Utilidad de las pruebas diagnósticas moleculares en la infección por

Utilidad de las pruebas diagnósticas
moleculares en la infección por HPV
Lic. Legarreta Gonzalo
Laboratorio BIONET – La Plata
Historia natural de la Infección por HPV
• La infección por Papilomavirus Humano (HPV) es la enfermedad de
trasmisión sexual mas común entre hombres y mujeres
• Se estima que el 70% de las mujeres sexualmente activas, pueden adquirir
la infección viral a lo largo de su vida
• Virus del Papiloma Humano (VPH) es responsable del 99% del cáncer de
cuello uterino
•Sin embargo, sólo un bajo% de las infecciones por HPV causan cáncer
cervical
• Primeras etapas del cáncer de cuello uterino se puede tratar
fácilmente (99,7% de éxito)
• La resolución de la infección confiere inmunidad. Una infección posterior
por el mismo genotipo debe atribuirse a una reactivación de una infección
latente
Historia natural de la Infección por HPV
•El virus del HPV no puede ser cultivado in Vitro.
•Los genotipos de HPV 16 y 18 suponen más del 70% de los casos de cáncer
cervical
• La probabilidad de que un HSIL regrese a LSIL es 3 veces mayor de que
suceda lo contrario.
• La carcinogénesis precisa de una infección persistente
EL PAPILOMAVIRUS
•
•
•
•
Virus de ADN de doble cadena, sin envoltura
Genoma de entre 7200-8000 pb
Mas de 100 tipos, >80 completamente secuenciados
Tipos se basan en su secuencia de ADN:
> 10% de variación genética = nuevo tipo
2-10% de variación genética = subtipo
< 2% de variación genética = variante
• Los números de los tipos fueron asignados según
fueron siendo descubiertos y no en base a su
relación filogenética
Filogenia
39
18
45
11
6
VP Humanos
(mucosa genital)
Beta HPV
33
16
35
31
VP Animales
VP Humanos
(cutaneos)
Alfa HPV
Chan et al., J Virology, 69:3074-83 (1995)
CLASIFICACIÓN EPIDEMIOLÓGICA DE LOS TIPOS DE VIRUS
PAPILLOMA HUMANO
GRUPO
GENOTIPOS HPV
ALTO RIESGO ESTABLECIDO
16-18-31-33-35-39-45-51-5256-58-59
PROBABLE ALTO RIESGO
26-53-66-68-73-82
BAJO RIESGO ESTABLECIDO
6-11-13-40-42-43-44-54-61-7072-81-CP6108 (89)
Muñoz N, Castellsague X, de Gonzalez AB, Gissmann L.
Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer. Vaccine 24(Suppl. 3), S1‐S10 (2006).
EL VIRUS: ORGANIZACIÓN GENÓMICA
• Consta de varios genes u “Open Reading
Frames” (ORF) de dos tipos diferentes:
• Hasta 8 genes de expresión temprana o
“early” (E1-E8) cuya expresión se traduce en
proteínas para la regulación y replicación viral
• 2 genes de expresión tardía o “late” (L1, L2)
que generan las proteínas para la unión de la
cápside
• Una región URR ó LCR que controla la
expresión de los genes tempranos E6 y E7
VARIABILIDAD GENÉTICA Y DETECCIÓN
• Los genes de expresión tardía “Late” presentan
secuencias muy semejantes entre los diferentes tipos
de VPH.
- gen L1 principal diana “consenso” de detección.
• Los genes de expresión temprana “Early” presentan
secuencias muy variables por lo que se han utilizado
para la detección específica del tipo.
- genes E6 y E7.
30
30
25
25
HPV (HC2)
20
20
15
15
Cancer
10
10
5
5
0
0
1519
2024
25- 3029 34
3539
4044
4549
5054
5559
Edad (Años)
1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER
Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.
