SUSTANCIAS CAPACES DE INDUCIR APOPTOSIS.(ES2245084)

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 245 084
51 Int. Cl. : C07C 47/263, C07C 49/707
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C07C 45/52, C07C 45/59
C07C 323/22, C07D 473/18
C07D 473/34, A23L 1/30
A23L 2/00, A61K 31/12
A61K 31/52, A61K 31/122
A61K 31/522
ESPAÑA
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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 99900318 .9
86 Fecha de presentación : 14.01.1999
87 Número de publicación de la solicitud: 1050525
87 Fecha de publicación de la solicitud: 08.11.2000
54 Título: Sustancias capaces de inducir apóptosis.
30 Prioridad: 19.01.1998 JP 2011298
31.03.1998 JP 10179798
28.09.1998 JP 28870198
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.12.2005
73 Titular/es: TAKARA BIO Inc.
4-1, Seta 3-chome
Otsu-shi, Shiga, JP
72 Inventor/es: Tatsumi, Yoko;
Sagawa, Hiroaki;
Ohnogi, Hiromu;
Kobayashi, Eiji;
Wu, Hua-Kang;
Koyama, Nobuto;
Ikai, Katsushige y
Kato, Ikunoshin
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Díez de Rivera de Elzaburu, Alfonso
ES 2 245 084 T3
16.12.2005
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 245 084 T3
DESCRIPCIÓN
Sustancias capaces de inducir apóptosis.
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Campo técnico
La presente invención se refiere a una sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis útil en el campo de agentes farmacéuticos, alimentos y bebidas, a un procedimiento para su fabricación y a agentes farmacéuticos, alimentos y
bebidas que contienen dicha sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis.
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Técnica anterior
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En los últimos años, ha llamado la atención un modo de apóptosis que se refiere a la muerte de tejidos celulares. A
diferencia de la necrosis que es una muerte celular patológica, la apóptosis es una muerte que queda integrada desde
el principio en los genes de la propia célula. Así, se biosintetiza una proteína génica de muerte programada activando
un gen que programa la apóptosis en el que algunas causas externas o internas actúan como desencadenante, o en
otros casos, se activa una proteína de muerte programada que existe en una célula como tipo no activado. Se cree que
la propia célula se degrada por la proteína de muerte programada producida de tipo activado por lo que se origina la
muerte de la célula. Si dicha apóptosis se pudiera expresar en tejidos o células deseadas, sería ahora posible excluir
las células innecesarias o perjudiciales del cuerpo en su forma natural y esto será significativamente importante.
Problema que va a solucionar la invención
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Un objeto de la presente invención es ofrecer una sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis útil en el
campo de agentes farmacéuticos, alimentos y bebidas, ofrecer un procedimiento para su fabricación y además ofrecer
agentes farmacéuticos, alimentos y bebidas que contienen dicha sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis
como componente efectivo.
Medios para solucionar los problemas
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Los autores de la invención han llevado a cabo una intensa investigación para conseguir los objetos anteriormente citados, han encontrado que un producto termotratado obtenido calentando al menos un compuesto seleccionado
de (a) pentosa, (b) derivados de pentosa tales como desoxirribosa, (c) compuestos que contienen pentosa tales como
ribonucleósidos, ribonucleótidos y ácido ribonucleico y (d) compuestos que contienen derivados de pentosa tales como desoxirribonucleósidos, desoxirribonucleótidos y ácido desoxirribonucleico tienen una fuerte acción inductora de
apóptosis hacia células cancerosas y tienen éxito en aislar una sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis que
es un componente activo de dicho producto termotratado y constituye la forma de llevar a cabo la presente invención.
El sumario de la presente invención es como sigue. Así, la primera característica de la presente invención se refiere a
un procedimiento para la fabricación de un compuesto seleccionado del grupo consistente en 4,5-dihidroxi-2-pentenal,
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 1,5-epoxi-1hidroxi-3-penten-2-ona y 4-5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona, caracterizado porque incluye una etapa de someter al
menos un compuesto seleccionado de los siguientes (a), (b), (c) y (d) a un tratamiento térmico:
a) pentosa seleccionada del grupo consistente en xilosa y ribosa;
b) derivados de pentosa en el punto (a) anterior;
c) compuestos que contienen pentosa en el punto (a) anterior;
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d) compuestos que contienen derivados en el punto (b) anterior.
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Ejemplos de los derivados de pentosa son desoxipentosa tales como desoxirribosa y derivados de pentosa en los
que un grupo que puede tener una carga negativa tal como grupo ácido fosfónico o grupo ácido sulfúrico, está unido
en la posición 5. Ejemplos de los compuestos que contienen pentosa son ribonucleósidos, ribonucleótidos, ácido ribonucleico y pentosa en los que un grupo que puede tener una carga negativa tal como un grupo ácido fosfórico o un
grupo ácido sulfúrico está unido en la posición 5. Ejemplos de los compuestos que contienen derivados de pentosa son
desoxirribonucleósidos, deoxirribonucleótidos y ácido desoxirribonucleico. Ejemplos de la sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis son los compuestos seleccionados de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona y
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
La segunda característica de la presente invención se refiere a un compuesto que induce apóptosis seleccionado de
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)1,3-dioxolano.
La tercera característica de la presente invención se refiere a un agente farmacéutico para el tratamiento o prevención de una enfermedad que es sensible a un compuesto seleccionado de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-22
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ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona, caracterizado porque dicho agente contiene
un compuesto seleccionado de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano, 1,5-epoxi-1hidroxi-3-penten-2-ona como componente efectivo.
Ejemplos del agente farmacéutico en la realización de la tercera característica de la presente invención son agentes
para el tratamiento de cáncer, reumatismo, diabetes mellitus de tipo II, enanismo, enfermedad inflamatoria, arteriosclerosis, enfermedad nerviosa, lesión por reperfusión isquémica y enfermedad viral.
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La cuarta característica de la presente invención se refiere a alimentos o bebidas que contienen un compuesto seleccionado de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten2-ona.
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Ejemplos del alimento o bebida en la realización de la cuarta característica de la presente invención se fabrican para
el tratamiento de cáncer, reumatismo, diabetes mellitus de tipo II, enanismo, enfermedad inflamatoria, arteriosclerosis,
enfermedad nerviosa, lesión por reperfusión isquémica y enfermedad viral.
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Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un espectro de masas de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona.
La Figura 2 muestra un espectro de RMN de 1 H de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona.
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La Figura 3 muestra un espectro de masas de 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona.
La Figura 4 muestra un espectro de RMN de 1 H de 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona.
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La Figura 5 muestra un espectro de masas de 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
La Figura 6 muestra un espectro de RMN de 1 H de 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
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La Figura 7 muestra un espectro de masas de 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
La Figura 8 muestra un espectro de RMN de 1 H de 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3dioxolano.
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La Figura 9 muestra la relación entre la concentración de pentosa y la cantidad producida de 4,5-dihidroxi-2ciclopenten-1-ona.
La Figura 10 muestra un espectro de masas del pico 1.
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La Figura 11 muestra un espectro de masas del pico 3.
La Figura 12 muestra un espectro de RMN de 1 H del pico 1.
La Figura 13 muestra un espectro de RMN de 1 H del pico 3.
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La Figura 14 muestra la concentración de NO2 − en el medio cuando se añadió 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano seguido por incubación bajo cada una de las condiciones de incubación.
Realizaciones de la invención
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La presente invención se ilustrará a continuación de forma específica como sigue.
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Pentosa es un nombre general para sacáridos que tienen cinco carbonos y arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa, y similares están presentes en la naturaleza como aldopentosa, mientras que ribulosa y xilulosa están presentes en la naturaleza
como cetopentosa.
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Ejemplos de derivados de pentosa son desoxipentosa y pentitol y, para la primera, desoxirribosa mientras que
para el último, ribitol, arabitol y xilitol están presentes de forma natural. Además, son también derivados de pentosa
aminosacáridos, ácido aldónico, ácido aldárico y similares que tienen cinco carbonos y se pueden preparar por un
procedimientos de síntesis.
Ejemplos del compuesto que contiene pentosa son compuestos de bajo peso molecular tales como fosfato de pentosa, ribonucleósidos y ribonucleótidos y compuestos de alto peso molecular tales como ácido ribonucleico, arabinano
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y xilano. También son compuestos que contienen pentosa ésteres, éteres, glicósidos y similares de pentosa y sus sales,
y éstos se preparan por un procedimiento de síntesis.
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Ejemplos del compuesto que contiene derivado de pentosa son fosfato de desoxipentosa, desoxirribonucleósidos,
desoxirribonucleótidos y ácido desoxirribonucleico que contiene desoxipentosa y riboflavina y ácido ribitolteioico que
contiene pentitol. Los compuestos que contienen derivado de pentosa son también ésteres, éteres, amidas, glicósidos
y similares de los derivados de pentosa y sus sales y éstos se preparan por un procedimiento de síntesis.
Ácido ribonucleico, ribonucleótidos, ribonucleósidos, ácido desoxirribonucleico, desoxirribonucleótidos y desoxirribonucleósidos actúan como coenzimas o desempeñan una función de conservación y expresión de información
genética y son sustancias bastante importantes para los organismos vivos. Ribosa-5-fosfato, ribulosa-5-fosfato y xilulosa-5-fosfato se encuentran en una amplia gama de organismos como intermedios metabólicos del ciclo de pentosa
fosfato. Las sustancias gomosas de las plantas, mucílago, hemicelulosa y polisacáridos bacterianos contienen arabinosa y xilosa y lixoflavina en músculo cardíaco humano y un cierto tipo de antibióticos son derivados de xilosa.
Pentosa cuando un grupo que puede tener una carga negativa está unido en la posición 5 y un compuesto que
contiene pentosa cuando un grupo que puede tener una carga negativa está unido en la posición 5 también están
incluidas en el compuesto que contiene pentosa usado en la presente invención. En la presente invención, un grupo
que puede tener una carga negativa puede ser cualquier grupo con tal que éste tenga una carga negativa en una solución
acuosa en al menos unas condiciones de pH 1 a 13 y 0ºC a 200ºC y son ejemplos grupo ácido fosfórico y grupo ácido
sulfúrico. Además, en la presente memoria descriptiva están incluidas sales, ésteres y anhídridos de ácido de los
mismos en un grupo que puede tener una carga negativa. No obstante, aunque un grupo carboxilo es un grupo que
puede tener una carga negativa, aldopentosa que tiene un grupo carboxilo en la posición 5 es ácido urónico y, por
tanto, está excluido del compuesto que contiene pentosa usado en la presente invención.
Ejemplos de la pentosa en la que un grupo que puede tener una carga negativa está unido en la posición 5 son
ribosa-5-fosfato y ribosa-5-sulfato.
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Ejemplos de un compuesto que contiene pentosa en el que un grupo que puede tener una carga negativa está
unido en la posición 5 son ácido ribonucleico, ribonucleótidos y ribonucleósidos, así como productos degradados de
los mismos, se pueden usar derivados de los productos degradados y sales de los productos degradados que son los
productos preparados por tratamiento químico, enzimático o físico de los mismos.
Pentosa, derivados de pentosa, compuestos que contienen pentosa y compuestos que contienen derivados de pentosa se obtienen por extracción de animales, plantas o microorganismos, se fabrican por un procedimiento de fermentación, se sintetizan por un medio químico y similares, y se puede usar un producto por cualquiera de los medios
de fabricación en la presente invención con tal que se forme por un tratamiento térmico una sustancia que tenga una
capacidad para inducir apóptosis.
En la presente invención, se puede usar también una sustancia que contiene pentosa seleccionada del grupo consistente en xilosa + ribosa, derivados de pentosa, compuestos que contienen pentosa y/o compuestos que contienen
derivados de pentosa. Tejidos de animales y plantas y células de animales, plantas y microorganismos contienen diversos tipos de pentosa seleccionados del grupo consistente en xilosa + ribosa, derivados de pentosa, compuestos que
contienen pentosa y compuestos que contienen derivados de pentosa y, por tanto, éstos se pueden usar en la presente
invención como tales.
En la presente invención, no existe limitación particular en cuanto al procedimiento de tratamiento térmico en la
fabricación de la sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis con tal que esté en las condiciones en las que se
obtiene un producto termotratado que tiene capacidad para inducir apóptosis y, por ejemplo, se calienta al menos un
compuesto seleccionado de los puntos (a) a (d) anteriormente citados a 30-400ºC durante desde unos pocos segundos
a unos pocos días o, con preferencia, a 50-200ºC durante desde unos pocos segundos a 24 horas, después de lo cual
se puede obtener un producto termotratado que tiene capacidad para inducir apóptosis. En el producto termotratado
se producen dos o más sustancias que tienen una capacidad para inducir apóptosis y, dependiendo del objeto, las
condiciones de tratamiento térmico tales como pH, tiempo, temperatura y concentración de materiales se pueden
modificar, después de lo cual se puede preparar un producto termotratado que tiene capacidad para inducir apóptosis
que contiene una sustancia deseada.
Por ejemplo, cuando se usan ribosa o ribosa-5-fosfato, se puede obtener un producto termotratado que contiene
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona calentando, por ejemplo, a 80-150ºC durante unos pocos minutos a unos pocos días.
De aquí en adelante, se hará referencia al producto termotratado del compuesto seleccionado de los puntos (a) a
(d) anteriores que tiene capacidad para inducir apóptosis simplemente como el producto termotratado de la presente
invención.
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No existe limitación particular para la concentración del material una vez calentado con tal que la concentración
esté dentro de un intervalo tal que se pueda obtener por el tratamiento térmico la sustancia que tiene capacidad para
inducir apóptosis. Así, la concentración se puede decidir teniendo en consideración la facilidad de trabajo, el rendi4
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miento y consideraciones similares. El tratamiento término en la presente invención puede ser calentamiento por vía
húmeda o calentamiento por vía seca. En el caso de un calentamiento por vía húmeda, se puede usar cualquiera de
los procedimientos de calentamiento por vía húmeda tales como calentamiento con vapor, calentamiento con vapor a
alta presión, calentamiento a alta presión y similares, mientras que, en el caso de un calentamiento por vía seca, se
puede usar cualquiera de los procedimiento de calentamiento por vía seca tales como calentamiento directo usando
aire seco y caliente y un calentamiento indirecto desde una fuente de calor a través de una separación. Ejemplos del
calentamiento directo son un calentamiento seco por una corriente de aire y un calentamiento seco por medio de pulverización mientras que los de calentamiento indirecto son calentamiento por medio de un tambor y similares. Además,
el material para la sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis de la presente invención se puede tratar por
cualquiera de los procedimientos comunes de calentamiento tales como ebullición, tostación, calcinación, decocción,
inyección de vapor, vesiculación, fritura y similares.
La sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis de la presente invención se puede purificar usando una
acción que induce apóptosis como indicador. En lo que se refiere a los medios de purificación, se pueden usar medios
de purificación conocidos convencionalmente tales como procedimiento químico y procedimiento físico.
Por ejemplo, cuando se usa ribosa y su solución acuosa 2M se calienta a 121ºC durante 14 horas, se produce
4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona en el producto termotratado. La 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona en el producto
termotratado se extrae con un disolvente y se concentra el extracto. El concentrado se separa por una cromatografía
en columna sobre gel de sílice, se concentra la fracción eluida de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona, seguidamente se
extrae la 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona del concentrado con cloroformo y el extracto concentrado se somete a una
cromatografía en columna en fase normal después de lo cual se aísla 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona en el producto
termotratado de la presente invención.
Cuando el producto termotratado anterior de ribosa se somete a un tratamiento con una columna de resina de intercambio iónico o, con preferencia, una columna de resina de intercambio iónico aniónica y se recogen las fracciones
no adsorbidas, se purifica a continuación la 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona. Como alternativa, el producto termotratado anterior de ribosa se trata con una columna de carbón activado, se separan las fracciones no absorbentes y se
lava la columna y eluye con un disolvente orgánico hidrófilo tal como una solución acuosa de etanol, con preferencia
una solución acuosa de etanol al 40% o superior, dando 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona pura. Cuando se combinan
ambos procedimientos, se puede obtener 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona de mayor pureza.
Mediante el uso del mismo medio de purificación, es posible obtener un compuesto seleccionado de 4,5-dihidroxi2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona y
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona a partir del producto termotratado de la presente invención.
A propósito, el producto puro y el producto parcialmente puro que se purifica por dichos medios de purificación
también están incluidos en la sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis de la presente invención.
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Los autores de la presente invención han descubierto que trans-4,5-dihidroxi-2-ciclopentenal citado en Biochemistry, 35, 659-665 (1996) y sus análogos están contenidos en el producto termotratado de la presente invención y han
descubierto que estos compuestos muestran una acción anticancerígena, una acción que induce apóptosis y similares.
Los autores de la presente invención también han podido aislar 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona y 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona a partir del producto termotratado de la presente invención. Estos han descubierto además que se produce
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano a partir de 4,5-dihidroxi-2-pentenal y han podido aislarlo con éxito. También han descubierto que 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona reacciona con un compuesto que
contiene SH dando un compuesto representado por la fórmula [I] y han podido aislarlo con éxito. Ellos también han
descubierto que estos compuestos tienen actividades fisiológicas tales como actividad para suprimir el crecimiento de
células de cáncer y actividad para inducir apóptosis.
