución de la muestra. Ver Tabla 1. 1. Distribuir 25 µl de diluyente en el pocillo 1, 100 µl en el pocillo 2 y 25 µl en cada uno de los pocillos 3 y 4. 2. Añadir 25 µl de la muestra en el pocillo 1. Mezclar el contenido del pocillo 1 y transferir 25 µl al pocillo 2. Mezclar y transferir 25 µl del pocillo 2 al pocillo 3, mezclar y desechar 25 µl del pocillo 3. Transferir otros 25 µl del pocillo 2 al pocillo 4, mezclar y desechar 25 µl del pocillo 4. 3. Añadir 75 µl de reactivo control al pocillo 3 y 75 µl de reactivo antígeno al pocillo 4. 4. Mezclar el contenido de los pocillos dando ligeros golpes en los lados de la placa o utilizar un agitador de placas durante al menos 30 segundos. 5. Cubrir la placa e incubar durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Evitar cualquier movimiento de la placa y mantener lejos de cualquier fuente de calor. 6. Leer los resultados. Utilización de los controles: Incluir los controles positivo y negativo en cada serie de muestras teniendo en cuenta que los controles ya están prediluidos 1:20. Añadir 25 µl de cada control directamente en los pocillos 3 y 4. No añadir solución diluyente. Pocillo nº 1 2 3 Control 4 Prueba Solución diluyente µl 25 100 25 25 Muestra µl 25 Conservação Dilución de la muestra Os reativos permanecem estáveis até a data de validade indicada na etiqueta, se forem conservados entre 2 e 8C. Não congelar. Material necessário não incluído Placas de microtitulação com fundo em forma de U (redondo), pipetas automáticas. Coleta da amostra 25 Mezclar y Transferir µl 25 25 25 25 1:2 1:10 1:20 1:20 Reactivo control µl - - 75 - Reactivo antígeno µl - - - 75 1:80 1:80 Dilución final INCUBAR DURANTE 45-60 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE Soro: Utilizar soro fresco. Los soros podem ser conservados por 5 días entre 2 e 8C. Para guardar por um período mais longo os soros devem ser congelados (-20°C). 22 Tabla 1 7 TEST CUANTITATIVO Se necesitan 8 pocillos para cada test. Utilizar la dilución 1:10 de la muestra preparada en el test cualitativo inicial (pocillo 2). Ver Tabla 2. 1. Distribuir 25 µl de diluyente en los pocillos 1 al 8. 2. Transferir 25 µl de la dilución 1:10 de la muestra preparada en el test cualitativo al pocillo 1. Mezclar el contenido del pocillo 1 y transferir 25 µl al pocillo 2. Mezclar y continuar esta preparación de diluciones dobles seriadas hasta el pocillo 8. Desechar 25 µl del pocillo 8. 3. Añadir 75 µl de reactivo antígeno en los pocillos 1-8. 4. Mezclar el contenido de los pocillos dando ligeros golpes en los lados de la placa o utilizar un agitador de placas durante al menos 30 segundos. 5. Cubrir la placa e incubar durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Evitar cualquier movimiento y mantener lejos de cualquier fuente de calor. 6. Leer los resultados. Un risultato negativo (diluizione finale 1:80) indica l’assenza di anticorpi anti-T. pallidum (leggere le limitazioni della metodica). Un risultato borderline può corrispondere ad uno stato iniziale della sifilide o ad una concentrazione di anticorpi residui presenti nel siero per una vecchia patologia sifilitica. In questo caso dovrà essere testato un nuovo campione del paziente, per dimostrare un eventuale aumento del titolo anticorpale, oppure potranno essere effettuati test di altra natura. Test quantitativo: Un titolo approssimato corrisponderà alla più alta diluizione finale alla quale è presente una reazione positiva. Limitazioni della procedura - - NOTA: Si el test cualitativo no se ha llevado a cabo, realizar las diluciones como en el test cualitativo. Después, distribuir 25 µl de diluyente en los pocillos 5 al 12. Mezclar y transferir 25 µl del pocillo 4 al 5 y proceder con esta preparación de diluciones dobles seriadas hasta el pocillo 12. Desechar 25 µl del pocillo 12. Añadir 75 µl de reactivo control en el pocillo 3 y 75 µl de reactivo antígeno en los pocillos 4-12. Proceder con los siguientes pasos como en el test cuantitativo. Utilización del control positivo: Incluir el control positivo en cada serie de muestras teniendo en cuenta que está prediluido 1:20. Ver Tabla 3. Añadir 25 µl de diluyente en los pocillos 2 a 8. Añadir 50 µl de control positivo directamente en el pocillo 1. No añadir diluyente en este pocillo. Transferir 25 µl del pocillo 1 al pocillo 2, mezclar y continuar como en el test cuantitativo. Lectura de los resultados - Il siero è il materiale preferito per tutti i test della sifilide, ma può anche essere usato plasma con EDTA per lo screening nelle emoteche. Nonostante ciò, sono state riscontrate alcune reazioni falsamente positive. I test risultati positivi o borderline effettuati su plasma devono essere ripetuti su siero. Anticorpi specifici possono persistere per un lungo periodo di tempo, anche dopo un efficace trattamento farmacologico contro tale patologia. Per valutare la risposta al trattamento, è raccomandato l’uso di un test reaginico (RPR reditest). La tecnica TPHA può dare origine a reazioni crociate con altre forme di infezione da Treponema, e reazioni falsamente positive con campioni provenienti da pazienti affetti da mononucleosi (EBV), lebbra, malattie autoimmuni e tossicomani. Occasionalmente, nello stadio iniziale della patologia, gli anticorpi specifici possono non essere individuati con la tecnica TPHA. Caratteristiche di funzionalità Sono state effettuate diverse valutazioni con il kit syphagen TPHA. In una delle valutazioni, eseguita in Germania, è stata ottenuta una specificità del 99,6% con l’analisi di 695 campioni (siero e plasma) che comprendevano campioni di individui di età diverse, di donne in stato di gravidanza e anche campioni che potevano provocare reazioni falsamente positive, come quelli lipemici e itterici, con autoanticorpi, e campioni di varie infezioni. Nella stessa valutazione la sensibilità ottenuta su 191 campioni già noti come positivi è stata del 100%. 