6065
incidencia de Cancer por 100,000
HPV Prevalencia (%)
HPV Prevalencia e incidencia Cancer Cervical
por Edad
Infección productiva HPV
¿Cómo se transforma una infección HPV en un
carcinoma? Integración del ADN viral en el ADN
huésped
E6
LCR
E7
ADN episomal del VPH
–
E1
L1
+
E2
L2
E5
E4
Punto de rotura
e integración
ADN huésped
AND huésped
ADN del VPH integrado
E2 E4
E5 L2
L1 LCR
E6
E7
E1
E2
Adaptado de 1. Phelps y Alexander. Ann Intern Med. 1995;123:368–382. 2. Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus
infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
La integración aumenta el riesgo de cáncer - I
Forma del VPH en la célula
Efecto
• Expresión del gen E6
controlada por E2
Episoma
p53
E6
Después de la
integración
PA
• La expresión de E6 deja
de estar controlada
• Bloqueo de la actividad
de p53 (degradación)
• Resistencia a la
apoptosis
Asociación de E6 con
p53 y PA
• Aumento de la
inestabilidad
cromosómica
Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
La integración aumenta el riesgo de cáncer - II
Forma del VPH en la célula
Efecto
• Expresión del gen E7
controlada por E2
Episoma
pRB
E7
• La expresión de E7 deja
de estar controlada
• Generación de
múltiples cromosomas
Después de la
integración
+
Libre
• Inmortalización celular
E2F
• Oncogénesis
Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
Métodos de detección de HPV
ÁCIDOS NUCLEICOS
Sonda directa:
-Southern Blot
SIN PRESERVACION TISULAR MORFOLOGICA
-Son especificos pero poco sensibles
-Hibridación in situ
-CON PRESERVACION TISULAR MORFOLOGICA
Inform ®HPV (Ventana): Sistema
automático de hibridación in
situ, preservando morfología.
Distingue ADN integrado y
episomal.
Detección del HPV mediante
amplificación de la señal.
Tecnología de captura de híbrido (HC2)
•
•
•
•
•
•
•
Hibridación ADN/ARN.
Cóctel de sondas:
- Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.
- Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44.
Sensibilidad adecuada a procesos
de cribado de VPH (1 pg/mL)
(120.000 particulas de virus)
Aprobado por la FDA.
Posibilidad de semicuantificar.
Estandarizada y automatizable.
Detecta de forma cruzada otros
genotipos.
(Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)
Detección del HPV mediante
amplificación de la señal.
Tecnología de captura de híbrido (HC2)
•
•
•
•
•
•
LIMITACIONES:
Prueba dependiente del estado de conservación del DNA viral
La semicuantificación de la Carga Viral solo indica el nº de copias
No distingue los diferentes tipos virales
No detecta infecciones múltiples
Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y
ciertos tipos virales de bajo riesgo
Método de captura de híbrido
(HC2)
• DESNATURALIZACIÓN
• HIBRIDACIÓN
CON SONDAS ARN DE
ALTO Y BAJO RIESGO
• CAPTURA DEL HÍBRIDO ADN/ARN MEDIANTE
ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN
• FIJACIÓN AL HÍBRIDO DE ANTICUERPOS ANTI-
ADN/ARN MARCADOS CON FOSFATASA
ALCALINA
• DETECCIÓN
DE LA ENZIMA FIJADA MEDIANTE
SUSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE
Detección del HPV por PCR
•
•
•
•
Es la técnica molecular más sensible y flexible.
Puede ser utilizada para la detección, la cuantificación, la secuenciación y el
análisis mutacional.
La cuantificación del producto resulta compleja (estándares internos).
Exige del laboratorio y del personal una normas y unas condiciones
especiales.
E2
E6
E7
L1
E5
L2
E1
E4
1
2
3
4
5
6
7
7,9 kb
primers
MY09/11 PGMY
CGTCCMARRGGAWACTGATC
GCMCAGGGWCATAAYAATGG
450 bp
GPMY09/11
GP5+/6+
AMPLICOR ® ROCHE
SPF10
150 bp
165 bp
65 bp
Características de las técnicas de
detección de ácidos nucleícos
Método
Ventajas
Inconvenientes
Sonda directa
SB es el estándar y el FISH
permite ver el HPV
asociado con la lesión
histológica.
Baja sensibilidad,
laborioso, y el SB no puede
utilizar tejido con ADN
degradado.
Señal
amplificada
Comercializada
y estandarizada.
Semicuantitativa.
Tecnologías patentadas y
costes elevados.
Genotipado en grupos.
Amplificación
de la diana
Tecnología flexible
(carga viral y genotipo).
Sensibilidad muy alta.
Análisis múltiple.
Pendiente de estandarizar.
Tecnologías patentadas.
