Enfermedad asociada a Clostridium difficile en la placa crecen tanto las cepas toxigénicas como las no toxigénicas, teniendo las mismas características morfológicas. E. Bouza Santiago, T. Peláez García y P. Catalán Alonso Servicio de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas-VIH. Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Madrid. Introducción Clostridium difficile es un bacilo grampositivo anaerobio, capaz de producir exotoxinas, que con frecuencia se comporta como un saprofito del colon. Por otro lado, puede ser el agente causal de cuadros diarreicos, de intensidad variable, relacionados con la administración de antimicrobianos. En el colon, las alteraciones morfológicas que produce varían desde una apariencia normal hasta imágenes de colitis inespecífica o, en sus formas más extremas, lesiones pseudomembranosas consideradas patognomónicas de esta entidad. El primer caso de colitis pseudomembranosa fue descrito por Finney en 1893 en una mujer joven recientemente gastrectomizada, que desarrolló un cuadro fatal de colitis con presencia de pseudomembranas parecidas a las formadas en faringe en casos de difteria1. En 1935, Hall y O’Toole describieron una especie de Clostridium en la flora intestinal de neonatos sanos, que era productora de exotoxinas letales al inyectarlas en ratones. La denominaron Bacillus difficile por su dificultad de crecimiento 2. En la década de los 60, con la introducción en el mercado de lincomicina y clindamicina, se produjo una elevada incidencia de cuadros de diarrea y de colitis pseudomembranosa, que alcanzó dimensiones epidémicas, llegando a afectar al 10% de los enfermos tratados con dichos fármacos3,4. En un primer momento, la llamada “colitis asociada a clindamicina” se atribuyó a muy diferentes causas incluyendo la isquemia intestinal, hasta que Larson et al5 en 1977 demostraron la presencia de una sustancia citotóxica en las heces de los pacientes con colitis asociada a antibióticos. Sólo un año después, en 1978, Barlett y su grupo 6, demostraron el papel etiológico de Clostridium difficile en la colitis pseudomembranosa lo que fue seguido por la comprobación de la eficacia terapéutica de vancomicina por Tedesco y su grupo7. En las dos décadas transcurridas desde entonces se ha acumulado una gran cantidad de información sobre la etiopatogenia, clínica, diagnóstico y tratamiento de la infección y enfermedad asociada a C. difficile. Microbiología C. difficile es un bacilo grampositivo, esporulado, capsulado y anaerobio. El esporo es oval y generalmente subterminal. Su aislamiento a partir de heces, se realiza en un medio selectivo de cicloserina-cefoxitina-fructosa, desarrollado por George et al (CCFA). El medio es inoculado con la muestra fecal y se incuba a 37°C durante dos a tres días en atmósfera anaerobia, ya que un período de incubación de un día no es suficiente para su óptima recuperación. El crecimiento de C. difficile es muy característico, tanto por la morfología de la colonia (verde estrellada) (fig. 1), por su olor a cuadra de caballos, así como por sus propiedades fluorescentes (las colonias presentan a la luz ultravioleta una fluorescencia verde pálida). C. difficile produce p-cresol y ácido isocaproico como metabolitos, que dan pruebas enzimáticas específicas. El principal inconveniente del cultivo de C. difficile en CCFA, a pesar de su alta sensibilidad, es su falta de especificidad, ya que Patogenia C. difficile desarrolla enfermedad debido a la producción de dos grandes toxinas proteicas, denominadas A y B. En la tabla 1, ofrecemos algunas características comparativas de ambas toxinas. Son las toxinas bacterianas conocidas de mayor peso molecular, y mientras la toxina A causa preferentemente el daño intestinal (enterotoxina), la toxina B es tóxica para líneas celulares mantenidas en cultivo (base de la prueba de laboratorio) 8. Los aislados toxigénicos de C. difficile producen toxinas A y B en cantidades