Guión de prácticas de bioquímica I_15-16

UniversidadMiguelHernández
Dpto.deBioquímicayBiologíaMolecular
FacultaddeMedicina
PrácticasdeBioquímicaI
Práctica1:LaBioquímicaenInternet‐Biomoléculasen3D
Práctica2:IntroducciónalLaboratoriodeBioquímica
Práctica3:Actividadesenzimáticas.Colinesterasadelsuero
Apellidos..................................................................
Nombre....................................................................
Nºexpediente.........................................................
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NORMASGENERALESPARALAREALIZACIÓNYEVALUACIONDELASPRÁCTICASDE
BIOQUIMICA
Normasgenerales.Introducciónalassesionesprácticas.
Consideracionesprevias.Encadalaboratorioesnecesariopreverquecualquierincidentequepuedaafectaral
funcionamientodelaUniversidad,tengaunaincidencianulaomínimasobrelaspersonas,lasinstalacionesy/o
la continuidad de las actividades. La organización del laboratorio debe permitir la correcta gestión de la
prevencióndelriesgo,imbuidaenlospropiosprocedimientosdetrabajo,prácticasyactividades.
Cualquierpersonaquerealicesusactividadesenellaboratoriodebeconocer:
Reglamentodefuncionamientodellaboratorio.
Riesgosparalaseguridadylasaluddelosproductosquímicosexistentes.
Riesgobiológicodelosagentesbiológicoempleados.
ManualdeAutoproteccióndeemergenciasdelaUMH.
Itinerariosysalidasdeemergenciageneralesyparticulares.
Localización y señalización de lavaojos y/o duchas de seguridad, extintores (su funcionamiento y
adecuación)einterruptoresdesuministroeléctrico.
Localizacióndelosbotiquines.
Riesgosparaelmedioambientedelosproductosquímicosexistentes.
Enestaintroducciónsepretendequeelalumnotomecontactoconellaboratorio,paralocualseleindicaránlas
normas generales de comportamiento en el mismo, las reglas de seguridad que hay que observar, las normas
específicas en caso de accidente, así como las normas generales para la realización de las prácticas de la
asignatura.
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Normasgeneralesdellaboratorio
Elalumnotienelaobligacióndeleeryestudiarconanticipaciónlasexperienciasarealizarenellaboratorio.
Elfundamentoteórico,silodesconoce,deberábuscarloenloslibrosadecuados.
Alahoraseñaladaparaelcomienzodelasprácticaselalumnodeberáestarenellugarcorrespondienteyen
supuesto.Seráobligatoriousarunabatablanca.Nodisponerdelabatablancaimplicanopoderrealizarla
prácticadeesedía.
Duranteelhorariodeprácticasnosepodrásalirdellaboratoriosinpermisodelprofesor.
Estáprohibidorealizarpruebasdiferentesalasindicadasenestecuadernodeprácticas.Elalumnoseceñirá
escrupulosamentealmismo.
Se valorará la actitud y el comportamiento general que cada alumno adopte durante la realización de las
prácticas,aspectoéstedeterminantedelanotafinal.
Reglasdeseguridad
Cuandosetrabajaenellaboratorio,tantodeprácticascomodeinvestigación,unosepuedeexponeraunaserie
de sustancias cuya característica más importante, desde el punto de vista de la seguridad, es su toxicidad y
peligrosidad. Una actitud de vigilancia y atención es imprescindible en todo momento, aunque no se esté
haciendo nada. Pensar y actuar de forma segura es parte integral de la educación química. No debe realizarse
ningúnexperimentoantesdeestarsegurodequesecomprendebienloquesevaahacer,ytrasdarrespuestaa
estasdospreguntas:¿Quéeslopeorquepuedepasar?¿Cómolopuedosolucionar?Preguntaralosprofesores,
en caso de duda, es una buena costumbre. Para evitar accidentes e incidentes desagradables es necesario el
extremarlasprecauciones.Elseguimientoestrictodelassiguientesnormasevitaráalmáximolaposibilidadde
accidentesenellaboratorio.
1. En primer lugar mantener en todo momento las batas y los vestidos abrochados (protección frente a
salpicadurasyderrames).
2. Nollevarpulseras,colgantesomangasanchasquepuedanengancharseenlosmontajes.Deberánlavarselas
manosantesydespuésdeentrarysalirdellaboratorioysiemprequehubieracontactoconalgúnproducto
químico.
3. Seevitarállevarpantalóncorto,faldascortas,sandalias,zapatosabiertos,etc.,porrazonesdeprotecciónde
lapiel.
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Enellaboratorioestáprohibidocomer,beberofumar.Nosedebeencenderningunallamanimecheroenel
laboratorio.
Noconectaraparatoseléctricossinasegurarsedequenohaypeligrodevaporesdedisolventespróximos.No
colocar jamás productos inflamables cerca de fuentes de calor. Muchas sustancias orgánicas inflamables
originanvaporesmásdensosqueelaire,capacesdedesplazarsedistanciasconsiderablesporencimadela
mesadelaboratorio.
Se tomarán las precauciones necesarias al trabajar con ácidos, bases o sustancias peligrosas para evitar
accidentes. Si se utilizan sustancias en forma de polvo fino, se deberá de utilizar mascarilla
fundamentalmente en el momento de la pesada para evitar su inhalación. Como norma general, para
pipetear disoluciones o sustancias nocivas líquidas o en caso de duda, se utilizará una propipeta. Los
disolventes orgánicos no se verterán por las pilas, sino que se almacenarán en los recipientes dispuestos
paratalfin.Losácidosybasesconcentradosseneutralizarán,yladisoluciónsalinaresultanteseverterácon
losgrifosabiertos.
Una norma general para la preparación de disoluciones de ácidos fuertes es que siempre se adicionará el
ácidosobreelaguaodisoluciónacuosa,alfindeevitarlaproyeccióndeestaúltimacomoconsecuenciadel
calentamientobruscoalmezclarseambasdisoluciones.Sifueranecesariocalentarelcontenidodeuntubo
deensayoalallama,seharáconeltuboalgoinclinado,agitandosuavementeyconlabocadeltubodirigida
haciaunlugarenquenohayaningunapersona.
Evitarelcontactofísicocondisolventesorgánicos.Norespirarvaporesdedisolvente.(Verapartadosobre
"riesgosasociadosalosdisolventes").Cuandoseutilicensustanciasvolátiles(disolventesorgánicoscomoel
cloroformo,éter,etc.)semanipularánenlacampanadegasesutilizando,siesnecesario,unamascarilla.
Lasgafasdeprotecciónsonobligatoriascuandoelprofesorasíloindique.Nousarnuncalentesdecontacto
(losvaporesorgánicospodríandañarlas;porotrolado,losreactivoscáusticosnopuedensereliminadosdel
ojosilaslentillasestánpuestas).Fíjatedóndeestánsituadoslosbañoslavadoresdeojos.
Usar guantes protectores cuando el profesor lo indique. En caso de contacto de productos corrosivos o
irritantesverindicacionesmásabajo.
El material del laboratorio ha de estar siempre limpio y seco, sin restos de sustancias anteriores. Los
residuossetratarándelasiguienteforma:
A)Materialdecristalroto,papelesyotros.Setiraráenlosrecipientesdestinadosespecialmente
aestefin.
B) Productos químicos tóxicos. Se tirarán en contenedores especiales para este fin. No tires
directamentealfregaderolosproductosespecialmentetóxicos.
C) Sustancias líquidas o disoluciones. Los que puedan verterse al fregadero, se diluirán
previamente,sobretodosisetratadeácidosydebases.Notiresalfregaderoproductosoresiduos
sólidosquepuedanatascarlas.Enestoscasosdepositalosresiduosenrecipientesadecuados.