Requieren experiencia
y dotación costosa
del laboratorio.
Genotipado del VPV
¿aporta información útil?
•
El genotipado es importante en
tres situaciones:
El potencial oncogénico y el
riesgo de progresión a CIN III
difieren de forma importante
según el genotipo.
- Es necesario monitorizar la
eficacia de las vacunas
multivalentes.
- Estudios epidemiológicos.
-
•
La incidencia acumulativa de CIN III en
pacientes seguidas durante diez años e
infectadas con HPV-16 y 18 es muy superior
(17,2 y 13,6) a la de las infectadas por otros
tipos oncogénicos (3%) o sin detección de
VPH (0,8%). Estos datos se refuerzan en
mujeres con más de 30 años.
VPH-16
VPH-18
(Schiffman et al. Virology 2005; 337: 76-84.
Khan et al. JNCI 2005; 97: 1072-9.
Castle et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3915-7)
Estrategia para el genotipado del VPH
PCR
Primers consenso
GP5+/6+ PGMY SPF10
MY09/11
primers específicos
Hibridación reversa
RFLP
Array
PCR en tiempo real
Secuenciación
Hibridación reversa
INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics)
•
•
Amplifica pequeños fragmentos de 65 bp en la región L1
(primers SPF). Controles internos
Detecta 28 tipos de HPV e infecciones múltiples.
Linear Array HPV Genotyping Test (Roche Diagnostics)
•
•
Amplifica la región L1 con mezclas de primers
(PGMY09/PGMY11) y el gen de la β globina humana, ambos
biotinilados.
El producto amplificado se hibrida con sondas de 37 tipos
de HPV fijadas a una membrana de nitrocelulosa.
(Kleter et al. J Clin Microbiol 1999; 37: 2508-17.
Gravitt et al. J Clin Microbiol 1998; 36: 3020-7.
Kornegay et al. J Clin Microbiol 2003; 41: 1080-6.
Van Hamont et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3122-9.)
RFLP
(patr
patrón
ón de restricción con endonucleasas
endonucleasas))
•
Método que permite combinar la
sensibilidad de la PCR con el
poder
discriminatorio
de
las
endonucleasas de restricción.
•
Es un sistema poco laborioso
y
menos
costoso
que
LIPA
y secuenciación.
•
Resulta difícil detectar infecciones
mixtas.
Bernard et al. J Infect Dis 1994; 170: 1077-85.
Wang et al. J Med Virol 1999; 59: 536-40.
Kay et al. J Virol Meth 2002; 105: 159-70.
Hibridación
Hibridaci
ón con microarrays
•
•
•
•
•
•
CLART® HPV2 (Genomica) (Biomerieux)
35 tipos de HPV
Tras una PCR de la región L1, que marca el
producto amplificado, se hibrida con
oligonucleótidos dispuestos en microarray.
Se generan sondas a cada tipo de VPH y se
fijan a los pocillos de reacción.
Se amplifica la muestra con primers
genéricos marcando con Cy5 el producto
amplificado.
Hibridación y lectura con software
especiales.
Ensayos de Real-time PCR HPV
• GenoID assay
• Identifica 14 tipos alto riesgo y 5 bajo riesgo (dos canales)
• Desarrollado para tres diferentes plataformas de real-time:
Roche LightCycler 2,
Applied Biosystems 7900 HT,
Corbett Rotor-Gene 6600
SENSIBILIDAD
+
Hibridación
in situ
Southern blot
Sonda
directa
HC II
Señal
amplificada
PCR
real time
PCR
Amplificación
de la diana
Propuesta de nuevo algoritmo de cribado
Mujeres de 25-64 años
HPV Test
Negativo
Normal
Control cada
5 años
Positivo
Normal o
Borderline
HPV test y
Citología cada
6-12 meses
Cito Neg
HPV Neg
Normal
Control cada
5 años
HPV+ y Cito Neg
HPV – y Cito
Borderline
CITOLOGÍA
=/> Leve
Colposcopía
Cito =/>
Leve
Colposcopía
HPV y Citología
cada 6-12 meses
EUROGIN November 2008
Test HPV - ADN
Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)
Captura Híbrida 2 (HCII, Digene)
Digene)
• Valor predictivo negativo
•
•
•
– Si test VPH positivo , NO significa que desarrollará cáncer, la
mayoría de mujeres que están infectadas no lo desarrollan
– Si test VPH negativo, es muy difícil que se desarrolle el cáncer
El verdadero valor del test está en muestras negativas (Cribado 3 a 5
años)
Sólo detectan infecciones muy prevalentes, de las cuales 70% de
las infecciones desaparecen en 1 año, y un 91% en dos años (sin
ningún tipo de tratamiento)
Sólo las infecciones persistentes tienen riesgo de desarrollar
lesiones precancerosas de alto grado y cáncer ( aprox. 10% de
mujeres con el virus.)
