ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Trabajo práctico de Espectroscopía de Fluorescencia
BIOFISICA 2016
ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Para realizar los trabajos experimentales de Biofísica, se contará con los
reactivos, soluciones y materiales que se detallan a continuación. En cada
teórico práctico se discutirá y diseñará el protocolo a seguir para cada sesión
de prácticos.
MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS:
Guardapolvo y elementos de seguridad, rotuladores indelebles, calculadora y
pen drive.
CONSIDERACIONES GENERALES:
1. Calibraciones para utilizar el espectrofluorómetro:
Para la calibración del espectrofluorómetro se utilizará como patrón SULFATO de
QUININA 0.1 ppm, los valores a utilizar dependerán de cada experimento.
De acuerdo al cronograma de experimentos, será necesario calibrar MAS de UNA
VEZ durante el práctico, los datos de la calibración se detallarán junto con los
experimentos a realizar.
Estos son los valores que se optimizaron a ex: 340 nm, em:450nm
Tyr en solución: If= 35
Trp en solución: para espectros y quenching: If= 35
Lisozima: If= 15
RNasa: If= 15
FLIPsuc: If=100
2. En todo el TP se trabajará con un volumen final de 2 ml por cubeta.
3. Los archivos deben guardarse como CVS tipeando *.txt, para ser
procesados con otros programas.
PARTE 1: Estudio de la fluorescencia de trp y tyr en solución y proteinas
OBJETIVO:

Estudiar el fenómeno de fluorescencia de triptófano y tirosina en
proteínas y relacionarlo con aspectos estructurales de las mismas.
Como metodología para lograr dicho objetivo se plantean los siguientes
objetivos particulares:
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
Verificar las bandas Rayleigh y Raman de distintas soluciones en
ausencia de fluoróforos.

Obtener los espectros de emisión y de excitación de triptófano y
tirosina en solución y en proteínas.

Analizar la extinción de la fluorescencia debida a la presencia de
ioduro.