similares, oscilando desde niveles bajos (cepas débilmente toxigénicas) hasta niveles muy altos (cepas altamente toxigénicas), existiendo también cepas no toxigénicas. Son extraordinariamente infrecuentes las cepas de C. difficile productoras de una sola de las toxinas. C. difficile vive con frecuencia en la superficie de objetos hospitalarios y en el colon de neonatos y de algunos adultos. Su presencia es tanto mayor cuanto mayor ha sido el tiempo de hospitalización y cuanto más frecuente ha sido el uso de antimicrobianos. Para la producción de un cuadro de diarrea asociada a Clostridium difficile (DACD), se requieren varios pasos. Por un lado, la alteración de la flora normal en presencia de los antimicrobianos, lo que permite el sobrecrecimiento de C. difficile y la producción de toxinas, y por otro, la presencia de un huésped susceptible donde deben coexistir la presencia de receptores en colon para dicha toxina y factores de debilidad asociados al mismo. Los agentes inductores más importantes de los cambios de la flora, aunque no los Fig 1. Aspecto de las colonias de C. difficile sobre placas de cicloserina-cefoxitinafructosa (CCFA). Medicine 1998; 7(74): 3422-3426 3422 © Idepsa 98 © ENFERMEDAD ASOCIADA A CLOSTRIDIUM DIFFICILE TABLA 1 Algunas características diferenciales de las toxinas de C. difficile Tamaño Diana Colon humano Liberación de citoquinas Receptores celulares Citotoxicidad Toxina A Toxina B 308 kd Enterotoxina Susceptible Sí Sí Sí 250 kd Citotoxina Susceptible Sí ? Sí TABLA 2 Clasificación de algunos antimicrobianos por su riesgo de causar diarrea asociada a C. difficile Frecuente Cefalosporinas Amox-clavulánico Clindamicina Ocasional Penicilinas Eritromicina únicos, son los antimicrobianos que se eliminan por vía fecal y que no se absorben totalmente. En la tabla 2, ofrecemos una clasificación de antimicrobianos de acuerdo a su probabilidad de seleccionar C. difficile. Los más frecuentemente asociados son cefalosporinas, clindamicina, amoxicilina-ac. clavulánico. La toxina A tiene un mecanismo de acción complejo y no del todo aclarado. Una vez que se une a receptores en los enterocitos, penetra en su interior y los lesiona y destruye apareciendo una necrosis hemorrágica, una reacción inflamatoria e infiltración por neutrófilos. Se estimula el sistema nervioso entérico lo que origina hipersecreción y un aumento de peristaltismo. Los receptores son glucoproteínas cuya distribución por la luz colónica es irregular, lo que puede explicar la distribución no uniforme de las lesiones del colon. La toxina B o citotoxina despolimeriza la actina destruyendo el citoesqueleto celular y produciendo a su vez abalonamiento de las células. Se han descrito diez serogrupos distintos de C. difficile que se denominan con letras mayúsculas. La cirugía previa, la gravedad de las enfermedades de base, la presencia de cáncer, la edad avanzada y hasta el sexo femenino son factores que aumentan la incidencia de DACD y su gravedad. Manifestaciones clínicas Como hemos comentado, C. difficile puede ser sencillamente un saprofito. Su presencia es característica, por ejemplo, en Rara Tetracicilina Metronidazol Quinolonas Cotrimoxazol Aminoglucósidos Rifampicina más de un 50%-70% de la flora colónica de los neonatos sin que ello conlleve enfermedad. Se calcula que aproximadamente un 3% de los adultos sanos son portadores de esta bacteria en colon. Dicha cifra aumenta al 15% cuando se trata de enfermos hospitalizados sin diarrea y a un 25% en enfermos que han recibido antibióticos, incluso tras dosis únicas para profilaxis antimicrobiana. Por otra parte, C. difficile puede ser responsable de cuadros de gravedad clínica variable que oscilan desde una simple diarrea acuosa a un cuadro de megacolon tóxico. Existen unos criterios que deben cumplirse a la hora de atribuir un cuadro clínico de diarrea a C. difficile y que resumimos en la tabla 3. C. difficile es responsable de al menos un 20%-30% de los