En consecuencia, cuando se usa como componente efectivo un compuesto seleccionado de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona (en lo sucesivo denominados el compuesto de la presente invención), es posible ahora ofrecer un agente farmacéutico para el tratamiento o
prevención de una enfermedad que muestre una sensibilidad hacia el compuesto de la presente invención tal como
una enfermedad cancerígena, una enfermedad que requiera inducción de apóptosis, una enfermedad que requiera la
supresión de la producción de oxígeno activo, una enfermedad que requiera la inducción de producción de factor de
crecimiento tipo insulina humana, una enfermedad que requiera la inducción de producción de proteína de choque
térmico y similares.
Cuando un compuesto que se selecciona del producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la
presente invención se usa como componente efectivo y se prepara en una preparación farmacéutica mezclándolo con
vehículos farmacéuticos conocidos, es posible ahora preparar un inductor de apóptosis. Por lo general, un compuesto
que se selecciona del producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención se
mezcla con un vehículo líquido o sólido farmacéuticamente aceptable y, si fuera necesario, se añade al mismo un
disolvente, agente de dispersión, emulsionante, tampón, estabilizador, carga, ligante, agente disgregante, lubricante y
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similares, dando un inductor de apóptosis que puede estar en forma sólida tal como comprimidos, granulados, polvos
diluidos, polvos, cápsulas y similares o en forma líquida tal como soluciones, suspensiones, emulsiones y similares.
Además, este puede estar en una preparación seca que se puede hacer líquida añadiendo un vehículo apropiado antes de
usar.
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El inductor de apóptosis de la presente invención se puede administrar bien por vía oral o parenteral, por ejemplo,
por inyección o infusión por goteo intravenoso.
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El vehículo farmacéutico se puede seleccionar dependiendo del modo anteriormente citado de administración y
de la forma de la preparación. En el caso de preparaciones orales, se pueden usar almidón, lactosa, azúcar, manitol,
carboximetilcelulosa, almidón de maíz, sales inorgánicas y similares. En la fabricación de preparaciones orales, se
pueden mezclar con los mismos además ligantes, agentes disgregantes, agentes tensioactivos, lubricantes, promotores
de la fluidez, correctores del sabor, agentes colorantes, aromatizantes y similares.
Por otro lado, en el caso de preparaciones parenterales, éstas se pueden preparar por procedimientos comunes en
los que se disuelve o se suspende un compuesto que se selecciona del producto termotratado de la presente invención o
el compuesto de la presente invención que es un componente efectivo de la presente invención en un diluyente tal como
agua destilada para inyección, solución salina fisiológica, solución acuosa de glucosa, aceite vegetal para inyección,
aceite de sésamo, aceite de cacahuete, aceite de semilla de soja, aceite de maíz, propilenglicol, polietilenglicol y similares, seguido, en caso necesario, por la adición de bactericidas, estabilizadores, agentes de isotonicidad, analgésicos
y similares.
El inductor de apóptosis que contiene un compuesto que se selecciona del producto termotratado de la presente
invención o el compuesto de la presente invención se administra por una vía adecuada dependiendo de la forma de
preparación. Tampoco existe limitación particular para el procedimiento de administración y se puede administrar
mediante uso oral, uso externo e inyección. Las preparaciones para inyección se administran, por ejemplo, por vía
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea y vías similares, mientras que las preparaciones para uso externo
incluyen supositorios y similares.
La dosis como inductor de apóptosis que contiene el producto termotratado de la presente invención como componente efectivo está determinada de forma apropiada por su forma de preparación, procedimiento de administración,
objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es constante, aunque normalmente, la
cantidad del componente efectivo contenida en la preparación varía de 1 a 1000 mg, con preferencia, de 10 a 200
mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los diversos estados patológicos y, por
tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras que, en otros casos, puede ser
necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente invención se puede administrar
directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de modo que el agente puede
ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como un inductor de apóptosis que contiene el compuesto seleccionado del compuesto de la presente invención como componente efectivo está determinada de forma apropiada por su forma de preparación, procedimiento
de administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es constante, aunque
normalmente, la cantidad del componente efectivo contenido en la preparación varía de 0,01 a 50 mg, con preferencia de 0,1 a 10 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los diversos estados
patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras que, en
otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente invención
se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de modo que
el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
El producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención tiene una acción que
induce apóptosis frente a células de cáncer, una acción supresora del crecimiento celular y una acción inhibidora de
la topoisomerasa II. Se puede fabricar un agente anticancerígeno cuando un producto termotratado de la presente
invención o un compuesto de la presente invención se use como componente efectivo. Así, cuando un producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención se usa como componente efectivo y se
elabora en forma de una preparación combinando con un vehículo farmacéutico conocido, se puede fabricar un agente
anticancerígeno. La fabricación del agente anticancerígeno se puede llevar a cabo por un procedimiento similar al
citado antes.
El agente anticancerígeno se puede administrar bien por vía oral o parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión
por goteo intravenoso.
El vehículo farmacéutico se puede seleccionar dependiendo del modo de administración anteriormente citado y
de la forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso del inductor de apóptosis anteriormente
citado.
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El agente anticancerígeno se administra por una vía apropiada dependiendo de la forma de administración. No
existe tampoco limitación particular en cuanto al procedimiento de administración y se puede administrar por medio
de uso oral, uso externo e inyección. Las preparaciones para inyección se administran, por ejemplo, por vía intrave6
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nosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea y similares, mientras que las preparaciones para uso externo incluyen
supositorios y similares.
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La dosis como un agente anticancerígeno que contiene el producto termotratado de la presente invención como
componente efectivo está determinada apropiadamente por su forma de preparación, procedimiento de administración,
objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es constante aunque, normalmente, la
cantidad del producto termotratado de la presente invención contenida en la preparación varía de 1 a 1000 mg, con
preferencia de 10 a 200 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los diversos
estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras
que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente
invención se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de
modo que el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como agente anticancerígeno que contiene el compuesto seleccionado del compuesto de la presente invención como componente efectivo está determinada de forma apropiada por su forma de preparación, procedimiento
de administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es constante, aunque
normalmente, la cantidad del componente eficaz contenido en la preparación varía de 0,01 a 50 mg, con preferencia de 0,1 a 10 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los diversos estados
patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras que, en
otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente invención
se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de modo que
el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
El reumatismo es una enfermedad autoinmune en la que los impedimentos tienen lugar en células periosteales y
células del cartílago. El producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención tiene
una acción inductora de apóptosis hacia células sinoviales. Por consiguiente, se puede fabricar un agente antirreumático cuando se use como componente eficaz un producto termotratado de la presente invención o el compuesto de
la presente invención. Así, cuando un producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente
invención se usa como componente efectivo y se elabora en forma de una preparación combinando con un vehículo
farmacéutico conocido, se puede fabricar un agente antirreumático. La fabricación del agente antirreumático se puede
llevar a cabo por un procedimiento similar al que ya se ha citado.
El agente antirreumático se puede administrar bien por vía oral o parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión
por goteo intravenoso.
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El vehículo farmacéutico se puede seleccionar dependiendo del modo de administración anteriormente citado y
de la forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso del inductor de apóptosis anteriormente
citado.
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El agente antirreumático se administra por una vía apropiada dependiendo de la forma de administración. No existe
tampoco limitación particular en cuanto al procedimiento de administración y se puede administrar por medio de uso
oral, uso externo e inyección. Las preparaciones para inyección se administran, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea y similares, mientras que las preparaciones para uso externo incluyen supositorios
y similares.
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La dosis como un agente antirreumático que contiene el producto termotratado de la presente invención como
componente efectivo está determinada apropiadamente por su forma de preparación, procedimiento de administración,
objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es constante aunque, normalmente, la
cantidad del producto termotratado de la presente invención contenida en la preparación varía de 1 a 1000 mg, con
preferencia de 10 a 200 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los diversos
estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras
que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente
invención se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de
modo que el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
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La dosis como agente antirreumático que contiene el compuesto seleccionado del compuesto de la presente invención como componente efectivo está determinada de forma apropiada por su forma de preparación, procedimiento de
administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es constante, aunque
normalmente, la cantidad del componente eficaz contenido en la preparación varía de 0,01 a 50 mg, con preferencia de 0,1 a 10 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los diversos estados
patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras que, en
otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente invención
se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de modo que
el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
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El factor de crecimiento de la insulina humana (en lo sucesivo denominado hlGF-1) tiene diversas acciones fisiológicas frente a diversas células y se ha usado como agente terapéutico para la diabetes mellitus tipo II (no dependiente
de la insulina) y para la incapacidad para crecer (enanismo). Un producto termotratado de la presente invención o
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el compuesto de la presente invención tiene una acción inductora de la producción de hIGF-1. Por consiguiente, se
puede preparar un inductor de la producción de hIGF-1 cuando el producto termotratado de la presente invención o el
compuesto de la presente invención se use como componente eficaz. Así, cuando se usa un producto termotratado de
la presente invención o el compuesto de la presente invención como componente efectivo y se elabora en forma de una
preparación combinando con un vehículo farmacéutico conocido, se puede fabricar un inductor de la producción de
hIGF-1. La fabricación del inductor de la producción de hIGF-1 se puede llevar a cabo por un procedimiento similar
al ya citado anteriormente. Se puede usar un inductor de la producción de hlGF-1 como agente terapéutico y preventivo para una enfermedad que requiera la inducción de la producción de hlGF-1 y para diabetes mellitus de tipo II y
también como agente terapéutico para el enanismo.
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El inductor de la producción de hIGF-1 se puede administrar bien por vía oral o parenteral, por ejemplo, por
inyección o infusión por goteo intravenoso.
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El vehículo farmacéutico se puede seleccionar dependiendo del modo de administración anteriormente citado y
de la forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso del inductor de apóptosis anteriormente
citado.
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El inductor de la producción de hIGF-1 se administra por una vía apropiada dependiendo de la forma de administración. No existe tampoco limitación particular en cuanto al procedimiento de administración y se puede administrar
por medio de uso oral, uso externo e inyección. Las preparaciones para inyección se administran, por ejemplo, por
vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea y similares, mientras que las preparaciones para uso externo
incluyen supositorios y similares.
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La dosis como inductor de la producción de hIGF-1 que contiene el producto termotratado de la presente invención como componente efectivo está determinada apropiadamente por su forma de preparación, procedimiento de
administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es constante aunque,
normalmente, la cantidad del producto termotratado de la presente invención contenida en la preparación varía de 1
a 1000 mg, con preferencia de 10 a 200 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo
de los diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos
casos mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de
la presente invención se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento
o bebida de modo que el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como inductor de la producción de hIGF-1 que contiene el compuesto seleccionado del compuesto de
la presente invención como componente efectivo está determinada de forma apropiada por su forma de preparación,
procedimiento de administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es
constante, aunque normalmente, la cantidad del componente eficaz contenido en la preparación varía de 0,01 a 50 mg,
con preferencia de 0,1 a 10 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los diversos
estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras
que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente
invención se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de
modo que el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
El producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención tiene una acción de
suprimir la producción de oxígeno activo y es posible fabricar un supresor de la producción de oxígeno activo cuando
el producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención sea un componente efectivo
y dicho supresor se puede administrar por un procedimiento que corresponde a una enfermedad que requiera supresión
de la producción de oxígeno activo.
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Así, el producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención es útil para suprimir
la producción de oxígeno activo y un antioxidante tal como un supresor de la producción de oxígeno activo que
contiene dicho compuesto como componente efectivo es útil como una terapia o una prevención de enfermedades
provocadas por producción y/o flujo excesivo de oxígeno activo.
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El oxígeno activo se puede clasificar de forma aproximada en radicales y no radicales. Ejemplos de oxígeno
activo del tipo radicálico son el radical hidroxi, radical hidroxiperoxi, radical peroxi, radical alcoxi, radical dióxido
de nitrógeno, monóxido de nitrógeno (denominado en lo sucesivo NO), radical tiilo y superóxido, mientras que los
ejemplos de oxígeno activo de un tipo no radicálico son oxígeno singlete, peróxido de oxígeno, hidroperóxido lipídico,
ácido hipocloroso, ozono y ácido peroxinitroso. Todos ellos están relacionados con muchas enfermedades tales como
diversas enfermedades inflamatorias, diabetes mellitus, cáncer, arteriosclerosis, enfermedades nerviosas y lesión por
reperfusión isquémica.
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Por ejemplo, el NO es un factor fundamental del factor relajante dependiente del endotelio (EDRF) [Nature, volumen 327, páginas 524-526 (1987)]. La presente invención ofrece un agente terapéutico o preventivo para las enfermedades que requieren la supresión de producción de NO.
No existe limitación particular en cuanto a enfermedades que requieren la supresión de la producción de NO y sus
ejemplos son hipotensión sistémica causada por choque tóxico o por terapia de ciertas citoquinas, disminución en la
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respuesta de la tensión arterial, enfermedades autoinmunes, inflamación, artritis, artritis reumatoide, diabetes mellitus,
enfermedades inflamatorias del intestino, insuficiencia de la función de los vasos sanguíneos, dilatación etiológica de
los vasos sanguíneos, lesión a los tejidos, isquemia cardiovascular, sensibilidad al dolor, isquemia cerebral, enfermedades causadas por angiogénesis, cáncer y similares. Las enfermedades incluyen las que se citan en las publicaciones
de patente japonesa abierta a consulta pública Hei-09/504.524; 09/505.288; 08/501.069; 08/512.318; y 06/508.849.
Un supresor de la producción de oxígeno activo es útil para la terapia y prevención de enfermedades que requieren la
supresión de la producción de NO como un supresor de la producción de NO.
El supresor de la producción de oxígeno activo se puede administrar bien por vía oral o parenteral, por ejemplo,
por inyección o infusión por goteo intravenoso.
El vehículo farmacéutico se puede seleccionar dependiendo del modo de administración anteriormente citado y
de la forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso del inductor de apóptosis anteriormente
citado.
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El supresor de la producción de oxígeno activo se administra por una vía apropiada dependiendo de la forma de
administración. No existe tampoco limitación particular en cuanto al procedimiento de administración y se puede
administrar por medio de uso oral, uso externo e inyección. Las preparaciones para inyección se administran, por
ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea y similares, mientras que las preparaciones para
uso externo incluyen supositorios y similares.
La dosis como supresor de la producción de oxígeno activo que contiene el producto termotratado de la presente
invención como componente efectivo está determinada apropiadamente por su forma de preparación, procedimiento
de administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es constante aunque,
normalmente, la cantidad del producto termotratado de la presente invención contenida en la preparación varía de 1
a 1000 mg, con preferencia de 10 a 200 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo
de los diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos
casos mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de
la presente invención se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento
o bebida de modo que el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como un supresor de la producción de oxígeno activo que contiene el compuesto seleccionado del compuesto de la presente invención como componente efectivo está determinada de forma apropiada por su forma de
preparación, procedimiento de administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata
y no es constante, aunque normalmente, la cantidad del componente eficaz contenido en la preparación varía de 0,01
a 50 mg, con preferencia de 0,1 a 10 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de
los diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos
mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la
presente invención se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento o
bebida de modo que el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
El producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención tiene una acción de
inducir la producción de proteína de choque térmico y es posible fabricar un inductor de la proteína de choque térmico
en el que el producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención es un componente efectivo y dicho inductor se puede administrar por un procedimiento conforme a la enfermedad que requiere la
inducción de la proteína de choque térmico.
Por consiguiente, el producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la presente invención tiene
actividad inductora de la proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70), y tiene actividad antiviral hacia virus ARN
y virus ADN tales como virus de la hepatitis, virus del SIDA, virus influenza, virus de la estomatitis vesicular y virus
del herpes. La proteína de choque térmico participa en la inmunidad frente al cáncer y los compuestos son eficaces
también para la inmunidad frente al cáncer. Además, los compuestos tienen actividad de defensa biológica tal como
actividad antiinflamación. Cuando se toma el producto termotratado de la presente invención o el compuesto de la
presente invención se pueden prevenir y curar enfermedades virales tales como resfriado por influenza.
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A propósito, la proteína de choque térmico es un nombre general para la proteína cuya síntesis se induce cuando
se somete una célula o un individuo a un cambio repentino de temperatura que es mayor que la temperatura normal
hasta un grado de aproximadamente 5 a 10ºC y existe ampliamente en procariotas y eucariotas superiores. Ejemplos
de proteínas conocidas de choque térmico son HSP90, HSP70, ubiquitina y HSP26. Entre ellas, HSP70 es un tipo de
chaperona molecular y está unida a una proteína en la que no se ha completado el plegamiento o se ha realizado de
forma incompleta para ayudar a la formación de la estereoestructura. La secuencia de aminoácidos de la proteína de
choque térmico se ha conservado bien durante el curso de la evolución y HSP70 es idéntica a la proteína DnaK de
Escherichia coli. En seres humanos, existen aproximadamente diez genes de HSP70 y algunos de ellos son expresados
de forma constitutiva mientras que otros son inducidos por diversos estímulos. Además de choque térmico, la síntesis
de la proteína de choque térmico es inducida por diversas sustancias químicas y por impedimentos celulares tales
como la oxidación.
