Cuantificacion de proteinas farmacia

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Tema 6
Cuantificación de proteínas
 Procedimiento de estudio de proteínas
• Selección de fuente
• Fraccionamiento de células
• Centrifugación
 Cromatografía
• Cromatografía en capa fina
• Cromatografía en columna
• Cromatografía de intercambio iónico
• Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel
• Cromatografía de afinidad
 Electroforesis
• Electroforesis en acetato de celulosa
• Electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE)
Procedimiento estudio de proteínas
Selección de la fuente
1º) Aislamiento de las proteínas
Disgregación del tejido
Ruptura celular
2º) Purificación
Cromatografía
Electroforesis
3º) Determinación de su
actividad
3º) Determinación de la
estructura primaria
3º) Determinación de sus
niveles de expresión
Selección de la fuente
Tejido
Disgregación del tejido: (Colagenasa, quelantes del Ca++....... )
Separación de las células
Cultivos celulares
Cultivos primarios
Líneas celulares
Fraccionamiento de las células
Químicos
Mecánicos
Lisis osmótica
Homogenización
Detergentes
Sonicación
Disolventes orgánicos
(acetona, etanol, TCA)
Congelación
Separación componentes celulares por CENTRIFUGACIÓN
• Homogenado se somete a altas velocidades de giro
• Separación por tamaño y densidad
• Las moléculas mayores se depositan antes
Estabilización de las proteínas:
• pH
• Degradación proteolitica
• Temperatura
Fraccionamiento celular por CENTRIFUGACIÓN
Homogenado
1000g x 10 min
c. enteras, núcleos
y citoesqueleto
 Separación en función del tamaño
20.000g x 20 min
mitocondrias,
lisosomas
y peroxisomas
80.000g x 1h
microsomas y
pequeñas vesículas
150.000g x 3h
ribosomas, virus y
grandes macromoléculas
 Aumento de la velocidad de
centrifugación
Separación y purificación de proteínas
Se basa en la diferente:
 Solubilidad
CROMATOGRAFÍA
 Tamaño
 Carga eléctrica
 Densidad
 Afinidad por otras moléculas
ELECTROFORESIS
Cromatografía
Papel (capa fina): Aminoácidos y Azúcares
Cromatografía
Columna: Aminoácidos y Proteínas
Cromatografía sobre papel
(Cromatografía de reparto)
Cromatografía
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Las diferentes proteínas se retrasan según sus interacciones con la matriz, de
acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamaño o unión a grupos químicos
Muestra
aplicada
El solvente se aplica
contínuamente a la
boca de la columna
Matriz
sólida
Moléculas fraccionadas
eluídas y recogidas
Tapón
poroso
Tubo de
ensayo
tiempo
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Cromatografía
TRES CLASES DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
A) Intercambio iónico:
B) Filtración en gel:
en base a la carga
Flujo de solvente
C) de Afinidad:
en base a interacción
en base al tamaño
Flujo de solvente
Flujo de solvente
Partícula
cargada
positivamente
Molécula
cargada
negativamente
unida
Molécula
cargada
positivamente
libre
Partículas
porosas
Molécula
pequeña
retrasada
Molécula grande
no retrasada
Partícula con
sustrato unido
covalentemente
Molécula de
enzima unida
Otras proteínas
pasan de largo
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Cromatografía de intercambio iónico
 Las proteínas se separan según
su carga a un pH determinado
(Ej: intercambio catiónico)
Proteínas
cargadas
positivamente se unen
a la matriz cargada
negativamente
Proteínas
cargadas
negativamente pasan
sin unirse
Cromatografía de filtración en gel o exclusión molecular
 Las proteínas se separan según su tamaño
Matriz de polímeros
de carbohidratos
Moléculas pequeñas
entran
entre
los
espacios
acuosos
dentro de la matriz
Moléculas grandes no
entran dentro de los
espacios de la matriz
Cromatografía de afinidad
 Las proteínas se separan en función de la especificidad de unión a un ligando
Moléculas que unen
glucosa se unen a
residuos de glucosa
(G) de la matriz
Adición de glucosa
(G)
Moléculas se liberan
tras la adición de
glucosa
Enzima - Sustrato
Antígeno - Anticuerpo
Hormona - Receptor
Electroforesis
Papel, acetato de celulosa
Electroforesis
Gel: proteínas (SDS-PAGE) y ac. nucleicos
Electroforesis en acetato de celulosa
Proteínas plasmáticas
 Albúmina
45-55% total
5-8%
 Globulinas: a1
a2
8-13%
b
11-17%
g
15-25 %
Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)
Formación de un gel de
poliacrilamida
Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)
Dodecil sulfato sódico
Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)
Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)
Marcadores de peso molecular
Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)
Proteínas teñidas con
Azul de Comassie
tras SDS-PAGE
Determinación de las
masas moleculares
Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)
Proteínas presentes en los sucesivos estadios de purificación de una enzima
Carril 1: extracto de partida
Resto de carriles: proteínas obtenidas después
de fraccionamiento cromatográfico
de la muestra del carril anterior
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