M-026 - Universidad Nacional del Nordeste

Resumen: M-026
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
Efecto de la pérdida aguda de volumen sanguíneo sobre la respuesta
granulopoyetica producida por la administración de filgrastim
en murinos tratados con ciclofosfamida
Enacan, Rosa E. - Abraham, Raisa M. - Berecoechea, Carlos S. - Poletti, Oscar H. - Barrios, Lilian
Cátedra Nº 1 de Fisiología Humana. Departamento de Ciencias Básicas. Facultad de Medicina de la UNNE.
Moreno 1240 - CP:3400 Corrientes. Argentina.- lbarrios@med.unne.edu.ar TE: 54- 3783 - 421355
ANTECEDENTES
La hemorragia es una complicación que se presenta con relativa frecuencia en pacientes oncológicos (1,2). La
neutropenia, por otro lado, es un efecto adverso frecuente de los regimenes terapéuticos que usan dosis crecientes de
drogas quimioterápicas aplicados a los pacientes con cáncer, debido a la mielosupresión que producen estas drogas
(3) – En los últimos años, se han presentado múltiples datos acerca del uso beneficioso de citoquinas que protegen o
restauran el sistema hematopoyético de mamíferos del efecto de la irradiación y drogas antineoplásicas (4). Así, el
filgrastim (factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante humano), eleva el número de neutrófilos
circulantes de pacientes y animales de experimentación tratados con quimioterápicos (5,6). Sin embargo, existe poco
conocimiento acerca de la capacidad de los sistemas hemopoyéticos afectados por el efecto depresor de las drogas
antineoplásicas de responder a la simultánea estimulación producida por la administración de filgrastim para
estimular el aumento de neutrófilos circulantes en un paciente que esta padeciendo una importante neutropenia y que
a la vez, sufre una pérdida sanguínea (estímulo para el aumento de una línea celular sanguínea distinta a la estimulada
por el filgrastim .
El motivo del presente trabajo fue estudiar la capacidad del sistema hemopoyetico de responder a la administración
diaria de filgrastim en ratones tratados al inicio del experimento con la droga quimioterápica ciclofosfamida y que han
padecido la sangría de aproximadamente el 10 % de su volemia en los dos días siguientes a la administración de la
droga antineoplásica.
MATERIAL Y METODOS
Animales: se usaron ratones hembras CF1 de 3 meses de edad con 20 a 25 g de peso corporal.
Ciclofosfamida (Cy): (Endoxan - Asta, LABINCA) La droga se administró a todos los animales de acuerdo al
siguiente esquema: 100mg/Kg de ciclofosfamida disuelta en agua destilada apirógena, vía ip, el día
0 del
experimento.
Filgrastim (Factor
estimulante de colonias de granulocitos recombinante humano: G-CSF): . Laboratorios
ROCHE: 5 viales conteniendo cada uno: 30 millones de unidades = 300 µg de G-CSF. Antes de las inyecciones, la
solución que contiene el filgrastim fue diluida con buffer salino de fosfato, pH 7.4, (PBS) conteniendo 0,1 % de
albúmina bovina sérica.
Esquema de tratamiento:
A todos los animales se les administró 100 mg/kg de ciclofosfamida por vía intraperitoneal el día 0 del experimento y
se le produjeron sangrías mediante dos extracciones iguales de 100 ul de sangre de la vena de la cola realizadas en los
días 1 y 3 del experimento. A los lotes problema se les administró 20 µg/kg/día vía sc de filgrastim y a los lotes de
animales control una dosis equivalente de la solución diluyente del filgrastim desde el día 4 y hasta el día 20, día final
del experimento. Lotes de 6-8 animales se sacrificaran a los 0 ,4, 8,12, 16 y 20 días a partir del inicio del
experimento.
Se determinaron:
Método de cultivo para la determinación de células progenitoras:
Células nucleadas de médula ósea y bazo de los distintos lotes de animales se suspendieron en alfa medio suplementado
con albúmina sérica; suero bovino fetal; lecitina, ácido linoléico y araquidónico, colesterol, transferrina saturada
humana, selenito sódico, 2 - mercaptoetanol; penicilina - estreptomicina, insulina, hidrocortisona y methylcelulosa.
