RESUMEN CIENTÍFICO: LA CONSTRUCCIÓN DE HUESOS POR

RESUMEN CIENTÍFICO: LA
CONSTRUCCIÓN DE HUESOS POR
DESACTIVACIÓN DE GENES
Marta Jiménez Muñoz
Introducción
La remodelación ósea es el proceso por el cual el hueso se renueva adaptándose a los
cambios y manteniendo su homeostasis mineral, evitando así la acumulación de
microdaños o fracturas en el tejido óseo. Se lleva a cabo mediante la coordinación de los
mecanismos de resorción de hueso por los osteoclastos y la síntesis de hueso nuevo por
las células denominadas osteoblastos. Este proceso se inicia con el reclutamiento y
activación de los precursores monocíticos de los osteoclastos, procedente de la línea
mieloide, que se encuentran en la circulación sanguínea. Estos precursores se unen a la
matriz ósea mediante receptores de integrinas y otras moléculas sellando las zonas de
resorción ósea. Por otra parte, las células osteoprogenitoras se diferencian en
osteoblastos que sintetizan la nueva matriz ósea en las denominadas superficies
formadoras de hueso. De estos últimos progenitores también se forman osteocitos que
quedarán incorporados en la matriz ósea como función de soporte y de regulación de la
remodelación. Por último, se encuentran las células de revestimiento que sirven de
protección cubriendo la superficie del hueso. Todo este conjunto formarían las BMU
(bone multicelular units)1
Una pérdida de regulación del proceso mencionado puede desembocar en alteraciones
metabólicas óseas, cuya principal representante es la osteoporosis. Éstas afectan a una
gran parte de población, fundamentalmente femenina y de avanzada edad, ya que la
deficiencia de estrógenos juega un importante papel. Debido al incremento de la
esperanza de vida en países desarrollados cabe esperar una mayor incidencia de este
tipo de enfermedades, por lo que se requerirá el desarrollo de tratamientos y terapias
eficaces.2 Estos desórdenes pueden deberse a diferencias en la producción de
reguladores sistémicos y locales, cambios en los receptores, alteraciones en los
mecanismos de transducción de señales, modificaciones en factores de transcripción
nuclear y en las enzimas que interfieren en la producción e inactivación de los
reguladores. Todo esto puede resultar en un aumento de la fragilidad del esqueleto
provocado por un exceso de resorción ósea que conlleva a un deterioro de la
microarquitectura y un descenso de la masa ósea; o por una insuficiente formación ósea
en respuesta al exceso de resorción que se da por la remodelación, principalmente.3
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Hasta el momento, los tratamientos farmacológicos para la osteoporosis se han centrado
principalmente en la inhibición o disminución de la resorción ósea, es decir, son
anticatabólicos. Una de las primeras terapias se basaba en la administración de
estrógenos que eran capaces de reducir la incidencia de fracturas óseas pero, que en
ciertos pacientes, podría aumentar el riesgo de cáncer de mama y de enfermedades
vasculares. Otro de los posibles tratamientos empleados consiste en la administración de
bifosfonatos, sustancias que se unen a la superficies del hueso y son tomados por los
osteoclastos conduciendo a su inactivación y su muerte celular. En varios estudios se
observó que un uso prolongado puede causar una inhibición excesiva de la
remodelación ósea, complicando la reparación de fracturas y microdaños, ya que se
evita una mayor pérdida de hueso pero no se estimula la formación de nuevo tejido
óseo3. Por todo esto, se comenzó a emplear un tratamiento basado en la hormona
paratiroidea que es capaz de estimular la formación de hueso nuevo pero, alterando la
resorción. No obstante puede dar efectos secundarios como hipercalcemia e
hipercalciuria, además del desarrollo de osteosarcomas si se administran dosis elevadas
o largas duraciones 4-6. Por todo esto, se requieren nuevas terapias que puedan
administrarse de forma dirigida, causando menos efectos adversos y que, además,
estimulen la formación de hueso sin alterar la resorción. 6
Uno de los principales retos para la búsqueda y administración de nuevas terapias
basadas en sustancias anabólicas que estimulen el desarrollo de hueso es la dificultad de
su administración en el lugar donde debe actuar, es decir, en las BMU 4. Como se
observa en la figura 1, estas zonas sería solamente accesibles a través de capilares.