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El inductor de la proteína de choque térmico se puede administrar bien por vía oral o parenteral, por ejemplo, por
inyección o infusión por goteo intravenoso.
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El vehículo farmacéutico se puede seleccionar dependiendo del modo de administración anteriormente citado y
de la forma de preparación y se puede usar del mismo modo que en el caso del inductor de apóptosis anteriormente
citado.
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El inductor de la proteína de choque térmico se administra por una vía apropiada dependiendo de la forma de
administración. No existe tampoco limitación particular en cuanto al procedimiento de administración y se puede
administrar por medio de uso oral, uso externo e inyección. Las preparaciones para inyección se administran, por
ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea y similares, mientras que las preparaciones para
uso externo incluyen supositorios y similares.
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La dosis como inductor de la proteína de choque térmico que contiene el producto termotratado de la presente
invención como componente efectivo está determinada apropiadamente por su forma de preparación, procedimiento
de administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es constante aunque,
normalmente, la cantidad del producto termotratado de la presente invención contenida en la preparación varía de 1
a 1000 mg, con preferencia de 10 a 200 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo
de los diversos estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos
casos mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de
la presente invención se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento
o bebida de modo que el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
La dosis como inductor de la proteína de choque térmico que contiene el compuesto seleccionado del compuesto de
la presente invención como componente efectivo está determinada de forma apropiada por su forma de preparación,
procedimiento de administración, objeto de uso y edad, peso corporal y síntomas del paciente que se trata y no es
constante, aunque normalmente, la cantidad del componente eficaz contenido en la preparación varía de 0,01 a 50 mg,
con preferencia de 0,1 a 10 mg por día (para adultos). Naturalmente, la dosis puede variar dependiendo de los diversos
estados patológicos y, por tanto, pueden ser suficientes dosis menores que las anteriores en algunos casos mientras
que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor que las anteriores. El agente farmacéutico de la presente
invención se puede administrar directamente por vía oral y, además, se puede añadir a cualquier alimento o bebida de
modo que el agente puede ingerirse de una forma rutinaria.
Se puede usar un compuesto que se selecciona del producto termotratado de la presente invención y/o uno de sus
productos parcialmente purificados o el compuesto de la presente invención como un material para alimento/bebida
que induce apóptosis, alimento/bebida carcinostático, alimento/bebida antirreumático, alimento/bebida que induce la
producción de hIGF-1, alimento/bebida supresora de la producción de oxígeno activo o alimento/bebida que induce la
proteína de choque térmico.
Un alimento o bebida en el que un compuesto que se selecciona del producto termotratado de la presente invención
y/o un producto parcialmente purificado del mismo o el compuesto de la presente invención está(n) contenido(s) en
los mismos, diluidos con los mismos y/o añadidos a los mismos es suficiente si dicho alimento o bebida contiene
una cantidad que es necesaria para expresar la acción fisiológica de un compuesto que se selecciona del producto
termotratado de la presente invención y/o un producto parcialmente purificado del mismo o el compuesto de la presente
invención.
No existe limitación particular en cuanto al procedimiento para fabricar el alimento o bebida de la presente invención tal como alimento que induce apóptosis, bebida que induce apóptosis, alimento carcinostático y bebida carcinostática y se puede usar la fabricación por un procedimiento de fabricación de alimentos o bebidas que se ha usado para
cocinado, procesado y otros procesos en general con tal que esté contenida en, diluida con y/o añadida al alimento o
bebida fabricada una cantidad eficaz del compuesto seleccionado del producto termotratado y/o uno de sus productos parcialmente purificados o el compuesto de la presente invención que tiene acción que induce apóptosis, acción
anticancerígena y similares.
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El producto parcialmente purificado del producto termotratado de la presente invención se obtiene por purificación
del producto termotratado de la presente invención cuando no existe limitación para ello, con tal que tenga una capacidad para inducir apóptosis y no existe limitación particular para ello con tal que sea un producto obtenido por un
procedimiento habitual en una etapa de purificación de alimentos y bebidas.
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Para dicho alimento y bebida, no existe limitación particular en cuanto a su forma con tal que esté contenida en
el mismo, diluida con el mismo y/o añadida al mismo una cantidad eficaz del compuesto seleccionado del producto
termotratado y/o uno de sus productos parcialmente purificados o el compuesto de la presente invención que tiene
acción que induce apóptosis, acción anticancerígena y similares y dicho alimento o bebida incluye la formas que
pueden administrarse por vía oral tales como comprimidos, granulados, cápsulas, gel y sol.
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Cuando se administra a ratones una dosis fisiológicamente activa eficaz del producto termotratado de la presente
invención y uno de sus productos parcialmente purificados y el compuesto de la presente invención, no se aprecia
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toxicidad aguda. Por ejemplo, no existen casos de muerte por una administración oral única de 100 mg/kg de cada uno
de 4,5-dihidroxi-2-pentenal y 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
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El agente farmacéutico de la presente invención es útil para mantener la homeostasis del cuerpo humano. Además,
un procedimiento para inducir apóptosis usando el compuesto seleccionado del producto termotratado de la presente
invención y/o uno de sus productos parcialmente purificados o el compuesto de la presente invención como componente efectivo es útil en investigación del mecanismo de defensa del organismo, mecanismo inmune o la relación entre
cáncer, enfermedades virales y similares, y el cuerpo humano, en el desarrollo de inhibidores que inducen apóptosis y
similares.
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Cuando el producto termotratado de la presente invención y/o un producto parcialmente purificado está(n) contenido(s) en un alimento o bebida, es posible fabricar alimentos o bebidas que inducen apóptosis, alimentos o bebidas
carcinostáticos, alimentos o bebidas antirreumáticos, alimentos o bebidas que inducen la producción de hIGF-1, alimentos o bebidas que suprimen la producción de oxígeno activo o alimentos o bebidas que inducen la proteína de
choque térmico. Los alimentos o bebidas que contienen el producto termotratado de la presente invención y/o uno de
sus productos purificados es un alimento o bebida saludable que tiene un efecto de prevención de la carcinogénesis, un
efecto anticancerígeno, un efecto antiviral y efectos similares al tomarlo y es un alimento o bebida útil para mantener
la homeostasis, en particular mantener la salud del estómago e intestino, del organismo debido a diversas actividades
fisiológicas de dicho producto termotratado y/o uno de sus productos purificados tales como acción inductora de apóptosis, acción anticancerígena, acción antirreumática, acción inductora de la producción de hlGF-1, acción supresora
de la producción de oxígeno activo y acción inductora de la proteína de choque térmico.
A propósito, se puede preparar 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona por un procedimiento de síntesis química. Ejemplos
de procedimientos conocidos de síntesis son un procedimiento de N. Tanaka, et al. [Tetrahedron, 32, 1713 (1976)],
un procedimiento de M. Nara, et al. [Tetrahedron, 36, 3161 (1980)] y un procedimiento de M. Gill, et al. [Australian
Journal of Chemistry, 34, 2587(1981)]. No obstante, los procedimientos son complicados, consistiendo en muchas
etapas de síntesis y además los rendimientos son bajos, por lo que no son los procedimientos que tienen una alta
eficiencia. A la vista de lo anterior, los autores de la presente invención han descubierto que, cuando se reduce 4-ciclopenten-1,3-diona con cloruro de cerio (III) y borohidruro sódico, es posible ahora producir 4-hidroxi-2-ciclopenten-1ona en una única etapa y con un alto rendimiento. Así, la presente invención ofrece un procedimiento industrial para
la síntesis de 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
Cuando se hace reaccionar 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, una de sus sustancias ópticamente activas y/o una de
sus sales con un compuesto que contiene SH, se produce en la solución de reacción el compuesto representado por la
fórmula [I] ya mencionada, (en lo sucesivo denominado derivado tio).
No existe ninguna limitación para el compuesto que contiene un grupo SH y son ejemplos de los mismos metanotiol, butanotiol, mercaptoetanol, aminoácido que contiene un grupo SH y derivado aminoacídico que contiene un
grupo SH. Ejemplos del aminoácido que contiene un grupo SH son cisteína y homocisteína.
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Ejemplos del derivado aminoacídico que contiene un grupo SH son derivados de los aminoácidos anteriormente
citados tales como derivados de cisteína, péptidos que contiene cisteína y péptidos que contienen derivados de cisteína.
No hay limitación particular para el péptido que contiene cisteína con tal que cisteína sea un componente constituyente
en el péptido. El péptido que contiene cisteína cubre desde sustancias de bajo peso molecular tales como oligopéptidos
(por ejemplo glutatión) hasta las de alto peso molecular tales como proteínas. El péptido que contiene cisteína u
homocisteína también se puede usar como péptido que contiene cisteína u homocisteína en la condiciones en las que
éste da cisteína u homocisteína durante la reacción tal como combinando con un tratamiento reductor. A propósito, el
péptido que contiene cisteína cubre también aquellos que contienen cisteína sacáridos, lípidos y similares. Además,
también puede ser una sal anhídrido de ácido, éster o similar de las sustancias anteriormente citadas.
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Para resumir, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona reacciona con un compuesto que contiene un grupo SH formando un
derivado tio.
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El medio para la purificación y aislamiento del derivado tio o una de sus sustancias ópticamente activas que se
prepara mediante la reacción de 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, una de sus sustancias ópticamente activas y/o una de
sus sales, con un compuesto que contiene un grupo SH tal como un aminoácido que contiene un grupo SH o uno de sus
derivados puede ser un medio de purificación conocido tal como un procedimiento químico y un procedimiento físico.
Así, se combinan procedimientos convencionales conocidos tales como filtración en gel, fraccionamiento usando una
membrana de fraccionamiento de pesos moleculares, extracción con disolvente, destilación fraccionada y diversos
procedimientos cromatográficos usando resina de intercambio iónico, y similares, por lo que se puede purificar o
aislar el compuesto de la presente invención o una de sus sustancias ópticamente activas o una de sus sales.
Por ejemplo, cuando se hacen reaccionar 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona y glutatión equimolares (tipo reducido),
se forma en la solución de reacción el derivado tio representado por la fórmula [II] siguiente y, como resultado de
cromatografía en columna sobre gel de sílice de los productos de reacción que contienen dicho derivado, se puede
purificar y aislar dicho derivado tio.
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La separación de la sustancia ópticamente activa del derivado tio se puede llevar a cabo sometiendo la mezcla
racémica a resolución mecánica, cristalización preferente, resolución por cristalización como sales diastereoisoméricas
o como compuestos de inclusión, resolución dinámica usando enzimas o microorganismos, resolución por medio de
cromatografía y técnicas similares.
Se pueden usar cromatografía de gases, cromatografía líquida, cromatografía en capa fina y similares en el caso de
una resolución por cromatografía y se puede usar una fase estacionaria quiral que es adecuada para cada una de ellas.
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Se puede usar un procedimiento que utiliza una fase estacionaria quiral, un procedimiento que utiliza un eluato
quiral, separación como un diastereoisómero y similares en una resolución óptica por cromatografía líquida.
Como fase estacionaria quiral se puede usar una fase estacionaria de tipo amida, la de tipo urea, la de tipo intercambio de ligando, fase estacionaria derivada de polisacárido-polisacárido, fase estacionaria de proteína, fase estacionaria
de éster del ácido polimetacrílico, fase estacionaria de polimetacrilamida y similares.
Con respecto a un líquido eluyente, del tipo hexano, se puede usar de forma adecuada un tipo alcohol, un tipo
acuoso (tampón) y similares, teniendo en cuenta la combinación con la fase estacionaria anteriormente citada.
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Con respecto a la sal del derivado tio o su sustancia ópticamente activa que son aceptables como agentes farmacéuticos se ejemplifican y se pueden preparar convirtiendo por medio de procedimientos conocidos.
El derivado tio, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales tiene actividades fisiológicas tales como actividad
anticancerígena, actividad para suprimir el crecimiento de células cancerosas, actividad para inducir apóptosis y debido
a estas actividades es posible ofrecer los agentes farmacéuticos que contienen el derivado tio, su sustancia ópticamente
activa o una de sus sales como componente efectivo.
Ejemplos
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La presente invención se ilustrará con más detalle por medio de los siguientes ejemplos aunque la presente invención no queda limitada en modo alguno a dichos ejemplos. A propósito, “%” usado en los ejemplos significa “% en
peso”.
Ejemplo 1
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Los valores de pH de una solución acuosa 1M de L(+)-arabinosa (fabricada por Wako Pure Chemical; 010-04582)),
una solución acuosa 1M de D-(-)-arabinosa (fabricada por Wako Pure Chemical; 013-04572), una solución acuosa 1M
de xilosa (fabricada por Nacalai Tesque; 367-19) y una solución acuosa de D-ribosa (comercializada por Nacalai
Tesque; 302-10) fueron 5,3, 4,9, 4,4 y 4,7, respectivamente.
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Estas se trataron a 121ºC durante cuatro horas y se midió su actividad para inducir apóptosis frente a leucemia
promielocítica humana HL-60 como sigue.
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Se esterilizaron sustancias calentadas y no calentadas de cada una de ellas por un filtro de membrana de 0,22 µm
preparando muestras para la actividad para inducir apóptosis. Se diluyeron dichas muestras con agua destilada aséptica
hasta un grado de 2, 4, 8, 16 y 32 veces, se midió su actividad para suprimir el crecimiento celular frente a leucemia
promielocítica humana HL-60 como sigue y se comparó su intensidad para inducir apóptosis.
Así, se colocaron 10 µl de cada una de las soluciones diluidas o 10 µl de agua destilada aséptica en un pocillo de
una placa de microvaloración de 96 pocillos. A continuación se añadieron a la misma 90 µl de un medio RPMI 1640
(fabricado por Nissui) que contenía 10% de suero bovino fetal (fabricado por Gibco) que contenía 5000 células HL-60
(ATCC CCL240) y se procedió a la incubación a 37ºC durante 48 horas en presencia de dióxido de carbono gaseoso
al 5%. Después de observar la forma de las células al microscopio óptico, se añadieron 10 µl de una solución salina
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5
10
acuosa tamponada con fosfato que contenía 5 mg/ml de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT; fabricado por Sigma), se continuó la incubación durante cuatro horas más y se observaron los estados de
crecimiento de células y la formación de formazán producido en las células al microscopio. Además, se añadieron 100
µl de 2-propanol que contenía HCl 0,04N, seguido por agitación del pocillo y se midió la absorbancia a 590 nm y se
usó como un grado de crecimiento de las células (un procedimiento con MTT).
El resultado fue que, en las secciones a las que no se añadió solución acuosa no calentada de L(+)-arabinosa,
solución acuosa de D-(-)-arabinosa, solución acuosa de D(+)-xilosa y solución acuosa de D-ribosa, no hubo diferencia
con respecto a la sección a la que se añadió agua (control) en términos de crecimiento celular, por lo que no se apreció
actividad inductora de apóptosis. Por el contrario, en las secciones en las que se añadieron soluciones diluidas 4, 4, 8 y
16 veces de solución acuosa de L(+)-arabinosa, solución acuosa de D(-)-arabinosa, solución acuosa de D(+)-xilosa y
solución acuosa de D-ribosa calentadas a 121ºC durante 4 horas se apreció deformación de las células al microscopio y,
puesto que la absorbancia a 590 nm disminuyó al compararla con el control al que se añadió agua, se apreció actividad
de supresión del crecimiento de células cancerígenas.
15
Ejemplo 2
20
25
(1) Los valores de pH de una solución acuosa 1M de 2-desoxi-D-ribosa (fabricada por Sigma; D2751) y una
solución acuosa 0,1 M de 2-desoxi-D-ribosa fueron 4,7 y 5,4, respectivamente. Se tomó una parte de la solución
acuosa 0,1 M de 2-desoxi-D-ribosa y se ajustó a pH 7,1 con NaOH 1N. Se calentó esta a 121ºC durante cuatro horas
y se midió la actividad inductora de apóptosis frente a células HL-60 por el procedimiento citado en el Ejemplo 1. A
propósito, las relaciones de dilución fueron 2, 4, 8, 16, 32, 64 y 128 veces.
El resultado fue que, en la sección en la que se añadió solución acuosa no calentada de 2-desoxi-D-ribosa no se
produjo diferencia con respecto a la sección control a la que se añadió agua en términos de crecimiento celular, por lo
que no se apreció actividad inductora de apóptosis. Por otro lado, se apreció supresión del crecimiento celular en las
secciones en las que se añadieron soluciones diluidas 128, 16 y 16 veces de una solución acuosa 1M de 2-desoxi-Dribosa, una solución acuosa 0,1 M de 2-desoxi-D-ribosa (pH sin ajustar) y una solución acuosa 0,1 M de 2-desoxi-Dribosa (pH 7,1), respectivamente, calentadas a 121ºC durante cuatro horas.
30
(2) Se separó el producto termotratado a 121ºC durante cuatro horas de una solución acuosa 1M de 2-desoxi-Dribosa obtenido en el Ejemplo 2-(1) por la siguiente HPLC de fase inversa.
