Acc.w = Anticuerpo Inmovilizado Monoespecífico (Cantidad constante) Ag = Antígeno Nativo (Cantidad variable) Enz Ag = Conjugado Enzima-Antígeno (Cantidad constante) AgAcc.w.= Complejo Antígeno-anticuerpo Enz AgAccw = Complejo Conjugado enzima-antígeno-Anticuerpo Ka = Tasa Constante de Asociación k-a = Tasa Constante de Disociación K = Ka / K –a = Constante de Equilibrio Después que el equilibrio se mantiene, la fracción unida al anticuerpo es separada del antígeno no unido por decantación o aspiración. La actividad de la enzima en la fracción unida al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración nativa del antígeno. De acuerdo al uso de varios sueros de referencia con diferentes concentraciones de antigeno conocido una curva dosis respuesta se genera a partir de la cual la concentración de antígeno de una muestra desconocida puede ser determinada. Triyodotironina Total (tT3) Código del producto: 125-300 Propósito: La Determinación cuantitativa de la Concentración de Triyodotironina en Suero Humano o plasma por ensayo inmunoenzimométrico con microplacas. RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA La medición de la concentración de triyodotironina sérica es generalmente considerada como una herramienta valorable en el diagnóstico de la disfunción tiroidea. Su importancia ha proporcionado el ímpetu para la mejora significativa de la metodología del ensayo que ha ocurrido en las últimas 2 décadas. La llegada del anti-suero monoespecífico y el descubrimiento de agentes bloqueadores a las proteínas séricas que se une a T3 han desarrollado en la evolución del radioinmunoensayo en forma simple. Esta metodología de inmunoensayo con enzima en microplacas proporciona la técnica con sensibilidad óptima donde se requiere algunas manipulaciones técnicas. En este método, la referencia del suero, muestra del paciente o el control se adiciona primero al pozo de la microplaca.- El conjugado enzima T3 es adicionado y entonces los reactivos son mezclados. Una reacción de competencia resulta entre el conjugado de enzima y la triyodotironina nativa para un número limitado de anticuerpos que se combinan a los sitios inmovilizados en el pozo. REACTIVOS Materiales Proporcionados A. Suero Humano de Referencia– 1ml/vial- Iconos A-F 6 viales de suero de referencia para la triyodotironina a concentraciones aproximadas de 0 (A), 0.5 (B), 1.0 (C), 2.5 (D), 5.0 (E) y 7.5 (F) ng/ml. Almacenar de 2-8ºC. Un preservante ha sido adicionado. Para unidades SI: ng/ml x 1.536=nmol/L B. Reactivo de Enzima- T3 total- 1.5 ml/vial – icono E Un (1) vial que contiene conjugado de T3- peroxidasa de rábano (HRP) en una matriz estabilizada con albúmina. Un preservante ha sido adicionado. Almacenaje de 2-8ºC. B C. Buffer de Conjugado T3/T4 Total – 13 ml – Icono Un (1) botella de reactivo que contiene buffer, colorante rojo, preservante e inhibidores de unión a proteínas. Almacenar a 2-8 ºC. D. Microplaca cubierta de Anticuerpo T3 - 96 pozos- Icono Una microplaca de 96 pozos cubiertas con suero anti-T3 de oveja y empacada en una bolsa de aluminio con un agente desecante. Almacenar de 2-8ºC. E. Concentrado de Solución de Lavado- 20 ml – Icono Un vial que contiene un surfactante en suero salino tamponado. Un preservante ha sido adicionado. Almacenar de 2-30ºC. A F. Substrato A – 7 ml/vial- Icono S Una (1) botella que contiene tetrametilbenzidina (TMB) en buffer. Almacenar de 2-8ºC. Después de completar el período de incubación requerida, el anticuerpo unido al conjugado de enzima-T3 es separado del conjugado no unido enzima-T3 por aspiración o decantación. La actividad de la enzima presente en la superficie del pozo es cuantificada por reacción con un sustrato adecuado para producir color. El empleo de varios sueros de referencia de concentraciones conocidos de triyodotironina permite la construcción de una curva