cuadros de diarrea asociada a antibióticos (DAA). Los casos restantes tienen con frecuencia una etiología desconocida. El lector no debe confundir ambas entidades ya que ello tiene implicaciones terapéuticas. Por ello ofrecemos algunas diferencias entre ellas en la tabla 4. La DAA responde siempre a la retirada de los mismos, y guarda una clara relación entre dosis e incidencia. Por el contrario, la DACD no guarda una clara relación entre dosis y duración del tratamiento antimicrobiano, precisa con frecuencia intervención con fármacos y puede ser grave. Los pacientes con DACD pueden tener fiebre, dolor abdominal y leucocitosis; la diarrea suele ser acuosa, profusa, verde-mucoide y ocasionalmente puede contener sangre. La colitis pseudomembranosa es una forma grave de la enfermedad y se caracteriza por lesiones irregulares en colon cuya demostración es endoscópica (figs. 2 y 3). Sólo un 20%-40% de los cuadros de DACD que revisten suficiente gravedad como para ser sometidos a endoscopia tienen pseudomembranas. En los restantes existe una reacción inflamatoria del colon que es inespecífica y que puede ocurrir en la diarrea simple asociada a antibióticos. Desde el punto de vista anatomopatológico, las pseudomembranas pueden tener hasta 2 cm de extensión y están formadas por mucina, fibrina, leucocitos y células necróticas. Inicialmente están aisladas y progresivamente pueden confluir. Epidemiología La DACD es, tradicionalmente, una entidad cuya distribución e incidencia es irregular. Existen entre 1 y 30 casos por cada 1.000 ingresos hospitalarios y puede comportarse como una enfermedad endémica o epidémica. En nuestra propia institución nos movemos alrededor de cifras de 5-8 casos por cada 1.000 ingresos, pero alcanzamos cifras próximas a los 30/1.000 ingresos entre los hospitalizados en la Unidad VIH. Aunque clásicamente se trata de una entidad de adquisición nosocomial existe evidencia de casos de adquisición comunitaria que pueden representar hasta el 4% de algunas series. También se ha demostrado que la DACD es más frecuente entre hospitalizados en la misma habitación que en casos índice, TABLA 3 Criterios diagnósticos de diarrea asociada a Clostridium difficile Diarrea caracterizada por la emisión de seis o más deposiciones líquidas o blandas en las 36 horas previas. Exclusión de otros agentes potencialmente causantes del cuadro de diarrea Detección de toxina de C. difficile por citotoxicidad sobre líneas celulares, tanto directamente a partir de muestras de heces como a partir de cepas de C. difficile aisladas de las mismas. Buena respuesta al tratamiento específico. La colitis pseudomembranosa está presente sólo en algunos casos. Su demostración requiere la práctica de colonoscopia y no simple recto-sigmoidoscopia 3423 © Idepsa 98 © ENFERMEDADES INFECCIOSAS (II) TABLA 4 Diferencias entre diarrea asociada a C. difficile (DACD) y diarrea asociada a antibióticos (DAA) DACD DAA Agente causal C. difficile + – Citotoxicidad + – Pseudomembranas + – Tratamiento específico + – y que se aíslan cepas de C. difficile tanto de los utensilios de la habitación del paciente como de las manos del personal que le atiende9. Los estudios de tipación molecular permiten afirmar que las cepas de un hospital pueden ser distintas o tratarse de las misma, dependiendo de las circunstancias endémicas o epidémicas de cada institución. Fig 2. Aspecto endoscópico del colon de un paciente con colitis pseudomembranosa. Cortesía del Servicio de Medicina del Aparato Digestivo, Hospital General Gregorio Marañón de Madrid. Fig 3. Imágenes macro y microscópicas del colon de una paciente fallecida con colitis pseudomembranosa. Cortesía del Departamento de Anatomía Patológica, Hospital General Gregorio Marañón de Madrid. Diagnóstico Para el diagnóstico clínico es imprescindible relacionar el cuadro diarreico con la administración concomitante o previa de antimicrobianos y excluir microbiológicamente otros