Cantidad de muestra inyectada: 40 µl
35
Columna: YMC-Pack ODS-AM (4,6 x 250 mm; fabricada por YMC)
Fase móvil A: agua
40
Fase móvil B: solución acuosa al 80% de acetonitrilo
Caudal: 0,8 ml/minuto
45
Elución: Fase móvil A (cinco minutos) → gradiente de concentración lineal desde la fase móvil A a B (20
minutos) → fase móvil B (cinco minutos)
Detección: absorbancia a 215 nm
50
55
Cada una de las fracciones recogidas cada dos minutos se concentró a vacío y se midió la actividad inductora de
apóptosis frente a células HL-60 por un procedimiento del Ejemplo 1. El resultado fue que la fracción 4 (tiempo de
retención: 6-8 minutos) mostró una fuerte actividad y la fracción 8 (tiempo de retención: 14-16 minutos) mostró una
actividad débil.
(3) Se repitió una HPLC de fase inversa del Ejemplo 2-(2) para preparar un producto seco de la fracción 4. El
análisis de masas de esta muestra se llevó a cabo usando DX302 (fabricado por Nippon Denshi). Además, se disolvió
esta muestra en dimetil sulfóxido pesado y se midió un espectro de resonancia magnética nuclear usando JNM-A500
(fabricado por Nippon Denshi).
FAB-MS (Espectro de masas - Bombardeo de átomos rápidos)
60
m/z 117 [M+H]+
En el anterior se usó como matriz glicerol.
65
RMN de 1 H
δ 3,44 (2H, m, 5-H), 4,27 (1H, m, 4-H), 4,95 (1H, t, H de 5-OH), 5,32 (1 H, d, J = 5,0 Hz, H de 4-OH), 6,20 (1H,
ddd, J = 2,0, 8,0, 15,5 Hz, 2-H), 7,10 (1H, dd, J = 4,0, 15,5 Hz, 3-H), 9,55 (1H, d, J = 8,0 Hz, 1-H)
13
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En los datos anteriores, el desplazamiento químico del protón residual de dimetil sulfóxido pesado se expresó
como 2,49 ppm.
Los números de asignación de las señales en la RMN de 1 H son como se muestran en la fórmula [III] siguiente.
5
Como resultado, los datos físicos para esta muestra fueron idénticos a los de trans-4,5-dihidroxi-2-pentanal y se ha
deducido que esta muestra es trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal representado por la fórmula [III] siguiente.
10
Esta muestra mostró una fuerte actividad inductora de apóptosis y actividad supresora de crecimiento de células
cancerígenas.
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplo 3
(1) Se calentaron a 121ºC durante cuatro horas cuatro tipos de desoxirribonucleótido 100 nM (dATP, dGTP, dCTP
y dTTP). Se midió por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 1 la actividad supresora de crecimiento de
células cancerígenas de cada una de las muestras calentadas.
El resultado fue que, en un medio al que se añadieron productos termotratados de dATP y dGTP hasta las soluciones
diluidas 16 veces y en un medio al que se añadieron con productos termotratados de dCTP y dTTP hasta las soluciones
diluidas 8 veces, los números de células viables se redujeron de forma significativa al compararlos con el caso al que
se añadió agua. Además, en la observación al microscopio óptico, se apreció agregación de núcleos, reducción en el
tamaño de las células y formación de cuerpos apoptóticos en las células cultivadas a las que se añadieron las muestras.
A propósito, no se apreciaron tales fenómenos en las células cultivadas a las que se añadieron 10 µl de agua (control).
(2) Se prepararon soluciones acuosas de cinco tipos de desoxirribonucleótido (desoxiadenosina, desoxiguanosina,
desoxicitidina, desoxitimidina y desoxiuridina) y se calentaron a 121ºC durante cuatro horas. Puesto que la solubilidad
de cada una de ellas es diferente, las concentraciones de las soluciones acuosas fueron 25 mM para desoxiadenosina,
25 mM para desoxiguanosina, 1M para desoxicitidina, 0,4M para desoxitimidina y 1M para desoxiuridina.
Se midió la actividad supresora de crecimiento de células cancerígenas de cada una de las muestras calentadas
por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 1. El resultado fue que los números de células viables se redujeron significativamente en los medios en los que se añadieron solución diluida hasta dos veces (1,25 M en base
al desoxirribonucleósido) de solución termotratada de desoxiadenosina, solución diluida hasta 4 veces (0,625 M en
base a desoxirribonucleósido) de solución termotratada de desoxiguanosina, solución diluida hasta 128 veces (0,78
mM en base a desoxirribonucleósido) de solución termotratada de desoxicitidina, solución diluida hasta 16 veces (2,5
mM en base a desoxirribonucleósido) de solución termotratada de desoxitimidina o solución diluida hasta 64 veces
(1,56 mM en base a desoxirribonucleósido) de solución termotratada de desoxiuridina al compararlas con la que se
añadió únicamente agua. Además, en una observación al microscopio óptico, se confirmaron agregación de núcleos,
reducción en el tamaño de las células y formación de cuerpos apoptóticos en las células cultivadas a las que se añadió
la muestra. A propósito, tales fenómenos no se apreciaron en las células cultivadas a las que se añadieron 10 µl de agua
(control).
(3) Cada una de las soluciones calentadas preparadas en el Ejemplo 3-(2) se separó por medio de una HPLC en las
siguientes condiciones.
55
Columna: gel TSK ODS-80Ts (5 µm) (20 mm x 25 cm; fabricada por Tosoh)
Fase móvil A: solución acuosa al 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA)
Fase móvil B: solución acuosa de TFA al 0,1% /acetonitrilo al 50%
60
Caudal: 8 ml/minuto
Condiciones de elución: Fase móvil A al 100% durante diez minutos → desde la fase móvil A al 100%
hasta la fase móvil B al 100% durante 40 minutos → fase móvil al 100% durante diez minutos
65
Detección: absorbancia a 215 nm
Cada 1,5 ml de las soluciones preparadas en el Ejemplo 3-(2) se sometieron a una HPLC y se fraccionaron cada
14
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minuto y cada fracción se concentró, se evaporó hasta sequedad, se volvió a disolver en agua y se sometió a un
procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 1, después de lo cual se confirmó la actividad inductora de apóptosis en
los picos próximos a los 15-16 minutos y próximos a 25-28 minutos en todas las muestras de solución calentadas.
5
(4) Se llevó a cabo la comparación de la sustancia que tiene un pico próximo a 15-16 minutos citada en el Ejemplo
3-(3) con trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal cuya estructura ya se aisló y analizó en el Ejemplo 2-(3) por medio de una
HPLC en las siguientes condiciones.
Columna gel TSK ODS-80Ts (5 µm), 4,6 X 250 mm
10
Fase móvil A: solución acuosa de TFA al 0,1%
Fase móvil B: solución acuosa de TFA al 0,1% /acetonitrilo al 50%
Caudal: 1 ml/minuto
15
Condiciones de elución: Fase móvil A al 100% durante diez minutos → desde fase móvil A al 100% hasta
fase móvil B al 100% durante diez minutos → fase móvil al 100% durante diez minutos
Detección: absorbancia a 215 nm
20
El resultado fue que la posición de elución de la sustancia activa cercana a 15-16 minutos fue idéntica a la de trans4,5-dihidroxi-2-pentenal.
25
Además, el análisis estructural de sustancias activas próximas a 15-16 minutos de cada uno de los productos
calentados se llevó a cabo por resonancia magnética nuclear (RMN de 1 H). Como resultado, la sustancia activa próxima
a 15-16 minutos se identificó como trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal.
Ejemplo 4
30
(1) El pH de una solución acuosa (0,25 mg/ml) de sal sódica de ácido desoxirribonucleico (DNA) (fabricada por
Wako Pure Chemical; 047-22491) fue 8,9. Por separado se tomo una muestra y se ajustó a pH 7,3 con HCl 1N. Esta
se calentó a 121ºC durante cuatro horas y se midió la actividad supresora de crecimiento celular frente a células HL60 por un procedimiento del Ejemplo 1. A propósito, las relaciones de dilución fueron 2, 4, 8, 16 y 32 veces.
35
El resultado fue que, en las secciones a las que se añadieron soluciones diluidas 8 y 16 veces de solución acuosa
termotratada (a 121ºC durante cuatro horas) de sal sódica de ADN (pH sin ajustar) y solución acuosa de sal sódica de
ADN (pH 7,3), la absorbancia a 590 nm se redujo al compararla con el control en el que solo se añadió agua. Así, se
apreció una actividad supresora del crecimiento celular.
40
(2) Se calentó a 121ºC durante cuatro horas una solución acuosa al 10% p/v de sal sódica de ADN y se repartió
con acetato de etilo a una relación de 1:2 para extraer en acetato de etilo, el extracto se evaporó a vacío y el residuo se
disolvió en una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol.
45
El gel de sílice para la cromatografía en columna (fabricado por Fuji Silicia Kagaku; BW-300SP) (aproximadamente 250 cm3 ) se equilibró con una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol y se cargó en una columna de 25 cm de
diámetro x 60 cm de longitud y se sometió la solución anteriormente preparada a cromatografía con una mezcla 9:1
de cloroformo y metanol a una presión de 24516 Pa seguida por fraccionamiento aproximadamente cada 8 ml.
50
El disolvente de la fracción se evaporó de forma apropiada para sustituirlo con una solución acuosa al 50% de
etanol y se midió la actividad para suprimir el crecimiento de células cancerígenas por un procedimiento con MTT
citado en el Ejemplo 1 salvo que la muestra se diluyó en serie a la mitad usando una solución acuosa al 50% de
etanol y se colocaron en un pocillo de una placa de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos 2 µl de cada
una de las soluciones diluidas o 2 µl de una solución acuosa al 50% de etanol. El tiempo de incubación fue de 16
horas.
55
60
65
El resultado fue que, en las células incubadas en las que se añadieron fracciones 65-81 ó 177, los números de
células viables se redujeron de forma significativa al compararlas con el caso en el que se añadió una solución acuosa
al 50% de etanol. Además, en una observación al microscopio óptico, se apreció agregación de núcleos, reducción del
tamaño de las células y formación de cuerpos apoptóticos en las células incubadas cuando se añadieron las fracciones
65-81 ó 177. A propósito, tales fenómenos no se apreciaron en las células incubadas en las que se añadieron 2,0 µl de
una solución acuosa al 50% de etanol (control).
(3) Las fracciones 65-81 se sometieron a cromatografía en capa fina y a una HPLC de fase inversa y se midió la actividad supresora del crecimiento de células cancerígenas y la formación de cuerpos apoptóticos por un procedimiento
con MTT citado en el Ejemplo 1, tras lo cual se apreció actividad supresora del crecimiento de células cancerígenas y
actividad inductora de cuerpos apoptóticos.
15
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En la cromatografía en capa fina, se usó gel de sílice 60F254 (fabricado por Merck; 1.05554) y se desarrolló una
mezcla 9:1 de cloroformo y metanol y se realizó la detección por un reaccionante de coloración de orcinol-ácido
sulfúrico.
5
En el análisis HPLC de fase inversa, se usó una columna con gel TSK ODS-80 Ts (4,6 x 250 mm; fabricada por
Tosoh) y, después de eluir con agua durante cinco minutos a un caudal de 0,8 ml/minuto, se llevó a cabo la elución
hasta una solución acuosa al 80% de acetonitrilo por medio de un gradiente de concentración durante 20 minutos y se
realizó la detección midiendo la absorbancia a 206 nm.
10
La sustancia activa de las fracciones 65-81 anteriores corresponde a una sustancia que tiene una mancha a Rf 0,42
en la cromatografía en capa fina y a una sustancia que tiene un pico en el tiempo de retención de 8,8 minutos en la
HPLC de fase inversa.
15
20
Las fracciones en las que se detectó una mancha de Rf 0,42 se recogieron y se evaporó el disolvente de las mismas
a vacío.
El componente activo se recogió seguidamente y se purificó por medio de una HPLC de fase inversa. Se usó una
columna de gel TSK ODS-80 Ts (20 mm de diámetro x 250 mm de longitud; fabricada por Tosoh) como columna y
se eluyó con agua a un caudal de 6,5 ml/minuto y se realizó la detección por absorbancia a 206 nm. Cada uno de los
picos se fraccionó y concentró a vacío, se midió su actividad por el procedimiento con MTT anteriormente citado y los
picos en los que se apreció actividad se disolvieron en agua pesada y dimetil sulfóxido pesado seguido por someterlos
a análisis por medio de espectro de resonancia magnética nuclear.
Los resultados se dan a continuación.
25
RMN de 1 H
δ 2,38 (1H, dd, J = 2,0, 19,0 Hz, 5-H), 2,98 (1H, dd, J = 6,5, 19,0 Hz, 5-H), 5,18 (1H, m, 4-H), 6,47 (1H, dd, J =
1,5, 6,0 Hz, 2-H), 7,94 (1H, dd, J = 2,5, 6,0 Hz, 3-H).
30
En los datos anteriores, los valores de desplazamientos químicos de HOD se expresan como 4,65 ppm.
Los números de asignación de las señales en la RMN de 1 H son como se muestran en la fórmula [IV] siguiente.
35
40
45
Como resultado, se ha deducido que esta sustancia es 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
50
55
(4) Se sometió la fracción 177 a una cromatografía en capa fina y a una HPLC de fase inversa del mismo modo
que en el Ejemplo 4-(3) y se midió la actividad supresora del crecimiento de células cancerígenas y la formación de
cuerpos apoptóticos por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 4-(2) tras lo cual se apreció una actividad
supresora del crecimiento de células cancerígenas y actividad inductora de cuerpos apoptóticos.
La sustancia activa de la fracción 177 anterior corresponde a una sustancia que tiene una mancha a Rf 0,37 en la
cromatografía en capa fina y a una sustancia que tiene un pico del tiempo de retención de 16,8 minutos en la HPLC de
fase inversa.
La fracción 177 en la que se detectó que la sustancia tiene una mancha a Rf 0,37 se recogió y se evaporó el
disolvente de la misma a vacío.
60
65
El componente activo se recogió seguidamente y se purificó por medio de una HPLC de fase inversa. Se usó una
columna de gel TSK ODS-80 Ts (20 mm de diámetro x 250 mm de longitud; fabricada por Tosoh) como columna y
eluyó con agua a un caudal de 6,5 ml/minutos y la detección se llevó a cabo a una absorbancia a 206 nm. Cada uno
de los picos se fraccionó y se concentró a vacío y se midió su actividad por el procedimiento con MTT anteriormente
citado y se llevó a cabo un análisis de masas de los picos en el que se apreció la actividad usando un espectrómetro
de masas DX302 (fabricado por Nippon Denshi). Se usó alcohol m-nitrobencílico como matriz y la medida se llevó a
cabo en un modo de ion positivo.
16
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FAB-MS
m/z 216[M+H]+
5
Seguidamente, se midió un espectro de resonancia magnética nuclear. El espectrómetro de resonancia magnética
nuclear usado fue un JNM-A500 (fabricado por Nippon Denshi). Los resultados son como se muestran a continuación.
RMN de 1 H
10
15
δ 2,71 (1H, dd, J = 3,0, 18,5 Hz, 5-H), 2,98 (1H, dd, J = 7,5, 18,5 Hz, 5-H), 5,89 (1H, m, 4-H), 6,50 (1H, dd, J =
2,0, 5,5 Hz, 2-H), 7,24 (2H, s ancho, H de 6’-NH2 ), 7,85 (1H, dd, J = 2,5, 5,5 Hz, 3-H), 8,10 (1H, s, 2’-H), 8,14 (1H,
s, 8’-H).
En los datos anteriores, la muestra se disolvió en dimetil sulfóxido pesado y los desplazamientos químicos de
protón residual de dimetil sulfóxido pesado se expresaron como 2,49 ppm.
Los números de asignación de las señales en la RMN de 1 H son como se muestran en la fórmula [V] siguiente.
20
25
30
35
Como resultado, se ha identificado que esta sustancia es 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona.
40
45
50
55
La Figura 1 muestra un espectro de masas de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona en el que el eje de abscisas incida
los valores m/z mientras que el eje de ordenadas indica la intensidad relativa (%).
La Figura 2 muestra un espectro de RMN de 1 H de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona en el que el eje de abscisas
indica el valor de los desplazamientos químicos (ppm) mientras que el eje de ordenadas indica la intensidad de la
señal.
(5) Se calentó a 121ºC durante 4 horas una solución acuosa al 10% p/v % de sal sódica de ADN. Se repartió esta
solución calentada con acetato de etilo en una relación de 1:2, se volvió a repartir la fase acuosa resultante con una
mezcla 3:1 de cloroformo y metanol en una relación de 1:1, se evaporó la fase del disolvente orgánico a vacío, se
añadió a la misma una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol y se eliminó el residuo dando una solución.
El gel de sílice para la cromatografía en columna (fabricado por Fuji Silicia Kagaku; BW-30SP) (aproximadamente
250 cm3 ) se equilibró con la solución mixta anterior y se cargó en una columna de 25 mm de diámetro x 60 cm de longitud y se desarrolló la solución preparada anteriormente a una presión de 24516 Pa primero con una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol y luego con una mezcla 6:1 de los mismos y se fraccionaron para cada una aproximadamente 8 ml.
Cada una de las fracciones se desarrolló por una cromatografía en capa fina usando una mezcla 4:1 de cloroformo
y metanol y se detectó por un reaccionante de coloración de orcinol-ácido sulfúrico. De las fracciones 380 a 500, se
detectó una mancha de Rf 0,36 de color marrón rojizo.
60
65
Se recogieron las fracciones 400-420 y se evaporó el disolvente orgánico a vacío y se sustituyó por etanol, seguido
por HPLC de fase inversa.