dosis respuesta de actividad y concentración. H. Solución de parada – 8ml/vial – Icono Una (1) botella que contiene un ácido fuerte (HCl 1N). Almacenar de 2-30ºC. El empleo de varios sueros referencia con concentraciones de triyodotironina conocidas permite la construcción de una grafica de actividad y concentración. De acuerdo a la interpolación en la curva de dosis respuesta, la actividad de una muestra desconocida puede ser correlacionada a la concentración de T3. I. Instrucciones del Producto Nota 1: No usar reactivos más allá de la fecha de expiración Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por 60 días cuando son almacenados de 2-8ºC. Nota 3: Ver al final del inserto la configuración para varios reactivos por tamaño de kit. PRINCIPIO Ensayo Inmunoenzimométrico Competitivo (TIPO 5) Los reactivos esenciales requeridos para un inmunoensayo de fase sólida incluyen el anticuerpo inmovilizado, el conjugado enzima-antígeno y el antígeno nativo. Después de la mezcla del anticuerpo inmovilizado, el conjugado enzima-antígeno y un suero que contiene el antígeno nativo, una reacción de competencia resulta entre el antígeno nativo y el conjugado enzima-antígeno para un número limitado de sitios de unión insolubilizados. La interacción es ilustrada por la siguiente ecuación: Ka Enz Enz Ag + Ag + Acc.w. AgAcc.w. + Ag Ac cw K-a Materiales requeridos pero no proporcionados: G. Substrato B – 7 ml/vial – Icono SB Una (1) botella que contiene peróxido de hidrógeno (H2O2) en buffer. Almacenar de 2-8ºC. STOP 1. Pipeta(s) de 50µl con una precisión superior al 1.5% 2. Pipeta(s) o dispensadores para las distribuciones repetidas de 0.100 ml y 0.350ml con una precisión superior al 1.5%. 3. Pipeta(s) de volumen ajustable (20-200 µl) y (200-1000µl) para el conjugado y las diluciones del sustrato. 4. Lavador de microplaca o una botella de lavado (opcional). 5. Lector de microplaca con capacidad de absorbancia con filtros de 450nm a 620nm. 6. Tubo de prueba para mezclar los substratos A y B. 7. Papel absorbente para secar los pozos de la microplaca. 8. Cubierta plástica o de microplaca para los pasos de incubación. 9. Aspirador al vacío o vacuo (opcional) para los pasos del lavado. 3. Adicionar 0.100ml (100µl) de Reactivo de trabajo A, solución de conjugado T3 Enzima a todos los pozos. (Ver sección preparación de reactivos). 4. Agitar la microplaca ligeramente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir. 5. Incubar 60 minutos a temperatura ambiente. 6. Descartar los contenidos de la microplaca por decantación o aspiración, si decanta, utilice papel absorbente para extraer el exceso de humedad. 7. Adicionar 350µl de buffer de lavado (ver Sección Preparación de Reactivos), decante o aspire. Repita 2 veces mas para un total de 3 lavados. Un lavador de placa automático o manual puede ser usado. Siga las instrucciones del fabricante para el uso apropiado. Si utiliza una botella de lavado, llene cada pozo por presión del contenedor (evitando formación de burbujas) Decante el lavado y repita 2 veces adicionales. 8. Adicione 0.100 ml (100µl) de solución de substrato de trabajo a todos los pozos (Ver Sección de Preparación del Reactivo). Siempre adicione reactivos en el mismo orden para minimizar las diferencias del tiempo de reacción en los pozos. 