La cantidad de células fue de una concentración final de 5 x 104 /ml de medio de cultivo para estudio de GM- CFU
(Unidades formadoras de colonias de granulocitos – macrófagos) medulares y de 2 x 105 para GM – CFU esplénicas
usándose como estimulante una concentración final de 20 % de medio condicionante de bazo de ratón (preparado en
nuestro laboratorio). 0,5 ml de suspensión final se colocó en placas de 26 cavidades, y se dejó permanecer 7 días en
estufa de cultivo con control electrónico de temperatura a 37º C y atmósfera húmeda de 5 % de CO2 (Cole Parmer
Instruments). Las colonias fueron contadas en microscopio invertido Nikon. Se consideraron colonias derivadas de
GM-CFU a colonias mayores de 8 células claras y redondeadas. Las colonias se contaron a los 8 días de cultivo.
Contajes celulares: los leucocitos periféricos/mm3 se contaron en hemocitómetro de Neubauer, mediante extracción de
300al de sangre por punción cardiaca. Las células de médula ósea femoral y de bazo fueron procesadas con
homogenador de vidrio y contadas en hemocitómetro standard.
Morfología celular: fue evaluada en sangre periférica, médula ósea y bazo mediante frotis teñidos con May GrünwaldGiemsa.
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Análisis estadístico: se realizó en el Software Instat (Graph Pad). Los datos fueron analizarán mediante una vía de
análisis de varianza (ANOVA) y el Test de comparaciones múltiples de Student - Neuman - Keuls. Los datos se
expresan como promedio ± un error standard y se considera significativa una p < .05.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La administración diaria de 20 ug/kg/día de filgrastim desde del día 4 hasta el día 20 del experimento a los
animales inyectado con ciclofosfamida el día 0 y con sangría aguda posterior, fue capaz de producir un aumento
significativo del número de neutrófilos circulantes desde el día 8 y hasta el final del experimento (Fig. 1) a la vez que el
valor de hematocrito que había disminuido por efecto de la ciclofosfamida y la sangría producida, retorna a valores
normales a partir del día 12 y hasta el final del experimento (Tabla 1) . Estos resultados indican que el sistema
hemopoyético de estos animales es capaz de responder al estímulo simultáneo de dos líneas celulares sanguíneas
diferentes a pesar de los efectos mielodepresores de la droga quimioterápica administrada inicialmente
Fig. 1: Cambios en el número absoluto de neutrófilos
circulantes. A todos los ratones se les administró 100
mg/kg de ciclofosfamida el día 0 y se les extrajeron 100
µL de sangre los días 1 y 3 del experimento. Filgrastim
fue administrado en dosis de 20 ug/kg /día desde el día 4
hasta el día 20 (barras grises : Cy + Sangría +
Filgrastim)). Los animales control (barras blancas: Cy +
Sangría Control ) recibieron PBS. Las barras representan
el valor promedio ± 1 Error Standard. (***) indica
diferencia significativa entre los Cy +Sangría + Filgrastim
y Cy + Sangría -Control : p< .001.
Tabla 1: % de hematocrito en ratones a los que se les administró 100 mg/kg de ciclofosfamida el día 0 y se les
extrajeron 100 µL de sangre los días 1 y 3 del experimento .Filgrastim fue administrado en dosis de 20 ug/kg /día
desde el día 4 hasta el día 20 (Cy + Sangría + Filgrastim). Animales control (Cy + Sangría Control) recibieron PBS.
Los resultados representan el valor promedio ± 1 Error Standard.
Día
0
4
8
12
16
20
Cy + Sangría Control
41.6 ± 0.5
31,0 ± 0,7
35,0 ± 0,5
42,5 ± 0,8
39,1 ± 0,7
43,9 ± 1,0
Cy +Sangría + Filgrastim
41.6 ± 0.5
32,2 ± 0,4
35,1 ± 0,8
41,1 ± 1,0
42,2 ± 1,1
40,2 ± 0,9
Como se observa en Fig. 2 , luego de la administración de 100 mg/kg de ciclofosfamida y sangría aguda de
aproximadamente el 10 % del peso corporal , los lotes de ratones tratados con filgrastim no muestran el efecto
estimulante sobre la población precursora granulocítica medular que normalmente produce este factor de crecimiento
(8), lo que sugiere que el mecanismo granulopoyético femoral esta alterado, al menos temporariamente en estos
animales aunque el aumento del número de neutrófilos observado puede involucrar un acortamiento del tiempo de
maduración de estas células mas que un aumento en el número de estas células precursoras.