En la HPLC, se usó una columna de gel TSK ODS-80 Ts (20 mm de diámetro x 250 mm de longitud; fabricada
por Tosoh), se eluyó con una solución acuosa al 8% de acetonitrilo a un caudal de 6 ml/minuto durante cinco minutos,
luego eluyó hasta una solución acuosa al 40% de acetonitrilo con un gradiente de concentración durante 30 minutos,
la detección se llevó a cabo por medio de absorbancia a 206 nm y se separó el pico de un tiempo de elución de 35
minutos.
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El pico de un tiempo de elución de 35 minutos se sometió a un análisis por HPLC de fase inversa y a un ensayo
con MTT usando células HL-60.
5
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15
En un análisis por HPLC de fase inversa, se usó una columna YMC-Pack ODS-AM (4,6 mm de diámetro x 250
mm de longitud; fabricada por YMC) y eluyó durante 20 minutos a un caudal de 0,8 ml/minuto por un procedimiento
de gradiente de concentración de soluciones acuosas de 4% a 25% de acetonitrilo y la detección se llevó a cabo por
medio de una absorbancia de 210 nm, después de lo cual se detectó un único pico a un tiempo de elución de 14
minutos.
En un ensayo con MTT, aproximadamente 13 µg/ml de producto secado del pico del tiempo de elución de 35
minutos mostraron una deformación y formación de cuerpos apoptóticos en las células, por lo que se apreció actividad
supresora del crecimiento de células cancerígenas y actividad inductora de apóptosis.
Se analizó el pico de un tiempo de elución de 35 minutos por medio de análisis de masas y por espectro de
resonancia magnética nuclear después de disolver en dimetil sulfóxido pesado.
En el análisis de masas, se usó un espectrómetro de masas DX 302. Se uso glicerol como una matriz y se llevó a
cabo la medida en modo de ion positivo.
20
FAB-MS
m/z 232 [M+H]+
25
El espectrómetro de resonancia magnética nuclear usado fue un JNM-A500. La muestra se disolvió en dimetil
sulfóxido pesado y los desplazamientos químicos del protón residual del dimetil sulfóxido pesado se expresaron como
2,49 ppm.
RMN de 1 H
30
σ 2,61 (1H, dd, J = 3,5, 18,5 Hz, 5-H), 2,91 (1H, dd, J = 7,0, 18,5 Hz, 5-H), 5,65 (1H, m, 4-H), 6,42 (2H, s ancho,
H de 2’-NH2 ), 6,46 (1H, dd, J = 2,0, 6,0 Hz, 2-H), 7,65 (1H, s, 8’-H), 7,81 (1H, dd, J = 2,5, 6,0 Hz, 3-H).
Los números de asignación de las señales en la RMN de 1 H son como se muestran en la fórmula [VI] siguiente.
35
40
45
50
Como resultado, se ha deducido que esta sustancia es 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona.
55
La Figura 3 muestra un espectro de masas de 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona en el que el eje de abscisas indica
valores m/z mientras que el eje de ordenadas indica intensidad relativa (%).
La Figura 4 muestra un espectro de RMN de 1 H de 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona en el que el eje de abscisas
indica valores de desplazamiento químico (ppm) mientras que el eje de ordenadas indica intensidad de la señal.
60
65
Ejemplo 5
(1) Se calentó a 121ºC durante 4 horas una solución acuosa 2M de D-ribosa (fabricada por Nacalai Tesque; 30210). Esta solución calentada se concentró a vacío, se repartió con acetato de etilo a la relación de 1:2 para extraer hasta
acetato de etilo, luego se evaporó el acetato de etilo a vacío del extracto y se disolvió el residuo en una mezcla 9:1 de
cloroformo y metanol.
El gel de sílice para la cromatografía en columna (fabricado por Fuji Silicia Kagaku; BW-300SP) (aproximada18
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5
10
15
20
25
mente 250 cm3 ) se equilibró con una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol y se cargó en una columna de 25 mm de
diámetro x 60 cm de longitud y se desarrolló la solución preparada anteriormente por medio de cromatografía usando
una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol con una presión de 19613 Pa y se fraccionó aproximadamente cada 8 ml. Se
evaporó el disolvente de las fracciones y se sustituyó con una solución acuosa al 50% de etanol y se midió la actividad
para suprimir el crecimiento de células cancerígenas por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 4-(2).
El resultado fue que las células cultivadas en las que se añadieron las fracciones 28 a 36 mostraron una reducción
significativa en el número de células viables al compararlas con el caso en el que se añadió una solución acuosa al
50% de etanol. Además, en la observación al microscopio óptico se confirmaron agregación de núcleos, reducción
en el tamaño de las células y formación de cuerpos apoptóticos en las células cultivadas en las que se añadieron las
fracciones 28 a 36. A propósito, tales fenómenos no se apreciaron en las células cultivadas en las que se añadieron µl
de una solución acuosa al 50% de etanol (control).
(2) Las fracciones 28-36 se someten a cromatografía en capa fina y a HPLC de fase inversa por el mismo procedimiento que en el Ejemplo 4-(3) y se midieron la actividad supresora del crecimiento de células cancerígenas y la
formación de cuerpos apoptóticos por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 4-(2), después de lo cual se
apreciaron actividad supresora del crecimiento de células cancerígenas y actividad inductora de cuerpos apoptóticos.
La sustancia activa de las fracciones 28-36 anteriores corresponde a una sustancia que tiene una mancha a Rf 0,44
en la cromatografía en capa fina y a una sustancia que tiene un pico del tiempo de retención de 9,7 minutos en la HPLC
de fase inversa.
Las fracciones 28-36 en las que se detectó la sustancia de una mancha de Rf 0,44 se concentraron a vacío, y se
sometieron a HPLC de fase inversa, después de lo cual se detectó un único pico a un tiempo de retención de 9,7
minutos.
En los ensayos de masas, se usó un espectrómetro de masas DX302. Se usó tioglicerol como una matriz y la medida
se llevó a cabo en un modo de ion positivo
30
FAB-MS
m/z 115 [M+H]+
97 [M-H2 0+H]+
35
79 [M-2H2 0+H]+
Además, se midió un espectro de resonancia magnética nuclear. El espectrómetro de resonancia magnética nuclear
usado fue un JNM-A500. Los resultados son como se muestran a continuación.
40
RMN de 1 H
δ 4,27 (1H, ddd, J = 2,0, 4,0, 19,5 Hz, 5-H), 4,51 (1H, td, J = 2,5, 19,5 Hz, 5-H), 4,93 (1H, d, J = 6,0Hz, 1-H), 6,02
(1H, m, 3-H), 7,23 (1H, ddd, J = 2,5, 4,0, 10,0 Hz, 4-H), 7,26 (1H, d, J = 6,0 Hz, H de 1-OH).
45
En los datos anteriores, la muestra se disolvió en dimetil sulfóxido pesado y los desplazamientos químicos del
protón residual de dimetil sulfóxido pesado se expresaron como 2,49 ppm.
Los números de asignación de las señales en la RMN de 1 H son como se muestran en la fórmula [VII] siguiente.
50
55
60
Como resultado, se ha identificado que esta sustancia es 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
65
La Figura 5 muestra un espectro de masas de 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona en el que el eje de abscisas indica
valores m/z mientras que el eje de ordenadas indica intensidad relativa (%).
La Figura 6 muestra un espectro de RMN de 1 H de 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona en el que el eje de abscisas
indica valor de desplazamiento químico (ppm) mientras que el eje de ordenadas indica intensidad de la señal.
19
ES 2 245 084 T3
Ejemplo 6
5
(1) Se calentó a 121ºC durante 4 horas una solución acuosa 2M de 2-desoxi-D-ribosa (fabricada por Sigma;
D2851). Se evaporó esta solución calentada (5 ml) a vacío y se disolvió el residuo en una mezcla 98:2 de cloroformo
y metanol.
10
El gel de sílice para la cromatografía (fabricado por Fuji Silicia Kagaku; BW-300SP) (aproximadamente 250 cm3 )
se equilibró con la mezcla anterior y se cargó en una columna de 25 mm de diámetro x 60 cm de longitud y se sometió
la solución preparada anterior a cromatografía con una mezcla 98:2 de cloroformo y metanol con una presión de 19613
Pa y fraccionamiento aproximadamente cada 8 ml.
Se evaporó el disolvente de cada una de las fracciones y se sustituyó con una solución acuosa al 50% de etanol y
se sometió la solución resultante a cromatografía en capa fina, a un análisis de HPLC de fase inversa y a un ensayo
con MTT por células de leucemia promielocítica humana (células HL-60).
15
20
En la cromatografía en capa fina se usó gel de sílice 60F254 (fabricado por Merck; 1.05554), se desarrolló por
una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol y se detectó por un reaccionante de coloración de orcinol-ácido sulfúrico.
En el análisis de HPLC de fase inversa se usó una columna de gel TSK ODS-80 Ts (4,6 x 250 mm; fabricada por
Tosoh), eluyó con agua durante cinco minutos a un caudal de 0,8 ml/minuto, eluyó durante 20 minutos hasta una
solución acuosa al 80% de acetonitrilo mediante un procedimiento de gradiente de concentración por medio de una
absorbancia a 206 nm.
El ensayo con MTT se llevó a cabo por un procedimiento citado en el Ejemplo 4-(2).
25
Como resultado del ensayo con MTT se apreció una fuerte actividad para suprimir el crecimiento celular en las
fracciones 48 y 88. En la fracción 48, se detectó una mancha de Rf 0,52 por una cromatografía en capa fina, mientras
que se detectó un pico del tiempo de retención de 9,1 minutos por un análisis de HPLC de fase inversa. En la fracción
88, se detectó una mancha de Rf 0,35 por una cromatografía en capa fina mientras que se detectó un pico del tiempo
de retención de 9,1 minutos por un análisis de HPLC de fase inversa.
30
Estas fracciones se sometieron a un análisis de masas y a un análisis por espectro de resonancia magnética nuclear
después de disolver en dimetil sulfóxido pesado, tras lo cual la fracción 48 era 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona mientras
que la fracción 88 era trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal.
35
(2) Se dejó reposar a -40ºC en un congelador de baja temperatura una solución etanólica de trans-4,5-dihidroxi-2pentenal que se preparó en el Ejemplo 6-(1), después de lo cual se generó un sólido.
El sólido se filtró por un papel de filtro y se lavó con etanol frío dando una solución etanólica y un sólido.
40
La solución etanólica se sometió de nuevo a cromatografía usando columna de sílice. Así, el gel de sílice para la
cromatografía en columna (fabricado por Fuji Silicia Kagaku; BW-300SP) (aproximadamente 250 cm3 ) se equilibró
con una mezcla 98:2 de cloroformo y metanol y se sometió a cromatografía por la misma mezcla a presión de 19613
Pa y se fraccionó aproximadamente en 8 ml cada una.
45
Trans-4,5-dihidroxi-2-pentenal eluyó en las fracciones 90 a 126 mientras que en las fracciones 67 a 76 eluyó una
sustancia secundaria.
El sólido anterior y la sustancia secundaria se sometieron a un análisis HPLC de fase inversa y a un ensayo con
MTT usando células HL-60.
50
En el análisis HPLC de fase inversa se usó una columna YMC-Pack ODS-AM (4,6 mm de diámetro x 250 mm de
longitud; fabricada por YMC), eluyó con agua a un caudal de 0,8 ml/minuto durante cinco minutos, luego eluyó hasta
una solución acuosa al 80% de acetonitrilo a un caudal de 0,8 ml/minuto por medio de un procedimiento con gradiente
de concentración durante 20 minutos y se detectó por una absorbancia a 210 nm.
55
En el sólido, se detectó un único pico a un tiempo de elución de 18 minutos, mientras que en la sustancia secundaria,
se detectó un pico principal a un tiempo de elución de 18 minutos.
60
En el ensayo con MTT, se apreciaron deformación y formación de cuerpos apoptóticos en el sólido y en la sustancia secundaria por lo que se apreciaron actividad de supresión del crecimiento celular y actividad de inducción de
apóptosis.
El sólido se sometió a un análisis de masas y a un análisis por espectro de resonancia magnética nuclear después
de disolver en dimetil sulfóxido pesado.
65
En el análisis de masas, se usó un espectrómetro de masas DX 302. Se usó glicerol como matriz y la medida se
llevó a cabo en un modo de ion positivo.
20
ES 2 245 084 T3
FAB-MS
m/z 215 [M+H]+
5
237 [M+Na]+
El espectrómetro de resonancia magnética nuclear usado fue un JNM-A500. La muestra se disolvió en dimetil
sulfóxido pesado y el desplazamiento químico del protón residual del dimetil sulfóxido se expresó como 2,49 ppm.
10
15
RMN de 1 H
δ 3,30 (2H, m, 1-H), 3,80 (1H, dd, J = 5,0, 8,5 Hz, 7-H), 4,01 (1H, m, 2-H), 4,05 (1H, t, J = 8,5 Hz, 7-H),4,66 (1H,
t, J = 6,0 Hz, H de 1-OH), 4,84 (1H, m, 6-H), 4,96 (1H, d, J = 5,0 Hz, H de 2-OH), 5,31 (1H, d, J = 6,5 Hz, 5-H), 5,66
(1H, ddd, J = 1,5, 6,5, 15,5 Hz, 4-H), 6,01 (1H, dd, J = 4,5, 15,5 Hz, 3-H), 6,21 (1H, ddd, J = 1,5, 8,0, 15,5 Hz, 9-H),
7,03 (1H, dd, J = 5,5, 15,5 Hz, 8-H), 9,57 (1H, d, J = 8,0 Hz, 10-H)
Los números de asignación de las señales en RMN de 1 H son como se muestran en la fórmula [VIII] siguiente.
20
25
Como resultado se ha deducido que esta sustancia es 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3dioxolano.
30
La Figura 7 muestra un espectro de masas de 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano en el que el eje de abscisas indica los valores m/z mientras que el eje de ordenadas indica intensidad relativa
(%).
35
La Figura 8 muestra un espectro de RMN de 1 H de 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3dioxolano en el que el eje de abscisas indica el valor del desplazamiento químico (ppm) mientras que el eje de ordenadas indica la intensidad relativa.
40
(3) Se preparó el concentrado del producto termotratado citado en el Ejemplo 6-(1) y se sometió este concentrado a
una cromatografía en sílice. Así, el gel de sílice para la cromatografía en columna (fabricado por Fuji Silicia Kagaku;
BW-300SP) (aproximadamente 250 cm3 ) se equilibró con una mezcla 98:2 de cloroformo y metanol, se sometió a
cromatografía con la misma mezcla a una presión de 19613 Pa y se fraccionó aproximadamente en 8 ml cada una.
45
Las fracciones 67 a 76 se recogieron, se concentraron, eluyeron en una columna YMC-Pack ODS-AM (4,6 mm de
diámetro x 250 mm de longitud; fabricada por YMC) con agua a un caudal de 0,8 ml/minuto durante cinco minutos,
luego eluyeron hasta una solución acuosa al 80% de acetonitrilo por un procedimiento de gradiente de concentración
durante 20 minutos y se detectó por medio de una absorbancia a 210 nm, después de lo cual se obtuvo un único pico
a un tiempo de elución de 18 minutos dando 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
Ejemplo 7
50
(1) Se disolvió ácido D-glucurónico (fabricado por Sigma; G 5269) (10 g) en un litro de agua, se calentó a 21ºC
durante cuatro horas y se concentró a vacío hasta aproximadamente 10 ml. Se añadió una capa superior (40 ml) de una
mezcla 3:2:2 de acetato de butilo, ácido acético y agua y se mezcló con el ácido y luego se concentró a vacío hasta
aproximadamente 10 ml el fluido sobrenadante obtenido por centrifugación.
55
60
El extracto anterior se aplicó a gel de sílice BW-300SP para cromatografía en columna (2 x 28 cm; fabricado por
Fuji Silicia Kagaku) y se separó usando una capa superior de una mezcla 3:2:2 de acetato de butilo, ácido acético
y agua como eluyente a un caudal de 5 ml/minuto con una presión de 20.265 Pa por un compresor. Se llevó a cabo
un fraccionamiento de modo que se preparó una fracción de 10 ml y, cuando se tomó una parte de cada una de las
fracciones y se analizó por una cromatografía en capa fina, las fracciones nº 61 a nº 80 contenían 4,5-dihidroxi-2ciclopenten-1-ona de alta pureza. Se combinaron estas fracciones, se concentraron a vacío y se extrajeron con 40 ml
de cloroformo y se concentró el extracto a vacío dando 100 mg de 4, 5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona representada
por la fórmula [IX] siguiente.
65
21
ES 2 245 084 T3
5
10
15
(2) Las propiedades físicas de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona obtenida en el Ejemplo 7-(1) se dan a continuación. A propósito, el análisis de masas de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona se llevó a cabo por un espectrómetro de
masas DX 302 (fabricado por Nippon Denshi). En la medida del espectro de RMN usando como disolvente cloroformo
pesado, se usó un JNM-A500 (fabricado por Nippon Denshi). La rotación específica, el espectro de absorción UV y
el espectro de absorción de infrarrojos (IR) se midieron usando un polarímetro (tipo DIP-370; fabricado por Nippon
Bunko), un espectrofotómetro (tipo UV-2500; fabricado por Shimadzu) y un espectrofotómetro de infrarrojos (tipo
FTIR-8000; fabricado por Shimadzu), respectivamente.