Enelcasoquesegenereunderramederesiduospeligrososdurantelarealizacióndelapráctica,elpapelque
seutiliceparasurecogidatambiénserádepositadoenelcontenedorestablecidoparaesegrupoderesiduos
peligrosos.Encasodeduda,preguntaraalgúnresponsablecómoproceder.
Unanormageneralqueseañadealascitadasyquecontribuyealaseguridadenellaboratorioesladelrigor
yordenenellaboratorio.Conelloqueremosresaltarqueentodomomentosehademantenerunalimpieza
yordenadecuadosenellaboratorio.
Antecualquierdudaosiseproducealgúnaccidente,avisarrápidamentealprofesor.
Normasdeactuación
Orden y limpieza. El orden es fundamental para evitaraccidentes. Mantener el área de trabajo ordenada, sin
libros,abrigos,bolsas,excesodebotesdeproductosquímicosycosasinnecesariasoinútiles.Mantenerlasmesas
siempre limpias. Se tienen que limpiar inmediatamente todos los productos químicos derramados. Limpiar
siempreperfectamenteelmaterialyaparatosdespuésdesuuso.
Responsabilidad. Trabajar sin prisas, pensando en cada momento lo que estás haciendo, y con el material y
reactivos ordenados. No se debe gastar bromas, correr, etc. en el laboratorio. No realizar un experimento no
autorizado. Un comportamiento irresponsable puede ser motivo de accidentes no deseados y comportar la
expulsióninmediatadellaboratorio.
Atención a lo desconocido. No utilizar ni limpiar ningún recipiente de reactivos que no lleve etiqueta.
Entregadlo inmediatamente al profesor. No sustituir nunca, sin autorización previa del profesor, un producto
químico por otro en un experimento. No utilizar un equipo o aparato sin conocer perfectamente su
funcionamiento.Nousarunapipetadirectamenteconlaboca,sinoatravésdeunsistemadeaspiración.
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Manipulacióndelvidrio.Noforzaruntubodevidrio,yaque,encasoderuptura,loscortespuedensergraves
Nousarnuncaequipodevidrioqueestéagrietadooroto.Depositarelmaterialdevidriorotoenuncontenedor
paravidrio,noenunapapelera.
Manipulacióndeproductosquímicos.
‐ Los productos químicos pueden ser peligrosos por sus propiedades tóxicas, corrosivas, inflamables o
explosivas.Muchosreactivos,particularmentelosdisolventesorgánicos,ardenenpresenciadeunallama.
Transportedereactivos.Notransportarinnecesariamentelosreactivosdeunsitioaotrodellaboratorio.Las
botellassetransportansiemprecogiéndolasporelfondo,nuncadeltapón.
Actuacionesencasodeaccidente
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En caso de accidente, avisar inmediatamente al profesor. En caso de gravedad llamar al 112, o al
teléfono de la universidad 8665 (966658665 para llamada externa). No llevar a cabo actuaciones
inseguras;siserealizanprimerosauxilios,hayqueestarseguro/adenoempeorarelestadodelaccidentado
(protección)yasegurarseunomismodenosufrirriesgo(autoprotección).
Fuego en el laboratorio. Evacuad el laboratorio, de acuerdo con las indicaciones del profesor y la
señalización existente en el mismo. Si el fuego es pequeño y localizado, apagadlo utilizando un extintor
adecuado, arena, o cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo sofoque. Retirad los
productosquímicosinflamablesqueesténpróximosfuego.Noutilizarnuncaaguaparaextinguirunfuego
provocadoporlainflamacióndeundisolvente.Encasodequeelfuegoseaimportante,accionarelpulsador
dealarma
Fuegoenlaropa.Siseincendialaropa,pedirayudainmediatamente.Tumbarseenelsueloyrodarsobreti
mismo para apagar las llamas. No correr (al hacerlo se aviva el fuego) ni intentar llegar a la ducha de
seguridadsinoestámuycerca.Ayudadaalguienqueseestéquemando.Cubridleconunamantaantifuego,
conducidle hasta la ducha de seguridad, si está cerca, o hacedle rodar por el suelo. No utilizar nunca un
extintor sobre una persona. Una vezapagado elfuego, mantenera la personatendida, procurando que no
cojafríoyproporcionarlelosprimerosauxilioshastalallegadadelaasistenciamédica.
Quemaduras. Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas o mantas
calefactoras,etc.,setrataranlavandolazonaafectadaconaguafríadurante10‐15minutos.Desinfectar(por
ej.conyodo)ycubrircongasas.Noaplicarungüentososustancias(pastadedientes,lejía,etc.)nipunciones
oretirarlasampollassiaparecen.Lasquemadurasmásgravesrequierenatenciónmédicainmediata.
Cortes.Loscortesproducidosporlaroturadematerialdecristalsonunriesgocomúnenellaboratorio.Se
debenlavarbien,conabundanteaguacorriente,durante10minutoscomomínimo.Sisonpequeñosydejan
de sangrar en poco tiempo, lavadlos con agua y jabón, aplicar un antiséptico y taparlos con una venda o
apósito adecuados. Si son grandes o muy profundos y no paran de sangrar, solicitar asistencia médica
inmediata.Noretirarnimanipularunposiblecuerpoextrañoenclavado.
Actuaciónencasodeinhalacióndeproductosquímicos.Conducirinmediatamentealapersonaafectada
aunsitioconairefresco.Requerirasistenciamédicainmediata.Alprimersíntomadedificultadrespiratoria
debeiniciarselarespiraciónartificialbocaaboca.Identificar,siesposible,elgascausante,usarlamáscara
adecuadaysinolahay,aguantarlarespiraciónmientrasseextingueelvapor(abriendoventanas,usando
campanas,etc.).Tratardenoexponerseencualquiercaso.
Actuación en caso de ingestión de productos químicos. Antes de cualquier actuación concreta pedir
asistenciamédica.Sielpacienteestáinconsciente,ponerlotumbado,conlacabezadelado.Taparloconuna
mantaparaquenotengafrío.Nodejarlosólo.Nodarlelíquidos,niprovocarelvómito.
Derrame o proyección de productos químicos sobre la piel. Los productos químicos que se hayan
vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundante, como mínimo
durante15minutos.Enelcasodeproductoscorrosivos,ademásdeloanterior,tambiénseretiraráocortará
lo más rápidamente posible la ropa, evitando salpicaduras a otras partes del cuerpo. Las duchas de
seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada del
cuerposeagrandeynoseasuficienteellavadoenunfregadero.Esnecesariosacartodalaropacontaminada
alapersonaafectadaloantesposiblemientrasestébajoladucha.Recuerdaquelarapidezenellavadoes
muyimportanteparareducirlagravedadylaextensióndelaherida.Proporcionarprimerosauxilioshastala
llegada de asistencia médica a la persona afectada. Avisar a tu profesor. Si un producto químico entra en
contactocontusojos,eltiempoesesencial,sobretodosielproductoescorrosivo(actuadenmenosde10
segundos). Cuanto antes se lave el ojo, menos grave será el daño producido. Lava los dos ojos con agua
corrienteabundantedurante15minutoscomomínimoenunaduchadeojos,y,sinohay,conunfrascopara
lavar los ojos. Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado
debajodelospárpados.Esnecesariorecibirasistenciamédica,porpequeñaqueparezcalalesión.Cuidado:
nousardemasiadapotenciadechorrodeagua,paraevitarlesionesalojo.
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Normasgeneralesparalarealizacióndelasprácticas
Antesdecomenzarlaprácticadeberárevisarquedisponedetodoelmaterialyproductosnecesariosparala
misma,yqueseencuentratodolimpioyenorden.Senotificaráalprofesorcualquieranomalía.Alfinalizarla
prácticadejarátodoelmaterialperfectamentelimpioyordenado,avisandoalprofesordehaberterminado
antesdeabandonarellaboratorio.