Fig. 2: Cambios en el número de células granulocíticas
femorales x 106.. A todos los ratones se les administró 100
mg/kg de ciclofosfamida el día 0 y se les extrajeron 100
µL de sangre los días 1 y 3 del experimento. Filgrastim
fue administrado en dosis de 20 ug/kg /día desde el día 4
hasta el día 20 (barras grises : Cy + Sangría +
Filgrastim)). Los animales control (barras blancas: Cy +
Sangría Control ) recibieron PBS. Las barras representan
el valor promedio ± 1 Error Standard.
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Sin embargo, en el bazo (Fig. 3 ) la administración de filgrastim a ratones tratados con ciclofosfamida y que
han padecido una sangría aguda generó un microambiente esplénico favorable a la granulopoyesis observándose un
incremento significativo del número de precursores granulocíticos , desde el día 12 y hasta el final del experimento.
Este efecto del filgrastim aumentando la granulopoyesis esplénica ya fue observado previamente en animales
normales (8) e indica migración de progenitores granulopoyéticos tempranos de la médula ósea femoral al bazo.
Esta incrementada granulopoyesis esplénica observada contribuye al aumento de neutrófilos circulantes observado.
Fig. 3: Cambios en el número de células granulocíticas
esplénicas x 106. Cambios en el número de células
granulocíticas femorales x 106.. A todos los ratones se les
administró 100 mg/kg de ciclofosfamida el día 0 y se les
extrajeron 100 µL de sangre los días 1 y 3 del
experimento. Filgrastim fue administrado en dosis de 20
ug/kg /día desde el día 4 hasta el día 20 (barras grises : Cy
+ Sangría + Filgrastim). Los animales control (barras
blancas: Cy + Sangría Control) recibieron PBS. Las
barras representan el valor promedio ± 1 Error Standard.
(** ; * ) indican diferencia significativa entre los Cy
+Sangría + Filgrastim y Cy + Sangría -Control : p< .01
y p< .05.
La población de GM-CFU de médula ósea de los animales que luego de ser inyectados con ciclofosfamida,
fueron sangrados y posteriormente tratados diariamente con filgrastim
muestra un comportamiento bifásico,
comparada con el lote control. Luego de un aumento significativo el día 8 estas células progenitoras disminuyen su
número entre los días 12 y 16 alcanzando valores similares al lote control el día 20 del experimento. (Fig 4). La
disminución observada podría ser compatible con migración de dichas células al bazo, ya que la administración
conjunta de ciclofosfamida con filgrastim constituye uno de los estímulos más importantes (7) para la movilización de
células medulares inmaduras hacia la sangre circulante y eventualmente hacia el bazo.
Fig 4: Cambios en el número de GM-CFU (Unidades de
colonias de granulocitos – macrófagos ) de médula ósea x
106. A todos los ratones se les administró 100 mg/kg de
ciclofosfamida el día 0 y se les extrajeron 100 µL de
sangre los días 1 y 3 del experimento. Filgrastim fue
administrado en dosis de 20 ug/kg /día desde el día 4
hasta el día 20 (barras grises : Cy + Sangría +
Filgrastim)). Animales control (barras blancas: Cy +
Sangría Control ) recibieron PBS. Las barras representan
el valor promedio ± 1 Error Standard. (*** ) indica
diferencia significativa entre los lotes Cy +Sangría +
Filgrastim y Cy + Sangría -Control : p< .001.
