NGS en el estudio de predisposición genética al desarrollo de

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NGS en el estudio de predisposición genética al desarrollo de arritmias en
pacientes en tratamiento antipsicótico o antidepresivo.
Martinez-Matilla M1,2, Gil R1,2, Blanco-Verea A1,2, Tajes M3, Bermejo A4, Lucena J5, Sanz P6, Carracedo A1, Brion M1,2.
1Grupo
de Medicina Xenómica, Universidade de Santiago de Compostela. Fundación Pública Galega de Medicina Xenómica; 2Grupo de Medicina Xenómica, Instituto de Investigación Sanitaria, SERGAS. Red de investigación
Cardiovascular; 3 Servicio de Psiquiatría, Complexo Hospitalario Universitario de Santiago; 4Instituto de Ciencias Forenses, Universidade de Santiago de Compostela; 5 Servicio de Patología Forense, Instituto de Medicina Legal de
Sevilla; 6 Universidad Pablo Olavide, Sevilla
Introducción y objetivos
Muestra
Determinados medicamentos antipsicóticos y antidepresivos se asocian con
efectos adversos cardiovasculares que aumentan el riesgo de sufrir arritmias
ventriculares graves (Torsade de Pointes) y muerte súbita, incluso a dosis
terapéuticas (Ray et al. 2004). Estos eventos cardiacos pueden aparecer en
individuos aparentemente sanos que desarrollan trastornos arritmogénicos
inducidos por la exposición al fármaco (Behr et al, 2012, Scott et al, 2013). Se
han establecido marcadores que infieren el aumento de riesgo de
padecerlos, como el intervalo QT que es el más comúnmente utilizado. Una
prolongación del intervalo QT indicaría un mayor riesgo de sufrir Torsade de
Pointes y muerte súbita.
El objetivo principal del proyecto es evaluar la posible predisposición
genética al desarrollo de arritmias en dos grupos de individuos a tratamiento
antipsicótico o antidepresivo: pacientes recuperados de una arritmia
ventricular o con intervalo QT prolongado, e individuos fallecidos por muerte
súbita cardiaca.
Muestra
APs1
Gen
Cambio aminoacídico
CACNA2D1
KCNE2
APs3
APs4
c.T1166C:p.V389A
c.T170C:p.I57T
rs74315448
0.000233
D
FBN1
c.G1547A:p.R516Q
B
PKP2
c.A1460G:p.Q487R
c.C233T:p.T78M
rs72546668
0.004419
P
c.C2870G:p.T957S
rs193922380
0.001328
P
rs112084407
0.000931
B
FBN1
c.G6700A:p.V2234M
APs16
EYA4
c.C1087A:p.P363T
APs18
GLA
c.G427A:p.A143T
APs19
MYBPC3
c.A1814G:p.D605G
MYBPC3
c.G1321A:p.E441K
MYBPC3
c.G836C:p.G279A
Criterio de inclusión
H
41
Trastorno esquizoafectivo
Nordiazepam 0,03 mg/L. Quetiapina y su
metabolito.
Tratamiento previo conocido
APs3
H
43
Trastorno bipolar, obesidad mórbida
Hidroclorotiazida, Lorazepam
Tratamiento previo conocido
APs4
M
28
APs5
M
40
APs10
M
27
M
48
Biperideno, Loprazolam,
Haloperidol, Ziprasidona y
Lorazepam. Esquizofrenia
Obesidad, EPOC, síndrome ansioso
depresivo, asma
Depresión. Asma alérgico
persistente
Psicofármacos,antidepresivos y
tranquilizantes mayores. Síndrome
ansioso depresivo
Esquizofrenia.
Akineton,Zyprexa,Haloperidol,
Sinogan,Dormodor,Tranxilium
Tratamiento para la depresión.
Escitalopram
APs13
H
43
APs14
M
60
APs16
H
43
Esquizofrenia. Neurolépticos y
ansiolíticos
APs18
H
54
Tranxilium,haloperidol
APs19
H
48
Esquizofrenia
APs20
H
33
Esquizofrenia. Potomania,
hiponatremia
Tratamiento previo conocido
Etanol, benzodiacepinas opiáceos,
metadona
Tratamiento previo conocido
Loracepam 0,48ug/ml, etanol 0,56g/l
Tratamiento previo conocido
Venlafaxina0,08ug/ml
Tratamiento previo conocido; análisis
toxicológico
Metadona:0,24ug/ml,
nordiazepan0,103ug/ml
Tratamiento previo conocido
Tratamiento previo conocido
Ac.valproico
Nordiazepam: 0,39ug/ml,
oxazepam:0,21ug/ml, gabapentina
diazepam:0,022ug/ml,
olanzapina:0,214ug/ml
Olanzapina:0,027ug/ml
Tabla 1. Datos de las muestras seleccionadas para el estudio y razón por la que se incluyeron.