FAB-MS m/z 115[M+H]+
20
Como matriz se usó glicerol.
RMN de 1 H(CDCl3 )
25
δ 4,20 (1H, d, J = 2,4 Hz, 5-H), 4,83 (1H, m, 4-H), 6,30 (1H, dd, J = 1,2, 6,1 Hz, 2-H), 7,48 (1H, dd, J = 2,1, 6,1
Hz, 3-H)
En los datos anteriores el valor del desplazamiento químico de RMN de 1 H se dio en base a que el valor del
desplazamiento químico del CHCl3 era 7,26 ppm.
30
Rotación óptica: [α]D 20 0º (c 1,3, agua)
IR (procedimiento de KBr): se apreciaron absorciones a 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm−1 .
35
UV: λmax 215 nm (agua)
Esta fracción se separó por una HPLC en fase normal usando una columna de Palpack tipo S y detección por medio
de absorción ultravioleta a 215 nm, después de lo cual la pureza fue de 98%.
40
45
(3) Se calentó a 121ºC durante 4 horas una solución acuosa 2M de D-ribosa (comercializada por Nacalai Tesque;
302-10) o una solución acuosa 2M de D-(+)-xilosa (fabricada por Nacalai Tesque; 367-19). La solución termotratada
(90 µl) se preparó para que reaccionara con 10 µl de una solución 1M en etanol de tiofenol (fabricado por Nacalai
Tesque; 338-01) a 37ºC durante 30 minutos. La solución termotratada y su producto de reacción con tiofenol se
analizaron por la siguiente HPLC de fase inversa.
Columna: YMC-Pack ODS-AM (4,6 x 250 mm; fabricada por YMC)
Fase móvil A: solución acuosa al 0,1 % de ácido trifluoroacético (TFA)
50
Fase móvil B: solución acuosa que contiene TFA al 0,1% y acetonitrilo al 80%
Caudal: 0,8 ml/minuto
55
Elución: fase móvil A (durante cinco minutos) → gradiente de concentración lineal desde la fase móvil A
hasta la fase móvil B (durante 20 minutos) → fase móvil B (durante cinco minutos)
Detección: absorbancia a 215 nm
Tamaño de la muestra inyectada: 10 µl
60
65
Cuando se analizó la solución termotratada se apreció un pico de tiempo de retención de 6,5 minutos en ribosa y
xilosa. Esto coincide con el tiempo de retención de 4,5-dihidroxi-1-ciclopenten-1-ona obtenido en el Ejemplo 7-(1).
Cuando se analizó el producto de reacción de la solución termotratada con tiofenol, el pico del tiempo de retención
de 6,5 minutos desapareció en ribosa y xilosa y apareció nuevamente un pico de tiempo de retención de 19,6 minutos.
El pico recién aparecido era idéntico al pico obtenido después de la retención de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona
con tiofenol del Ejemplo 7-(1) con tiofenol.
22
ES 2 245 084 T3
A partir de lo anterior, es evidente que se produce 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona cuando se calientan ribosa o
xilosa.
5
10
(4) Se calentó a 121ºC durante 14 horas cada una de las soluciones acuosas 0,1 M, 0,2 M, 0,5 M, 1 M y 2 M
de D-ribosa o D-(+)-xilosa. Estas se analizaron por la misma HPLC de fase inversa que en el Ejemplo 7-(2) y se
midió el pico de tiempo de retención de 6,5 minutos con el fin de determinar la cantidad producida de 4,5-dihidroxi2-ciclopenten-1-ona. El resultado se da en la Figura 9. Así, la Figura 9 muestra la relación entre la concentración de
pentosa y la cantidad producida de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona, indicando el eje de abscisas la concentración de
pentosa (M) y el eje de ordenadas la cantidad producida (mM) de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona. A propósito, en
la Figura 9, los puntos negros son la cantidad de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona producida en la ribosa termotratada
mientras que los triángulos negros son la cantidad de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona producida en la D-(+)-xilosa
termotratada.
Ejemplo 8
15
(1) Se disolvió en 5 ml de agua ribosa-5-fosfato sódico (50 mg) (fabricado por Nacalai Tesque; 302-12), se ajustó
a pH 3 con HCl y se calentó a 121ºC durante cuatro horas. El producto calentado resultante se analizó por la HPLC de
fase inversa siguiente.
20
Columna: gel TSK ODS-80 Ts (4,6 mm x 250 mm; fabricada por Tosoh)
Fase móvil: solución acuosa de TFA
Caudal: 1 ml/minuto
25
Detección: absorbancia a 215 nm
Tamaño de la muestra inyectada: 20 µl
30
35
40
45
El resultado fue que se encontró un pico de tiempo de retención de 4,7 minutos y que era idéntico al tiempo de
retención de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona obtenido en el Ejemplo 7(1). Además, a partir de la curva de calibración que muestra la relación entre el área del pico y 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona obtenido a partir de dicha 4,5dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona pura, se calculó la concentración de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona en este producto
calentado como 6,3 µg/ml.
Se sometió este producto calentado (200 µl) a una HPLC del mismo modo que antes y se recogió una fracción de
tiempo de retención de 3,8-5,8 minutos. Se repitió dos veces la misma operación y la fracción recogida se concentró y
evaporó a vacío. Se añadió a esta una mezcla 4:1:1 de N,O-bis(trimetilsilil)-acetamida (fabricada por Nacalai Tesque),
trimetilclorosilano (fabricado por G. L. Science) y piridina (fabricada por Pierce) para llevar a cabo la trimetilsililación
y se analizó la estructura por cromatografía de gases/análisis de masas usando un analizador de masas (tipo DX-302;
fabricado por Nippon Denshi) después de lo cual el espectro de masas de un pico que apareció al mismo tiempo de
retención que la 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona obtenido en el Ejemplo 7-(1) fue idéntico al de dicha 4,5-dihidroxi2-ciclopenten-1-ona pura.
Por consiguiente, se confirmó ahora la producción de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
(2) Se disolvió ribosa-5-fosfato sódico (30 mg) en 3 ml de agua y se ajustó hasta pH 2,5 por HCl 1N. Se midió la
cantidad de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona contenida en esta muestra por la siguiente HPLC de filtración en gel.
50
Columna: gel TSK G2500PW (XL) (7,8 x 300 mm; fabricada por Tosoh)
Temperatura de la columna: 40ºC
Fase móvil: agua
55
Caudal: 1 ml/minuto
Detección: absorbancia a 215 nm
60
El resultado fue que se observó un pico de tiempo de retención de 11,4 minutos y el tiempo de retención fue
idéntico al de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona pura obtenido en el Ejemplo 7-(1). Además, a partir de la curva de
calibración que muestra la relación entre el área del pico y 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona obtenida a partir de
dicha 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona pura, se calculó la concentración de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona en
este producto calentado como 8,9 µg/ml.
65
A partir de lo anterior, es ahora evidente que, cuando se calienta ribosa-5-fosfato sódico, se produce 4,5-dihidroxi2-ciclopenten-1-ona.
23
ES 2 245 084 T3
Ejemplo 9
5
10
Se calentó a 121ºC durante cuatro horas una solución acuosa 2M de D-ribosa. Se concentró esta solución calentada
a vacío y se repartió con acetato de etilo a la relación de 1:2 para extraer hasta acetato de etilo, se evaporó el acetato
de etilo a vacío y se disolvió el residuo en una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol.
El gel de sílice para la cromatografía en columna (BW-30 SP fabricado por Fuji Silicia Kagaku) (aproximadamente
250 cm3 ) se equilibró con la mezcla anterior y se cargó en una columna de 25 mm de diámetro x 60 cm de longitud
y se sometió a cromatografía la solución anteriormente preparada con una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol a una
presión de 19613 Pa y se fraccionó aproximadamente cada 8 ml. El disolvente de la fracción se evaporó apropiadamente seguido por una cromatografía en capa fina, se recogieron las fracciones 38-57 que tenían una mancha de Rf 0,5
y se evaporó de las mismas el disolvente y se sustituyó por una solución acuosa al 50% de etanol. En la cromatografía
en capa fina se usó gel de sílice 60F254 , se llevó a cabo el desarrollo con una mezcla 9:1 de cloroformo y metanol y la
detección se realizó por un reaccionante de coloración de orcinol-ácido sulfúrico.
15
20
A continuación se separó la sustancia activa y se purificó por una HPLC de fase inversa. En la separación, se usó una
columna de gel TSK ODS-80 Ts (4,6 x 250 mm), eluyó con agua durante 10 minutos a un caudal de 6,5 ml/minuto,
luego eluyó hasta una solución acuosa al 60% de acetonitrilo por un procedimiento de gradiente de concentración
durante 15 minutos y la detección fue por absorbancia a 206 nm. Se recogió el pico de tiempo de elución de 15
minutos.
25
Se sometió el pico de tiempo de elución de 15 minutos a una medida de la actividad supresora del crecimiento
de células cancerígenas y actividad inductora de apóptosis por un procedimiento con MTT citado en el Ejemplo 4(2), después de lo cual se apreció deformación de las células y supresión de la formación de formazán, por tanto, se
confirmó la actividad supresora del crecimiento celular y actividad inductora de apóptosis.
30
Se sometió el pico de tiempo de retención de 15 minutos a un análisis de HPLC de fase inversa. En el análisis se usó
una columna de gel TSK ODS-80 Ts (4,6 x 250 mm) y ésta eluyó con 0,8 ml/minuto de agua durante cinco minutos,
eluyó hasta una solución acuosa al 80% de acetonitrilo por un procedimiento de gradiente de concentración durante
20 minutos y, la detección fue por medio de absorbancia a 206 nm. En este análisis un pico de tiempo de retención de
15 minutos eluyó a un tiempo de elución de 5,7 minutos y su tiempo de elución fue idéntico al de la 4,5-dihidroxi-2ciclopenten-1-ona citada en el Ejemplo 7-(1). Además, se analizó la fracción del pico de tiempo de retención de 15
minutos por espectro de resonancia magnética nuclear después de disolver en dimetil sulfóxido pesado y se confirmó
el espectro de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona.
35
Ejemplo 10
40
45
50
Se disolvieron en 25 ml de agua 4-ciclopenten-1,3-diona (Aldrich; código 16.168-3) (1 g; 10,4 mmol) y 1,94 g (5,2
mmol) de cloruro de cerio (III)·7H2 O (Nacalai Tesque; código 077-20). Se añadió de forma gradual NaBH4 (Nacalai
Tesque; código 312-29) (198 mg; 5,2 mmol) con agitación y, después de completarse la adición el pH se hizo neutro
o menor con HCl 1N.
La solución de reacción se sometió a una TLC usando un disolvente de desarrollo que era una mezcla 9:1 de
cloroformo y metanol y se detectó por orcinol-ácido sulfúrico, después de lo cual se detectó una mancha roja aproximadamente a Rf 0,5. La solución de reacción neutralizada se concentró a vacío hasta el estado de jarabe, se extrajo
el jarabe con 100 ml de una mezcla 40:1 de cloroformo y metanol y se filtró el extracto a través de gel de sílice. El
filtrado se concentró a vacío y se purificó sometiendo a una cromatografía sobre gel de sílice de media presión (80
g) usando una mezcla 40:1 de cloroformo y metanol, dando 236 mg (rendimiento: 23%) de 4-hidroxi-2-ciclopenten1-ona de alta pureza en un aceite amarillo pálido que se confirmó a partir de su espectro de resonancia magnética
nuclear.
Ejemplo 11
55
Se calentó a 37ºC durante una hora un tampón fosfato 200 mM de pH 7 (2 ml) que contenía 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona 50 mM y L-glutatión 100 mM para preparar una muestra y se sometió esta muestra a una HPLC de fase
inversa para recoger los picos. La columna usada fue una columna de gel TSK ODS-80 Ts (20 mm de diámetro x 250
mm de longitud; fabricada por Tosoh). La elución se llevó a cabo con 6,5 ml/minuto de agua destilada y la detección
se realizó por una absorbancia a 206 nm. Se recogieron los picos, se concentraron a vacío y se sometieron a un ensayo
con MTT usando células de leucemia promielocítica humana (células HL-60) citadas en el Ejemplo 1.
60
Como resultado del ensayo con MTT se apreciaron en el pico 1 de tiempo de elución de 14,4 minutos y en el pico
3 de tiempo de elución de 16,6 minutos actividad supresora del crecimiento de células cancerígenas y producción de
cuerpos apoptóticos. Los dos picos en los que se apreció la actividad se purificaron sometiendo a una cromatografía
de nuevo usando la misma columna.
65
Se analizaron los dos picos en los que se apreció actividad por un análisis de masas y un espectro de resonancia
magnética nuclear.
24
ES 2 245 084 T3
El análisis de masas se llevó a cabo por un espectrómetro de masas de tipo DX 302 (Nippon Denshi) en modo de
ion positivo usando glicerol como matriz.
5
10
15
FAB-MS del pico 1:
FAB-MS del pico 3:
m/z 406 [M+H]+
m/z 406 [M+Z]+
428 [M+Na]+
El espectrómetro de resonancia magnética nuclear usado fue un JNM-A500 (Nippon Denshi) y la medida se llevó
a cabo disolviendo en agua pesada. Los valores de desplazamiento químico en la RMN de 1 H cuando se fijó el HOD
a 4,65 ppm fueron los siguientes.
Pico 1; σ 2,13 (2H, m, 5’-H), 2,29 (1H, m, 2-H), 2,45 (1H, m, 5-H), 2,50 (2H, m, 4’-H), 2,65 (1H, m, 5-H), 2,69
(1H, m, 2-H), 2,90-3,00 (1H, m, 1’-H), 3,10-3,18 (1H, m, 1’-H), 3,61 (1H, m, 3-H), 3,76 (1H, m, 6’-H), 3,89 (2H, s,
9’-H), 4,50-4,62 (2H, m, 4-H, 2’-H)
Pico 3; σ 2,10 (2H, m, 5’-H), 2,27 (1H, m, 2-H), 2,29 (1H, m, 5-H), 2,48 (2H, m, 4’-H), 2,76-2,84 (1H, m, 5-H),
2,84-2,92 (1H,m, 2-H), 2,93-3,02 (1H, m, 1’-H), 3,09-3,21 (1H,m, 1’-H), 3,40 (1H, m, 3-H), 3,73 (1H, m, 6’-H), 3,86
(2H, s, 9’-H), 4,31-4,40 (1H, m, 4-H), 4,59 (1H, m, 2’-H).
20
Los números de asignación de las señales del pico 1 y del pico 3 son como se muestra en la fórmula [X] siguiente.
25
30
35
40
45
El pico 1 fue una mezcla de diastereoisómeros de un compuesto 3R,4S y un compuesto 3S,4R mientras que el pico
3 fue una mezcla de diastereoisómeros de un compuesto 3R,4R y un compuesto 3S,4S.
A partir de lo anterior fue evidente que el pico 1 de la presente muestra era cis-3-L-glutatión-s-il-4-hidroxi-2ciclopenten-1-ona en la que las posiciones 3 y 4 estaban en forma cis mientras que el pico 3 de la presente muestra era
trans-3-L-glutatión-s-il-4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona en la que las posiciones 3 y 4 estaban en trans.
La Figura 10 muestra un espectro de masas del pico 1 en el que el eje de abscisas indica m/z mientras que el eje de
ordenadas indica la intensidad relativa (%).
50
La Figura 11 muestra un espectro de masas del pico 3 en el que el eje de abscisas indica m/z mientras que el eje de
ordenadas indica la intensidad relativa (%).
La Figura 12 muestra un espectro de RMN de 1 H del pico 1 en el que el eje de abscisas indica el valor de desplazamiento químico (ppm) mientras que el eje de ordenadas indica la intensidad de señal.
55
La Figura 13 muestra un espectro de RMN de 1 H del pico 3 en el que el eje de abscisas indica el valor de desplazamiento químico (ppm) mientras que el eje de ordenadas indica la intensidad de señal.
Ejemplo 12
60
(1) Se suspendieron en un medio RPMI 1640 hasta una concentración de 2,5 x 105 células/5 ml) células HL-60
(ATCC CCL-240) incubadas a 37ºC en un medio RPMI 1640 (fabricado por BioWhittaker) que contenía 10% de suero
bovino fetal (fabricado por JRH) tratado a 56ºC durante 30 minutos.
65
Se añadieron a 5 ml de esta suspensión 10 µl de 12,5 mM, 25 mM, 50 mM o 100 mM de una solución en etanol al
70% de 4,5-dihidroxi-2-pentenal preparado en el Ejemplo 6-(1), 0,05 mM, 0,5 mM, 5 mM o 50 mM de una solución
en etanol al 70% de 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ol preparado en el Ejemplo 6-(1), 5 mM, 10 mM o 20 mM de una
solución en etanol al 70% de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona preparada en el Ejemplo 4-(4), 2,5 mM, 5mM, 15
25
ES 2 245 084 T3
5
10
mM o 25 mM de una solución en etanol al 70% de 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona preparada en el Ejemplo 4-(5),
75 mM, 150 mM o 300 mM de una solución en etanol al 70% de 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona preparada en
el Ejemplo 5-(2) o 5 mM, 25 mM o 50 mM de una solución en etanol al 70% de 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano preparado en el Ejemplo 6-(2), seguido por incubación a 37ºC en presencia de
dióxido de carbono gaseoso al 5% durante 24 horas.