10. Cronómetro 11. Materiales de control de calidad. PRECAUCIONES Para el uso Diagnóstico in Vitro No para el Uso Interno ni Externo en Humanos o Animales Todos los productos que contienen suero humano se encontraron no reactivos para el Antígeno de Superficie de la Hepatitis B, VIH 1 y 2 y anticuerpos para VHC por los reactivos licenciados por la FDA. A pesar de que nos test no conocidos aseguran que agentes infecciosos están ausentes todos los productos sericos humanos deberán ser manipulados como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedades. Adecuados procedimientos de laboratorio para el manejo de productos sanguíneos pueden ser encontrados en el Centro de Control de Enfermedades/ Instituto Nacional de Salud, “Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos”, 2da Edición, 1988, HHS Publicación Nº (CDC) 888395. RECOLECCION DE MUESTRA Y PREPARACION Se deben seguir las precauciones en la recolección de muestras de sangre, plasma o suero por punción venosa. Para la comparación exacta con los valores normales establecidos, se debe obtener una muestra de suero o plasma por la mañana en ayunas. La sangre será recogida en un tubo de punción venosa con tapa roja sin aditivos o anticoagulantes para suero (o tubos que contengan EDTA o Heparina). Permitir que la sangre coagule. Centrifugar la muestra para separar el suero o plasma de las células. Las muestras pueden ser refrigeradas de 2-8ºC por un período máximo de 5 días. Si la muestra no puede ser procesada durante este tiempo, la muestra deberá almacenarse a temperatura de -20ºC hasta 30 días. Evitar el congelamiento y descongelamiento repetitivo. Cuando se procesa en duplicado, se requiere 0.100ml de muestra. PREPARACION DE REACTIVOS 1. Reactivo de Trabajo A- Solución de Conjugado T3Enzima Diluir el conjugado T3-enzima 1:11 con el buffer del conjugado T3/T4 total en un contenedor adecuado. Por ejemplo, diluir 160µl de conjugado con 1.6 ml de buffer para 16 pozos (un exceso leve de solución es hecha). Este reactivo será usado dentro de las 24 horas para el rendimiento máximo del ensayo. Almacenar de 2-8ºC. Formula general: Cantidad de búfer requerido = número de pozos * 0.1 Cantidad de enzima T3 necesaria =# de pozos* 0.01 i.e = 16 x 0.1 = 1.6ml de búfer de conjugado T3/T4 total 16 x 0.01 =0.16ml (160µl) para el conjugado enzimático T3. 2. Buffer para Lavado Diluir los contenidos del Concentrado de Lavado a 1000 ml con agua destilada o desionizada en un contenedor de almacenaje adecuado. Almacenar a temperatura ambiente de 20-27ºC hasta 60 días. 3. Solución de Substrato de Trabajo Vierta los contenidos del vial ámbar marcada con “A” dentro del vial claro marcado como solución “B”.Colocar la tapa amarilla al vial claro para fácil identificación. Mezcle e identifique según corresponda. Almacenar de 2-8ºC. Nota: No usar el substrato de trabajo si se ve azul. PROCEDIMIENTO Antes de iniciar el procedimiento, permita que todos los reactivos, sueros de referencia y los controles alcancen temperatura ambiente (20-27ºC). 1. Marque los pozos para cada suero de referencia control y suero de pacientes para ser procesadas por duplicado. Coloque las tiras de pocillos no usadas dentro de la bolsa de aluminio, sellarlo y almacenarlo de 2-8ºC. 2. Pipetear 0.050 ml (50µl) del suero de referencia apropiado, control o muestra dentro del pozo asignado. NO MEZCLAR LA MICROPLACA DESPUES ADICIONAR DE SUBSTRAT0 9. Incube a temperatura ambiente por 15 minutos. 10. Adicione 0.050 ml (50µl) de solución de parada para cada pozo y mezcle ligeramente (por 15-20 segundos). Siempre adicione reactivos en el mismo orden para minimizar las diferencias del tiempo de reacción en los pozos. 11. Lea la absorbancia en cada pozo de cada pozo a 450 nm (usando una longitud de onda de 620-630 nm para minimizar las imperfecciones del pozo) en un lector de microplaca. Los resultados deberán ser leídos dentro de los 30 minutos siguientes a la adición de la solución de parada. Nota: Para reprocesar muestras con concentraciones mayores de 7.5 ng/ml, pipetear 25µl de muestra y 25µl del suero de referencia 0 dentro del pozo de la muestra (esto mantiene una concentración uniforme de la proteína). Multiplicar el valor leído por 2 y obtendrá la concentración de Triyodotironina. CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio ensayará los controles a niveles en el rango del hipotiroideo, eutiroideo e hipertiroideo