DETECTORES PARA HPLC DETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) - longitud de onda fija - longitud de onda variable - arreglo de fotodiodos • DETECTOR ÍNDICE REFRACCIÓN • DETECTOR FLUORESCENCIA • DETECTOR ELECTROQUÍMICO • MS/FTIR/Conductividad HPLC 5 10/96 1 Señal del detector LINEALIDAD DEL DETECTOR Respuesta lineal máxima . Concentración mínima detectable Concentración de la muestra HPLC 5 10/96 2 RUIDO Y DERIVA DEL DETECTOR Ruido de alta frecuencia Ruido baja frecuencia Deriva y ruido de baja frecuencia HPLC 5 10/96 3 TIPOS DE FUENTES LUMÍNICAS FUENTE DE LÍNEAS E 253.7 nm Lámpara de Hg Longitud de onda FUENTE CONTÍNUA E Lámpara de Deuterio Longitud de onda HPLC 5 10/96 4 FACTOR DE RESPUESTA Respuesta D PENDIENTE = BD / AB . C PENDIENTE = BC / AB A Concentración B HPLC 5 10/96 5 USO DE DETECTORES DE HPLC TIPO PORCIENTO DE USO Absorbancia 70.7 Ultravioleta, fija Ultravioleta, filtro Espectrofotométrica Fluorescencia (28.0) (8.7) (34.0) 15.0 Índice de Refracción 5.5 Electroquímico 4.4 Otros 4.4 Analytical Chemistry, 54 (1982) 323R. HPLC 5 10/96 6 DETECTOR UV DE FIJA Lente de Cuarzo Filtro Referencia Muestra Foto Detectores Fuente de mercurio Comparador LOG Registrador Filtro UV Pre-Amps HPLC 5 10/96 7 CELDA DE FLUJO: DOS CANALES SALIDA ENTRADA MUESTRA VENTANA DE CUARZO 1 mm DE LA FUENTE AL DETECTOR 1 mm 10 mm ENTRADA REFERENCIA SALIDA HPLC 5 10/96 8 LOS BENEFICIOS DE LA DETECCIÓN CON VARIABLE Selectividad y sensibilidad mejoradas = 254 nm Mantequilla hidrolizada 40 nanogramos de Estándar de Vitamina A en Alcohol Vitamina A Alcohol 0 = 325 nm 5 0 5 Tiempo de Retención ( Minutos) HPLC 5 10/96 9 MUESTRAS IMPOSIBLES A 254nm • Azúcares • Triglicéridos • Esteroides • Barbitúricos • Ésteres Metílicos • Ácidos carboxílicos • Hidrocarburos • Polímeros HPLC 5 10/96 10 DETECTOR DE UV DE VARIABLE : ESQUEMA HPLC 5 10/96 11 HPLC 5 10/96 12 DE ABSORCIÓN DE CROMÓFOROS CHROMOPHORE FORMULA MAX (nm) Amine – NH2 195 Ethylene – C C – 190 Ketone > C= O 195 Ester – COOR 205 Aldehyde – CHO 210 Carboxyl – COOH 200-210 Nitro – NO2 310 Phenyl 202, 255 Naphthyl 220, 275 HPLC 5 10/96 13 DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS: ESQUEMA HPLC 5 10/96 14 SALIDA 3-D DE UN DETECTOR PDA HPLC 5 10/96 15 USO DEL MODO 3 - D DE PDA • Número de picos • de máxima sensibilidad • de mínima interferencia • programación en f (tiempo) HPLC 5 10/96 16 PDA: PROCESOS CUALITATIVOS • • • • Pureza de pico Confirmación del compuesto - ( max. y tR ) Identificación del compuesto (no es fácil) Índice de pureza (relación de 1/2, 10 pts) intervalo : <1.5 puro, > 1.5 impuro HPLC 5 10/96 17 VERIFICACIÓN DE PUREZA DE PICO El problema: ¿está este pico “puro”? A B C HPLC 5 10/96 18 SUPERPOSICIÓN ESPECTRAL mAU A B C 190 • 230 270 nm 310 No, el pico representa al menos dos compuestos coeluyendo. HPLC 5 10/96 19 DETECTORES DE ARREGLO DE DIODOS • • • Ampliamente usados, aceptados Principal uso – verificación de pureza de pico Ahorra tiempo - no se requiere volver a analizar cuando los picos no han sido bien detectados A. Se