Analizar el efecto de agentes caotrópicos en la fluorescencia de
proteínas.
SOLUCIONES, REACTIVOS Y MATERIAL DE LABORATORIO:
 Buffer fosfato 10 mM pH=7
 Solución de triptofano 1mM
 Solución de tirosina 1 mM
 Solución de NaI 3M
 Na2S2O3
 Parafilm
 Tips
 Cubeta de cuarzo (3 mL)
 Pipetas (1, 2 y 5 mL)
 Pipetas automáticas (5 – 50 L, 50 – 200 L, 200 – 1000 L)
 Pisetas con agua y alcohol
 Sol. de RNAsa en H2O, aprox 10 mg/ml
 Sol. de lisozima en H2O, aprox 10 mg/ml
 Cloruro de Guanidinio 8 M, pH 7
TRABAJO PRÁCTICO:
 Antes de empezar a hacer los espectros, preparar las soluciones de proteínas en
Cloruro de Guanidinio para que se vayan desnaturalizando. Lisozima y RNasa
0,1mg/ml en Cloruro de Guanidinio 8 M pH 7.
CALIBRAR (0.1 ppm Sulfato de Quinina, ex: 340 nm, em: 450nm, If=35)
A. Caracterización de Tyr y Trp en solución. Espectros de emisión y excitación.
1. Espectro de emisión de buffer fosfato pH 7, excitando a 280 nm, barriendo
entre 280 y 450 nm. BLANCO.
2. Espectro de emisión de buffer fosfato pH 7, excitando a 295 nm, barriendo
entre 290 y 450 nm. BLANCO.
3. Espectro de emisión de Tyr 15 M en buffer fosfato pH 7, excitando a 280
nm, barriendo entre 290 y 450 nm.
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4. Espectro de excitación de la solución anterior, entre 240 y 290 nm, fijando
emisión a max del punto 3.
5. Espectro de emisión de Trp 10 M en buffer fosfato pH 7, excitando a 280
nm, barriendo entre 290 y 450 nm.
6. Espectro de excitación de la solución anterior, entre 220 y 320 nm fijando
em=max obtenido en el punto 5.
B. Extinción (Quenching) de la fluorescencia de Triptofano por Ioduro.
Evaluar la intensidad de fluorescencia de la solución de Trp 10M en buffer fosfato
pH 7 ante el agregado de cantidades crecientes de NaI, utilizando exc=295 nm
(cuando se trabaja con ioduro se debe excitar a 295nm, ya que el mismo absorbe a
280 nm) y em=em
max.
Antes de fijar las longitudes de onda hacer un espectro de
emisión de la solución de Trp excitando a 295 nm. Agregar alícuotas de NaI 3M
(empezar agregando de a 5 ul y luego ir incrementando el volumen de cada agregado
hasta aproximadamente 400 ul como máximo). Agregar Na2S2O3 al stock de NaI
antes de usarlo.
CALIBRAR (0.1 ppm Sulfato de Quinina, ex: 340 nm, em: 450nm, If=15)
C. Caracterización de Tyr y Trp en proteínas. Espectros de absorción.
1. Espectro de emisión de una solución de RNAsa 0,1 mg/ml en buffer pH 7, entre
290 y 450 excitando a 280 nm. Determinar max de emisión.
2. Espectro de emisión de una solución de lisozima 0,1 mg/ml en buffer pH 7,
entre 290 y 450 excitando a 280 nm. Determinar max de emisión.
3. Espectro de emisión de la solución de Cloruro de Guanidinio 8 M pH 7,
excitando a 280 nm, barriendo entre 290 y 450 nm. BLANCO
4. Espectro de emisión de la solución de RNasa 0,1 mg/ml en Cloruro de
Guanidinio 8 M pH 7, entre 290 y 450 excitando a 280 nm. Determinar max de
emisión.
5. Espectro de emisión de una solución de lisozima 0,1 mg/ml en Cloruro de
Guanidinio 8 M pH 7, entre 290 y 450 excitando a 280 nm. Determinar max de
emisión.
D. Procesar y analizar los resultados obtenidos.
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PARTE 2: Empleo de nanosensores basados en FRET para la
determinación de analitos
Introducción Diversos procesos celulares están regulados por cambios en la concentración de pequeñas moléculas: iones como el calcio, fosfoinositoles, aminoácidos, neurotransmisores, hormonas, iones metálicos, nucleótidos cíclicos, ATP o azúcares. Las concentraciones de estos iones o metabolitos cambian ante diferentes condiciones de crecimiento o condiciones de estrés, por lo cual la integración de esta información con datos genómicos y fisiológicos es de gran ayuda en el entendimiento del funcionamiento celular [1] Los nanosensores basados en FRET comenzaron a diseñarse a fines de la década de los `90 como una herramienta para monitorear los niveles en estado estacionario de iones o metabolitos en compartimientos celulares a través de microscopía de fluorescencia. Al ser constructos codificados genéticamente su expresión puede controlarse y dirigirse a un compartimiento celular específico. De esta manera, brindan una resolución temporal y espacial en la cuantificación del analito. Además resultan poco invasivos y no destructivos [1]. En el presente trabajo se empleará el constructo FLIPsuc, el cual es un nanosensor para sacarosa. Este sensor se construyó empleando una proteína de Agrobacterium tumefaciens que posee un rol putativo en la unión de sacarosa (AtThuE) [2]. Dicha proteína se fusionó en el extremo N‐terminal a la proteína eCFP (cyan fluorescent protein) y en el C‐terminal a eYFP (yellow fluorescent protein). Debido al solapamiento de los espectros de emisión de eCFP y de excitación de eYFP (Figura 1), al excitar la eCFP a 433 nm se da transferencia de energía (FRET) hacia la eYFP, que emite fluorescencia en un máximo alrededor de 530 nm. Para que un nanosensor basado en FRET sea útil, debe evidenciarse un cambio en la relación R=Ifaceptor/ Ifdador ante el agregado del analito, cuya magnitud se evalúa a través del Rango dinámico, RD= Rmáx/Rmin. En el caso de FLIPsuc, Rmáx= Rapo sin agregado de ligando y Rmin=Rsat, en condición saturante del ligando. El rango dinámico es una medida de la máxima diferencia que puede observase en el FRET y por lo tanto un indicador de la relación señal/ruido que brinda el sensor [3]. 4