En el bazo (Fig.5 ), los cambios en el número de GM-CFU de los animales que, luego de recibir la inyección
de ciclofosfamida fueron sangrados y posteriormente tratados con filgrastim, muestran un comportamiento diferente
al observado en la médula ósea. Comparado con el lote control, salvo en día 8, la población de GM-CFU esplénica
aumento significativamente en todos los días estudiados. Esto indicaría que la administración de ciclofosfamida y
posterior sangría y tratamiento con filgrastim, ha generado un microambiente favorable para la granulopoyesis en un
órgano que en ratones normales contribuye ínfimamente al número de neutrófilos circulantes
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Fig. 5: Cambios en el número absoluto de la población
de GM-CFU (Unidades de colonias de granulocitos –
macrófagos ) de bazo x 106. A todos los ratones se les
administró 100 mg/kg de ciclofosfamida el día 0 y se les
extrajeron 100 µL de sangre los días 1 y 3 del
experimento. Filgrastim fue administrado en dosis de 20
ug/kg /día desde el día 4 hasta el día 20 (barras grises : Cy
+ Sangría + Filgrastim)). Los animales control (barras
blancas: Cy + Sangría Control ) recibieron PBS. Las
barras representan el valor promedio ± 1 Error Standard.
(*** ; * ) indican diferencia significativa entre los Cy
+Sangría + Filgrastim y Cy + Sangría -Control : p<
.001. y p< .05.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos sugieren que ni el efecto depresor hemopoyético de la ciclofosfamida , ni el nivel de
estímulo de eritropoyesis generado por la sangría producida en el animal interfieren con la estimulación de la línea
granulocítica producida por la administración de filgrastim. Ello podría deberse a que el número de células
progenitoras hemopoyéticas comunes a ambas líneas es suficiente para atender la demanda en estas condiciones
experimentales. Esta hipótesis es refrendada por el hecho de que el valor de hematocrito de los animales que
disminuyó por efecto de la ciclofosfamida y la sangría , retorna a valores similares al del animal normal, tanto en el lote
control, como en los animales que recibieron la administración de filgrastim. Sin embargo, estos resultados no
descartan que ante estímulos simultáneos más intensos, no pueda producirse una competencia por células ancestrales
comunes, con mutua inhibición de ambas líneas, como fuera informado previamente por otros autores (9) .
BIBLIOGRAFÍA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Wasif Saif M, Moody JS, Russo SM. Gastrointestinal bleeding associated with concurrent capecitabine and
radiotherapy in patients with pancreatic cancer. JOP. 2005, 6:325-33.
Koutras AK, Makatsoris T, Paliogianni F, Kopsida G, Onyenadum A, Gogos CA, Mouzaki A, Kalofonos
HP.Oxaliplatin-induced acute-onset thrombocytopenia, hemorrhage and hemolysis. Oncology. 2004;67:179-82.
Hurria A, Brogan K, Panageas KS, Jakubowski A, Zauderer M, Pearce C, L, Howard J, Hudis C. Change in cycle 1
to cycle 2 haematological counts predicts toxicity in older patients with breast cancer receiving adjuvant. Drugs
Aging. 2005;22:709-15.
Lyman GH. Guidelines of the National Comprehensive Cancer Network on the Use of Myeloid Growth Factors
with Cancer Chemotherapy: A Review of the Evidence. J Natl Compr Canc Netw. 2005 , 3:557-571.
Douglas W. Blayney, Brian W. McGuire, Scott E. Cruickshank, David H. Johnson. Increasing Chemotherapy Dose
Density and Intensity: Phase I Trials in Non-Small Cell Lung Cancer and Non-Hodgkin’s Lymphoma. The
Oncologist, 2005; 10: 138-149
Barrios L, Poletti OH, Agustini MI. The influence of recombinant human granulocyte colony – stimulating factor
on granulopoiesis in mice recovering from cyclophosphamide treatment. Methods Find Exp Cli Pharmacol 2000,
22: 275- 280.
De Pasquale MD, Cacchione A, Foco M, Gozzer M, Libera F, Soscia F, Ragni G, Cappelli C. Peripheral blood
stem cell collection in paediatric malignancies: between three mobilizing regimens] Clin Ter. 2003 ;154:305-9
Barrios, L Agustini MI, Poletti OH, Juaristi J, Brandan NC. Effects of recombinant human granulocyte colony
stimulating factor (rhG-CSF) on murine bone marrow and spleen erythropoiesis. APPTLA 1998, 48: 18-24.
de Haan G, Engel, C, Dontje B, Nijhof W, Loeffler M. Mutual inhibition of murine erythropoiesis and
granulopoiesis during combined erythropoietin, granulocyte colony – stimulating factor, and stem cell factor
administration: in vivo interactions. Blood 1994; 84: 4157-4163