para el monitoreo del rendimiento del ensayo. Estos controles serán tratados como desconocidos, determinando los valores en cada procedimiento de prueba. Las graficas de control de calidad permitirán el seguimiento del rendimiento de reactivos suministrados. Los métodos estadísticos pertinentes serán empleados para acertar en las tendencias. El laboratorio individual agrupará los límites del rendimiento del ensayo aceptable. Además, la absorbancia máxima será consistente con la experiencia anterior. La desviación significativa de un rendimiento establecido previamente, puede indicar cambio no notificado en condiciones experimentales o degradación de los reactivos del kit. Reactivos frescos serán usados para determinar la razón de estas variaciones. CALCULO DE RESULTADOS Una curva dosis respuesta es usada para obtener la concentración de Triyodotironina en muestras desconocidas. 1. Registrar la absorbancia obtenida de la impresión del lector de microplacas como se muestra en el Ejemplo 1. 2. Graficar la absorbancia para cada suero duplicado de referencia versus la concentración de T3 correspondiente en ng/ml en el papel de gráfica lineal (no promediar los duplicados del suero de referencia antes del trazo). 3. Dibujar la mejor curva fija a través de los puntos obtenidos. 4. Para determinar la concentración de T3 de una muestra desconocida, localice la absorbancia promedio de los duplicados para cada desconocido en el eje vertical Y de la gráfica, encuentre el punto de intersección sobre la curva y lea la concentración (en ng/ml) del eje horizontal X de la gráfica (el duplicado del desconocido puede ser Si más de 1 placa es usada, se recomienda repetir la curva dosis respuesta. 5. La adición de la solución sustrato inicia una reacción cinética, la cual es terminada por la adición de la solución de paralización. Por tanto, la adición de los substratos y la solución de detención serán adicionadas en la misma secuencia para eliminar cualquier desviación durante la reacción. Valor (ng/ml) Media 0 2.101 0.5 1.662 1.0 0.966 2.5 0.551 5.0 2.507 C1 2.073 D1 2.128 E1 1.678 Cal B Cal C F1 1.646 G1 0.964 H1 0.969 A2 0.550 Cal D Cal E B2 0.551 C2 0.372 D2 0.369 E2 1.701 Cal F Ctrl 1 F2 2.556 6. Los lectores de placa miden verticalmente. No tocar el fondo de los pozos. 7. La falla en remover la solución adherente adecuadamente en los pasos de aspiración o lavado por decantación puede resultar en una pobre replicación y resultados falsos. 8. 0.370 7.5 1.726 0.92 0.734 3.58 1.638 G2 0.755 H2 0.791 A3 1.145 B3 1.115 Ctrl 2 1.130 Paciente 1.95 * Los datos que se presentan en el ejemplo 1, figura 1 tienen el propósito de ilustrar solamente, por lo tanto no deberán ser utilizados en lugar de la curva estándar elaborada con cada ensayo. No se deben emplear muestras altamente lipémicas, hemolizadas o contaminadas 4. 2.604 Cal A B1 Abs (B) Abs (A) Numero de Pozo I.D. Muestra A1 3. Usar componentes del mismo lote. No mezclar los reactivos de diferentes lotes. 9. Es esencial un pipeteo preciso y exacto así como seguir el tiempo exacto y la temperatura requerida. Cualquier desviación de las instrucciones de uso puede arrojar resultados inexactos. 10. Se deben seguir las buenas prácticas de laboratorio todos los estándares nacionales aplicables, regulaciones y leyes de manera estricta para asegurar el cumplimiento y uso adecuado del dispositivo. 11. Es importante calibrar todos los equipos, por ejemplo: pipetas, lectores, lavadores y/o instrumentos automatizados con este reactivo y realizar un mantenimiento preventivo rutinario 12. El análisis de riesgo – como lo requiere la directiva IVD 98/79/EC de la marca CE- para estos y otros dispositivos elaborados por Monobind, pueden ser solicitados vía Email: Monobind@monobind.com B. Interpretación 1. Los resultados de laboratorio por si solos son únicamente un aspecto para determinar el cuidado del paciente y no deben ser la única base para una terapia, particularmente si los resultados están en conflicto con otros determinantes. 