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FIGURA 1: Espectros de excitación y de emisión típicos de proteínas CFPs e YFPs. Los espectros de excitación corresponden a espectros de absorción normalizados. Los espectros de emisión fueron obtenidos al excitar en los correspondientes máximos de excitación y se muestran como emisión de fluorescencia normalizada. Los espectros fueron graficados a partir de los datos publicados en la página web de R. Tsien http://www.tsienlab.ucsd.edu/Documents.htm. En el caso del sensor FLIPsuc, ante el agregado de sacarosa FRET disminuye. Existen otros ejemplos de nanosensores construidos en forma similar donde sucede lo contrario, aumenta FRET ante la unión del ligando [3]. A menos que se disponga de suficiente información estructural del dominio que une el ligando, difícilmente pueda predecirse si se producirá un aumento o disminución de R, y esto debe determinarse empíricamente. Previo al empleo en células de un constructo basado en FRET, el mismo debe caracterizarse en forma aislada para determinar así el rango de concentraciones del analito ante el cual se observa un cambio en R y cuál es la magnitud de ese cambio, evaluando así su utilidad como sensor. En el presente trabajo realizaremos la titulación del sensor FLIPsuc abarcando un amplio rango de concentraciones de sacarosa para determinar la constante de disociación aparente (Kd aparente)1 del constructo por sacarosa y el rango dinámico del sensor. 1
Se denomina Kd aparente porque el parámetro determinado refleja una combinación entre la constante de disociación Kd intrínseca de la proteína y el cambio conformacional necesario para ver la variación de FRET. 5
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Desarrollo experimental Materiales: ‐Solución stock de FLIPsuc a una concentración ~ 10 µM en Buffer Fosfato 10 mM pH 7.9 ‐Solución stock de sacarosa 2 M en Buffer Fosfato 10 mM pH 7. ‐Buffer Fosfato 10 mM pH 7. Calibración: Quinina 0.1 ppm λexc=340 nm λem=450 nm If= 100 Preparación de soluciones: ‐
Preparar una tanda de 7 tubos de diluciones seriadas 1/10 del stock de sacarosa 2 M y 8 tubos de diluciones seriadas 1/10 de sacarosa 1 M, según la tabla de concentraciones en el Anexo. Luego, de cada tubo se emplearán 10 µl para un volumen final de muestra en la cubeta de 2 ml. ‐
Preparar una dilución 1/5 del stock de proteína FLIPsac (Vf= 0,5 ml en buffer fosfato 10 mM, pH 7). Colocarla en hielo. Mantener siempre esta dilución cubierta con papel aluminio, dado que la proteína sufre photobleaching. Obtención de los espectros: ‐
Realizar los espectros de emisión entre 440 nm y 590 nm, excitando a 433 nm. ‐
Espectro del buffer fosfato 10 mM, pH 7. ‐
Espectros de la proteína con el agregado de sacarosa: para cada punto agregar a la cubeta 2 ml buffer fosfato 10 mM pH 7, 20 µl de la dilución 1/5 de FLIPsac + 10 µl de la dilución de sacarosa correspondiente y homogeneizar. No lavar la cubeta entre los puntos. ‐
Guardar la mezcla correspondiente al primer punto en un tubo Falcon sin cubrir con papel aluminio y a T.A., repetir el espectro de emisión al terminar todos los puntos. Compararlo con el obtenido al principio. 6
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Ajuste de los datos: ‐
A cada espectro restarle el blanco del buffer y extraer las Ifs de los máximos de emisión para eCFP y eYFP. ‐
Calcular para cada punto el R= IfeYFP/ IfeCFP. ‐
Calcular el rango dinámico= Rmáx/Rmin. ‐
Calcular para cada punto la Saturación: S=(R‐Rapo)/(Rsat‐Rapo) y graficar S vs [L]. Tener en cuenta que S= [proteína]unida al ligando/[proteína]total = Bmáx[L]/(Kd+ [L]); siempre que se cumpla la condición de que la [proteína] <<< [L]agregada, de manera que la [L]agregada se considera prácticamente igual la [L]libre. Se obtiene una isoterma de unión que se ajusta a una hipérbola, a partir de la cual se puede estimar la Kd aparente. Para una mejor visualización de los puntos, se puede utilizar una escala logarítmica en el eje x; con lo cual la curva se transforma en una sigmoidea. Bibliografía 1. Hou, B.‐H.; Takanaga, H.; Grossmann, G.; Chen, L.‐Q.; Qu, X.‐Q.; Jones, A. M.; Lalonde, S.; Schweissgut, O.; Wiechert, W.; Frommer, W. B. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protocols 2011, 6, 1818–1833. 2. Lager, I.; Looger, L. L.; Hilpert, M.; Lalonde, S.; Frommer, W. B. Conversion of a putative Agrobacterium sugar‐binding protein into a FRET sensor with high selectivity for sucrose. J. Biol. Chem. 2006, 281, 30875–30883. 3. Park, J. G.; Palmer, A. E. Quantitative measurement of Ca2+ and Zn2+ in mammalian cells using genetically encoded fluorescent biosensors. Methods Mol. Biol. 2014, 1071, 29–47. 7
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Anexo
Tabla de concentraciones
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 [Sacarosa] [Sacarosa] M inicial para M final agregados de a 10 µl 0 0
1.00E‐09 2.00E‐07 5.00E‐09 1.00E‐06 1.00E‐08 2.00E‐06 5.00E‐08 1.00E‐05 1.00E‐07 2.00E‐05
5.00E‐07 1.00E‐04 1.00E‐06 2.00E‐04 5.00E‐06 1.00E‐03 1.00E‐05 2.00E‐03 5.00E‐05 1.00E‐02
1.00E‐04 2.00E‐02 5.00E‐04 1.00E‐01 1.00E‐03 2.00E‐01 5.00E‐03 1.00E+00 1.00E‐02 2.00E+00

Filas grises: preparar diluciones seriadas 1/10 del stock 2M de sacarosa. 
Filas blancas: preparar diluciones seriadas 1/10 de una dilución 1M de sacarosa. 8