Por tanto, estos test presentan limitaciones que las tecnología
basada en la determinación de ARNm virales pretende resolver
Test de detección de ARNm
Detección específica de expresión oncogénica E6/E7
Métodos de amplificación de isotérmicos
NASBA® Real-Time technologies
PreTec HPV-Proofer (Norchip – Biomerieux)
- 5 genotipos HR-HPV (16-18-31-33-45)
-Discrimina genotipo
APTIMA GenProbe: 14 Genotipos HR-HPV
(16-18-31-33-35-39-45-51-52-56-58-59-66-68)
-No Discrimina genotipo
Detección de ARNm de E6/E7 del HPV:
Detección
Nuclisens Easy HPV - Biomerieux
•
•
•
•
Amplificación de diana ARN (NASBA)
Utiliza sondas específicas (molecular beacons)
Determina 5 genotipos: 16, 18, 31, 33 y 45
Molden et al., J Virol Meth,
2007,142,204.
Andersson et al., Int J Oncol,
2006,29,705
Detección
Detecci
ón de ARNm de E6/E7 del VPH
•
•
•
La expresión de E6 y E7
puede medirse por sus
niveles de ARNm
Es un marcador indirecto
de integración vírica.
Tiene
mayor
valor
predictivo
positivo
que
otras técnicas moleculares
en lesiones de bajo grado.
(Lie et al. Gynecol Oncol 2005; 97: 908-15.)
Test de detección de ARNm
• En un estudio con un seguimiento de 2 años, la detección del mRNA de
E6/E7 produjo una reducción de 2,5 veces en el número de falsos
positivos para lesiones CIN2+, en comparación con las pruebas de ADN.
• Esto conlleva una reducción significativa del número de biopsias
innecesarias.
• La valoración de E6/E7 mRNA se puede realizar en mujeres de todas las
edades para la detección de lesiones precancerosas
• En una evaluación de análisis de rutina (n=491 ASCUS/LSIL), el valor
predictivo positivo (VPP) de la detección de E6/E7 (con PreTect®
HPVProofer, NorChip) para la detección de lesiones precancerosas
(CIN2+) fue del 50%, incluso en mujeres menores de 30 años.
• De acuerdo con este estudio, una de cada dos mujeres con mRNA de
E6/E7 positivo (mayores o menores de 30 años) tienen lesiones
precancerosas subyacentes.
Adaptado de Molden et al. Int J of Cancer: 2005; 114, 973-97610
www.e6e7.com.ar
Test VPH - ADN
Significación diagnóstica
Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)
Captura Híbrida 2 (HCII, Digene/Qiagen)
HPV negativo
HPV positivo
La mujer no se encuentra
infectada por VPH.
Es muy difícil que se
desarrollen lesiones severas o
cáncer
Alto Valor predictivo negativo
(VPN)
La mujer esta infectada por
VPH
Bajo Valor predictivo positivo
(VPP)
NO significa que desarrollará
cáncer, la mayoría de mujeres
que están infectadas no lo
desarrollan
Un 90% de las infecciones se aclaran
en 2 años
(cribado 3 a 5 años)
Test HPV - ARNm
Significación diagnóstica
HPV ARNm E6/E7
Prueba
negativa
Prueba
positiva
No hay expresión de
oncoproteínas
Aunque el virus este presente
no hay actividad oncogénica
Presencia de oncoproteínas
en el exocervix.
Existe actividad celular
anormal, integración viral y
alta probabilidad de
progresión.
Alto Valor predictivo negativo
(VPN)
Alto Valor predictivo positivo
(VPP)
Alta correlación con progresión
MUCHAS GRACIAS
http://www.bio-net.com.ar