enteropatógenos. C. difficile se cultiva en medios selectivos que contienen cicloserina, cefoxitina y fructosa. Previamente a la siembra se puede hacer un enriquecimiento térmico o con alcohol. Igualmente, es conveniente prerreducir las placas que se van a utilizar, ya que se obtiene un mayor rendimiento de recuperación de aislados. El principal inconveniente del cultivo de C. difficile en CCFA, a pesar de su alta sensibilidad, es su falta de especificidad, ya que en la placa crecen tanto las cepas toxigénicas como las no toxigénicas, con las mismas características morfológicas. Teniendo en cuenta que las cepas aisladas deben ser toxigénicas para poder implicarlas en la responsabilidad de los cuadros, para el diagnóstico microbiológico de la diarrea por C. difficile, la técnica de referencia es la demostración de la citotoxicidad (producida por la toxina B) en cultivos celulares de un filtrado de heces o de una cepa de C. difficile aislada de las mismas, y su posterior neutralización por antitoxina B de C. difficile o suero anti-C. sordellii. La figura 4 esquematiza la técnica de realización de la prueba de citotoxicidad en cultivo. La figura 5 muestra el aspecto de una línea celular de fibroblastos humanos normal y tras la acción de la toxina de C. difficile. En hospitales que no pueden disponer de la prueba de citotoxicidad o para situaciones que requieran diagnóstico inmediato, existen procedimientos alternativos para la demostración de la presencia de toxinas de C. difficile10,11. Existen técnicas como la aglutinación con látex, los enzimoinmunoensayos (EIA) para la detección de toxinas A y B y la demostración de la presencia de los genes que codifican dichas toxinas. En un trabajo reciente10, se comparan simultáneamente cuatro métodos de detección de toxina por EIA con la detección de citotoxicidad en 700 muestras. Estos métodos encuentran valores de sensibilidad que oscilan entre el 87% y el 98% y una especificidad del 96% al 99%. Los valores predictivos negativos oscilaron entre el 98% y el 99%. No obstante, los distintos “kits” dieron variaciones amplias en el valor predictivo positivo (64%-96%). 3424 © Idepsa 98 © Algunos laboratorios12,13 han desarrollado técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de los genes que codifican las toxinas de C. difficile con resultados inicialmente buenos. Faltan, sin embargo, estudios comparativos con otros procedimientos que permitan establecer el papel real de dichas técnicas en la práctica diagnóstica diaria 14. No es preciso recordar que el laboratorio de Microbiología debe realizar, además, el aislamiento y archivo de aislados de C. difficile toxigénicos, lo que permitirá el tipado de cepas en situaciones en las que epidemiológicamente se requiera y la posibilidad de hacer pruebas de sensibilidad antibiótica. Si bien, los procedimientos ideales para dicho tipado distan de estar establecidos15. Otro aspecto diagnóstico que merece un comentario es el de la demostración de pseudomembranas en intestino grueso. La realización de endoscopia debe reservarse para pacientes con un cuadro clínico grave en los que persistan dudas diagnósticas razonables. No debe olvidarse que si bien la demostración de pseudomembranas es, prácticamente patognomónica, su ausencia en absoluto excluye la DACD 16. Tratamiento En lo referente al tratamiento hay que mencionar que no está indicado en portadores asintomáticos 17. El control de la DACD requiere una serie de medidas generales y el uso de antimicrobianos. No insistiremos en las medidas generales de soporte como la rehidratación y la nutrición parenteral. Es necesario evitar el uso de agentes antiperistálticos y aislar al paciente con medidas de precaución entérica cuando sea posible18. Un porcentaje sustancial de los pacientes con cuadros menos graves responden exclusivamente a la retirada de antibióticos. En pacientes con cuadros más graves o persistentes es necesario, además, la administración de