PESTE PORCINA CLÁSICA (cólera del cerdo)

CAPÍTULO 2.8.3
PESTE PORCINA CLÁSICA
(cólera del cerdo)
RESUMEN
La peste porcina clásica (PPC), también denominada cólera del cerdo, es una enfermedad vírica
contagiosa de los cerdos. El agente causal es un miembro del género Pestivirus de la familia
Flaviviridae, estrechamente relacionado con los virus de la diarrea bovina fetal y de la enfermedad
de la frontera. Solo existe un serotipo de virus de la PPC (CSFV).
La enfermedad puede tener un desarrollo agudo, subagudo, crónico, de aparición tardía o
inaparente, dependiendo de varios factores víricos y del hospedador, siendo los más importantes
la edad de los animales, la virulencia del virus y el tiempo de infección (pre- o post-natal). Los
cerdos adultos suelen mostrar menos síntomas graves de la enfermedad que los jóvenes y tienen
mayor probabilidad de supervivencia. En las cerdas gestantes, el virus puede atravesar la barrera
placentaria e infectar a los fetos. La infección intrauterina con cepas del virus de baja o moderada
virulencia origina lo que se conoce como el síndrome de la “cerda portadora”, que se caracteriza
por la muerte prenatal o perinatal, el nacimiento de lechones enfermos o una camada
aparentemente "sana" pero infectada persistentemente. Un brote de PPC tiene graves
consecuencias económicas para el mercado de los cerdos y de sus productos derivados.
La elevada variabilidad clínica de la PPC dificulta a menudo el diagnóstico realizado sobre bases
clínicas y patológicas. Los métodos de laboratorio son por tanto, esenciales para un diagnóstico
inequívoco. La detección del virus, del ácido nucleico vírico en la sangre y de anticuerpos en el
suero son los mejores métodos para diagnosticar PPC en cerdos vivos, mientras la detección del
virus o del ácido nucleico vírico o del antígeno en muestras de órganos resulta más adecuada en
cerdos muertos.
Identificación del agente: Para la detección del antígeno de la PPC puede utilizarse la
inmunofluorescencia directa (IFD) en cortes de órganos de cerdos afectados. Para determinar si la
fluorescencia se debe a antígenos de PPC o de Pestivirus que no producen PPC se emplean
varios anticuerpos monoclonales. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza
generalmente para la detección del fenómeno de la PPC. El aislamiento del CSFV se debe intentar
en la línea celular de riñón de cerdo (PK-15) o en otra línea celular adecuada. El crecimiento del
virus en los cultivos se examinan por inmunofluorescencia o tinción con inmunoperoxidasa; los
aislamientos positivos se caracterizan posteriormente por medio de MAbs y por secuenciación
génica parcial. Los protocolos basados en la reacción en cadena de la polimerasa para la
identificación del ácido nucleico del CSFV, están actualmente ganando aceptación internacional y
se están utilizando en varios laboratorios, tanto para la detección del agente como para la
diferenciación de los pestivirus de los rumiantes. Los enzimoinmunoensayos de captura antigénica
(ELISA) son también útiles para realizar una criba en la piara pero no deben utilizarse en base a un
solo animal.
Pruebas serológicas: La detección de los anticuerpos específicos contra el virus es
particularmente útil en las piaras donde se sospecha una infección por CSFV iniciada al menos
21 días antes. Los métodos serológicos son también adecuados para el control y para estudios de
prevalencia, y resultan esenciales en el caso de que un país desee el reconocimiento internacional
de estar exento de la enfermedad sin vacunación.
Como en los cerdos de cría se observan ocasionalmente anticuerpos contra CSFV que muestran
reacción cruzada con los pestivirus de los rumiantes, las pruebas de análisis deben acompañarse
de pruebas confirmativas que sean específicas para CSFV Algunas pruebas ELISA son
relativamente específicas para CSFV pero la prueba de la neutralización comparativa es el método
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Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
definitivo de diferenciación, y compara el nivel de anticuerpos frente a diferentes especies de
Pestivirus.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Las vacunas contra la PPC contienen
un virus vivo que se ha atenuado mediante pases en cultivos celulares o a través de los
hospedadores adecuados que no pertenezcan a la familia Suidae. La producción de estas vacunas
con virus vivos modificados (MLV) se basa en un sistema de lotes de inóculos que se ha validado
respecto a la identidad del virus, esterilidad, pureza, seguridad, falta de transmisión, estabilidad e
inmunogenicidad. Si se utiliza el CSFV para la producción de vacunas o en estudios de infección
experimental, las instalaciones deben cumplir los requisitos de Contención de la OIE para
patógenos del Grupo 4.