4+ : Tapiz homogéneo de células aglutinadas que cubre el fondo del pocillo, a veces con bordes irregulares. In una seconda valutazione eseguita in Francia, su un gruppo di 55 campioni di siero positivo e 201 di siero negativo, comprendente anche siero con anticorpi eterofili, fattore reumatoide, EBV e Borrelia, la sensibilità e la specificità ottenuta sono state del 100%. 3+ : Tapiz homogéneo de células aglutinadas que cubre parcialmente el fondo del pocillo. In un’altra prova, 4 test di TPHA disponibili in commercio e un test di TPPA vennero valutati per determinarne la capacità di rivelare anticorpi anti-treponema. Dei 235 campioni inizialmente positivi usati per il calcolo di sensibilità del syphagen TPHA, 10 mostrarono una reazione non specifica con il reagente di controllo, 4 diedero un risultato indeterminato e 2 negativo. Il syphagen TPHA mostrò una sensibilità iniziale del 99,1% (223/225; intervallo de confidenza del 95%: 96,8 - 99,9) una volta esclusi i campioni non specifici. Dopo un secondo test, 7 dei campioni inizial mente non specifici diedero un risultato positivo e 3 dei campioni indeterminati furono negativi, risultando una sensibilità finale del 97,8% (227/232; intervallo di confidenza del 95%: 95,0 - 99,3). Il syphagen TPHA fu il più sensibile dei test di TPHA studiati. Dei 235 campioni positivi, 114 erano di individui con uno stadio di malattia e un trattamento noti. Un campione diede risultato non specifico con il reagente di controllo e venne escluso. La tavola che segue indica la distribuzione dei 113 campioni restanti (numero di campioni positivi con syphagen TPHA / numero di campioni totale). 2+ : Tapiz homogéneo de células aglutinadas rodeado por un anillo de hematíes. 1+ : Tapiz homogéneo de células aglutinadas rodeado por un patente anillo de hematíes. ± : Botón de hematíes con una pequeña abertura central. : Botón de hematíes con una muy pequeña abertura central o botón totalmente compacto. Positivo Dudoso Negativo : desde 4+ a 1+ :± : NOTA: Cualquier aglutinación observada en el pocillo del reactivo control (pocillo 3) indica la presencia de aglutininas no específicas. Aunque las reacciones inespecíficas son poco frecuentes cuando se utilizan hematíes de pollo, una muestra con este tipo de reacción no puede interpretarse con este kit. Primaria Secondaria Interpretación de los resultados Latente precoce El control negativo debe dar un resultado negativo. El control positivo debe dar un resultado positivo en el test cualitativo. Para el test cuantitativo, ver el título y rango establecido en la etiqueta del vial. Latente tardiva Test cualitativo: Un resultado positivo (dilución final 1:80 o superior) indica la presencia de anticuerpos anti-T. pallidum, que resultan de una infección pasada o presente. 8 Non trattata Trattata Non trattata Trattata Non trattata Trattata Non trattata Trattata 31/33 7/7 37/37 5/5 15/15 4/4 4/4 7/8 Bibliografia Vedere “References” nel testo inglese. 21 TEST QUANTITATIVO Ogni test richiede 8 pozzetti. Usare il campione diluito 1:10, preparato per il test qualitativo (pozzetto 2). Vedere Tabella 2. 1. Aggiungere 25 µl di diluente dal pozzetto 1 al pozzetto 8. 2. Trasferire 25 µl del campione diluito 1:10 ottenuto nel precedente test qualitativo nel pozzetto 1. Mescolare il contenuto del pozzetto 1 e trasferire 25 µl nel pozzetto 2. Mescolare e continuare la preparazione della serie di diluizioni al raddoppio fino al pozzetto 8. Scartare 25 µl dal pozzetto 8. 3. Aggiungere 75 µl di reattivo antigene nei pozzetti da 1 ad 8. 4. Mescolare il contenuto dei pozzetti dando leggeri colpi ai lati della piastra, oppure utilizzando un agitatore di piastra per minimo 30 secondi. 5. Coprire la piastra ed incubare per 45-60 minuti a temperatura ambiente. Evitare le vibrazioni e mantenere lontano da fonti di calore. 6. Leggere i risultati. NOTA: Se il test qualitativo non è stato ancora effettuato, eseguire le diluizioni come nel test qualitativo; poi aggiungere 25 µl di diluente dal pozzetto 5 all’12. Mescolare e trasferire 25 µl dal pozzetto 4 al 5 e continuare la preparazione della serie di diluizioni al raddoppio fino al pozzetto 12. Scartare 25 µl dal pozzetto 12. Aggiungere 75 µl di reattivo controllo al pozzetto 3 e 75 µl di reattivo antigene dal pozzetto 4 all’12. Proseguire poi con le successive fasi come nel test quantitativo. Uso del controllo positivo: Includere il controllo positivo in ogni serie di campione tenendo conto che è prediluito 1:20. Vedere Tabella 3. Aggiungere 25 µl di diluente dal pozzetti 2 al 8. Aggiungere 50 µl di controllo direttamente nel pozzetto 1. Non aggiungere diluente in questo pozzetto. Trasferire 25 µl dal pozzetto 1 al 2, mescolare e continuare come nel test quantitativo. Lettura dei risultati 4+ : Tappeto omogeneo di cellule che copre il fondo del pozzetto, talvolta con contorni irregolari. 3+ : Tappeto omogeneo di cellule che copre parzialmente il fondo del pozzetto. 2+ : Tappeto omogeneo di cellule circondato da un anello di cellule. 