Las pipetas deben estar bien limpias y secas antes de ser utilizadas. Pipetear siempre con la propipeta
adecuada.Nopipetearentrevariaspersonas.
Todos los frascos, botellas, etc., han de estar correctamente etiquetados y cerrados, evitando que se
confundan los tapones. Los recipientes donde se almacenan sustancias y disoluciones se deben marcar
adecuadamenteutilizandorotuladores,lápicesdeceraoetiquetas.Encadacasoseindicarálasustanciade
quesetrataysuconcentración,asícomolafechadepreparación.
Sedebendeanotarenelcuadernodeprácticaslasdisolucionespreparadasysuconcentración,asícomoel
volumenpreparadodecadauna.
Todos los frascos y botellas que contienen los reactivos preparados deberán situarse en el fondo de la
bancadaomesadetrabajo,evitandodejarlosenlosbordes.
Cada alumno (con independencia de que haya formado parte de un grupo de varias personas) deberá
presentaruninformederesultadosdecadaprácticaenlaformaindicadaporelprofesor.
Antecualquierdudapreguntaralprofesordeprácticas.
Se recuerda que para APROBAR la asignatura es necesario superar las prácticas. Las prácticas son
obligatoriasylanoasistenciaalasmismas,salvocausadefuerzamayor,implicalanecesidaddesuperarlas
enunaPRUEBATEÓRICAY/OPRÁCTICA,DEACUERDOCONLASDIRECTRICESDELAASIGNATURA.
Riesgosasociadosalosdisolventes
Esesencialrecordarquelamayoríadelosdisolventesorgánicossoninflamables,yardensiestánexpuestosa
unallama.Además,muchossontóxicosocarcinógenos.Porejemplo,muchosdisolventesclorocarbonados,sise
acumulan en el organismo, causan un deterioro del hígado similar a la cirrosis originada por uso excesivo de
etanol. El cloroformo y el éter son anestésicos, causando somnolencia y náuseas. En otras palabras, los
disolventesorgánicossontanpeligrososcomoloscompuestosquímicoscorrosivos(p.ej.elácidosulfúrico).A
continuaciónsecitanalgunosejemplos:
•Ácidoacéticoglacial:essuficientementecorrosivoparacausarquemaduras.Susvaporespuedenirritarlos
ojosylosconductosnasales.
•Acetona:noesmuytóxicacomparadaconotrosdisolventes.SinembargoesMUYinflamable.
•Benceno:seabsorbefácilmenteatravésdelapiel,ypuedeafectaralamédulaóseayprovocarleucemia.
Estáconsideradocomoagentecarcinógenoyafectaalhígadoylosriñones.Ademásesmuyinflamable.
•Diclorometano:noesinflamableynoestáconsideradocomocarcinógeno.Siseingierepuededeteriorarel
hígado,ysusvaporespuedenoriginarsomnolenciaynáuseas.
•Etanol:esunconocidoagentetóxicoyesextremadamenteinflamable.
• Éter etílico: es extremadamente inflamable y puede originar explosiones (presencia de peróxidos). No es
particularmentetóxico,peroengrandesconcentracionespuedeoriginarsomnolenciaynáuseas.
• Hexano, pentano, éter de petróleo: pueden irritar el tracto respiratorio y la piel. También pueden actuar
comotóxicoydepresivosdelsistemanerviosocentral.Sonaltamenteinflamables.
•Metanol:mástóxicoqueeletanol,provocaporingestióncegueraymuerte.Esmuyinflamable.
•Tolueno:noestáconsideradocomoagentecarcinógeno,peroestantóxicocomoelbenceno.Puedeactuar
comoanestésico,yafectaralsistemanerviosocentral.
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He leído y entiendo las Normas de Seguridad y los Riesgos Asociados al laboratorio
Nombre:_________________________ Apellidos: _____________________________
Curso Académico:_________________ Grado:________________________________
Firma:
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PRÁCTICA1:LaBioquímicaenInternet‐Biomoléculasen3D.
Prof.responsable:LuisMiguelGutiérrezPérez(luisguti@umh.es)
INTRODUCCIÓN
Esevidenteparacualquierestudiantequeseacerqueconcuriosidadalasnuevastecnologías
de la información, que se están abriendo un buen número de posibilidades en apoyo del
estudioycomprensióndelabioquímica.Esporelloqueestaprácticaestadedicadaaconocer
ymanejarestosnuevosrecursos.LaInternet(WWWo simplementeWeb)esantetodouna
fuente inmensa de todo cuanto el ser humano piensa que merece ser enseñado (sea o no
honesto, esto hay que advertirlo), y por ello existen una variedad casi incatalogable de
información en relación con la bioquímica. En principio podríamos dividir estas fuentes en
cuantosuinterésennuestrocampoencuatrotipos:
A.DireccionesconinterésparalocalizarinformaciónsobrecualquieraspectodelaBioquímica
y Biología molecular. Éstas serían la base de partida para localizar otras direcciones
específicas. Sería el caso de las direcciones URL(Universal Resource Locator):
http://www.cellbio.comohttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.Todasellasorganizanlabúsqueda
de direcciones (links) en secciones como: Enseñanza de Bioquímica y Biología Molecular,
Protocolosexperimentales,basesdedatos,fuentesdeprogramas,revistasespecializadasetc.
B.DireccionesdebasesdedatosconrelevanciaeninvestigaciónydocenciaenBioquímicay
Biología Molecular. Éstas pueden ser de especial utilidad para la utilización de recursos
didácticos complejos como la representación de biomoléculas en 3‐D o la utilización de
recursosdeinvestigacióncomolabúsquedaoalineamientodesecuenciasodelosvaloresde
separación de proteínas en 2D‐PAGE. Estas fuentes se especificarán en más detalle con
posterioridad. A este tipo de direcciones pertenecen por ejemplo la dirección:
http://www.rcsb.org/pdb/.
C.Direccionesdeinterésespecíficoenaspectosdeinvestigación.Seríaelcasodedirecciones
queproveendeprotocolosexperimentales,odeforosdediscusiónsobretemasespecíficosde
uncampodeinvestigaciónoinclusolaspertenecientesarevistasespecializadas.Ejemplosde
este tipo serían las direcciones: http://www.protocol‐online.net , o
http://bioinformatics.weizmann.ac.il/
D.Finalmentesepodránencontrardireccionescuyointerésprincipalseaeldelaeducaciónen
campos biológicos o bioquímicos. Un ejemplo de este tipo sería http://esg‐
www.mit.edu:8001/esgbio.
Dado que este seminario tiene por objeto el mostrar la utilidad de estas fuentes de
información en el apoyo de la docencia e investigación se centrará en un aspecto concreto
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comoeslasposibilidadesdelarepresentaciónymanipulacióndemoléculasbiológicasen3
dimensiones.
2.BASESDEDATOSDEESTRUCTURASDEBIOMOLÉCULASACCESIBLESENINTERNET.
Enlosúltimosañosjuntoalostradicionalesbancosdeestructuraprimariadeproteínasyde
secuencia de nucleótidos han aparecido los bancos de estructura tridimensional de
biomoléculas.Tantoenladocenciaenbioquímicadondelavisualizaciónymanipulaciónde
unamoléculaentresdimensionespermitelamejorcomprensiónderelacionesestructurales
como en investigación donde las relaciones estructura‐función están siendo la clave para el
mejor entendimiento del diseño molecular, la existencia de extensos bancos de estructura
espacial de biomoléculas (especialmente de proteínas) son un apoyo inestimable para el
bioquímico. La estructura de las proteínas puede almacenarse en archivos de coordenadas
espacialesde sus átomos constituyentes, siendo el más extendidoel tipo dearchivo protein
database(nombre.pdbonombre.ent).Estosarchivospuedenobtenersedediferentesfuentes
siendo los bancos más importantes los correspondientes al Protein Data Bank en EE.UU.