No se dispone de vacunas convencionales eficaces con virus completos inactivados. Están
disponibles subunidades de “vacunas marcadoras” que, en contraste con las vacunas con MLV,
inducen anticuerpos que pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural utilizando una
prueba diagnóstica de acompañamiento. Las “vacunas marcadoras” registradas en la actualidad se
basan en la principal glicoproteína de la envoltura vírica del CSFV (subunidad E2), y se producen
en los insectos mediante la tecnología de ADN recombinante.
A. INTRODUCCIÓN
Los virus que causan la peste porcina clásica (PPC), la diarrea víral bovina (DVB) y la enfermedad de la frontera
(EF) son miembros de la familia Flaviviridae, género Pestivirus, y están estrechamente relacionados entre sí
tanto antigénica como estructuralmente. Los síntomas clínicos y las lesiones observadas post mórtem en los
cerdos afectados por PPC son muy variables debido a factores dependientes del virus y de los hospedadores.
Además, las infecciones congénitas con pestivirus de rumiantes pueden dar lugar en cerdos a una enfermedad
clínica que es indistinguible de la PPC (31, 33, 35).
Los síntomas más destacados de la enfermedad son su aparición en todos los grupos de edad, acompañada por
pirexia, agrupamiento de animales, inapetencia, torpeza, debilidad, conjuntivitis, estreñimiento seguido de diarrea
y ataxia. Varios días después de la aparición de los síntomas clínicos, las orejas, el abdomen y la parte interna
de los muslos pueden mostrar una decoloración morada. Los animales con la enfermedad en forma aguda
mueren en 1–3 semanas. La muerte súbita en ausencia de enfermedad clínica no es sintomática de la PPC.
En algunas circunstancias relacionadas con la edad del animal y su condición, así como con la cepa de virus
implicado, puede aparecer la enfermedad en forma subaguda o crónica y durar 2–4 semanas o incluso meses.
La enfermedad crónica acarrea una disminución del crecimiento, anorexia, pirexia intermitente y diarrea. Las
infecciones congénitas persistentes pueden pasar indetectables durante meses y limitarse solo a unos cuantos
lechones de la piara o puede afectar a una gran cantidad. Los síntomas clínicos son inespecíficos: debilidad en
ausencia de pirexia. Las infecciones crónicas y persistentes siempre conducen a la muerte del animal. Las tasas
de mortalidad en la piara pueden superar ligeramente el nivel esperado. La PPC afecta al sistema inmune, y una
característica es una leucopenia generalizada, que a menudo puede detectarse antes de la aparición de la fiebre.
La inmunosupresión puede acarrear infecciones concurrentes.
En casos agudos, las lesiones patológicas graves pueden ser a menudo poco llamativas o están ausentes. En
los casos típicos, los nódulos linfáticos se inflaman y enrojecen, y se presentan hemorragias en la serosa, en las
membranas mucosas de los órganos intestinales. Pueden ocurrir infartos del bazo, los riñones, la vejiga urinaria,
la piel y bajo la dermis. En los casos subagudos y crónicos, además de las lesiones anteriores, pueden
observarse úlceras necróticas o en “botón” en la mucosa del tracto gastrointestinal, la epiglotis y la laringe.
Los hallazgos histopatológicos no son patognomónicos. Las lesiones pueden incluir una degeneración
parenquimatosa del tejido linfático, proliferación celular del tejido vascular intersticial y una meningoencefalitis no
supurativa, con o sin desgarro vascular.
Una fuente autorizada ha publicado recientemente una crítica útil sobre el diagnóstico de la PPC y su vacunación
(3) que, a modo de guía general, también proporciona fuentes de información sobre la validación y la opinión
científica acerca de la aplicabilidad de ciertos productos comerciales.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
La variabilidad de los síntomas clínicos y de las lesiones post mórtem no suministran una evidencia firme para
establecer un diagnóstico inequívoco. Otras enfermedades víricas pueden confundirse con la PPC, como la
peste porcina africana, la dermatitis y el síndrome de neuropatía porcinos (PDNS), el síndrome de debilidad
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Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
multisistémica post-destete (PMWS), la púrpura trombocitopénica y varias enfermedades septicémicas como la
salmonelosis (especialmente la producida por Salmonella choleraesuis), la erisipela, la pasteurelosis, la
actinobacilosis (producida por Actinobacillus suis) y las infecciones con Haemophilus parasuis. De hecho, estas
bacterias causan frecuentes infecciones concurrentes y el aislamiento de estos patógenos puede enmascarar al
virus de la PPC (CSFV) como la causa real de la enfermedad. De forma similar, los PDNS pueden enmascarar
una infección latente por PPC.