1+ : Tappeto omogeneo di cellule circondato da un marcato anello di cellule. ± : Bottone di cellule con una piccola apertura centrale. : Bottone di cellule con o senza una piccolissima apertura nel centro. Positivo : da 4+ a 1+ Borderline : ± Negativo : NOTA: Qualunque agglutinazione osservate nel pozzetto del reattivo controllo (pozzetto 3) indicano la presenza di agglutinine non specifiche. Comunque reazioni non specifiche sono molto rare usando emazie di pollo, un campione che dà questo risultato non può essere interpretato con queste kit. Un resultado negativo (dilución final 1:80) indica la ausencia de anticuerpos anti-T. pallidum (ver limitaciones de la técnica). Un resultado dudoso en el test cualitativo puede corresponder a un bajo nivel de anticuerpos en estados iniciales de sífilis o a anticuerpos residuales de una sífilis ya tratada. En este caso se debe probar una nueva muestra para demostrar un posible aumento en el título de anticuerpos. Test cuantitativo: El título aproximado corresponderá a la dilución final más alta que muestre reacción positiva. Limitaciones del procedimiento - - Aunque el suero es la muestra de elección para todos los tests de sífilis, pueden utilizarse muestras de plasma EDTA para screening en bancos de sangre. Sin embargo, y puesto que se ha descrito una relativa incidencia de reacciones falsamente positivas o dudosas, deberá repetirse el test de aquellas muestras inicialmente positivas utilizando el suero del paciente. Los anticuerpos específicos pueden persistir durante un largo período de tiempo, incluso después de haberse tratado la enfermedad. Para evaluar la respuesta al tratamiento, se recomienda hacer uso de los tests reagínicos (RPR reditest). La técnica TPHA puede dar lugar a reaciones cruzadas con otras formas de infecciones treponémicas y a reacciones falsamente positivas con muestras de pacientes afectos de mononucleosis, lepra, drogadictos o enfermedades autoinmunes. Ocasionalmente, en estados iniciales de sífilis, los anticuerpos específicos no pueden ser detectados por la técnica de TPHA. Características funcionales Se han realizado varias evaluaciones con el kit syphagen TPHA. En una de las evaluaciones realizada en Alemania, se obtuvo una especificidad de un 99,6% al analizar 695 muestras (suero y plasma) que incluían muestras de individuos de diferentes edades, de mujeres embarazadas y también muestras que pueden producir reacciones falsamente positivas como son muestras lipémicas e ictéricas, con auto-anticuerpos y muestras de infecciones diversas. En la misma evaluación la sensibilidad obtenida frente a un panel de 191 muestras ya conocidas como positivas fue del 100%. En una segunda evaluación realizada en Francia, con un panel de 55 muestras de sueros positivos y de 201 sueros negativos, que incluía también sueros con anticuerpos heterófilos, factor reumatoide, EBV y Borrelia, se obtuvo una sensibilidad y una especificidad de un 100%. En otra evaluación, 4 ensayos de TPHA disponibles comercialmente y un ensayo de TPPA se evaluaron para determinar su capacidad para detectar anticuerpos anti treponema. De las 235 muestras inicialmente positivas usadas para el cálculo de sensibilidad del syphagen TPHA, 10 mostraron reacción inespecífica con el reactivo control, 4 dieron resultado indeterminado y 2 negativo. El syphagen TPHA mostró una sensibilidad inicial del 99,1% (223/225; 95% intervalo de confianza: 96,8 - 99,9) una vez excluidas las muestras inespecíficas. Después de la recomprobación, 7 de las muestras inicialmente inespecíficas dieron resultado positivo y 3 de las muestras indeterminadas fueron negativas, resultando una sensibilidad final del 97,8% (227/232; 95% intervalo de confianza: 95,0 - 99,3). El syphagen TPHA fue el test más sensible entre los tests de TPHA estudiados. De las 235 muestras positivas, 114 eran de individuos con estadio de la enfermedad y tratamiento conocidos. Una muestra dio resultado inespecífico con el reactivo control y fue excluida. La tabla siguiente indica la distribución de las 113 muestras restantes (número de positivas con syphagen TPHA / número de muestras totales). Primaria Secundaria Interpretazione dei risultati Latente temprana Il controllo negativo deve dare un risultato negativo. Il controllo positivo deve dare un risultato positivo nel test qualitativo. Per il test quantitativo, vedere il titolo e il range prescritto nell’etichetta del flacone. Latente tardía Test qualitativo: Un risultato positivo (diluizione finale 1:80 o superiore) indica la presenza di anticorpi anti-T. pallidum, dovuti ad una passata o presente infezione. 20 No tratada Tratada No tratada Tratada No tratada Tratada No tratada Tratada 31/33 7/7 37/37 5/5 15/15 4/4 4/4 7/8 Bibliografía Ver “References” del texto inglés. 9 HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN Plasma: syphagen TPHA Indirekter Hämagglutinationstest zum Nachweis spezifischer Antikörper gegen Treponema pallidum in Humanserum und –plasma. Prinzip Kükenerythrozyten wurden mit Extrakten von Treponema pallidum (Stamm Nichols) sensibilisiert. Bei Anwesenheit von spezifischen Antikörpern im Serum oder Plasma von Syphilispatienten agglutinieren die Antikörper mit den Erythrozyten. Unspezifische Reaktionen werden durch einen Ansatz mit nichtsensibilisierten Erythrozyten (Kontrollreagenz) nachgewiesen. Nichtpathogene Treponemen-Antikörper werden durch einen im Probendiluent enthaltenen Extrakt aus Reiter-Treponemen absorbiert. Bestandteile REF 300015700. a) b) c) d) e) Antigenreagenz: 1 x 15 ml. Suspension aus Kükenerythrozyten, sensibilisiert mit T. pallidum Antigenextrakten. Gebrauchsfertig. Enthält < 0,1% Natriumazid. Kontrollreagenz: 1 x 15 ml. Suspension aus nichtsensibilisierten Kükenerythrozyten. Gebrauchsfertig. Enthält < 0,1% Natriumazid. Diluent (Absorptionsmedium): 1 x 50 ml. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit löslichen Komponenten von T. Reiter und Stabilisatoren. Enthält < 0,1% Natriumazid. Positive Kontrolle: 1 x 2,5 ml. Immunreaktives Kaninchenserum. 1:20 vorverdünnt. Siehe Titer und zulässiges Intervall auf dem Reagenzflaschenetikett. Enthält < 0,1% Natriumazid. Negative Kontrolle: 1 x 2,5 ml. Normales, nichtreaktives Kaninchenserum. 1:20 vorverdünnt. Enthält < 0,1% Natriumazid. Vorsichtsmaßnahmen syphagen TPHA ist ausschließlich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. Die Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Durch die Reaktion der Azide in Metallabflussrohren können explosive Komponenten entstehen. Mit ausreichend Wasser nachspülen. Alle benutzten Materialien sind separat in Behältern für biologische Abfälle zu entsorgen. Gefahrenklasse Nicht eingestuft. Gefahrenhinweise Keine. Sicherheitshinweise P280: Schutzhandschuhe / Schutzkleidung / Augenschutz / Gesichtsschutz tragen. P305+351+338: BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. Il siero è la matrice preferita per tutti i test della sifilide, ma può essere anche usato plasma con EDTA per lo screening nelle emoteche. Altri anticoagulanti dovranno essere valutati prima dell’uso. Il plasma può essere conservato a 2-8°C e il test deve essere eseguito entro 72 ore dal prelievo. PROCEDURA Controllo di qualità: Prima di fare un gruppo di determinazioni è consigliabile testare i reagenti con tutti i controlli inclusi nel kit, eseguendo le operazioni descritte nella relativa sezione. Se non si ottengono i risultati sperati, scartare il kit. TEST QUALITATIVO Portare tutti i reattivi a temperatura ambiente. Assicurarsi che il reattivo antigene ed il reattivo controllo siano opportunamente risospesi. Ogni test necessita di 4 pozzetti, 2 dei quali verranno utilizzati per la preparazione della diluizione del campione. Vedere Tabella 1. 1. Aggiungere 25 µl di diluente nel pozzetto 1, 100 µl nel pozzetto 2 e 25 µl nei pozzetti 3 e 4. 2. Aggiungere 25 µl di campione nel pozzetto 1. Mescolare il contenuto del pozzetto 1 e trasferire 25 µl nel pozzetto 2. Mescolare e trasferire 25 µl dal pozzetto 2 al 3, mescolare e scartare 25 µl dal pozzetto 3. Trasferire ulteriori 25 µl dal pozzetto 2 al 4, mescolare e scartare 25 µl dal pozzetto 4. 3. Aggiungere 75 µl di reattivo controllo al pozzetto 3 e 75 µl di reattivo antigene al pozzetto 4. 4. Mescolare il contenuto dei pozzetti dando leggeri colpi ai lati della piastra, oppure utilizzando un agitatore di piastra per minimo 30 secondi. 5. Coprire la piastra ed incubare per 45-60 minuti a temperatura ambiente. Evitare le vibrazioni e mantenere lontano da fonti di calore. 6. Leggere i risultati. Uso dei controlli: Includere i controlli, positivo e negativo, in ogni serie di campioni tenendo conto che i controlli sono già prediluiti 1:20. Aggiungere 25 µl di ogni controllo direttamente nei pozzetti 3 e 4. Non aggiungere soluzione diluente. Pozzetto nº 1 2 3 Controllo 4 Test Soluzione diluente µl 25 100 25 25 Campione µl 25 25 Mescolare e transferire µl Lagerung Diluizione di campione Die Reagenzien sind bei Lagerung zwischen 2 und 8°C bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Nicht einfrieren. 25 25 25 25 1:2 1:10 1:20 1:20 Reattivo controllo µl - - 75 - Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material Reattivo antigene µl - - - 75 Mikrotiterplatten mit rundem Boden (U-Form), Hubkolbenpipetten. Diluizione finale 1:80 1:80 Probenmaterial INCUBARE A TEMPERATURA AMBIENTE PER 45-60 MINUTI Serum: Frisches Serum verwenden. Bei Lagerung zwischen 2 und 8°C können die Seren 5 Tage verwendet werden. Bei längerer Lagerung sollten die Proben eingefroren werden (-20°C). 10 Tabella 1 19 VEDI CAMBI RISALTATI syphagen TPHA Test di emoagglutinazione indiretta per la determinazione di anticorpi specifici anti-Treponema pallidum, nel siero o plasma umano. Principio Le emazie di pollo stabilizzate vengono sensibilizzate con un estratto antigenico di Treponema pallidum (ceppo di Nichols). Queste emazie agglutineranno a contatto con gli anticorpi specifici, presenti nel siero o plasma di pazienti affetti da sifilide. Le eventuali reazioni aspecifiche vengono messe in evidenza tramite l’utilizzo di un reattivo controllo costituito da emazie di pollo non sensibilizzate. Gli anticorpi volti verso ceppi non patogeni di treponema, vengono adsorbiti tramite un estratto di treponema di Reiter, presente nella soluzione diluente. Componenti Plasma: Obgleich Serum das Probenmaterial der Wahl für alle Syphilistestungen ist, kann zu Screening-Zwecken in Blutbanken EDTA-Plasma verwendet werden. Andere Antikoagulantien müssen zuvor evaluiert werden. Die Proben sollten innerhalb von 72 Stunden nach der Blutentnahme analysiert werden. DURCHFÜHRUNG Qualitätskontrolle: Vor der Probenanalyse ist die Qualität der Reagenzien mit den beiden, in der Packung enthaltenen Kontrollen zu überprüfen. Die Vorgehensweise ist im entsprechenden Abschnitt beschrieben. Sollten die erwarteten Werte nicht erreicht werden, ist die Packung nicht zu verwenden. QUALITATIVE BESTIMMUNG Die Reagenzien sind auf Raumtemperatur zu bringen. Antigen- und Kontrollreagenz sind vollständig zu resuspendieren. Für jeden Test werden 4 Vertiefungen der Mikrotiterplatte benötigt, 2 davon zur Probenverdünnung. Sehen Tabelle 1. REF 300615700. 