(http://www.rcsb.org/pdb/ ) y a la Swiss 3D Image Collection (http://expasy.hcuge.ch ) en
Suiza.
Enestosbancosdeestructurasepuedenhacerusodesistemasdebúsquedamuyversátiles
queincluyenlaposibilidaddeincluircamposdenombrescompletosoparciales,familiasde
proteínas, organismos, técnicas experimentales de obtención de estructura, referencias
bibliográficas(autoresetc.),einclusofórmulasolaclasificacióndelaComisióndeEnzimas.
MientrasqueelProteinDataBankconstituyeunbancomuycompletodearchivospdb(Hay
unas20.000estructuras),elbancodelaColecciónSuizadebiomoléculasseespecializaenla
directavisualizacióndelasproteínasensupáginaWeb.conimágenesdetipoGIFyporellose
limitaaunas5000imágenes.Ademásdeestasfuentesprincipalesexistenotrosbancospara
la localización de archivos pdb que representan moléculas sencillas como el agua en sus
diferentes formas, glúcidos, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, fármacos etc.
(http://www.nyu.edu/pages/mathmol/library).UnavezdescargadoatravésdeInternetlos
archivosdeseadosdeberemosdedisponerdelosprogramasadecuadosparasuvisualización
ymanipulación.
3. PROGRAMASPARALAVISUALIZACIÓNDEBIOMOLÉCULASEN3D.
Existen una gran diversidad de programas para la representación tridimensional de
biomoléculas,sinembargopocosdeelloshansidoaceptadoscomostandarddeuso(aceptan
archivos *.pdb) y desde luego muchos menos han sido desarrollados altruistamente para el
uso y disfrute libre de la comunidad científica. Entre los últimos 10 años se desarrollaron
estosprogramasparautilizarenunPCdotadodelsistemaoperativoWindowsycabecitarel
programapioneroRasmoldesarrolladoporRobertSayledelaUniversidaddeEdimburgo(se
puede obtener http://www.umass.edu/microbio/rasmol , o sus programas gemelos Protein
Explorer o Chemscape Chime (http://www.mdli.com), este último desarrollado para ser
incorporadoennavegadoresInternet(NetscapeyExplorer)yelprogramaSwissPDBViewer
desarrollado
por
Nicolas
Guex
de
la
empresa
Glaxo‐Wellcome
(http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.htm ) para PC y Apple Mackintosh. Centraré mi
interés inicialmente en el primero de éstos, mucho más extendido en uso y con menos
requisitos a la hora de poder utilizarlo (el programa Swiss PDB Viewer requiere
8
Quickdraw3D, obtenible de Apple en su dirección web: http://www.apple.com pero el
tamañodeesteprogramadeunas8MBhacemásdifícilsuobtención).
Hoy en día se utilizan versiones integradas derivadas de Rasmol como Jmol, estas están
integradasenelnavegadorypresentandeformamásintuitivatodaslascapacidadesdelos
programasoriginales.
4. UTILIZACIÓNDEJMOLPARAELESTUDIODEUNAPROTEINAMODELO.
Primero necesitaremos una proteína que sea un modelo interesante para estudiar las
capacidades de dichos programas nosotros propondremos el estudio de la estructura
tridimensionaldeHemoglobina.
Primero entre en la página del banco de datos de estructuras del Protein Databank
(http://www.rcsb.org/pdb/), y haga una búsqueda de las estructuras almacenadas sobre
dichaproteína.Seconscientedelavariabilidaddeformasalmacenadasysusdiferencias.
Una vez elegida una molécula es el momento de comprender las diferentes opciones de
representación estructural (átomos, esqueleto, cartoons etc), de color o incluso las
posibilidadesderepresentacióndelassuperficies.
El siguiente aspecto del programa será analizar las partes fundamentales de la estructura
relacionadasconlafuncióndelaproteínaparaelloutilizaremosotrasopcionescomoLigands
oLigandsandpocket.
También se aprenderá a la utilización de estos programas para la determinación de
dimensiones moleculares y distancias entre átomos, para ello se os propondrá dimensional
algunasdelasproteínasdeinterésenmetabolismocondimensionesmasextremas.
5. EXTENSIONDELOSPROGRAMASALESTUDIODEOTRASBIOMOLECULAS.
Hasta ahora hemos mostrado el empleo de la visualización 3D a proteínas pero es muy
sencilloimportararchivosestructuralesdeotrasmoléculasdeinterésbiológico.Paraellose
puede
partir
de
bases
de
datos
conocidos
como
la
indicada
http://www.nyu.edu/pages/mathmol/library, o simplemente utilizar una búsqueda de
Internetdecaráctergeneralizado(empleandoeltipodemoléculaabuscaryeltipodearchivo
pdbcomoguíaenlabúsqueda).
RealizaremoslabúsquedadeunarchivoestructuraldelADNyrealizaremosunestudiodesus
características dimensionales fundamentales como las dimensiones de los surcos mayor y
menorolasdistanciasentrebasesemparejadas.
6. REALIZACIONDEGRAFICOSDEMOLECULASENALTACALIDAD
Existen programas que aunque sean menos intuitivos permiten posibilidades de análisis y
representación de biomoléculas muy interesantes. Este es el caso del programa
SwissPDBViewer (http://www.expasy.org/spdbv/), que constituye una herramienta de
investigación para el estudio de distancias moleculares y de parámetros estructurales. La
capacidaddeesteprogramaresideenlaseleccióndeunaminoácidoparaexplorarsuentorno
verFigura1),ymásaúnparainclusomutardiversosresiduosparaposteriormenteentender
comodichasmutacionesafectanalaestructuradelaproteína.Elprogramapermiteasímismo
9
una diversidad de cálculos que incluyen la realización de diagramas de Ramachandran, tal
comosemuestraenlamismaFigura1.
Figura 1. Copia de pantalla de la ejecución del
programa SWISS-3D PDBVIEWER. Se muestra la
capacidad de éste para la observación de las
relaciones entre aminoácidos en una región concreta
del complejo protéico de fusión vesicular (SNARE
complex), formado por 4 cadenas pertenecientes a 3
proteínas (sintaxina, SNAP-25 y sinaptobrevina). En el
recuadro se observa el diagrama de Ramachandran de
éstas.
Lacombinacióndeesteprogramaconel
representador tridimensional (renderización
3D)
denominado
Povray
(Http://www.povray.org),
permite
la
representación de moléculas en el sistema
gráfico de más calidad de cuantos se han
mencionado en este trabajo, la viveza de
luces y texturas obtenida con dichos
programaspuedeserobservadaenlaFigura
representando
dos
moléculas
simultáneamente.
En la práctica realizaremos algunas
representaciones de alta calidad con
moléculas de interés biológico como
fármacos, aminoácidos, proteínas, ácidos
grasos,etc.
2,
Figura 2. Moléculas de glúcido y ácido graso
tratadas por Swiss 3D Viewer y representadas por
Povray, incorporando fuentes de luz y texturas.
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CUESTIONES‐INFORMEPRÁCTICANº1
NOMBREYAPELLIDOS............................................................................................
NºMATRICULA..............................................................................................................
FECHADELAPRÁCTICA...........................................................................................
GRUPO...............................................................................................................................
1.¿Las bases de datos manejadas poseen únicamente proteínas o estructuras de
otrassustancias?,indiquequeotrostiposdemoléculassepuedenencontrar.
2.Utilizando la hemoglobina como molécula ejemplo, que número de estructuras
son accesibles para su estudio estructural. Indique el porqué de dicha
variabilidad.