2. Para resultados de pruebas válidas, los controles adecuados y otros parámetros deben estar dentro de los rangos listados y requerimientos del ensayo. 3. Si los kits de prueba están alterados, ya sea por mezcla de partes de diferente kits, lo cual puede producir resultados de prueba falsos o si los resultados son interpretados incorrectamente, Monobind no tendrá responsabilidad. 4. Si se utiliza el sistema de reducción de datos controlados por Computador para interpretar los resultados del ensayo, es necesario que los valores de predicción para los calibradores se ubiquen dentro del 10% de las concentraciones asignadas. 5. La concentración de Triyodotironina total sérica depende de multiples de factores: función de glándula tiroides y su regulación, la concentración de globulina que se une a la tiroxina (TBG) (3,4) y la unión de la Triyodotironina a TBG. Así, la concentración de Triyodotironina total solamente no es insuficiente para evaluar el estado clínico. La curva es un ejemplo solamente. PARAMETROS DE CC Los resultados de la prueba se consideraran válidos teniendo encuenta los siguientes criterios: 1. La absorbancia (DO) del calibrador a 0 ng/ml deberá ser ≥ 1.3 2. 4 de 6 grupos de control de calidad estarán dentro de los rangos establecidos. ANALISIS DE RIESGOS A. Desempeño de la prueba 1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo sea sostenido en forma constante para resultados reproducibles. 2. El pipeteo de las muestras no se extenderá más de 10 minutos para evitar derivaciones. 6. Una disminución de los valores de Triyodotironina total se encuentra en enfermedades relacionadas con el metabolismo de proteínas, ciertas enfermedades hepáticas y administración de testosterona, difenilhidantoína o salicilatos. Una tabla de drogas de interferencia y condiciones, la cual afecta los valores de tiroxina total, ha sido compilada por el Journal de la Asociación Médica de Químicos Clínicos. RANGOS ESPERADOS DE VALORES Un estudio de una población adulta eutiroidea fue tomado para determinar los valores esperados para el Sistema de prueba T3 ELISA Los valores promedio (R), desviación estándar (σ) y rangos esperados (±2 σ) se presentan en la Tabla 1. El número total de muestras fue 105. TABLA I Valores Esperados para el Sistema de Prueba T3 ELISA (En ng/ml) Promedio (X) Desviación estándar (σ) Rangos esperados (±2 σ) 1.184 0.334 0.52 - 1.85 Es importante tener encuenta que el establecimiento de un rango de valores esperados, se ha definido por un método dado, para una población de personas “normales” y dependiendo de multiplicidad de factores: la especificidad del método, la población probada y la precisión del método en las manos del analista. Por estas razones cada laboratorio dependerá del rango de valores esperados establecidos por el fabricante, hasta que se determine un rango local determinado por el analista usando el método con muestras propias de la región donde le laboratorio se encuentra localizado. CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO A. Precisión La precisión intra e interensayo del Sistema de Prueba de microplaca tT3 ELISA AccuBindTM, se determino mediante análisis de 3 diferentes niveles de suero pool control. El número (N), valor promedio (X), la desviación estándar (σ) y el coeficiente de variación (CV) para cada uno de estos sueros control se presentan en la Tabla 2 y Tabla 3. TABLA 2 Precisión intraensayo (Valores en mg/ml) Muestra Bajo Normal Alto N 16 16 16 X 0.78 1.92 3.55 σ 0.06 0.10 0.14 C.V. 7.9 % 5.4% 3.9% TABLA 3 Precisión Inter Ensayo* (valores en mUI/ml) Muestra Bajo Normal Alto N 10 10 10 X 0.76 1.85 3.43 σ 0.07 0.13 0.16 C.V. 8.9 % 6.7% 4.5% * Medido en 10 experimentos