Las células incubadas se observaron al microscopio óptico y se confirmó la agregación de los núcleos, reducción
en el tamaño de las células y formación de cuerpos apoptóticos en las células incubadas cuando se añadió una concentración final 1 µM o superior de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, una concentración final 10 µM o superior de 4-hidroxi2-ciclopenten-1-ona, una concentración final 10 µM o superior de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, una concentración final 39 µM o superior de 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, una concentración final 625 µM o superior de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona o una concentración final 80 µM o superior de 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano. A propósito, dichos fenómenos no se apreciaron en las células incubadas a las
que se añadieron 10 ml de solución en etanol al 70% usada como control.
15
(2) Se suspendieron en medio RPMI 1640 hasta 2,5 x 105 células/5 ml células HL-60 que se incubaron en un medio
RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10% procesado a 56ºC durante 30 minutos.
20
25
30
35
40
45
Se añadieron a 5 ml de la suspensión 10 µl de 12,5 mM, 25 mM, 50 mM o 100 mM de una solución en etanol al
70% de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 0,05 mM, 0,5 mM, 5mM o 50mM de una solución en etanol al 70% de 4-hidroxi2-ciclopenten-1-ona, 5mM, 10mM o 20 mM de una solución en etanol al 70% de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1ona preparada en el Ejemplo 4-(4), 2,5 mM, 5 mM, 15 mM o 25 mM de una solución en etanol al 70% de 4-(9guaninil)-2-ciclopenten-1-ona preparada en el Ejemplo 4- (5), 75 mM, 150 mM o 300 mM de una solución en etanol
al 70% de 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona preparada en el Ejemplo 5-(2) o 5 mM, 25 mM o 50 mM de una
solución en etanol al 70% de 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano preparado en el
Ejemplo 6-(2) seguido por incubación a 37ºC en presencia de 5% de dióxido de carbono gaseoso durante 24 horas
y 48 horas y las células resultantes se sometieron a una medida de las células apoptóticas usando FACScan por un
procedimiento citado en las páginas 129-130 de “Experimental Protocol Series - Apoptosis Experiment Protocol” que
era una edición especial de “Saibo Kogaku (Cell Technology)” (editado por Shujunsha en 1994) y también a una
medida del análisis de fragmentación de ADN por un procedimiento citado en las páginas 61-63 de “Biomanual UP
Series - New Experimental Methods for Apoptosis” (editado por Yodosha en 1995).
El resultado fue que se confirmaron células apoptóticas en las células incubadas en las que se añadió una concentración final 50 µM o superior de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, una concentración final 10 µM o superior de 4-hidroxi2-ciclopenten-1-ona, una concentración final 10 µM o superior de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, una concentración final 20 µM o superior de 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, una concentración final 600 µM o superior de
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona o una concentración final 50 µM o superior de 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano. Además, se confirmó fragmentación de ADN en las células incubadas cuando
se añadieron concentraciones finales 50, 100 y µM de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, concentración final 10 µM de 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona y concentraciones finales 10 y 30 µM de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona. A propósito,
dichos fenómenos no se apreciaron en las células incubadas a las que se añadieron 10 µl de solución en etanol al 70%
usada como control.
(3) Se tiñeron con azul de tripano al 0,4% las células que se incubaron durante 24 horas del mismo modo que en
el Ejemplo 9-(2) y se observaron al microscopio óptico el número de células viables que no se tiñeron y de células
muertas que se tiñeron de azul, se determinó la concentración (tasa de supervivencia50 ) de cada una de las muestras en
las que la tasa de supervivencia era del 50% y los resultados se dan en la Tabla 1.
TABLA 1
50
Nombre de la sustancia
55
60
Tasa de supervivencia50
(µM)
4,5-dihidroxi-2-pentenal
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
124
25,5
22,4
67,9
438
74,4
Ejemplo 13
65
(1) Se añadió un µl de un ADN pBR322 (0,25 µg/(µl) (fabricado por Takara Shuzo) a una mezcla de 2 µl de
topoisomerasa II [fabricada por Topogen; 2 unidades/µl], 2 µl de tampón diluido diez veces [Tris-HCl 0,5M (pH 8,0),
KCl 1,2M, MgCl2 0,1 M, trifosfato de adenosina 5 mM y ditiotreitol 5 mM], 2 µl de albúmina sérica bovina al 0,1%
26
ES 2 245 084 T3
(fabricada por Takara Shuzo), 11 µl de agua destilada y 2 µl de agua destilada (un control) o 4,5-dihidroxi-2-pentenal
o 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona en diversas concentraciones con agua y luego se hizo reaccionar durante 30 minutos,
se detuvo la reacción añadiendo 2 µl de una solución acuosa de dodecilsulfato sódico al 1%, glicerol al 50% y Azul
de Bromofenol al 0,02%.
5
10
La solución de reacción anterior (µl) se aplicó a un gel de agarosa al 1% preparado a partir de agarosa L03 (fabricada por Takara Shuzo) tampón TAE [consistente en 40 mM de Tris, 5 mM de acetato sódico y 1 mM de etilendiamina
tetraacetato disódico (EDTA); ajustado hasta pH 7,8 con ácido acético] y se llevó a cabo una electroforesis en un
tampón TAE. Después de la electroforesis, se sumergió el gel en una solución acuosa 1 µg/ml de bromuro de etidio
y se irradió con radiación ultravioleta y se observó el patrón electroforético de ADN. A propósito, en el control en el
que se añadió agua, el ADN cambió totalmente desde un tipo superarrollado a un tipo circular relajado mientras que
cuando se inhibió la actividad topoisomerasa II, el cambio del tipo superarrollado al tipo circular relajado se inhibió
total o parcialmente.
15
Como resultado, en el control al que se añadió agua, el ADN cambió totalmente desde un tipo superarrollado a un
tipo circular relajado pero el cambio desde un tipo superarrollado a un tipo circular relajado estuvo parcial o totalmente
inhibido por 100 µM o más de 4,5-dihidroxi-2-pentenal o 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, por lo que se confirmó la
actividad inhibidora de topoisomerasa II de cada uno de los compuestos.
20
(2) La actividad inhibidora de topoisomerasa I de cada uno de los compuestos se midió por el mismo procedimiento
que en Ejemplo 13-(1) salvo que se usó topoisomerasa I [fabricada por Topogen; 0,01 unidades/(µl] en lugar de
topoisomerasa I y, como patrón diluido a la décima parte se usaron Tris-HCl 100 mM (pH 7,9), EDTA disódico 10
mM, espermidina 1 mM y glicerol al 50%.
25
30
El resultado fue que no se confirmó en ninguno de los compuestos actividad inhibidora de topoisomerasa I.
Como se ha citado antes, cada uno de los compuestos mostró actividad inhibidora específica hacia topoisomerasa
II que apareció transitoriamente solo en una etapa de la división en células normales pero que se expresa a alto nivel
a lo largo de todos los períodos celulares como resultado de la aparición de cáncer. A propósito, todos los demás
compuestos de la presente invención mostraron también la misma actividad inhibidora.
Ejemplo 14
35
40
45
50
Se incubaron células Hs 68 (ATCC CRL-1635) que eran células de cáncer humano en un medio D-MEM (fabricado
por Gibco BRL) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS fabricado por BioWhittaker) a 37ºC en presencia de 5%
de CO2 hasta que las células se saturaron en el medio de cultivo, se suspendió solución de tripsina-EDTA (fabricado
por BioWhittaker) en el medio anterior hasta 3 x 105 células/ml y se colocaron 200 µl de la suspensión en cada uno de
los pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos. Después de cinco días desde la incubación, se descartó el
medio en la etapa en la que las células estaban casi saturadas en el medio de cultivo y se añadió un medio que contenía
5, 10, 20, 40, 100 ó 200 µM de 4,5-dihidroxi-2-pentenal o 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona. Se adoptó un período de
tiempo de 96 horas y, cada 24 horas se recuperó el líquido sobrenadante del medio incubado y se midió la influencia
de 4,5-dihidroxi-2-pentenal y 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona sobre la inducción de producción de hlGF-1 en células
Hs68 usando un kit ELISA para hlGF-1 (fabricado por Diagnostic System Labo).
El resultado fue que en células Hs68, la actividad inductora de la producción de hlGF llegó a un máximo después
de 24 horas y luego se redujo con el paso del tiempo cuando se añadían 100 µM o más de 4,5-dihidroxi-2-pentenal
o 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona. A propósito, la actividad inductora de hlGF-1 de 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona fue
mayor que la de 4,5-dihidroxi-2-pentenal.
Los resultados se dan en la Tabla 2 y en la Tabla 3.
TABLA 2
55
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
Concentración (µM)
Tiempo de incubación
24 horas
48 horas
72 horas
96 horas
Actividad inductora de la producción de hlGF-1 (ng/ml)
60
65
0
40
100
200
0
0
39,9
37,9
0
0
10,0
10,4
27
0
0
9,6
9,9
0
0
4,4
4,2
ES 2 245 084 T3
TABLA 3
4,5-dihidroxi-2-pentenal
5
Concentración (µM)
Tiempo de incubación
24 horas
48 horas
72 horas
96 horas
Actividad inductora de la producción de hlGF-1 (ng/ml)
0
40
100
200
10
0
0
15,3
11,3
0
0
10,0
11,1
0
0
5,2
9,9
0
0
4,6
4,5
15
Como tales, 4,5-dihidroxi-2-pentenal y 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona mostraron actividad inductora de la producción de hlGF-1. Otros compuestos de la presente invención también mostraron la misma actividad.
20
25
30
Ejemplo 15
(1) Se suspendieron células U937 (ATCC CRL-1593) que era una cepa de células sinoviales establecidas a partir
de efusión pleural de pacientes que sufren linfoma de tejido en un medio RPMI 1640 que contenía 10% de FBS hasta
que su concentración fue 5 x 105 células/ml y se colocaron 100 µl de la suspensión en cada uno de los pocillos de una
placa de microvaloración de 96 pocillos. Después de esto, se añadieron 100 µl del medio anterior y luego se añadió
4,5-dihidroxi-2-pentenal o 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona hasta que su concentración fue 5, 75, 100, 150 ó 200 µM.
La mezcla se incubó a 37ºC en presencia de dióxido de carbono gas y, después de 24, 48 y 72 horas, se añadieron 10
µl de Premix WST-1 (MK400; fabricado por Takara Shuzo). La mezcla se hizo reaccionar a 37ºC durante tres horas y
se definió el valor (A450−650 ) obtenido restando la absorbancia a 650 nm (A650 ) de la absorbancia a 450 nm (A450 ) como
el grado de crecimiento celular.
Los resultados se dan en la Tabla 4 y en la Tabla 5.
TABLA 4
35
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
Concentración (µM)
40
45
Tiempo de incubación
24 horas
48 horas
72 horas
Grado de crecimiento celular (A450−650 )
0
50
75
100
150
200
0,940
0,501
0,557
0,591
0,524
0,353
3,912
0,930
0,968
1,054
1,126
0,643
1,829
0,875
0,821
0,532
0,478
0,338
50
TABLA 5
4,5-dihidroxi-2-pentenal
Tiempo de incubación
55
24 horas
Concentración (µM)
60
65
0
50
75
100
150
200
48 horas
72 horas
Grado de crecimiento celular (A450−650 )
0,940
0,821
0,606
0,560
0,505
0,370
3,912
1,471
0,879
0,948
0,823
0,644
28
1,829
1,245
0,862
0,597
0,465
0,753
ES 2 245 084 T3
Como tales, 4,5-dihidroxi-2-pentenal y 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona mostraron actividad supresora del crecimiento celular frente a células sinoviales. Otros compuestos de la presente invención mostraron también la misma
actividad.
5
10
15
(2) Se incubaron células DSEK (propiedad del Department of Second Internal Medicine, Total Medical Center,
Saitama Medical College, como modelo de reumatismo in vitro) que eran cepas de células fibroblastos establecidas a
partir de membrana sinovial de un paciente que sufría reumatismo crónico en un medio Iscov-MEM (IMDM; fabricado
por Gibco BRL) que contenía 10% de FBS (fabricado por BioWhittaker) a 37ºC en presencia de CO2 al 5% hasta que
las células se saturaron en un incubador, se suspendió una solución de tripsina-EDTA (fabricada por BioWhittaker)
en el medio anterior hasta 3 x 104 células/ml y se colocaron 200 µl de la suspensión en cada pocillo de una placa
de microvaloración de 96 pocillos (fabricada por Falcon). Cuando las células estaban casi en un estado de saturación
del 80% después de 5-7 días desde la incubación, se cambio el medio y se añadieron 200 µl del medio anterior que
contenía 50, 75, 100 ó 150 µM de 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona o 4,5-dihidroxi-2-pentenal.
Se adoptó un intervalo de tiempo de 96 horas y, cada 24 horas se añadieron 10 µl de Premix WST-1 (MK 400;
fabricado por Takara Shuzo) seguido por reacción a 37ºC durante 3,5 horas y el valor (A450−650 ) obtenido restando la
absorbancia a 650 nm (A650 ) de la absorbancia a 450 nm (A450 ) se definió como grado de crecimiento celular.
Los resultados se dan en la Tabla 6 y en la Tabla 7.
20
Además, en la Tabla 8 se muestran las concentraciones inhibidoras de crecimiento celular al 50% (CI50 ) calculadas
a partir de los datos de A450−650 .
TABLA 6
25
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
Concentración (µM)
Tiempo de incubación
24 horas
30
35
24 horas
72 horas
96 horas
Grado de crecimiento celular (A450−650 )
0
50
75
100
150
1,04
0,57
0,51
0,50
0,46
1,25
0,71
0,68
0,64
0,55
1,45
0,73
0,68
0,67
0,63
2,35
0,54
0,55
0,51
0,50
40
TABLA 7
4,5-dihidroxi-2-pentenal
Tiempo de incubación
45
24 horas
Concentración (µM)
50
55
0
50
75
100
150
24 horas
72 horas
96 horas
Grado de crecimiento celular (A450−650 )
1,04
1,12
1,11
1,02
0,96
1,25
0,83
0,77
0,63
0,61
1,46
0,96
0,67
0,54
0,41
2,33
0,98
0,59
0,59
0,55
TABLA 8
60
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
65
Concentración (µM)
4,5-dihidroxi-2-pentenal
48 horas
96 horas
48 horas
96 horas
60
35
165
75
29
ES 2 245 084 T3
(3) Se prepararon células DSEK en las condiciones citadas en el Ejemplo 15-(2) y se añadieron 20 µl de medio que
contenía 25, 50, 75, 100, 200 ó 400 µM de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2ciclopenten-1-ona o 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
5
Se adoptó un período de tiempo de 72 horas y, cada 24 horas se midió el grado de crecimiento celular con el paso
del tiempo. Se midieron también los valores de CI50 de cada uno de los compuestos.
El resultado se da en la Tabla 9.
10
TABLA 9
Nombre de la sustancia
CI50 (µM)
15
20
25
30
35
40
45
50
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
4,5-dihidroxi-2-pentenal
4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano
24 horas
72 horas
207
232
132
267
60
119
67
68
Los grados de crecimiento celular después de 24 y 72 horas del control al que no se añadió muestra fueron 3,95 y
3,97, respectivamente.
Como tales, cuando se añadieron 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona o 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano a células DSEK (modelo de reumatismo)
in vitro, los casos a los que se añadieron cada uno de los compuestos mostraron una inhibición significativa del crecimiento de células de reumatismo al compararlas con el caso en el que se añadió PBS. Además en observaciones con
un intervalo de tiempo se apreció que los compuestos no solo mantenían su actividad inhibidora de crecimiento sino
que también tenían tendencia a potenciar la actividad con el paso del tiempo.
A partir de los resultados anteriores se encontró que 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9guaninil)-2-ciclopenten-1-ona y 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano tenían una potente actividad antirreumática y se espera que se desarrollen como agentes terapéuticos y alimentos saludables útiles para el
reumatismo crónico. Además, otros compuestos de la presente invención también mostraron la misma actividad antirreumática.
Ahora, en la incubación de células DSEK, se recuperaron 150 µl/pocillo de líquido sobrenadante del medio cada
24 horas y se midió la influencia de 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona o 4,5-dihidroxi-2-pentenal sobre la producción de
citoquinas (TGF-β humana, FGF-β humana, IL-1 α humana y una IL-10 humana) usando un kit ELISA específico para
cada una de las citoquinas (el kit fabricado por INTERGEN para FGF-β humana e IL-10 humana; y el kit fabricado
por Promega para IL-1 α humana y TGF-β humana).
El resultado fue como sigue. 4-Hidroxi-2-ciclopenten-1-ona inhibió la producción de FGF-β humana e IL-1 humana α; 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona inhibió la producción de TGF-β humana y FGF-β humana y activó la
producción de IL-1 α humana; 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxalano activó la producción de IL1 α humana; y 4,5-dihidroxi-2-pentenal activó la producción de IL-1 α humana e IL-10 humana.