3.Utilizandolasfuncionesdemediciónindique:
Tamañoaproximadodelahemoglobina.Anchoxlargoxprofundidad
Deunadelascadenasquelaforman.
DistanciasentreelátomodeFedelgrupoHemoylosaminoácidosmáscercanosde
lacadenadeglobinayelOmascercanotransportado.
4. Busque dos proteínas de relevancia en el estudio del metabolismo con las
dimensiones mas extremas y determine su tamaño tal como hizo con la
hemoglobina.
Proteínamásgrande;
Proteínamáspequeña;
4.Obtener un archivo pdb representativo de la estructura del ADN y realizar las
medicionesquecaracterizandichaestructura.
5.Localicelosarchivosdeestructurayrepresenteenaltacalidadlasmoléculasque
leindiqueelprofesor,salvandolosarchivosgráficosobtenidos.
11
12
PRÁCTICA2:Introducciónalasprácticasdelaboratorio.
Disolucionestampones,medicióndepHyactividadenzimática
Prof.responsable:ManuelCriadoHerrero(manuel.criado@umh.es)
OBJETIVOSGENERALES
En esta práctica se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio de
bioquímica.Seindicaránalalumnounasnormasgeneralesderealizaciónydeseguridad.Sele
describiráelmaterialdelaboratorioyseharáespecialhincapiéenlaimportanciadelcorrecto
uso de las unidades de masa, volumen y concentración, así como del cuidado, correcta
utilización y limpieza del material utilizado. Especial hincapié se hará en el manejo de las
distintasclasesdepipetas.Adicionalmenteselesenseñaráamanejarelcolorímetro.
Una vez establecidas las nociones básicas de manejo de materiales se procederá a la
preparación de disoluciones tampón y la medición del pH de las mismas mediante el pH‐
metro.Enlasegundapartedelapráctica,yconelfindecontinuarejercitandoloaprendidoen
cuanto a pipeteo de líquidos y manejo del colorímetro, se realizará la determinación de la
fosfatasa alcalina en una muestra problema a partir de la elaboración de un patrón de
concentraciones conocidas. Una vez terminada la práctica se procederá a evaluar
individualmentelamismamediantelarealizacióndeuncuestionarioqueincluyaresultadosy
cuestionessobrelaprácticarealizada.Finalmente,lalimpiezadelpuestodetrabajoasícomo
delmaterialutilizadoserátenidaencuentaendichaevaluación.
OBJETIVOSESPECÍFICOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Elalumnoalfinalizarlaprácticadeberásercapazde:
Conocerlasnormasdeseguridaddeunlaboratorio.
Distinguirentrelosdistintosmaterialesutilizadosenellaboratorio.
Utilizarcorrectamentelasunidadesdemasa,volumenyconcentración.
Medirunvolumendeterminadoconelmenorerrorposible.
PrepararunadisolucióntampónymedirsupH
Aprenderelfuncionamientoylautilizacióndeuncolorímetro.
Deducirunaactividadenzimáticaapartirdeunarectapatrón
Aprenderyllevaralaprácticalasnormasdelimpiezadelmaterialdeunlaboratorio.
INTRODUCCIÓN
PRIMERAPARTE
La medida de líquidos es una de las operaciones mas comunes en el laboratorio de
Bioquímica.Elusodeprobetasymatracesaforadosesfrecuenteenellaboratoriodequímica.
Ademásdeestos,laspipetasgraduadasymicropipetasautomáticassonusadasamenudoen
13
ellaboratoriodebioquímica.Enestaprácticaejercitaremossuusoparaprepararunasolución
tampón.
Para manipular líquidos con las pipetas graduadas usaremos un dispositivo
denominadoPipetusyqueesencialmenteesunapequeñabombaquepermiteaspirarlíquido
seleccionandoundeterminadovolumenyposteriormentedepositarlodondeseanecesario.
Pipetus
Pipetasgraduadasdedistintosvolúmenes
Paraaspirarlíquidointroducimosla puntadelapipetaenelmismoyapre‐
tamoselbotónsuperior(flechane‐ gra)hastaalcanzarelvolumendesea‐ do.Sifueranecesarioenrasaríamos conelbotóninferior.
Paradepositarellíquidoapoyamosla
puntadelapipetaenlapareddeltubo
yapretamoselbotóninferior(flecha
blanca)hastaevacuartodoellíquido
oalcanzarundeterminadovolumen.
14
Paramanipularpequeñosvolúmenesusaremoslasmicropipetasautomáticas(véaseel
esquemaabajo)
Rueda para
fijar el volumen
Punta
Eyector de puntas
(A) (B)
(C)
Para pipetear con micropipetas automáticas fijaremos primero el volumen deseado
con la rueda y colocaremos una punta. A continuación realizaremos lo indicado en las figuras
dearribacomosigue(verpáginasiguiente):
15
(A) Con el dedo pulgar presionando el extremo del émbolo y bajado hasta el primer tope
introduciremoslapuntadeplásticoenellíquidoaextraer
(B)Levantaremoslentamenteelpulgarparaqueellíquidoasciendaporlapunta
(C) Apoyaremos la punta en la pared del recipiente donde queramos verter el líquido y
presionaremoselpulgardenuevosobreelextremodelémbolohastaquetodoellíquidohaya
sidoevacuado
Conelfindepracticarelusodepipetasymicropipetasprepararemosvariassoluciones
tampón y mediremos su pH, actividades estas también muy útiles y frecuentes en el
laboratoriodebioquímica.
Las soluciones tampón están formadas, en general, por mezclas binarias de un ácido o
base débiles con la correspondiente sal generada con base o ácido fuertes. Por ejemplo, ácido
acético (ácido débil) + acetato sódico (sal de este ácido con una base fuerte). O también
hidróxido amónico (base débil) + cloruro amónico (sal de esta base con un ácido fuerte). Su
utilidad radica en que mantienen la concentración de H+ prácticamente invariable en las
disoluciones en las que están presentes, lo que resulta de gran importancia tanto en el
laboratoriodebioquímicacomoenlosfluidospresentesenlosseresvivos.
Portanto,ennuestroprácticacadagrupo utilizarádoscomponentesquemezcladosen
distintas proporciones darán lugar a distintos pHs que se medirán con el pH‐metro.
Obviamente,elrangodepHobtenidodependerádelaparejadecomponentesusada.
En cuanto al pH‐metro consiste básicamente en un electrodo sensible a la
concentracióndeH+yunvoltímetrocapazdedetectarunafuerzaelectromotriz.
Electrodo
Voltímetro
Calibrado para Vidrio semipermeable a H
Electrodo +
medición de pH
El vidrio del electrodo actúa de membrana semipermeable a los H+. Cuando se
introduzca en una disolución se producirá un movimiento de H+ según la diferencia de
concentración entre la disolución y el interior del electrodo. Esto producirá una corriente
eléctrica detectada por el voltímetro y traducida en valor de pH, al haberse calibrado
previamenteelpH‐metroconunadisolucióndepHconocido.
16
SEGUNDAPARTE
En esta parte de la práctica continuaremos ejercitando el uso de micropipetas y
determinaremos una actividad enzimática, lo que dará oportunidad de usar otro aparato
esencial del laboratorio de bioquímica como es el espectrofotómetro, en nuestro caso una
versiónbásica(colorímetro)yaquemediremosenlazonavisibledelespectro.
Como enzima se ha elegido la fosfatasa alcalina, que está implicada en el transporte de
metabolitos a través de las membranas celulares. Esta enzima hidroliza ésteres fosfóricos a
pH básico liberando fosfato inorgánico. Está presente en casi todos los tejidos, sobre todo en
hígado, riñón, intestino y hueso. La alteración de su concentración en suero puede orientar
sobre el estado de un determinado tejido. Así por ejemplo, un aumento en los niveles de
fosfatasa alcalina puede indicar abuso en el consumo de alcohol, anemia, cáncer (huesos,
próstata, etc.) y otras enfermedades hepáticas, renales, etc. Por el contrario, niveles bajos
pueden indicar cretinismo y déficit de vitamina C. Por otro lado, la concentración de fosfatasa
alcalinaesdependientedelaedad,siendobastantemásaltadurantelainfancia.
