Comparaci ón entre novillas y vacas como donantes de ovocitos para la producci ón in vitro de embriones Dpto. de Reproduccion Animal Y Conservación de Recursos Zoogenéticos INIA - Madrid Índice • • • • • Introducci ón Materiales y m étodos Diseño Experimental Resultados Conclusi ón Adaptado de Rizos, 2007 Introducci ón 1 La calidad del ovocito es el factor que mas afecta al rendimiento de blastocistos. (Rizos et al., 2002, 2003) La calidad del ovocito está afectada por: Estado fisiológico y reproductivo de la donante Tamaño folicular Amplitud e integridad de las células del cúmulo (Lonergan et al., 1994; Fair et al., 1995; Leibfried-Rutledge, 1999; Armstrong, 2001, Boland et al., 2001) Los ovarios de vacas proporcionan menos ovocitos que los de novillas. (Zhang et al., 1991; Moreno et al., 1992; Mermillod et al., 1992). Adaptado de Rizos, 2007 Introducci ón 2 Los ovocitos de vacas producen mas embriones que los de las novillas. (Galli et al., 2003) En OPU durante 4 años: novillas (n=2.143 sesiones) vacas (n=2.641 sesiones) El número de embriones congelables y transferibles es el doble: vacas (2.5 embriones por sesión) novillas (1.4 embriones por sesión) (Galli et al., 2003) Adaptado de Rizos, 2007 Material y M étodos Recuperaci ón ecográfica: Ø Mediante punción folicular usando una sonda ecográfica transvaginal (OPU) en animales vivos (Experimento 1). Adaptado de Rizos, 2007 Experimento 1: Diseño Experimental • 8 novillas (19-21 meses) • 8 vacas (3-5 años; 30-40 días post parto) • OPU 2 veces/semana (5 semanas) Parámetros medi da/animal: • El tamaño de distribución de los folículos aspirados • Número y calidad de los ovocitos recogidos Producción In vitro de embriones/por grupo experimental de animales: • Solo son usados los ovocitos de grado 1y 2 para IVM/IVF/IVC Parámetros medi dos por grupo experi mental de animales : • Tasa de división a las 48 h post inseminación • Producción blastocistos los días 6, 7 y 8 Adaptado de Rizos, 2007 Experimento 1: Resultados Tabla 1. Distribución de tamaños foliculares en las novillas y vacas lactantes post-parto . Tipo de Animal Numero Medio de Folículos Aspirados por Animal 2-4 mm 5-7 mm 8-10mm >10mm Novillas 5.9 3.2 1.1 0.3 Vacas 4.0 2.3 1.0 0.4 SCI 1.8±1.6 0.8±0.9 0.06±0.5 0.08±0.3 Significación (P) < 0.05 NS NS NS Nueve replicas; SCI: intervalos simultáneos de confianza (Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949) Tabla 2. Número de folículos aspirados y morfología de los ovocitos en novillas y vacas Frisonas lactantes post-parto. No. de folículos aspirados/ animal No. de ovocitos recuperados/ animal Novillas 10.4 4.7 3.0 1.6 Vacas 7.8 2.8 1.8 0.9 SCI 2.6±2.5 1.9±1.8 1.2±1.0 0.7±0.7 Significación (P) < 0.001 < 0.001 < 0.05 <0.05 Tipo de Animal Nueve replicas; SCI: intervalos simultáneos de confianza (Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949) Numero de Ovocitos Grado 1-2 Grado 3-4 recuperados/ recuperados/ animal animal Tabla 3. Capacidad de desarrollo después de maduración, fecundación y cultivo in vitro en novillas y vacas lactantes post-parto Tipo de Animal No. ovocitos Divididos (%) Blastocistos Obtenidos (%) Día 6 Día 7 Día 8 Novillas 129 45.7 7.8 12.4 12.4 Vacas 74 48.7 5.4 8.1 8.11 0.928 0.399 0.188 0.188 Significación (P) Cinco replicas (Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949) Experimento 2: Diseño experimental • 205 ovarios de novillas (menos de 30 meses) • 169 ovarios de vacas (4 años) • Aspiración manual Parámetros medi dos/ por ovario: • Número de fol ículos aspirados • Número y calidad de ovoci tos recogidos Producción In vitro de embriones por grupo experi mental de animales: • Solo son usados los ovocitos de grado 1y 2 para IVM/IVF/IVC Parámetros medi dos/por grupo experimental de animales : • Tasa