pueden registrar distintas 's B. Se puede re-graficar y re-integrar HPLC 5 10/96 20 ABSORBANCIA AL UV DE SOLVENTES LC UV CORTE SOLVENTE n-Hexano Tetracloruro Benceno Clorofromo 254 nm Fuente Hg Cloruro de metileno Acetona Acetonitrilo Metanol Agua 200 250 300 HPLC 5 10/96 21 DETECTOR UV : RESUMEN • • • • • Buena sensibilidad 10-6 a 10-10 g Selectivo Se puede eluir con gradiente Costo variable El más empleado HPLC 5 10/96 22 DETECTOR ÍNDICE DE REFRACCIÓN : ESQUEMA EFLUENTE COLUMNA SOLVENTE PURO filtro HPLC 5 10/96 23 DETECTOR IR : RESUMEN • • • • • • Respuesta universal Mala sensibilidad ~ 10-6 g No se pueden gradientes Se afecta por la temperatura Básico para GPC Empleado en escalas preparativas HPLC 5 10/96 24 COMPARACIÓN DE IR Y UV Inyección IR A B C D E Inyección UV Tiempo HPLC 5 10/96 25 DETECTOR DE FILTRO FLUOROMÉTRICO : ESQUEMA TUBO FOTOMULTIPLICADOR FILTRO (EMISIÓN) LENTE LÁMPARA DE MERCURIO CELDA DE MUESTRA FILTRO (EXCITACIÓN) LENTE EFLUENTE DE LA COKUMNA SALIDA HPLC 5 10/96 26 DETECTOR DE FLUORESCENCIA: CROMATOGRAMA DE EJEMPLO CROMATOGRAMA DE FLUORESCENCIA 5 picogramos benzo(a)pireno Inyección Tiempo HPLC 5 10/96 27 DETECTOR AMPEROMÉTRICO DE PELÍCULA DELGADA PARA HPLC MINIATURE REFERENCE ELECTRODE LOCKING COLLAR DUAL PARALLEL MOBILE PHASE PREHEATER AUXILIARY ELECTRODE COLUMN WORKING ELECTRODE BLOCK OUTLET TOP VIEW GASKET INLET QUICK RELEASE MECHANISM HPLC 5 10/96 28 EXTRACTOS DE BUPRENORFINA DE PLASMA Y ORINA (ECD) (a) BLANCO DE PLASMA (b) 40 ng/ml (STD) (c) (d) BLANCO DE ORINA ORINA 1.5 40 ng/ml 0 4 8 12 0 4 8 12 0 4 8 12 0 4 8 12 min HPLC 5 10/96 29 DETECTOR ELECTROQUÍMICO B. Fleet, C.T. Little, J.Chrom.Sci, 12 (1974) 747 ENTRADA SALIDA SALIDA Tapón de vidrio poroso Contra electrodo Electrodo de trabajo de grafito Electrodo de Referencia Ag/AgCl HPLC 5 10/96 30 DETECTOR ELECTROQUÍMICO APLICACIONES EN REDUCCIÓN EN OXIDACIÓN • Quinonas • Hidrocarburos aromáticos • Compuestos nitro, nitroso y azo • Aminas primarias, secundarias y terciarias • Compuestos organometálicos • Aminas aromáticas • Metales pesados • Compuestos heterocíclicos • Compuestos fenólicos HPLC 5 10/96 31 DERIVADOS SENSIBLES AL UV Analyte Reagent RNH2 N-Succinimidyle p-Nitrophenylacetate RCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'Diisopropylisourea ROH 3,5-Dinitrobenzoyl Chloride R2CO p-NitrobenzyloxyamineHydrochloride 2,4-D.N.P.H. HPLC 5 10/96 32 DERIVADOS SENSIBLES FLUORESCENCIA Analyte Reagent RNH2 Dansyl Chloride Fluorescamine RCOOH 4-Bromomethyl-7methoxycoumarin R--OH Dansyl Chloride R2C = O NH2 Dansyl Hydrazine RCH-COOH Phthaldehyde HPLC 5 10/96 33 DERIVADOS CON PROPIEDADES ELECTROQUÍMICAS Analyte Reagent ROH, R2NH, 2,4-Dinitrobenzoyl RNH2 Chloride R-CH-COOH 2,4-Dinitrofluorobenzene RCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'Diisopropylisourea R2C = O 2, 4-DinitrophenylHydrazine HPLC 5 10/96 34 ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LC Efluente LC Espectrómetro de masas Solvente Muestra Sistema de datos Al Vacío Espectro de masas Muestra concentrada HPLC 5 10/96 35