Ladeterminacióndefosfatasaalcalinasebasaenlasiguientereacción: Fosfatasa p‐nitrofenilfosfato (pNPP) p‐nitrofenol (pNP)
Condiciones Alcalinas Muestra problema
p‐nitrofenolato
(amarillo A410) Demaneraquesielaboramos
unarectapatróncondiferentes
concentracionesdepNPsere‐
moscapacesdedeterminarla
concentracióndefosfatasaal‐
calinadeunamuestraproble‐
maapartirdelaabsorbancia
observadacomoresultadode
laaccióndelaenzimasobre
elsustratopNPP
A410
U/L
p‐nitrofenol (pNP)
17
MATERIALESyREACTIVOS
Guióndeprácticas
Pipetus
Pipetasgraduadasde5y10ml
Micropipetasautomáticasde0,1y1ml
pH‐metro
Tubosde50ml
Unconjuntodedosdisolucionesparaprepararsolucióntampón
Frascolavador
Vasodeprecipitados
Tubosdeensayo
Cajasdepuntasamarillas(0,1ml)yazules(1ml)
Vortex
Colorímetro
Soluciones de manitol, MgCl2, p‐nitrofenol (pNP), p‐nitrofenilfosfato (pNPP), NaOH y
tampóncarbonato
Soluciónproblemadefosfatasaalcalina
Gradilla
Bañodeaguaa30oC
Ordenadoreimpresora
PROCEDIMIENTOPRIMERAPARTE:Preparacióndedisolucionestampón
De acuerdo con lo indicado en la introducción sobre la naturaleza de los tampones se
suministrará a cada grupo un conjunto de dos componentes (A/B, C/D o E/F) que
debidamentemezcladosdeberíanproducirunadisolucióntampónconunpHdeterminado.
1.Numerardel1al4cuatrotubosde50mlsuministrados
2.Utilizandolaspipetasymicropipetasadecuadas(segúnseindicaacontinuación)pipetear
en los tubos del paso 1 las siguientes cantidades (en ml) dependiendo del grupo de
componentesdeladisolucióntampónquesehansuministrado.
1
Tubo
1
2
3
4
A(ml)
19.84
17.78
8.26
0.74
B(ml)
0.16
2.22
11.74
19.26
2
Tubo
1
2
3
4
3
C(ml)
16.06
11
7.48
1.66
18
4
D(ml)
3.94
9
12.52
18.34
Tubo
1
2
3
4
E(ml) F(ml)
17.6
2.4
12.42 7.58
9.88 10.12
8.05 11.95
Ejemplo1:siqueremospipetear17.78mldeberíamospipetear10y7mlconlapipetade10
ml.Luegopipetear780lconlamicropipetade1ml.
Ejemplo2:siqueremospipetear9.88mldeberíamospipetear9mlconlapipetade10ml.
Luegopipetear800lconlamicropipetade1mly80lconlamicropipetade100l.
Ensuma,usarlaspipetasde5y10mlparacantidadesenterasdemlylasmicropipetaspara
cantidadesmenoresde1ml(micropipetade1000l)y0,1ml(micropipetade100l).
3. Cerrar cada tubo con su correspondiente tapón y mezclar suavemente volteando el tubo
unascuantasveces.
4.ProcederalamedidadelpHdecadaunodelostubos,paralocual:
Seenjuagaráelelectrodoconunchorrodeaguadestiladadeunfrascolavador
Sesecaráelelectrodoconunpapel.Nofrotar,solosecarellíquidoquepuedaquedaradherido
alelectrodo.
19
Seintroduciráelelectrodoencadatubode50mldelpaso2sumergiéndoseaprox.unos2‐3
cmenladisolucióncuyopHsequieremedir.
2-3 cm
Seesperaráhastaobtenerunvalorestableyseanotaráconbolígrafo(NOlápiz)enlatabla
deresultadosdelfinaldelaprácticaindicandoquéparejadecomponentessehausadopara
hacereltampón.Esteproceso(enjuagar,secareintroducirelelectrodo)serepetiráparacada
unodelostuboscuyopHsevayaamedir.
Atención:loselectrodossonfrágiles.Importantemanejarlosconcuidado,evitandoun
golpeconlasparedesdelostubosoconcualquierotrasuperficie.Unavezsehasecado
con un papel el electrodo, este debe sumergirse inmediatamente en líquido, ya sea la
disolución a medir o la de almacenaje si ya no se va a usar más. Nunca dejar que se
seque.
PROCEDIMIENTO SEGUNDA PARTE: Determinación de la actividad fosfata‐
saalcalinaenunamuestraproblema
1.Preparar7tubos,marcarloscomoseindicaypipetear
B
elvolumendecadadisoluciónenlindicadoenlatabla
deabajo.Mezclarenelagitadorvortex.
Cuidado:Añadirlamuestradeenzima(tuboM)enúl‐
timolugar,despuésdeañadidotodolodemás,mez‐
claryrápidamentepasaralpaso2.
Tubo
Tampón
Manitol
MgCl2
pNP
Carbonato
(producto)
B
800
100
100
1
775
100
100
25
2
750
100
100
50
3
725
100
100
75
4
700
100
100
100
5
650
100
100
150
M
650
100
100
20
1
2
3
pNPP
(sustrato)
100
4
5
M
Muestra
(enzima)
50
2.Incubarlostubosdurante15mina30oCenbañodeagua.
3. Sacar los tubos del baño y detener la reacción añadiendo a cada tubo 1 ml de 3N NaOH.
Mezclarconvortex.
Cuidado: Manipular la disolución de NaOH con precaución ya que es caústica y puede
dañarlapielylaropa.
4. Medir la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos del paso 3 en un colorímetro.
Antesdeprocederajustarelblanco(teclaR)coneltuboB.Anotarcadaunadelasmedidas
conunbolígrafo(Nolápiz)enlahojaderesultadosdelfinal.
5. Utilizando los ordenadores del laboratorio que ya estarán preparados, representar
gráficamente la concentración de p‐nitrofenol (pNP) en abcisas frente a la absorbancia
medida en ordenadas (tubos 1 a 5). Ajustar a una recta. A partir de la recta deducir la
concentración de fosfatasa alcalina de la muestra problema basándose en la absorbancia
medidaeneltuboM.
6.Imprimirlagráficaconsuscorrespondientesdatosparaentregarlaalfinaldelaprácticaal
profesor.Cadaalumnodeberáimprimirsuhoja
PROCEDIMIENTOFINAL.
Síganselospasostalycomosedetallan,sinomitirnada:
1.Limpiartodoydejarlocomoseencontróalprincipio.Paraello:
 Verterloslíquidosdelostubosenelbidóncorrespondiente
 Enjuagarlostubosconaguadelgrifoydespuésconaguadestilada.Nousardetergente.
Asegurarsedesulimpiezaydejarlosescurriendobocaabajo
 Enjuagarpipetasycualquierotromaterialquesehayausadodelamismaformaqueen
elpuntoanterior
 Dejartodoordenadosobrelamesada
2.Enseñaralprofesorelpuestodetrabajoypedirlelahojadecuestiones.Resolverlas
3.Entregaralprofesor:
 Lahojaderesultadosdelfinaldelaprácticaconlosdatosanotadosenlasdospartesde
lapráctica
 Lahojaimpresaapartirdeloscálculoshechosenelordenador
 Lahojadecuestionesresueltas
(Elnombredelalumnodebeirescritoentodaslashojas)
21
22
HOJADERESULTADOSDELAPRÁCTICA2BIOQUÍMICAIMEDICINA
NOMBRE
GRUPODEPRÁCTICAS
PUESTODETRABAJO
FECHADELAPRÁCTICA
PARTE1
Componentes ((indicar ccon u
un ccírculo) A/BC/DE/F
Tubonº
1
2
3
4
pHmedido
PARTE2
Tubo
1
2
3
4
5
M
Medidade
A410
23
Concentración
(U/l)
25
50
75
100
150
¿?