Por tanto, un diagnóstico presuntivo basado en síntomas clínicos y en lesiones post mórtem debe confirmarse
con las investigaciones en el laboratorio. Dado que la pirexia es uno de los primeros signos de la PPC y está
acompañada por una viremia (7), la detección del virus o del ácido nucleico vírico en sangre, recogida en
heparina, en etiléndiamino tetraacético (EDTA), o en tejidos recogidos de algunos animales febriles, es el método
preferido para detectar las piaras infectadas en la fase inicial.
De este modo, las pruebas laboratoriales de diagnóstico van a ser fundamentales considerando las graves
consecuencias que puede tener un brote de PPC en el mercado de ganado porcino y de sus productos derivados.
Los métodos de laboratorio para el diagnóstico de PPC se dirigen a detectar el virus, el ácido nucleico vírico o los
antígenos víricos, o bien a la detección de los anticuerpos específicos. Para una interpretación correcta de los
resultados de estas pruebas, el inspector veterinario debe prestar una atención particular a la presentación
simultánea de dos o más de los síntomas predominantes de la enfermedad citados anteriormente. Para el
diagnóstico de la PPC no se debe realizar el muestreo al azar. Adicionalmente, se pueden tomar muestras de
sangre de un grupo mayor de cerdos para la detección de los virus y los análisis mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (RT-PCR) pueden recogerse de un número mayor de cerdos.
La PPC está bajo control oficial y el virus tiene un elevado riesgo de dispersión desde el laboratorio: en
consecuencia, debe realizarse un análisis de riesgos para determinar el nivel necesario de seguridad para el
diagnóstico y la caracterización del virus. La instalación debe cumplir los requisitos del Grupo de Contención
apropiado según determina la estimación de riesgos resumida en el capítulo 1.1.2. Bioprotección y seguridad
humana en los laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones de los animales. Los países sin
acceso a un laboratorio regional o nacional especializado de ese tipo, deberían enviar las muestras a un
laboratorio de referencia de la OIE.
Los anticuerpos aparecen en la tercera semana de la enfermedad y persisten durante toda la vida del animal
superviviente. Las muestras para detección de los anticuerpos se recogen en tubos ordinarios (no heparinizados)
cuando hayan transcurrido 3 semanas o más desde que ocurrió el contacto sospechoso con un brote confirmado,
utilizando cerdos convalecientes y piaras en contacto.
1.
Identificación del agente
a)
Métodos inmunológicos
•
Prueba de inmunofluorescencia
La prueba de inmunofluorescencia (IFD) es una prueba rápida que puede utilizarse para detectar el CSFV
en cortes finos de amígdalas, bazo, riñón, nódulos linfáticos o porciones distales del íleon. Los tejidos
deben recogerse de varios animales (febriles y o enfermos) (4) y transportarse sin conservantes en frío,
pero no congelados. Los cortes se tiñen directamente con inmunoglobulina anti-PPC conjugada con
isotiocianato de fluoresceína (FITC) o indirectamente utilizando un conjugado secundario con FITC, y se
examinan en un microscopio de fluorescencia. El tejido de las amígdalas es el más adecuado durante la
primera fase de la infección, ya que es el primero en ser afectado independientemente de la ruta de
infección (25). En casos subagudos y crónicos, el íleon es con frecuencia positivo y a veces, puede ser el
único tejido que muestre fluorescencia. Un resultado negativo por IFD no elimina por completo la presencia
de infección de la PPC. Cuando se mantiene la sospecha de PPC, se deben obtener más muestras o
intentar el aislamiento del virus en cultivo celular (por ejemplo, en riñón porcino [PK-15] u otra línea celular
de origen porcino que sea sensible y que se conozca que está libre de contaminación con Pestivirus).