Tratamiento previo conocido
Tratamiento previo conocido
Tratamiento previo conocido; análisis
toxicológico
Tratamiento previo conocido; análisis
toxicológico
Metodología
Un total de 12 muestras han sido analizadas (Tabla 1): 11 casos recogidos en los Institutos
de Medicina Legal de Galicia y Sevilla de individuos bajo tratamiento con antidepresivos
y/o antipsicóticos que fallecieron de muerte súbita –todos ellos con concentraciones
terapéuticas de los medicamentos en sangre- y un caso de una paciente recuperada de
una arritmia ventricular grave, con un patrón de Síndrome de Brugada inducido por un
medicamento hasta ahora no asociado con este patrón arritmogénico.
c.A57344G:p.Y19115C
APs12
Análisis toxicológico
D
P
MYBPC3
Tratamiento previo conocido
APs1
APs12
Polyphen2
c.G3947A:p.G1316E
CAV3
APs20
ESP6500_ EA1
FBN1
TTN
APs5
rs dbSNP137
Sexo Edad
P
rs104894845
0.001338
B
0.000120
B
rs193922377
0.000236
P
MYLK2
c.C260T:p.A87V
rs121908107
0.000117
P
MYLK2
c.C284A:p.A95E
rs121908108
0.000117
D
El estudio se está llevando a cabo en la plataforma de Next-Generation Sequencing
(NGS) 5500 SOLiDTM System (Life Technologies) utilizando el sistema SureSelect Custom
Target Enrichment System kit (Agilent Technologies). Se secuenció un panel 500K de genes
asociados a muerte súbita cardiaca para buscar variantes genéticas raras que puedan
relacionarse con una mayor predisposición a sufrir arritmias. Las 7 primeras se incluyeron
en un panel diseñado con 81 genes, mientras que las 5 siguientes se incluyeron en un
panel actualizado con un total de 86 genes. Las variantes fueron identificadas mediante
GATK version 2.1 (Genome Analysis Toolkit, Broad Institute, Cambridge, MA, USA), Picard
tools version 1.77 y LifeScope version 2.5.1 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). La
anotación fue realizada mediante ANNOVAR version 2012Mar08.
Tabla 2. Variantes genéticas priorizadas. 1ESP: Exome Sequencing Project, población americana de origen europeo.
2Polyphen: B: Benigna, P: Probablemente dañina, D: Dañina.
Resultados
A
Tal y como se muestra en la tabla 3, los resultados de ambos paneles de secuenciación fueron
muy satisfactorios y robustos, con solamente un 0.39% de media de la secuencia blanco no
cubierta. La cobertura media por muestras superó con creces los estándares de calidad
mínimos, con una cobertura media de 400X y más de un 98% de la secuencia blanco cubierta
al menos 20X.
Tamaño de la
% lecturas en
región blanco
el blanco
(bp)
T78M
% del blanco no
cubierto
% del blanco
cubierto 1X
% del blanco
cubierto 5X
% del blanco
cubierto 10X
% del blanco
cubierto 20X
Cobertura media
del blanco
425364
0.47% (2011 bp)
99,53%
99,18%
98,82%
98,19%
227,35
72,01%
425364
0.36% (1530 bp)
99,64%
99,30%
99,08%
98,76%
446,46
500K Vs.1
67,29%
425364
0.29% (1216 bp)
99,71%
99,50%
99,19%
97,57%
247,61
APs5
500K Vs.1
77,93%
425364
0.38% (1603 bp)
99,62%
99,30%
99,08%
98,69%
498,28
APs10
500K Vs.1
73,41%
425364
0.53% (2268 bp)
99,47%
99,02%
98,18%
94,85%
121,38
APs12
500K Vs.1
77,63%
425364
0.4% (1682 bp)
99,60%
99,35%
99,12%
98,81%
379,21
APs13
500K Vs.1
76,67%
425364
0.38% (1631 bp)
99,62%
99,35%
99,19%
98,79%
456,46
Aps14
500K Vs.2
78,09%
458707
0.56% (2564 bp)
99,44%
99,14%
98,97%
98,62%
710,46
APs16
500K Vs.2
77,62%
458707
0.39% (1799 bp)
99,61%
99,43%
99,29%
99,01%
503,04
APs18
500K Vs.2
70,67%
458707
0.34% (1549 bp)
99,66%
99,52%
99,42%
99,23%
289
APs19
500K Vs.2
60,05%
458707
0.27% (1240 bp)
99,73%
99,57%
99,48%
99,34%
386,77
APs20
500K Vs.2
72,16%
458707
0.33% (1514 bp)
99,67%
99,42%
99,26%
99,06%
535,6
PROMEDIO
71,08%
439256,92
0,39%
99,61%
99,34%
99,09%
98,41%
400,135
Muestra
Panel
APs1
500K Vs.1
49,44%
APs3
500K Vs.1
APs4
B
Tabla 3. Resultados de cobertura obtenidos con la plataforma 5500 SOLiDTM System (Life Technologies).