24
PRÁCTICA3:CINÉTICAENZIMÁTICA:Colinesterasadelsuero.
Prof.Responsable:JavierSaezValero(j.saez@umh.es)
INTRODUCCIÓN
En los vertebrados existen dos tipos de colinesterasas, enzimas que hidrolizan preferentemente los
ésteres de colina, la acetilcolinesterasa (AChE) y la butirilcolinesterasa (BuChE). Son codificadas
por genes distintos, y se distinguen por la preferencia de sustrato (acetilcolina y butirilcolina), sus
características cinéticas, y el efecto de inhibidores: iso-OMPA (tetraisopropil pirofosforamida),
inhibe preferente BuChE, y BW (dibromuro de 1,5 bis (4-alildimetilamoniofenil) pentan-3-ona)
inhibe AChE.
La AChE es una enzima vital, por su papel en la hidrólisis de la acetilcolina liberada en las sinapsis
colinérgicas, aunque posiblemente desempeña otras funciones, ya que está presente en tejidos no
colinérgicos. La función de la BuChE no ha sido aún totalmente establecida y no se conoce sustrato
biológico específico, aunque también puede cumplir un papel en la hidrólisis de acetilcolina.
Para el ensayo de AChE y BuChE en el
laboratorio, usamos tio-análogos de sus sustratos
específicos (que no biológicos), en una reacción
conocida como método de Ellman (*).
*A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase
activity. Biochem Pharmacol. 1961;7:88-95
En el ensayo, la reacción se produce en
presencia de DTNB (ácido ditiobisnitrobenzoico), el cuál reacciona con la tiocolina
que se libera. Apreciamos el curso de la reacción
por el incremento de color, que nos indicará el
incremento de producto con el tiempo.
El aumento de color lo medimos en un
colorímetro a una longitud de onda de 410 nm
(determinaremos el incremento de
absorbancia/unidad de tiempo).
25
OBJETIVOS
En esta práctica el alumno realizará la medición del curso temporal de una reacción enzimática y
determinará los parámetros cinéticos de constante de Michaelis (KM) y velocidad máxima (Vmax).
Como fuente de enzima se utilizará la butirilcolinesterasa (abreviada BuChE), también llamada
colinesterasa plasmática.
El alumno habrá de ser capaz de:
 Medir actividades enzimáticas por técnicas colorimétricas
 Representar gráficamente el curso temporal de la reacción y valorar la linearidad del proceso
 Calcular actividades enzimáticas, expresando el resultado en unidades de actividad
enzimática
 Observar una cinética michaeliana y representar la curva de velocidad frente a concentración
de sustrato
 Determinar las constantes cinéticas por la representación de Lineweaver-Burk
MATERIALES y REACTIVOS







Colorímetro
Tubos de ensayo y gradilla; micropipetas y pipetas de 5 y 10 ml, y diversos frascos
Material biológico: suero (contiene la enzima BuChE)
Butiriltiocolina (BuTCh) 6 mM en agua
Tampón fosfato 0.1M pH 7,4
Ácido 5,5’-ditiobis nitrobenzoico (DTNB), 0.9 mM, en tampón fosfato 0.1M pH 7,4
El alumno traerá: cronómetro, calculadora y regla para las gráficas.
26
MÉTODO Ensayo de actividad enzimática
El alumno va a observar:
1) La formación de producto con el tiempo.
2) El efecto de la concentración de sustrato.
Preparación de disolución diluida de suero (enzima)
El tubo de ensayo etiquetado "enzima" (distinto a todos los demás de la gradilla), contiene 1 ml de
suero y 9 ml de tampón fosfato pH 7.4.
Tener en cuenta que es una disolución 1:10 para realizar los cálculos del factor “f” (ver más
adelante; ya que al pipetear 1ml, tomamos sólo 0.1 ml suero). Recordar mezclar bien cada vez que
pipeteis.
Procedimiento:
1) Disponer de tubos de ensayo pequeños utilizables en el colorímetro.
Etiquételos del 1 al 6 (más un tubo para el cero o blanco).
2) A continuación, prepare los tubos 1 al 6 de acuerdo con el protocolo del esquema siguiente.
Esquema protocolo ensayo actividad enzimática
B
1
2
3
4
5
6
NO
0,05
0,1
0,2
0,4
0,5
1,0
Sustrato 6mM
2
0,95
0,9
0,8
0,6
0,5
0,0
Agua (ml)
1
1
1
1
1
1
1
DTNB (ml)
No añadir el enzima hasta el momento de la medida
NO
1
1
1
1
1
1
Enzima (ml)
Volumen total: 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml Para ello:
 Añadir el volumen de sustrato (butiril-tiocolina o BuTCh) y de agua indicado para completar.
 Añadir 1 ml de disolución de DTNB (agitar y esperar 2 minutos hasta primera medida).
27
3) Antes de la primera medida de actividad, usar el tubo “blanco” que contiene sólo 2 ml de agua y
1 ml de DTNB (volumen total 3 ml), y usarla para hacer el ‘autocero’ del colorímetro.
4) Ahora va a añadir la enzima. Tenga en cuenta que una vez añadida la enzima ya ha
empezado la reacción enzima-sustrato. Tenga a mano: la disolución de enzima, un trocito de
parafilm, una pipeta de 1 ml y un reloj o cronómetro con el que pueda medir segundos. Debe
terminar la reacción en un tubo para añadir la enzima al siguiente.
El procedimiento es el siguiente:
 Añadir 1 ml de enzima,
 mezclar dándole la vuelta tapando el tubo con parafilm,
 poner en marcha el cronómetro,
 inmediatamente después introducir el tubo en el colorímetro,
 cada 20 segundos, durante 2 minutos, anote el valor de absorbancia (a 410 nm).
Entre las medidas de los distintos tubos, si otro compañero está esperando, cede el uso del
colorímetro.
* En general es preferible iniciar la reacción añadiendo el sustrato, pero en esta práctica conviene
dispararla con la enzima. Ello nos lleva a despreciar el valor de hidrólisis espontánea. Un
inconveniente del método es la interferencia que producen los grupos tioles libres presentes en las
proteínas de la muestra, los cuales al reaccionar también con el DTNB pueden alterar la medida
enzimática. Ello se evita, en parte, incubando las muestras con el DTNB, antes de añadir el sustrato,
hasta que los grupos tioles se valoren convenientemente. La adición de inhibidores es necesaria si la
muestra puede contener AChE y BuChE, si sólo una de ellas está presente, como es el caso, se
pueden omitir.
28
CÁLCULOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Una Unidad Internacional de actividad enzimática (UI o U) es la cantidad de enzima que transforma
1 μmol de sustrato por minuto (unidad de tiempo) en las condiciones de ensayo (1 U= 1 mol/min)
Partimos de la Ley de Lambert-Beer, ya que la relación absorbancia / concentración sigue dicha
Ley de Lambert-Beer:
Absorbancia = ×C×L
Siendo:
 = coeficiente de extinción molar del cromóforo (litro / mol×cm)
C = concentración molar de producto formado (moles / litro)
L = longitud del paso óptico (para la cubeta de medida usada: 1 cm)
Por tanto podemos despejar la concentración del producto, y el resto de parámetros los conocemos:
C = Abs / (×L)
En nuestra reacción colorimétrica: 1,36×104 (moles / litro) y L = 1 (cm).