Existe un riesgo relativamente alto de resultados falsos (positivos y negativos) cuando la IFD es utilizada
por los laboratorios no muy familiarizados con el método. Por tanto, la IFD debería utilizarse solo por
laboratorios que tienen experiencia en el uso de esta técnica, en aplicarla de forma rutinaria y hayan tenido
entrenamiento en la interpretación de la fluorescencia.

Procedimiento de la prueba
En cada serie de muestras de órganos para examen deben incluirse cortes de control positivo y negativo.
i)
Se corta un trozo de las amígdalas, bazo, riñón o íleon, de aproximadamente 1 × 1 × 0,5 cm, y se
monta con un compuesto criostático o con agua destilada en un criostato.
ii)
Se congela el trozo de órgano en el criostato.
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Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
iii)
Se cortan secciones de un grosor menor de 4–8 µm y se montan en cubres libres de grasa de 10 ×
32 mm con una esquina cortada. Todos los cortes se montan con esta esquina en la misma posición
(por ejemplo, arriba a la derecha).
iv)
Después de secar, los cortes montados se fijan con acetona (de grado analítico) durante 10 minutos a
temperatura ambiente, o al aire durante 20 minutos a 37°C.
v)
Los cortes se sumergen brevemente en una solución salina tamponada con fosfato (PBS), se elimina
el exceso de líquido con papel absorbente y se colocan (con la esquina cortada arriba a la derecha) en
una cámara de incubación húmeda con un pequeño volumen de agua colocada en el fondo de la
cámara.
vi)
Se deposita la solución de trabajo de inmunoglobulina anti-PPC en los cortes y se incuban en la
cámara cerrada durante 30 minutos a 37°C. Si se requiere un segundo conjugado con FITC, se lava el
corte cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente, y luego se añade la
dilución de trabajo del conjugado con FITC, incubándose como se ha descrito antes.
vii)
Los cortes se lavan cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente.
viii) Se elimina el exceso de PBS con papel absorbente y se monta el cubre con el tampón de montaje en
un porta para microscopio (con el corte entre el cubre y el porta).
ix)
Se elimina el exceso del líquido de montaje con papel absorbente y se examinan los cortes para la
fluorescencia en un microscopio de luz UV. Un corte positivo para PPC muestra células con
fluorescencia verde brillante. En las amígadalas, la fluorescencia es particularmente evidente en la
línea epitelial de las criptas. En cortes de riñón, la fluorescencia es más abundante en los túbulos
proximales y distales del córtex renal y en los conductos colectores de la médula. En el íleon, la
fluorescencia es más destacable en las células epiteliales de las glándulas de Lieberkünhn, mientras
que en el bazo la reactividad es más difusa, con concentraciones de células linfoides en la lámina
linfoide periarterial (PALS).
La IFD requiere utilizar una inmunoglobulina anti-PPC preparada a partir de un anticuerpo policlonal contra
el CSFV que no distingue entre los antígenos de diferentes pestivirus. Los conjugados utilizados para IFD
en cortes o en cultivos celulares inoculados deben prepararse de gama-globulinas anti-CSFV de cerdos
libres del patógeno específico. La dilución de trabajo de los conjugados (al menos 1/30) debe combinar un
máximo de brillo con un mínimo de fondo. La prueba debería realizarse solo en muestras de animales
recién muertos, dado que la autolisis y la contaminación bacteriana a menudo dan como resultado una
tinción de fondo alta.
Las cepas de virus vacunales vivos modificados (MLV) se multiplican principalmente en los nódulos
linfoides regionales y en el epitelio de las criptas de las amígdalas. Los cerdos vacunados con cepas MLV
pueden dar la prueba IFD positiva 2 semanas después de la vacunación (22, 28). La inoculación en conejo
se utiliza para diferenciar entre las cepas de CSFV adaptadas a conejo y las cepas de campo. A diferencia
de las cepas de campo, las cepas adaptadas a conejo causan una reacción febril e inducen una respuesta
inmune en los conejos cuando se suministran intravenosamente.CSFV adaptadas al conejo. Dado que la
secuenciación del ácido nucleico empieza a estar disponible y es más fiable, la inoculación de los animales
ya no se considera necesaria para diferenciar entre las cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV.
En la prueba IFD, los cerdos infectados con pestivirus de rumiantes pueden dar reacciones positivas falsas.