1. 25 µl Diluent in Vertiefung 1, 100 µl in Vertiefung 2 und je 25 µl in Vertiefungen 3 und 4 geben. a) 2. 25 µl Probe in Vertiefung 1 geben. Mischen und 25 µl aus Vertiefung 1 in Vertiefung 2 überführen. Mischen und 25 µl aus Vertiefung 2 in Vertiefung 3 überführen, mischen und 25 µl aus Vertiefung 3 verwerfen. Weitere 25 µl aus Vertiefung 2 in Vertiefung 4 überführen, mischen und 25 µl aus Vertiefung 4 verwerfen. 3. 75 µl Kontrollreagenz in Vertiefung 3 und 75 µl Antigenreagenz in Vertiefung 4 geben. 4. Reaktionsansätze durch leichtes Kippen der Mikrotiterplatte oder mittels eines Schüttlers für 30 Sekunden mischen. 5. Platte abdecken und für 45-60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Jegliche Art von Vibration vermeiden und vor Hitze schützen. 6. Ergebnisse ablesen. b) c) d) e) Reattivo antigene: 1 x 15 ml. Sospensione di emazie di pollo sensibilizzate. Pronto all’uso. Contiene < 0,1% di sodio azide. Reattivo controllo: 1 x 15 ml. Sospensione di emazie di pollo non sensibilizzate. Pronto all’uso. Contiene < 0,1% di sodio azide. Soluzione diluente: 1 x 50 ml. Tampone fosfato salino, contenente componenti solubili di T. Reiter ed agenti stabilizzanti. Contiene < 0,1% di sodio azide. Controllo positivo: 1 x 2,5 ml. Siero di coniglio immune. Prediluito 1:20. Vedere il titolo e il range prescritto nell’etichetta del flacone. Contiene < 0,1% di sodio azide. Controllo negativo: 1 x 2,5 ml. Siero di coniglio normale. Prediluito 1:20. Contiene < 0,1% di sodio azide. Precauzioni syphagen TPHA è per uso diagnostico IN VITRO. I reattivi di questo kit contengono sodio azide come conservante. La sodio azide può reagire con il piombo o in rame formando composti altamente esplosivi, perciò lavare abbondantemente con acqua le tubature per evitarne l’accumulo. Depositare tutti i materiali utilizzati in recipienti idonei per materiale biocontaminante. Classe di pericolo Non classificato. Indicazioni di pericolo Nessuna. Consigli di prudenza P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/Proteggere gli occhi/il viso. P305+351+338: IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Conservazione Tutti i componenti del kit sono stabili fino alla data di scadenza se conservati a 2-8°C. Non congelare. Verwendung der Kontrollen: Bei jeder Serie von Proben sind die negative und positive Kontrolle (1:20 vorverdünnt) mit zu analysieren. 25 µl jeder Kontrolle sind direkt in Vertiefung 3 bzw. 4 zu geben. Es ist kein Diluent hinzuzufügen. Vertiefung Nr. 1 2 3 Kontrollreagenz 4 Test Diluent µl 25 100 25 25 Probe µl 25 25 Mischen und überführen µl 25 25 25 1:2 1:10 1:20 1:20 Kontrollreagenz µl - - 75 - Micropiastre a fondo tondo (ad U), pipette automatiche. Antigenreagenz µl - - - 75 Raccolta dei campioni Endverdünnung 1:80 1:80 Materiale necessario non incluso Siero: Usare siero fresco. Il siero va conservato a 2-8°C per non più di 5 giorni; per tempi più lunghi debe essere congelato (-20°C). 18 Verdünnung der Probe 25 FÜR 45-60 MINUTEN BEI RAUMTEMPERATUR INKUBIEREN Tabelle 1 11 QUANTITATIVE BESTIMMUNG Für jeden Testansatz werden 8 Vertiefungen der Mikrotiterplatte benötigt. Als Ausgangsverdünnung ist die Probenverdünnung von 1:10 des qualitativen Ansatzes zu verwenden (Vertiefung 2). Sehen Tabelle 2. Un résultat négatif (dilution finale 1:80) indique l’absence d’anticorps anti-T. pallidum (voir limites de la méthode). Un résultat douteux dans le test qualitatif peut correspondre à un taux bas d’anticorps dans les stades précoces de syphilis ou à un taux résiduel d’anticorps dans les syphilis traitées. Dans ce cas, une nouvelle échantillon supplémentaire pourra être testé pour démontrer une possible augmentation du titre des anticorps. 1. 25 µl Diluent in die Vertiefungen 1-8 geben. 2. 25 µl der 1:10 verdünnten Probe aus dem qualitativen Ansatz in Vertiefung 1 geben. Mischen und 25 µl aus Vertiefung 1 in Vertiefung 2 überführen. Mischen und in gleicher Weise die Verdünnung bis Vertiefung 8 fortsetzen. Aus Vertiefung 8 nach Mischen 25 µl verwerfen. 3. 75 µl Antigenreagenz in die Vertiefungen 1-8 zugeben. 4. Reaktionsansätze durch leichtes Kippen der Mikrotiterplatte oder mittels eines Schüttlers für 30 Sekunden mischen. 5. Platte abdecken und für 45-60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Jegliche Art von Vibration vermeiden und vor Hitze schützen. - 6. Ergebnisse ablesen. - Test quantitatif: Le titre approximatif correspondra à la dernière dilution finale donnant une réaction positive. Limites de la procédure - WICHTIGE BEMERKUNG: Sollte der qualitative Ansatz nicht durchgeführt worden sein, so sind die Verdünnungen entsprechend des qualitativen Tests anzusetzen. In diesem Fall muß für den quantitativen Ansatz je 25 µl Diluent in die Vertiefungen 5 bis 12 pipettiert werden. Mischen und 25 µl aus Vertiefung 4 in Vertiefung 5 geben und die Verdünnungsreihe entsprechend bis Vertiefung 12 fortsetzen. Aus Vertiefung 12 nach Mischen 25 µl verwerfen. Anschließend 75 µl Kontrollreagenz in Vertiefung 3 und je 75 µl Antigenreagenz in die Vertiefungen 4-12 geben. Die weiteren Schritte sind wie oben beschrieben durchzuführen Verwendung der positiven Kontrolle: Bei jeder Serie von Proben ist die positive Kontrolle (1:20 vorverdünnt) mit zu analysieren. Sehen Tabelle 3. 25 µl Diluent in die Vertiefungen 2-8 geben. 50 µl der Kontrolle direkt in Vertiefung 1 pipettieren. In Vertiefung 1 kein Diluent zugeben. 