de división a las 48 h post inseminación • Producción de blastocistos a los Días 6, 7 y 8 Adaptado de Rizos, 2007 Tabla 4. Número de folículos aspirados y morfología de los ovocitos en novillas y vacas cruzadas . No. de ovarios No. de folículos aspirados/ovario Novillas 409 14.5 3.6 2.4 Vacas 337 16.4 3.8 2.4 -1.85±3.77 -0.19±1.79 0.09±1.83 NS NS NS Tipo de Animal SCI Significación (P) Ocho replicas; SCI: intervalos simultáneos de confianza (Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949) Numero de Ovocitos Grado 1-2 Grado 3-4 recuperados/ recuperados/ ovario ovario Tabla 5. Capacidad de desarrollo de los ovocitos después de la maduración, fecundación y cultivo in vitro en novillas y vacas cruzadas. Tipo Animal No. ovocitos Divididos (%) Blastocistos Obtenidos (%) Día 6 Día 7 Día 8 Novillas 1241 79.9 15.2 29.0 33.4 Vacas 1125 80.8 20.7 42.6 46.5 0.819 0.333 0.005 0.007 Significación (P) Ocho replicas (Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949) Experimento 3: Diseño experimental • ovarios de novillas • 12-18 meses • 19-24 meses • 25-30 meses • ovarios de vacas ( 4 años ) • Aspiración manual Producción In vitro de embriones por grupo experi mental de animales: • Solo son usados los ovocitos de grado 1y 2 para IVM/IVF/IVC Parámetros medi dos/por grupo experimental de animales : • Tasa de división a las 48 h post inseminación • Producción de blastocistos a los Días 6, 7 y 8 Adaptado de Rizos, 2007 Tabla 6. Efecto de la edad de la novilla sobre la capacidad de desarrollo después de la FIV. Tipo de Animal No. ovocitos Divididos (%) Blastocistos Obtenidos (%) Día 6 Día 7 Día 8 Novillas (12-18 m) 708 84.9ab 15.4 32.3ab 35.0a Novillas (19-24 m) 804 81.2a 14.2 30.9a 35.2a Novillas (25-30 m) 682 78.5a 15.5 32.0ab 36.5a Vacas 588 86.7b 15.8 41.0b 48.3b 0.055 0.822 0.12 0.028 Significación (P) Seis replicas a, b Valores en la misma co lumna con diferente superíndices difieren significativamente (P<0.05). (Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949) Experimento 4: Diseño experimental • Ovarios de novillas (menos de 30 meses) • Ovarios de vacas ( 4 años) • Aspiración manual Producción In vitro de embriones por grupo experi mental de animales: • Solo son usados los ovocitos de grado 1y 2 para IVM/IVF/IVC Parámetros medi dos/por grupo experimental de animales : • Tasa de división a las 48 h post inseminación • Producción de blastocistos a los Días 6, 7 y 8 Adaptado de Rizos, 2007 Ligadura del oviducto para evitar la pérdida de ovocitos Transferencia cigotos al oviducto de oveja por la fimbria Recuperación embriones mediante lavado de la fimbria del oviducto Catéter para la transferencia de cigotos Catéter para la recolección de embriones o o mediante disección del oviducto y lavado en el laboratorio Disección de oviducto Adaptado de Rizos, 2007 Tabla 7. tasa de desarrollo de ovocitos de ovarios de matadero de novillas y vacas, cultivados in vitro o in vivo en oviductos de oveja. Origen de los Ovocitos No. Transferidos No. Obtenidos n (%) Blastocistos Obtenidos (%) Día 7 Día 8 Novillas 930 564 (60.6) 20.4 25.2 Vacas 686 367 (53.5) 45.0 53.1 0.552 0.004 0.001 Significación (P) Tres replicas (Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949) Conclusiones • Las vacas lactantes durante el post-parto temprano presentan menos folículos en sus ovarios que las novillas, lo cual origina una menor recuperación de ovocitos de buena calidad por animal sometido a la OPU. • Independientemente del origen (vacas o novillas) los ovocitos de calidad similar presentan una capacidad de desarrollo igualmente similar. Hay diferencias en la capacidad de desarrollo de los ovocitos obtenidos de vacas y novillas considerando la edad, el metabolismo, el manejo y otros factores. Adaptado de Rizos, 2007