en duplicado durante un período de 10 días. B. Exactitud El Sistema de prueba tT3 ELISA AccuBindTM fue comparado con un método de radioinmunoensayo de referencia. Las muestras biológicas de poblaciones eutiroideas, hipotiroideas e hipertiroideas fueron usadas (Los valores van del rango de 0.15 ng/ml – 8.0 ng/ml). El número total de muestras fue 120. La última ecuación (y=mx+b) y la correlación del coeficiente se calculo para el método ELISA tT3 AccuBindTM en comparación con el método de referencia. Los datos obtenidos son descritos en la Tabla 4. TABLA 4 Media (X) Este Método Referencia 1.62 1.68 Análisis Coeficiente de correlación y = 3.8 + 0.947(x) 0.987 Solamente un pequeño sesgo entre este método y el de referencia se observa por la cercanía de los valores promedios. La ecuación de regresión cuadrada última y el coeficiente de correlación indican excelente correlación entre métodos. C. Especificidad La reacción cruzada del anticuerpo de Triyodotironina a sustancias seleccionadas fue evaluada por la adición de cantidades de sustancia de interferentes a una matriz sérica en varias concentraciones. La reacción cruzada fue calculada por la derivación de un ratio entre la dosis de la sustancia que interfiere a la dosis de tiroxina necesaria para desplazar la misma cantidad del conjugado. Sustancia I-Triyodotironina l-tiroxina Yodotirosina Diyodotirosina Diyodotironina Fenilbutazona Salicilato de sodio Reacción cruzada 1.0000 < 0.0002 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 Concentración -10µg/ml 10µg/ml 10µg/ml 10µg/ml 10µg/ml 10µg/ml D. Sensibilidad TM El procedimiento de tT3 ELISA AccuBind tiene una sensibilidad de 0.04 ng/ml. La sensibilidad fue acertada por la determinación de la variabilidad del suero calibrador 0 ng/ml usando 2σ estadísticas (95% de certeza) para calcular la dosis mínima. REFERENCIAS 1. Gharib, H., Ryan, R.J., Mayberry, W.E., & Hockett, T., "Radioimmunoassay for Triiodothyronine (T3):.Affinity and Specificity of Antibody for T3",J Clinical Endocrinol. 33,509. (1971) 2. Chopra, I.J., Ho, R.S.,& Lam, R. "An improved radioimmunoassay of triiodothyronine in human serum," J. Lab Clinical Med. 80, 729. (1971). 3. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gilberman, U., "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests." Clinical Chemistry 21, 3660. (1975). 4. Sterling, L., Diagnosis and Treatment of Thyroid Disease, Cleveland CRC Press, p.9-51. (1975). 5. Braverman, LE.:”Evaluation of thyroid status in patients with thyrotoxicosis.” Clin.Chem. 42, 174-178. (1996) 6. Braverman, LE., Utigen, RD., Eds.: Werner and Ingbar’s ‘The Thyroid – A Fundamental and Clinical Text’ 7th Ed. Philadelphia. Lippinscott-Raven. (1996) 7. Comeau, L., Pianan, U., Leo-Mensah, T, et.al.:”An automated chemiluminescent immunoassay test for total triiodothyronine.” Clin.Chem.37, 941. (1991) 8. Chopra, IJ.:’Radioimmunoassay of iodothyronines-Handbook of Radioimmunoassay.’ G.E. Abraham.Ed.New York. Marcel Dekker, Inc. (1977) 9. Kozwich,D., Davis, G., Sockol, C.:”Development of total triiodothyronine enzyme immunoassay in microtiter plate format.” Clin.Chem. 37, 1040. (1991) 10. Papanastasiou-Diamandi, A., Khosravi, M.:”Total T3 (triiodothyronine) measurement in serum by time resolved flourescence immunoassay.” Clin.Chem.37, 1029. (1991) Revisión: 2 Date: 112210 Cat #: 125-300 Tamaño 96(A) A 1ml set 1ml set B 1(1.5ml) 2(1.5ml) 1(8ml) 2(8ml) C 1(13ml) 2(13ml) 1(60ml) 2(60ml) D 1placa 2 placas 5 placas 10placas E 1(20ml) 1(20ml) 1(60ml) 2(60ml) 2(30ml) Reactivo ( lleno ) promediado como se indica). En el siguiente ejemplo, la absorbancia promedio (1.130) intercepta con la curva dosis respuesta en 1.95ng/ml de concentración de T3 (Ver Figura 1). 192(B) 480(D) 2ml set 960(E) 2ml set x2 F 1(7ml) 2(7ml) 1(30ml) G 1(7ml) 2(7ml) 1(30ml) 2(30ml) H 1(8ml) 2(8ml) 1(30ml) 2(30ml)