25 µl aus Vertiefung 1 in Vertiefung 2 überführen, mischen und die Verdünnungsreihe entsprechend fortsetzen. Aus Vertiefung 8 nach Mischen 25 µl verwerfen. Auswertung der Ergebnisse - Bien que le sérum est l’échantillon type pour tous les tests de syphilis, des échantillons de plasma EDTA peuvent être utilisés pour screening dans les banques de sang. Cependant, certaines réactions peuvent s’avérer faussement positives. Dans ce cas, on devra renouveler l’expérience avec du sérum sur tous les tests initialement positifs ou douteux. Les anticorps spécifiques peuvent persister pendant une longue période, même après un traitement réussi de la maladie. Afin d’estimer la réponse au traitement, l’emploi d’un test réagine (RPR reditest) est recommandé. La technique TPHA peut donner des réactions croisées avec d’autres formes d’infections à tréponèmes et des réactions faussement positives avec des échantillons de patients atteints de la mononucléose infectieuse, de la lèpre, toxicomanes ou de maladies autoimmunes. Occasionnellement, dans certains cas de syphilis primaires précoces, les anticorps spécifiques ne pourront pas être détectés par la technique TPHA. Caractéristiques fonctionnelles Il a été procédé à différentes évaluations avec le kit syphagen TPHA. Dans le cadre de l’une des évaluations réalisées en Allemagne, une spécificité de 99,6% a été obtenue à partir de l’analyse de 695 échantillons (sérums et plasmas), comprenant des échantillons d’individus de différents âges, de femmes enceintes, de même que d’autres échantillons susceptibles de produire des réactions faussement positives tels que les échantillons lipémiques et ictériques avec des auto-anticorps et des échantillons d’interactions diverses. Dans le cadre de la même évaluation, la sensibilité obtenue face à un tableau de 191 échantillons déjà connus comme étant positifs a été de 100%. Dans le cadre d’une deuxième évaluation réalisée en France, avec un tableau de 55 échantillons de sérums positifs et de 201 sérums négatifs, parmi lesquels nous trouvions également des sérums avec des anticorps hétérophyles, facteur rhumatoïde, EBV et Borréliose, la sensibilité et la spécificité obtenues ont été de 100%. Au cours d’une autre évaluation, 4 tests de TPHA disponibles dans le commerce et un test de TPPA ont été étudiés afin de déterminer leur capacité à détecter des anticorps anti-tréponèmes. Parmi les 235 échantillons initialement positifs utilisés pour calculer la sensibilité du syphagen TPHA, 10 ont affiché une réaction non spécifique avec le réactif de contrôle, 4 ont donné un résultat indéterminé et 2 un résultat négatif. Le syphagen TPHA a montré une sensibilité initiale de 99,1% (223/225; 95% intervalle de confiance: 96,8 - 99,9) après avoir rejeté les échantillons non spécifiques. Après une nouvelle vérification, 7 des échantillons initialement non spécifiques ont donné un résultat positif et 3 des échantillons indéterminés ont été négatifs, ce qui a donné une sensibilité finale de 97,8% (227/232; 95% intervalle de confiance: 95,0 - 99,3). Le syphagen TPHA a été le test le plus sensible parmi les tests de TPHA étudiés. Parmi les 235 échantillons positifs, 114 étaient des individus présentant un stade de la maladie et un traitement connus. Un échantillon a donné un résultat non spécifique avec le réactif de contrôle et il a été rejeté. Le tableau suivant indique la distribution des 113 autres échantillons (nombre de positifs avec syphagen TPHA / nombre total d’échantillons). 4+ : Glatte, manchmal mit gefalteten Rändern. 3+ : Glatte Zellmatte, den Boden der Vertiefung teilweise bedeckend. 2+ : Glatte Zellmatte, umgeben von schmalem Erythrozytenring. 1+ : Glatte Zellmatte, umgeben von breitem Erythrozytenring. ± : Zellknopf mit kleiner, zentraler. : Kompakter Zellknopf mit oder ohne sehr schmaler Öffung im Zentrum. Positiv : von 4+ bis 1+ Grenzwertig : ± Negativ : Primaire BEMERKUNG: Sollte es in Vertiefung 3 (Kontrollreagenz) zu einer Agglutination kommen, so deutet dies auf unspezifische Agglutinine hin. Obwohl nichtspezifische Reaktionen bei der Verwendung von Kükenerythrozyten äußerst selten vorkommen, kann bei einer solchen Probe das Ergebnis nicht interpretiert werden. Secondaire Latente précoce Latente tardive Interpretation der Ergebnisse Die negative Kontrolle sollte ein negatives Ergebnis zeigen. Die positive Kontrolle sollte ein positives Ergebnis in der qualitativen Bestimmung. Für den quantitativen Test, siehe Titer und zulässiges Intervall auf dem Reagenzflaschenetikett. 12 Non traité Traité Non traité Traité Non traité Traité Non traité Traité 31/33 7/7 37/37 5/5 15/15 4/4 4/4 7/8 Bibliographie Voir “References” du texte anglais. 17 TEST QUANTITATIF Qualitativer Test: Chaque test nécessite 8 puits. Utiliser la dilution au 1:10 de l’échantillon préparé pour les test qualitatif (puits 2). Voir Table 2. Ein positives Ergebnis (Endverdünnung 1:80 oder höher) zeigt die Anwesenheit von Antikörpern gegen T. pallidum aufgrund einer akuten oder zurückliegenden Infektion an. Ein negatives Ergebnis (Endverdünnung 1:80) weist auf die Abwesenheit von Antikörpern gegen T. pallidum hin (Beschränkungen der Technik lesen). Ein grenzwertiges Ergebnis im qualitativen Test kann auf einen niedrigen Antikörpertiter in der Frühphase einer Syphilisinfektion oder auf Restantikörper nach einer behandelten Syphilis zurückzuführen sein. In diesem Fall muß zwecks Verlaufskontrolle eine weitere Blutprobe analysiert werden. 