Ejemplo 16
55
60
65
Se suspendieron células HepG2 (ACTT HB-8065) que eran las cepas de células establecidas de pacientes que
sufrían hepatoblastoma primario en medio DMEM (fabricado por Gibco) que contenía 10% de FBS (fabricado por
BioWhittaker) hasta 3,8 x 103 células/ml, se colocaron 200 µl de la suspensión en cada pocillo de una placa de
microvaloración de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC en presencia de dióxido de carbono gaseoso al 5% hasta que
las células se saturaron en un incubador, se cambió el medio y luego se añadió 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona o 4,5dihidroxi-2-pentenal para que estuvieran en una cantidad de 25, 50, 100 ó 250 µM, la mezcla se incubó durante 24,
48 ó 72 horas, se añadieron 10 µl de Premix WST-1 (MK 400; fabricado por Takara Shuzo) se hizo reaccionar la
mezcla a 37ºC durante tres horas y se definió el valor (A450−650 ) obtenido restando la absorbancia a 650 nm (A650 ) de la
absorbancia a 450 nm (A450 ) como el grado de crecimiento celular.
Los resultados se dan en la Tabla 10 y en la Tabla 11.
30
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TABLA 10
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
5
Tiempo de incubación
24 horas
Concentración (µM)
0
25
50
100
150
10
15
48 horas
72 horas
Grado de crecimiento celular (A450−650 )
3,47
1,30
1,38
1,31
1,23
2,96
0,70
0,81
0,56
0,43
2,57
0,49
0,47
0,35
0,30
TABLA 11
20
Tiempo de incubación
4,5-dihidroxi-2-pentenal
25
Concentración (µM)
30
0
25
50
100
150
35
40
45
50
24 horas
48 horas
72 horas
Grado de crecimiento celular
(A450−650 )
3,47
3,39
1,97
1,81
1,40
2,96
2,69
2,96
2,70
0,79
2,57
1,70
1,70
0,89
0,35
Como tales, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona y 4,5-dihidroxi-2-pentenal mostraron actividad para suprimir el crecimiento de células de cáncer frente a células de hepatoblastoma HepG2. Otros compuestos de la presente invención
también mostraron la misma actividad.
Ejemplo 17
(1) Se suspendieron células RAW 264.7 (ATCC TIB 71) hasta 3 x 105 células/ml en un medio de Eagle modificado
por Dulbecco (fabricado por BioWhittaker; 12-917F) que contenía 10% de suero bovino fetal (fabricado por Gibco),
sin Rojo Fenol y 2 mM de L-glutamina (fabricada por Lifetech Oriental; 25030-149) y se añadieron 500 µl de la
suspensión a cada pocillo de una placa de microvaloración de 48 pocillos y se incubó a 37ºC durante 12 horas en
presencia de dióxido de carbono gaseoso al 5%. Se añadieron al pocillo 10 µl de 50 µg/ml de lipopolisacárido (LPS;
fabricado por Sigma, L-2012) o 10 µl de una solución 2,5 µg/ml de LPS y 500 unidades/ml de interferón γ (fabricado
por Genzyme; código MG-IFN), luego se añadieron 10 µl de una solución acuosa 1000, 500 ó 250 µM de 2-(trans3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano, se incubó la mezcla durante 18 horas más y se midió
la concentración de NO2 − generada por oxidación de NO en el medio. A propósito, se prepararon como controles una
sección a la que no se añadieron LPS e interferón γ y una sección a la que no se añadió 2-(trans-3,4-dihidroxi-1butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
55
Después de la incubación anterior, se añadieron 100 µl de reaccionante de Griess al 4% (fabricado por Sigma;
G4410) a 100 µl de medio, se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos y se midió la
absorbancia a 490 nm. A partir de una curva de calibración preparada por NaNO2 de concentraciones conocidas
disueltas en el medio anterior se calculó la concentración de NO2 − en el medio. Todas las medidas se llevaron a cabo
por triplicado.
60
El resultado fue que 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2- formilvinil)-1,3-dioxolano inhibió la inducción
de la producción de NO por LPS e interferón de una forma dependiente de la concentración.
65
El resultado se da en la Figura 14. Así, la Figura 14 muestra la concentración de NO2 − en el medio cuando
se añadió 2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano seguido por incubación en cada una
de las condiciones de incubación. En la Figura 14, el eje de abscisas indica las condiciones de incubación y el eje
de ordenadas indica las concentraciones de NO2 − (µM). En la figura se hace referencia a 2-(trans-3,4-dihidroxi-1butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano solo como “dioxolano”.
31
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5
Incluso a la concentración final de 10 µM en la que no se apreció ninguna inhibición del crecimiento celular,
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano mostró actividad inhibidora de la producción
de NO en aproximadamente 50%. Este resultado indica que la inhibición de la producción de NO por 2-(trans-3,4dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano no está causada por inhibición del crecimiento celular por
2-(trans-3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(trans-2-formilvinil)-1,3-dioxolano. Todos los demás compuestos de la presente
invención mostraron también la misma actividad.
Ejemplo 18
10
Se colocaron 5 ml de un medio RPMI 1640 que contenía 10% de FBS que contenía 2 x 105 células/ml de HL-60
(ATCC CCL-240) en cada uno de los pocillos de una placa de seis pocillos, se incubaron a 37ºC durante 24 horas en
presencia de CO2 al 5%, luego se añadió 4,5-dihidroxi-2-pentenal hasta que la concentración final fue 0, 12,5, 25, 50
ó 100 µM o se añadió 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona hasta que la concentración final fue 0, 2,5, 5, 10, 20, 40 ó 80 µM
y se incubó la mezcla durante seis horas más.
15
Después de completarse la incubación, se realizó el recuento de células y luego se recuperaron las células por
centrifugación y lavado con PBS para preparar las células tratadas con cada una de las muestras. Además, se prepararon
así células que se calentaron a 45ºC durante cinco minutos seguido por someterlas a la misma incubación.
20
25
30
35
40
Las células tratadas como tales se sometieron seguidamente a SDS-PAGE según el procedimiento citado en “Molecular Cloning” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). De este modo, se suspendieron las células en tampón
de muestra de SDS-PAGE hasta una concentración de 2,5 x 106 células/ml, se trató la suspensión de células resultante
a 100ºC durante diez minutos, se aplicaron 5 µl de cada una de dos láminas de gel de SDS-PAGE (un gel de apilado
al 5% y un gel de separación al 10%) y se llevó a cabo una electroforesis. Uno de los geles se tiñió con Comassie
mientras que el otro se sometió a transferencia en una membrana de transferencia de poli(difluoruro de vinilideno)
(Immobilon™ fabricado por MILLIPORE; número de catálogo IPVH000-10). Esta membrana se sometió a un bloqueo durante la noche a 4ºC usando Block Ace (fabricado por Dainippon Pharmaceutical; número de catálogo UKB25).
La membrana que se sometió a bloqueo como tal se hizo reaccionar con anticuerpo monoclonal HSP 72/73 (Ab1) (fabricado por Oncogene Research Products; número de catálogo HSP01) que se hizo reaccionar específicamente
con proteína de choque térmico termoinducida de 70 kDa, se lavó con TBS que contenía 0,05% de Tween 20 y se
lavó después con TBS. Después de esto, se hizo reaccionar con anticuerpo secundario mezclado con peroxidasa HRP IgG de conejo antirratón (H + L) (fabricado por ZYM ED Laboratories; número de catálogo 61-6520) y se lavó como
en la operación anterior. La membrana que se hizo reaccionar con el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario
como tal se hizo reaccionar con RENAISSANCE™ (un reaccionante de quimioluminol fabricado por Dupont NEN,
número de catálogo NEL-100) y luego se expuso a una película de rayos X para confirmar la inducción de la proteína
de choque térmico de 70 kDa.
Como resultado, se confirmó la inducción de la proteína de choque térmico por 4,5-dihidroxi-2-pentenal y por 4hidroxi-2-ciclopenten-1-ona. En la Tabla 12 y en la Tabla 13 se muestra el grado de intensidad de la inducción. En las
Tablas 12 y 13, “+” muestra la intensidad de inducción y, a más símbolos “+”, mayor es la inducción. A propósito, “-”
significa que no hay inducción y “±” significa poca inducción. El resto de compuestos de la presente invención mostró
también la misma actividad inductora de la proteína de choque térmico.
45
TABLA 12
Concentración (µM)
50
4,5-dihidroxi-2-pentenal
55
1,25
25
50
100
-
±
+++
-
TABLA 13
Concentración (µM)
60
4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona
65
2,5
5
10
20
40
80
-
±
+
+++
++
±
A propósito, la suspensión de células sin tratar presentó “-” (sin inducción) y la suspensión de células que se había
calentado a 45ºC durante 5 minutos presentó “++”.
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Ejemplo 19
Inyección
5
Se concentró y se secó el producto de neutralización de D-ribosa termotratada que se describe en el Ejemplo 1.
Seguidamente se disolvió el producto resultante en agua destilada para inyección para preparar una solución al 1%.
Esta solución se envasó en viales para liofilización en una cantidad de 10 mg en base a la fracción sobrenadante y
luego se liofilizó. Como disolvente para disolución se unió por separado a la misma una solución salina fisiológica (2
ml).
10
Del mismo modo, para preparar una inyección se usó 2-desoxi-D-ribosa termotratada que se describe en el Ejemplo
2.
15
Del mismo modo, para preparar una inyección se usaron 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)1,3-dioxolanol o 5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
Ejemplo 35
20
Comprimidos
Se prepararon comprimidos conforme a la siguiente formulación.
25
30
Sal sódica de ADN termotratada
Almidón de maíz
Carboximetilcelulosa
Polivinilpirrolidona
Estearato de magnesio
Total
10 mg
65 mg
20 mg
3 mg
2 mg
100 mg por comprimido
Se usó el producto liofilizado de la sal sódica termotratada de ADN que se describe en el Ejemplo 4.
35
Del mismo modo, para preparar comprimidos se usaron 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona,
4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)1,3-dioxolanol o 5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
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65
Mérito de la invención
La presente invención ofrece el producto termotratado de la presente invención y/o uno de sus productos parcialmente purificados que tiene capacidad para inducir apóptosis que induce apóptosis frente a células de cáncer en cáncer
y es eficaz para la prevención y tratamiento de cáncer y también ofrece el compuesto de la presente invención que
es una sustancia que tiene capacidad para inducir apóptosis. La presente invención también ofrece un procedimiento
para fabricar 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona a partir de otros compuestos además del grupo ácido urónico. En cánceres digestivos tales como cáncer de colon y cáncer gástrico, en particular, se puede inducir apóptosis de las células de
cáncer tomando oralmente un compuesto que se selecciona del producto termotratado de la presente invención y/o uno
de sus productos parcialmente purificados o el compuesto que tiene capacidad para inducir apóptosis como alimento
o bebida. Así, el alimento o bebida que contiene, se le ha añadido y/o tiene diluido en el mismo un compuesto seleccionado del producto termotratado de la presente invención y/o uno de sus productos parcialmente purificados o el
compuesto que tiene capacidad para inducir apóptosis, es bastante eficaz para la prevención y tratamiento de cánceres
digestivos. Los agentes farmacéuticos que contienen un compuesto que se selecciona del producto termotratado de la
presente invención y/o uno de sus productos parcialmente purificados o el compuesto que tiene capacidad para inducir
apóptosis como componente efectivo tiene actividad supresora de crecimiento celular frente a células cancerígenas y
del crecimiento anómalo de células sinoviales y, son muy eficaces para mantener la homeostasis del cuerpo humano.
Debido a la capacidad para inducir la producción de hlGF, dichos agentes farmacéuticos también son eficaces para
el tratamiento y prevención de enfermedades que requieren la inducción de la producción de hlGF-1. Dichos agentes
farmacéuticos también son eficaces para el tratamiento y prevención de enfermedades que requieren la supresión de
oxígeno activo, por ejemplo la supresión de la producción de NO. Además, debido a la capacidad de inducir proteína
de choque térmico, dichos agentes farmacéuticos son eficaces para el tratamiento y prevención de enfermedades que
requieren la inducción de proteína de choque térmico, por ejemplo, una enfermedad viral.
Es posible suministrar el producto termotratado de la presente invención y/o uno de sus productos parcialmente
purificados o el compuesto que tiene capacidad para inducir apóptosis a bajo precio en grandes cantidades usando
alimentos como material. Además, la presente invención ofrece un procedimiento para inducir convenientemente
apóptosis usando el producto termotratado de la presente invención y/o uno de sus productos parcialmente purificados
o el compuesto que tiene capacidad para inducir apóptosis como componente efectivo, tras lo cual se puede llevar a
33
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cabo usando dicho procedimiento el estudio del mecanismo de apóptosis y el desarrollo de un inhibidor de la inducción
de apóptosis.
5
Además, la presente invención ofrece los agentes farmacéuticos que usan un compuesto seleccionado del compuesto de la presente invención. Dichos agentes farmacéuticos son muy eficaces para el tratamiento y prevención de
enfermedades incurables tales como cáncer, patologías reumáticas, diabetes mellitus y enfermedades virales.
10
La presente invención ofrece además un alimento o bebida en el que está contenido, se ha añadido y/o se ha
diluido con el mismo un compuesto seleccionado del compuesto de la presente invención. Dicho alimento o bebida
es un alimento o bebida funcional tal como un alimento o bebida que induce apóptosis, carcinostática, antirreumática,
contra la diabetes mellitus e inductora de la proteína de choque térmico que es eficaz para la prevención y mejora de
enfermedades incurables tales como cáncer, patologías reumáticas, diabetes mellitus y enfermedades virales.
15
La presente invención ofrece además un procedimiento convencional para la fabricación de 4,5-dihidroxi-2-pentenal y 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona. Por otro lado, la presente invención ofrece el nuevo compuesto que tiene actividad fisiológica tal como 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona y 2-(3,4-dihidroxi-1butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
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REIVINDICACIONES
5
1. Un procedimiento para la fabricación de un compuesto seleccionado del grupo consistente en 4,5-dihidroxi-2pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 1,5epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona y 4-5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona, caracterizado por incluir una etapa que consiste
en someter al menos un compuesto seleccionado de los siguientes (a), (b), (c) y (d) a un tratamiento térmico:
a) pentosa seleccionada del grupo consistente en xilosa y ribosa;
10
b) derivados de pentosa en el punto (a) anterior;
c) compuestos que contienen pentosa en el punto (a) anterior;
15
d) compuestos que contienen derivados en el punto (b) anterior.
2. Un procedimiento de fabricación según la reivindicación 1, en el que los derivados de pentosa son desoxipentosa.
3. Un procedimiento de fabricación según la reivindicación 1, en el que los derivados de pentosa son desoxirribosa.
20
25
4. Un procedimiento de fabricación según la reivindicación 1, en el que los compuestos que contienen pentosa son
ribonucleósidos, ribonucleótidos o ácido ribonucleico.
5. Un procedimiento de fabricación según la reivindicación 1, en el que los compuestos que contienen pentosa son
pentosa en la que está unido en posición 5 un grupo que puede tener una carga negativa.
6. Un procedimiento de fabricación según la reivindicación 1, en el que los derivados de pentosa son derivados de
pentosa en la que está unido en posición 5 un grupo que puede tener una carga negativa.
30
7. Un procedimiento de fabricación según las reivindicaciones 5 ó 6, en el que el grupo que puede tener una carga
negativa es grupo ácido fosfórico o grupo ácido sulfúrico.
8. Un procedimiento de fabricación según la reivindicación 1, en el que los compuestos que contienen derivados
de pentosa son desoxirribonucleósidos, desoxirribonucleótidos y ácido desoxirribonucleico.
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45
50
9. Un compuesto que induce apóptosis seleccionado de 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano.
10. Un agente farmacéutico para terapia o prevención de una enfermedad que tiene sensibilidad a un compuesto seleccionado de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil))-2-ciclopenten-1-ona, 4(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3penten-2-ona, caracterizado porque, dicho agente farmacéutico contiene un compuesto seleccionado de 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil)-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona como componente efectivo.
11. El uso de un agente farmacéutico según la reivindicación 10 en la fabricación de un agente para el tratamiento
de un trastorno seleccionado del grupo consistente en cáncer, reumatismo, diabetes mellitus de tipo II, enanismo, una
enfermedad inflamatoria, arteriosclerosis, una enfermedad nerviosa, lesión por reperfusión isquémica y una enfermedad viral.
12. Alimento o bebida que contiene un compuesto seleccionado del grupo consistente en 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil))-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4dihidroxi-1-butenil)-4-(2-formilvinil)-1,3-dioxolano, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona.
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13. El uso de un compuesto seleccionado del grupo consistente en 4,5-dihidroxi-2-pentenal, 4-hidroxi-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-adeninil))-2-ciclopenten-1-ona, 4-(9-guaninil)-2-ciclopenten-1-ona, 2-(3,4-dihidroxi-1-butenil)-4-(2formilvinil)-1,3-dioxolano, 1,5-epoxi-1-hidroxi-3-penten-2-ona, en la fabricación de un alimento o bebida para el
tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo consistente en cáncer, reumatismo, diabetes mellitus de tipo II,
enanismo, una enfermedad inflamatoria, arteriosclerosis, una enfermedad nerviosa, lesión por reperfusión isquémica
y una enfermedad viral.
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