Figura 1. Apartados A-C: Imágenes histológicas de las BMUs. Se aprecian
osteoclastos (OC) y osteoblastos (OB), entre otras células. El apartado D muestra un
esquema de la estructura mencionada. Imagen extraída de 4
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La mayoría de las células localizadas en las BMUs son el objetivo del estudio realizado
por Zhang et al en el que se pretende incorporar un siRNA capaz de silenciar el gen
Plekho 1 en las células que se encuentran en las superficies de formación. Este gen,
también llamado CKIP -1 codifica para la proteína casein kinase 2 interacting protein-1
(CKIP-1; figura 2) que contiene un dominio N-terminal con homología a pleckstrin, un
motivo de cremallera de leucina en el extremo C-terminal y cinco motivos ricos en
prolina a lo largo de la proteína que median interacciones con numerosas proteínas
celulares entre las que nos interesa destacar smurf 1 7. CKIP-1 regula las modificaciones
postranscripcionales de algunas proteínas para mediar la interacción entre enzima y
sustrato facilitando su fosforilación y ubiquitinación. Se ha demostrado queCKIP-1
interactúa y promueve la actividad E3 ligasa de smurf 1 (Smad ubiquitylation regulatory
factor 1) aumentando su afinidad por los sustratos. La formación de un complejo entre
estas dos proteínas provoca un cambio conformacional que facilita la ubiquitinación y
degradación en el proteasoma de ciertas proteínas osteoblasticas dificultando la
formación de nuevo hueso 5, 7.
Fundamentos experimentales.
Actualmente, hay dos tipos de moléculas que se emplean en terapias dirigidas hueso: los
bifosfonatos que sienten afinidad por superficies de formación y de resorción; y los
oligopéptidos (como el Asp8) que presentan una gran afinidad por las superficies de
resorción 6. Puesto que la terapia que se busca está orientado exclusivamente a las
superficies de formación de hueso, los autores del texto han desarrollado un sistema que
consiste en DOTAP-based cationic liposome con 6 secuencias repetidas de AspSerSer
que contiene el siRNA de interés. Esta afinidad diferencial entre las distintas moléculas
por las superficies óseas se debe a los diferentes patrones de los cristales de
hidroxiapatita que se observan en la zona de resorción y de formación.6
Figura 2. Representación esquemática de la terapia propuesta basada en un siRNA que silencie el gen
Plekho 1. Imagen tomada de 5.
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Para comprobar la direccionalidad de las moléculas y su afinidad por las diferentes
zonas del hueso se inyectó en ratas adultas xylenol orange (XO) que se une a la
deposición de hueso nuevo en las superficies de formación dando una fluorescencia de
color rojo. Tras esto, se inyectan a un grupo de ratas el oligopéptido Asp8 unido a FITC
y al otro grupo la molécula (AspSerSer)6 también marcada con FITC. Como se muestra
en la figura 3 puede observarse que las superficies de formación emitían una mayor
fluorescencia de color verde (debida a FITC) en las ratas inyectadas con (AspSerSer)6.
Por el contrario, en las ratas que fueron inyectadas con Asp8 se apreciaba mayor
fluorescencia en las zonas de resorción. Por otra parte, se coinyectó una población de
ratas con (AspSerSer)6-FITC y Asp8-rhodamine y se vio que había una colocalización
muy débil. Estas mediciones de fluorescencia se realizaron en secciones de hueso
descalcificado mediante microscopía láser confocal.
Figura 3. Apartado A.: Sección de hueso descalcificado tratado con Asp8 o (AspSerSer)6
observado mediante microcopía láser confocal.