1. Ajouter 25 µl de diluant dans les puits 1 à 8. 2. Trasférer 25 µl de la dilution au 1:10 de l’échantillon préparé dans le test qualitatif dans le puits 1. Mélanger le contenu du puits 1 et trasférer 25 µl dans le puits 2. Mélanger et continuer la préparation de cette série de doubles dilutions jusq’au puits 8. Eliminer 25 µl du puits 8. 3. Ajouter 75 µl de réactif antigène dans les puits 1 à 8. Quantitiver Test: Der Titer wird mit der höchsten Endverdünnung angegeben, die eine positive Reaktion zeigt. 4. Mélanger le contenu des puits par tapotement de la plaque ou en utilisant un agitateur de plaques pendant au moins 30 secondes. Begrenzung der Methode 5. Couvrir la plaque et incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Eviter toute source de vibration et garder à l’abri de toute source de chaleur. 6. Lire le résultats. NOTE: Si le test qualitatif n’a pas été effectué, faire les dilutions comme dans le test qualitatif. Ajouter alors 25 µl de diluant du puits 5 au puits 12. Mélanger et transférer 25 µl du puits 4 au puits 5 et continuer la préparation de cette série de doubles dilutions jusqu’au puits 12. Eliminer 25 µl du puits 12. Ajouter 75 µl de réactif contrôle dans le puits 3 et 75 µl de réactif antigène dans les puits 4 à 12. Réaliser les étapes suivantes comme dans le test quantitatif. - Utilisation du contrôle positif: Inclure le contrôle positif dans chaque série d’echantillons en tenant compte du fait que le contrôle est prédilué au 1:20. Voir Table 3. Ajouter 25 µl de diluant dans les puits 2 à 8. Ajouter 50 µl du contrôle positif directement dans le puits 1. Ne pas ajouter de diluant dans ce puits. Transférer 25 µl du puits 1 au puits 2, mélanger et continuer comme dans le test quantitatif. Lecture des résultats 4+ : Voile homogène de cellules couvrant la totalité du puits, quelquefois avec des bords repliés. 3+ : Voile homogène de cellules couvrant partiellement le fond du puits. 2+ : Voile de cellules entouré par un cercle de cellules. 1+ : Voile de cellules entouré par un cercle plus épais de cellules. ± : Bouton de cellules avec une petite overture centrale. : Bouton de cellules avec, ou sans, une très petite overture centrale. Positif Douteux Négatif - : de 4+ à 1+ :± : NOTE: Une agglutination dans le puits de contrôle (puits 3) indique la présence d’agglutinines non spécifiques. Cependant, les réactions non spécifiques sont très rares avec l’emploi des érythrocytes de poulet, un échantillon donnant ce résultat ne pourra pas être interprété avec cet kit. Obgleich Serum das Probenmaterial der Wahl für alle Syphilistestungen ist, kann zu Screening-Zwecken in Blutbanken EDTA-Plasma verwendet werden. In wenigen Fällen wurden falsch positive Ergebnisse gefunden. Daher muß Serum für alle Bestätigungsuntersuchungen, schwach positive und grenzwertige Ergebnisse aus Plasmaproben verwendet werden. Spezifische Antikörper können auch nach erfolgreich behandelter Infektion lange Zeit im Blut persistieren. Zur Kontrolle des Behandlungserfolgs empfiehlt sich die Durchführung eines Cardiolipin-Tests (RPR reditest von Biokit). Bei der TPHA-Methode kann es zu Kreuzreaktivitäten bei anderen TreponemenInfektionen und zu falsch positiven Ergebnissen bei Patienten mit infektiöser Mononukleose, Lepra, Autoimmunerkrankungen und Drogenabhängigkeit kommen. Im Frühstadium einer Syphilis-Infektion kann es vorkommen, dass die spezifischen Antikörper mit der TPHA-Technik nicht detektiert werden. Charakteristische des Tests Die Qualität des Syphagen TPHA-Tests wurde in einigen Evaluierungen untersucht. In einer in Deutschland durchgeführten Studie wurde eine Spezifität von 99,6% ermittelt. Für diese Evaluierung wurden 695 negative Proben (Serum und Plasma) verwendet, wobei das Versuchspanel Proben von Patienten unterschiedlichen Alters, von Schwangeren, mit Autoantikörpern und verschiedenen Infektionen sowie lipämische und ikterische Proben umfasste. Bei einer Studie mit 191 positiven Proben ergab sich eine Sensitivität von 100%. Aus einer Gruppe von 55 positiven und 201 negativen Proben wurde in Frankreich eine Sensitivität und Spezifität von 100% ermittelt. Darin enthalten waren auch Proben mit heterophilen Antikörpern, Rheumafaktoren, EBV und Borrelien. Bei einer anderen Untersuchung wurde bei 4 handelsüblichen TPHA-Tests und einem TPPA-Test die Fähigkeit zum Nachweis von Treponema-Antikörpern untersucht. Von den 235 eingesetzten, ursprünglich positiven Proben zur Berechnung der Sensitivität von syphagen TPHA wiesen 10 eine unspezifische Reaktion mit dem Kontrollreagenz auf, 4 ergaben ein unbestimmtes und 2 ein negatives Ergebnis. Nach Ausschluss der unspezifischen Proben wies syphagen TPHA eine anfängliche Sensitivität von 99,1% (223/225; 95%-Konfidenzintervall: 96,8 - 99,9). Bei neuerlicher Überprüfung erzielten 7 der ursprünglich unspezifischen Proben ein positives Ergebnis und 3 der unbestimmten Proben ein negatives Ergebnisse. Dies ergibt eine endgültige Sensitivität von 97,8% (227/232; 95%-Konfidenzintervall: 95,0 - 99,3). Von den untersuchten TPHA-Tests erzielte syphagen TPHA die höchsten Sensitivitätswerte. Von den 235 positiven Testproben stammten 114 von Personen deren Krankheitsstadium und Behandlung bekannt war. Eine Probe ergab ein unspezifisches Resultat mit dem Kontrollreagenz und wurde ausgeschlossen. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Verteilung der restlichen 113 Proben (Anzahl der positiven Ergebnisse mit syphagen TPHA / Gesamtanzahl der Proben). Primärstadium Sekundärstadium Interprétation des résultats Le contrôle négatif doit donner un résultat négatif. Le contrôle positif doit donner un résultat positif dans le test qualitatif. Pour le test quantitatif, voir le titre et le rang établi sur l’étiquette du flacon. Test qualitatif: Un résultat positif (dilution finale 1:80 ou supérieure) indique la présence d’anticorps anti-T. pallidum résultant d’une infection passée ou présente. 16 Frühlatenz Spätlatenz unbehandelt behandelt unbehandelt behandelt unbehandelt behandelt unbehandelt behandelt 31/33 7/7 37/37 5/5 15/15 4/4 4/4 7/8 Literatur Sehen “References“ im englischen Text. 13 LIRE LES CHANGEMENTS SURLIGNÉS syphagen TPHA Test d’hémagglutination indirecte pour la détection des anticorps spécifiques anti-Treponema pallidum dans le sérum ou le plasma humain. Principe Des érythrocytes stabilisés de poulet sont sensibilisés avec un extrait antigénique de Treponema pallidum (souche Nichols). Ces cellules agglutineront avec les anticorps spécifiques présents dans le sérum ou le plasma des patients syphilitiques. Les réactions non spécifiques sont détectées par l’emploi d’un réactif contrôle non sensibilisé. Les anticorps de tréponèmes non pathogènes sont absorbés par un extrait de tréponèmes de Reiter inclus dans le diluant. Composants REF 300615700. Plasma: Bien que le sérum est l’échantillon type pour tous les tests de syphilis, des échantillons de plasma EDTA peuvent être utilisés pour screening dans les banques de sang. Autres anticoagulants doivent être évalués avant leur utilisation. Le plasma peut être conservé à 2-8°C et testé dans les 72 heures qui suivent la collecte du sang. PROCÉDURE Contrôle de qualité: Avant de réaliser une série de déterminations, tester les réactifs avec chaque contrôle, inclus dans le coffret, suivant les étapes décrites dans la section correspondante. Si les résultats attendus ne sont pas obtenus, ne pas utiliser le réactif. TEST QUALITATIF Attendre que les réactifs atteignent la température ambiante. S’assurer que le réactif antigène et le réactif contrôle soient bien en suspension. Chaque test nécessite 4 puits, 2 d’entre eux servant pour la preparation de la dilution de l’échantillon. Voir Table 1. 1. Déposer 25 µl de diluant dans les puits 1, 100 µl dans le puits 2 et 25 µl dans chaq’un des puits 3 et 4. 2. Ajouter 25 µl d’échantillon dans le puits 1. Mélanger le contenu du puits 1 et transférer 25 µl dans le puits 2. Mélanger et transférer 25 µl du puits 2 au puits 3. Mél anger et retirer 25 µl du puits 3. Transférer de nouveau 25 µl du puits 2 au puits 4. Mélanger et retirer 25 µl du puits 4. 3 Ajouter 75 µl de réactif contrôle au puits 3 et 75 µl de réactif antigène au puits 4. 4 Mélanger le contenu des puits par tapotement de la plaque ou en utilisant un agitateur de plaques pendant au moins 30 secondes. 5 Couvrir la plaque et incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Eviter toute source de vibration et garder à l’abri de toute source de chaleur. Précautions 6 Lire les résultats. syphagen TPHA est destiné à un usage diagnostique IN VITRO. Les réactifs contiennent de l’azide sodique comme conservateur. Les azides peuvent réagir avec des canalisations métalliques et former des composants explosifs. Aprés elimination, rincer abondamment avec de l’eau. Déposer tout le matériel utilisé dans des récipients conçus pour le matériel biocontaminant. Utilisation des contrôles: a) b) c) d) e) Réactif antigène: 1 x 15 ml. Suspension des hématies de poulet sensibilisées. Prêt a l’emploi. Contient < 0,1% d’azide de sodium. Réactif contrôle: 1 x 15 ml. Suspension des hématies de poulet non sensibilisées. Prêt a l’emploi. Contient < 0,1% d’azide de sodium. Solution diluant: 1 x 50 ml. Solution tampon phosphate contenant des composants solubles de T. Reiter et des agents stabilisateurs. Contient < 0,1% d’azide de sodium. Contrôle positif: 1 x 2,5 ml. Sérum de lapin immunisé. Prédilué au 1:20. Voir le titre et le rang établi sur l’étiquette du flacon. Contient < 0,1% d’azide de sodium. Contrôle négatif: 1 x 2,5 ml. Sérum de lapin non immunisé. Pédilué au 1:20. Contient < 0,1% d’azide de sodium. Classe de danger Non classifié. Mentions de danger Aucune. Conseils de prudence P280 : Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de protection des yeux/ du visage. P305+351+338 : EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : rincer avec précaution à l’eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. Conservation Les réactifs sont stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur le coffret, si ils sont conservés à 2-8°C. Ne pas congeler. Matériel nécessaire non fourni Inclure les contrôles positif et négatif dans chaque série d’échantillons en tenant compte du fait que les contrôles sont dejà prédilués au 1:20. Ajouter 25 µl de chaque contrôle directement dans les puits 3 et 4. Ne pas ajouter de diluant. Puits nº 1 2 3 Contrôle 4 Test Diluant µl 25 100 25 25 Échantillon µl 25 25 Mélanger et transférer µl Dilution de l'échantillon 25 25 25 25 1:2 1:10 1:20 1:20 Réactif contrôle µl - - 75 - Réactif antigène µl - - - 75 1:80 1:80 Plaques de microtitration avec puits en U (fond rond), pipettes automatiques. Dilution finale Prélèvement de l'échantillon Sérum: Utiliser du sérum frais. Le sérum peut être conservé à 2-8°C pendant 5 jours. Pour des périodes plus longues, les serums doivent être congelés (-20°C). 14 INCUBER PENDANT 45-60 MINUTES À TEMPÉRATURE AMBIANTE Table 1 15