antimicrobianos capaces de eliminar a C. difficile de la luz intestinal. Los estudios de sensibilidad in vitro demuestran que los glucopéptidos (vancomicina, teicoplanina), metronidazol, ácido fusídico o bacitracina son los más activos19. El fármaco de elección es metronidazol, que se administra a razón de 250 mg cada 6-8 horas, 7-14 días. Es particularmente útil cuando no es posible ENFERMEDAD ASOCIADA A CLOSTRIDIUM DIFFICILE Pbs 1/40 + antitoxina te complejidad, está al alcance de todos los Servicios de Microbiología Clínica y su tratamiento contribuye sin duda a la disminución de una importante causa de morbilidad en enfermos hospitalizados. BIBLIOGRAFÍA Filtro Fig 4. Esquema de la técnica de realización de la prueba de citotoxicidad. utilizar la vía oral, ya que alcanza buenos niveles en la luz del colon tras la administración parenteral. Por su parte, vancomicina resulta igualmente eficaz para pacientes que pueden tolerar la administración oral, y su administración se hace a razón de 125 mg cada 6 horas durante 7 a 14 días20. No se ha demostrado que dosis superiores de vancomicina (250 mg cada 6 horas) tengan mayor efectividad21, y hay que tomar en consideración que el uso indiscriminado de vancomicina con carácter tópico en la luz intestinal puede favorecer el desarrollo de resistencias a la misma de algunos microorganismos como los del género Enterococcus22. Existe poca experiencia en el tratamiento de la DACD con otros glucopéptidos como teicoplanina. La existente demuestra una actividad semejante a la de vancomicina en dosis de 100 mg cada 12 horas por vía oral23. La experiencia con bacitracina, ácido fusídico y otros fármacos es escasa, pero en general los resultados son peores que los obtenidos con los medicamentos de referencia24. Un 10%-20% de los enfermos con DACD sufren una recaída en la que habitualmente no está claro si se trata de recidi- Fig 5. Línea normal de fibroblastos humanos. Efecto citotóxico por la presencia de toxina de C. difficile. vas o de reinfecciones. En general, suelen ser menos graves que el primer episodio y vuelven a responder a un nuevo ciclo de tratamiento antimicrobiano que en ese caso debe prolongarse entre una y seis semanas. Un subgrupo mínimo de pacientes, aproximadamente el 1%, sufren múltiples recaídas, lo que obliga a realizar un tratamiento más prolongado. En esos casos suele asociarse a vancomicina, rifampicina o metronidazol 20. En dichos pacientes, tras un ciclo de quince días con la asociación, puede hacerse un tratamiento de mantenimiento con colestiramina25 o recolonización con Lactobacillus o Saccharomyces boulardii26. En un estudio prospectivo, el uso profiláctico de S.boulardii concomitantemente con la utilización de b-lactámicos se asoció con una menor incidencia de diarrea asociada a antibióticos27. Esta levadura parece que produce una proteasa que impide la fijación de la toxina A a los receptores del colon. La mayoría de los casos con múltiples recaídas están causados por cepas distintas28, y son, por tanto, reinfecciones y no recaídas. Un pequeño número de pacientes, desarrollan megacolon tóxico y precisan intervención quirúrgica, generalmente resección subtotal del colon, lo cual se asocia a una elevada mortalidad 29. La mortalidad general asociada a DACD es baja14,30. Pese a la gravedad de las enfermedades de base y de la situación clínica de algunos enfermos, la DACD raramente tiene una evolución fatal. En resumen, nuestra intención ha sido llamar la atención sobre la frecuencia de enfermedad asociada a C. difficile como una causa importante de diarrea nosocomial. Su diagnóstico, pese a una aparen- 1. Finney JMT. Gastroenterostomy for cicatrizing ulcer of the pylorous. Bull Johns Hopkins Hosp 1893; 4: 53. 2. Hall IC, O´Toole E. Intestinal flora in newborn infants with description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficile. Am J Dis Child 1935; 49: 390. 3. 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