Así, para calcular la actividad enzimática usaremos el valor del incremento de absorbancia (Abs)
frente al tiempo (aparición de producto coloreado).
Dicho de otro modo, debemos calcular la aparición de producto (o desaparición de sustrato) por
tiempo. En la ecuación de Lambert-Beer dividimos entre tiempo… C/ t = (Abs/ t) / (×L)
Y ya tendremos estimación de la actividad enzimática.
Para los cálculos del Abs lo primero se representa la absorbancia de cada tubo, en los tiempos
sucesivos, frente al tiempo, y comprobamos si la misma es más o menos lineal.
*para los cálculos debe usarse sólo su tramo lineal
La pendiente de la recta de Abs frente a tiempo nos proporcionaría el dato del incremento de
absorbancia (Abs) frente al tiempo (Abs /seg o min), ya que en y = m×x + n;
y la pendiente o m = y / x, en este caso y=Abs y x= tiempo.
Para facilitar los cálculos sin la necesidad de obtener el valor numérico de la pendiente también
podemos directamente calcular el Abs por min yendo a valores obtenidos experimentalmente que
se ajusten mejor a la recta [por ej. calcular la diferencia de Absorbancia entre los segundos 0 y 60
seg, o 20 y 80 seg, o 40 y 100 seg, etc. (siempre 1 min)].
Así, si sustituimos este dato (Abs / min) en la ecuación: C/ t = (Abs/ t) / (×L),
obtendremos el valor de actividad enzimática: C/min (moles / Litro×min).
Obviamente debemos considerar los volúmenes de muestra (y totales) que usamos. Así, en realidad
para calcular la actividad enzimática por ml, empleamos la expresión:
Actividad en U/ml (µmol / min×ml) = [(Abs/min)×103×Vt] / [1,36×104×1×Vm]
Donde Vt es el volumen total en la cubeta, y Vm el volumen de muestra (enzima).
103 es un factor de conversión [resultante de pasar de moles a μmoles (103), y de litros a ml (103]
Para simplificar los cálculos, conviene calcular un factor “f” tal que:
Actividad en U/ml (µmol×min-1×ml-1) = (Abs/min) ×f
Calculad dicho factor f para nuestros ensayos. Así pues, debe comprobar la linealidad de Abs
gráficamente, calcular el Abs/min y multiplicar este valor por el factor “f” para obtener la
actividad (velocidad de reacción) en mol/min /ml suero
29
30
RESULTADOS
*Entregar al Profesor esta hoja de manera individual junto a las de cálculo después de la práctica y
antes de abandonar el laboratorio
CUESTIONES PRÁCTICA
NOMBRE Y APELLIDOS:
Nº MATRICULA:
GRUPO (al que pertenece):
DNI:
nº puesto:
FECHA DE LA PRÁCTICA:
1.1. ¿Por qué es mejor usar butiriltiocolina que acetiltiocolina para medir la actividad de
butirilcolinesterasa?
1.2. ¿Y por qué usar butiriltiocolina y no butirilcolina en este ensayo (método de Ellman)?
1.3. ¿Por qué prescindimos de inhibidores de colinesterasas para el ensayo de la butirilcolinesterasa
en el suero de pollo?
2.1. En la práctica, y para realizar el ajuste manual en la gráfica de velocidad frente a [sustrato],
asumimos que se cumple la ecuación de Michaelis – Menten, ¿a qué tipo de curva ajustamos dicha
representación? ¿qué representa la KM en dicha gráfica?
2.2. ¿De qué grafica es más exacto realizar los cálculos de KM y Vmáx?
(según gráfica representada más adelante)
3.- En las hojas siguientes deberá incluir los siguientes cálculos:
- Las tablas de Abs y las gráficas de absorbancia frente a tiempo
- Tabla con valores de Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S] para cada tubo
- Gráfica de v frente a S y gráfica de 1/v frente a 1/S (realizadas con el ordenador)
- Valor obtenido de KM y Vmáx (con unidades)
A continuación se recogen los DATOS y CÁLCULOS
(entregar sólo una copia por pareja de prácticas)
31
REGISTRO DE LOS DATOS EXPERIMENTALES
Comprobar la linealidad del incremento de Absorbancia y calcular el ∆Abs/min para al menos 2
intervalos de 1 min, usar el valor promedio como ∆Abs/min de cada tubo
TUBO 1
T (sg)
Abs410
0
20
40
60
80
100
120
TUBO 2
T (sg)
Abs410
0
20
40
60
80
100
120
TUBO 3
T (sg)
Abs410
0
20
40
60
80
100
120
32
(continuación)
TUBO 4
T (sg)
Abs410
0
20
40
60
80
100
120
TUBO 5
T (sg)
Abs410
0
20
40
60
80
100
120
TUBO 6
T (sg)
Abs410
0
20
40
60
80
100
120
33
Calculad la actividad enzimática en U/ml suero (mol/min×mL de suero)
Con el cálculo del factor “f” es inmediato el cálculo de la actividad (v0, velocidad de reacción)
Actividad en U/ml (µmol×min-1×ml-1) = (Abs/min) ×f
INDIQUE SU VALOR f=
Realizar ahora el cálculo para cada tubo ([S0]):
TUBO 1
TUBO 2
TUBO 3
TUBO 4
TUBO 5
TUBO 6
Abs/min
V(µmol×min-1×ml-1)
S (µM)
*Para conocer la concentración de sustrato final en cada uno de los tubos, debe aplicar la fórmula de
que los equivalentes iniciales y finales de sustrato.
Vi × Si = Vf × Sf
Por ejemplo, para el tubo 1:
Sustrato 6mM
Agua (ml)
DTNB (ml)
Enzima (ml)
Volumen total:
B
NO
2
1
NO
3 ml
0.05ml × 6mM = 3ml × S1
1
0,05
0,95
1
1
3 ml
2
0,1
0,9
1
1
3 ml
→ (S1 = 0.1 mM)
3
0,2
0,8
1
1
3 ml
4
0,4
0,6
1
1
3 ml
5
0,5
0,5
1
1
3 ml
6
1,0
0,0
1
1
3 ml
De la misma forma anterior, halle las concentraciones S2 hasta S6, y expresarlas en valores µM.
Contamos pues con 6 pares de valores, v0, [S0],
(uno por cada tubo) para la representación de Michaelis–Menten:
v0 frente a [S0]
Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten
La representación se realizará en los ordenadores del laboratorio, bajo las indicaciones del profesor
responsable. Una vez representados los puntos se realizará un “ajuste manual” a una hipérbola
rectangular. Téngase en cuenta la dificultad del ajuste al representar tan sólo 6 puntos; por ello el
cálculo de la Vmax ni la KM se realizará en la gráfica de dobles inversos.
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En la práctica no suelen calcularse la Vmax ni la KM a partir de la curva de saturación, es poco
preciso, por lo que usamos la representación de Lineweaber-Burk o de dobles inversos, por lo que
primero calculamos 1/v y 1/[S] de la tabla anterior
TUBO 1
TUBO 2
TUBO 3
TUBO 4
TUBO 5
TUBO 6
1/V
1/S
Con estos 6 pares de valores, 1/v0, 1/[S0], (uno por cada tubo)
realizamos la representación de dobles inversos calculando
los valores de Vmax y KM por los puntos de intersección con los ejes
De nuevo recurrimos al uso del ordenador para la representación de la gráfica y en este caso
también para el ajuste de la recta y los puntos de corte con los ejes de donde obtendremos los
valores de la Vmax y la KM (puntos de corte. Indicar dichos valores con sus unidades
correspondientes.
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