Apartado B: Sección de hueso descalcificado de ratas coinyectadas con (AspSerSer)6-FITC
y Asp8-rhodamine. Imagen tomada de 6
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Un segundo experimento consistió en el examen in vivo de la distribución del siRNA en
algunos órganos como corazón, bazo, pulmones, riñones y hueso. Para ello se empleó
tecnología de imagen biofotónica que ayudó a detectar la localización de siRNA Plekho
1 marcado con el fluorocromo FAM. Esta molécula se inyectó de diferentes formas en
distintos grupos de ratas hembras: de forma libre, contenido en un liposoma con
(AspSerSer)6, contenido en un liposoma sin el oligopéptido anterior o con in vivo jetPEI
como control positivo. A la vista de la figura 4, se dedujo que la intensidad de
fluorescencia intraósea era mayor en el grupo al que se había inyectado el liposoma con
(AspSerSer)6. Sin embargo en hígado era menor que en as ratas tratadas con in vivo
jetPEI. Casi no se apreciaba fluorescencia en corazón, bazo, pulmos, riñones excepto
una pequeña señal en riñones en las inyectadas con siRNA libre
Los datos cuantitativos de fluorescencia coincidían con las imágenes obtenidas.
También se examinó la expresión de la proteína Plekho 1 mediante un westernblot y de
su mRNA por real-time PCR en hueso y en tejidos no esqueléticos.
Figura 4. En el apartado A se muestra la localización del siRNA marcado con FAM mediante el
análisis de imagen biofotónica. Apartado C: westernblots de la expresión de Plekho 1 en distintos
órganos. Imagen modificada de 6
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La figura 5 muestra imágenes obtenidas por microtomografía computerizada de hueso
trabecular procedente de la tibia proximal de distintas ratas hembras de 6 meses de edad
sin la enfermedad tras la inyección del siRNA de forma libre, contenido en un liposoma
con (AspSerSer)6 o contenido en un liposoma sin el oligopéptido anterior. Los datos
indican que El grupo con (AspSerSer)6 mostraba aumento en BMD (densidad de masa
ósea), volumen óseo relativo, grosor trabecular, número de trabéculas y densidad de
conectividad. Además se muestra una arquitectura mejor organizada5, 6.
Figura 5. Arquitectura tridimensional de hueso trabecular obtenido por microtomografía
computerizada in vivo. Tomada de 6.
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Conclusiones y opinión personal
El desarrollo de nuevas terapias orientadas al tratamiento de la osteoporosis o incluso a
la curación de fracturas o de otras enfermedades asociadas al sistema esquelético han
sido mejoradas gracias a los estudios realizados por este y otros grupos de
investigación. Este nuevo enfoque de tratamiento de las enfermedades óseas mediante la
estimulación de formación de hueso permite una mejor solución a dichos problemas así
como una disminución en los efectos secundarios producidos por la falta de un sistema
que permita realizar una inserción de siRNA dirigida a las zonas deseadas. Estos
resultados suponen un gran avance en el campo clínico, ya que es posible activar
selectivamente un solo aspecto de la unidad remodeladora sin influir en gran medida
sobre los demás factores u órganos. No obstante, aún quedan una gran cantidad de
ensayos que realizar para que estas terapias sean aplicables a personas de forma eficaz y
segura.
Referencias
1. Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 3 Suppl
3, S131-9 (2008).
2. Erviti, J. Drugs prescription for osteoporosis. An. Sist. Sanit. Navar. 26, 107-121
(2003).
3. Raisz, L. G. Pathogenesis of osteoporosis: concepts, conflicts, and prospects.
J. Clin. Invest. 115, 3318-3325 (2005).
4. Khosla, S. Building bone to reverse osteoporosis and repair fractures. J. Clin. Invest.
118, 421-428 (2008).
5. Clifford, J. R. Building bones by knocking down genes. Nat. Med. 18, 202-204
(2012).
6. Zhang, G. e. a. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate
RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18, 307-314 (2012).
7. Nie, J. et al. CKIP-1: A scaffold protein and potential therapeutic target integrating
multiple signaling pathways and physiological functions. Ageing Res. Rev. 12, 276-281
(2012).