Figura 1. A. Confirmación de la variante rs72546668 en el gen CAV3 de la muestra APs5. 1A. Electroferograma en
el que se muestra la mutación en heterocigosis. Se observa la lectura del alelo C ,de referencia y T, mutado,
produciéndose un cambio de aminoácido de Treonina (ACG) a Metionina (ATG). B. Imagen de la misma mutación
con el visor genómico IGV en la que se ve el alineamiento de las sondas en esa región y el número de lecturas de
cada alelo para la posición.
Tras la priorización de variantes detectadas en cada muestra siguiendo protocolos previamente establecidos (Hoischen et al. 2011), se encontró un total de 16 variantes no
sinónimas en regiones codificantes en 9 de ellas (Tabla 2). 8 de las variantes resultaron ser mutaciones hasta la fecha no descritas en la bibliografía ni presentes en las bases
de datos consultadas, mientras que las 8 restantes están catalogadas en dbSNP137, con frecuencias inferiores a 0.0005 y hasta ahora no han sido asociadas a ninguna
patología.
Además de estas variantes raras, dos polimorfismos previamente asociados a incremento de riesgo de Síndrome de QT largo y Síndrome de Brugada se ven representados
en nuestras muestras con una frecuencia superior a la de la población general, a pesar de las pocas muestras analizadas: K897T (rs1805123) en KCNH2 (gen que codifica el
canal de potasio dependiente de voltaje), se encuentra en un 58,33% del total de muestras analizadas, con respecto al 23,26% descrito en población general; H558R
(rs1805124) en SCN5A (gen que codifica el canal de sodio dependiente de voltaje) aparece con una frecuencia de 41,67%, casi el doble de la frecuencia descrita en
población general, de un 23,21%.
Las posibles variantes patogénicas fueron confirmadas por secuenciación convencional (Figura 1) y valoradas mediante herramientas "in silico“. Su presencia se evaluó en
bases de datos específicas de locus (LSDB) y en el Exome Sequencing Project (ESP).
Conclusiones
Referencias
La principal limitación del estudio es la dificultad para obtener muestras
(tanto forenses como clínicas) que cumplan los criterios de inclusión. A
pesar de ello, los primeros resultados obtenidos en el estudio parecen
indicar que los genes asociados a trastornos arritmogénicos son buenos
candidatos para la búsqueda de variantes raras que expliquen la
predisposición a sufrir arritmias o muerte súbita en ciertos individuos en
presencia de fármacos antidepresivos y antipsicóticos.
Ray et al. (2004) Cyclic antidepressants and the risk of sudden cardiac death. Clin Pharmacol Ther ;75:234
Asimismo, a la vista de los datos de cobertura y confirmación de variantes
resultantes de la secuenciación, se confirma que la tecnología de
secuenciación empleada es muy robusta y adecuada para este tipo de
estudios.
Behr et al. (2012) Drug-induced arrhythmia: pharmacogenomic prescribing? Eur Heart J. 34(2) 89-95
Scott et al, (2013) QTc prolongation, torsades de pointes, and psychotropic medications. Psychosomatics
54:1-13
Hoischen et al. (2011) De novo nonsense mutations in ASXL1 cause Bohring-Opitz syndrome. Nat Genet
43(8):729-731
Agradecimientos
Fondo de Investigación Sanitaria (FIS. PI10/00851 and PI11/01081) , Red de Investigación Cooperativa de las
Enfermedades Cardiovasculares y Fundación Botin.
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