Las infecciones congénitas con pestivirus de rumiantes pueden ocasionar síntomas clínicos y lesiones
patológicas indistinguibles de las presentes en la PPC crónica (31, 33, 35). Las infecciones por CSFV o por
pestivirus de rumiantes se pueden diferenciar probando sueros de la cerda y de la camada, o de otros
animales en contacto con un lechón IFD-positivo, para anticuerpos neutralizantes frente a cada virus. Si se
aísla el virus o se puede detectar el ácido nucleico vírico utilizando la RT-PCR, las secuencias posteriores
proporcionan una herramienta rápida y precisa para distinguir entre los pestivirus de los rumiantes y el
CSFV.
Otro método para distinguir estos virus es por inoculación de lechones seronegativos con una suspensión
de material sospechoso seguido de al menos 4 semanas de pruebas de neutralización vírica (NV) en sus
sueros para los anticuerpos respectivos. Sin embargo, las pruebas NV pueden durar varios días y los
métodos de inoculación en los animales duran varias semanas.

Diferenciación de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la
inmunoperoxidasa
La utilización de un conjunto de tres anticuerpos monoclonales (MAbs), conjugados con peroxidasa de
rábano (HRPO) o con FITC, o usados en conjunción con un conjugado anti-ratón, que sean capaces de
detectar de modo específico todas las cepas naturales de CSFV, las cepas vacunales de CSFV y los
pestivirus de rumiantes, respectivamente, permitirían, por una parte, una diferenciación inequívoca entre las
cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV y, por otra, distinguir entre el CSFV y otros pestivirus (11,
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Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
36, 38). Un prerrequisito es que el MAb contra el VPPC reconozca todas las cepas de campo y que el MAb
anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el país. No hay ningún MAb que reaccione
selectivamente con todos los pestivirus de los rumiantes (11). En áreas no vacunadas, se puede omitir el
MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal
anti-PPC conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como única
confirmación de que un aislamiento corresponde a la PPC. Un prerrequisito es que el MAb contra el CSFV
reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales
empleadas en el país. No hay ningún MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de
rumiantes (10). En áreas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como
control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-PPC conjugada a HRPO. Se debe tener
cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como la única confirmación de que un aislamiento corresponde
a PPC.

Procedimiento de la prueba
i)
Se cortan ocho o más secciones (4–8 µm) de las amígdalas que son positivas por IFD, o de otro
órgano positivo si no se dispone de amígdalas.
ii)
Se fijan los cortes con acetona (grado análitico) durante 10 minutos en cubres libres y dejar secar al
aire.
iii)
Se preparan diluciones de trabajo de los respectivos MAbs conjugados con peroxidasa en PBS +
0,01% de Tween 80 + suero de caballo al 5%, pH 7,6. (también puede utilizarse MAb conjugado con
FITC, así como MAb sin conjugar siempre que se emplee un conjugado secundario).
iv)
Después de lavar con PBS, se depositan en la dilución de trabajo del conjugado monoclonal
respectivo dos cortes, y otros dos en la dilución de trabajo del conjugado policlonal (controles).
v)
Se incuba durante 1 hora a 37°C en una cámara húmeda.
vi)
Se lavan seis veces los cortes en PBS, durante 10 segundos cada vez.
vii)
Se tiñen los cortes con una solución recién preparada de cromógeno del substrato1 durante 5–
15 minutos a temperatura ambiente.
viii) Se lavan los cortes con acetato sódico 0,05 M, pH 5,0, en agua destilada y montarlos en portas para
microscopía.
ix)
Se examinan las secciones en un microscopio de fondo claro. La tinción del citoplasma de las células
del epitelio de las criptas de las amígdalas de un color rojo oscuro indica el reconocimiento del virus
aislado por el conjugado respectivo, y se considera positivo.
x)
Interpretación de la prueba:
Anticuerpo
policlonal
Anticuerpo monoclonal específico para
Interpretación
Cepa PPC
Cepa PPC vacunal
Cepa DVB/EF
+
+
–
–
Cepa de campo de la PPC
+
+
+
–
Cepa vacunal de la PPC
+
–
–
+
Cepa DVB/EF
+
–
–
–
Otros Pestivirus*, no PPC†
† Se debe considerar siempre la existencia de cepas nuevas de la PPC, y cualquier aislamiento de casos en que se sospeche
la PPC debería enviarse al laboratorio de referencia de la OIE.

Prueba de captura del antígeno
Para un diagnóstico rápido de PPC en cerdos vivos, se han desarrollado enzimoinmunoensayos de captura
del antígeno (ELISA) para investigar en piaras en las que se sospecha que se han infectado recientemente.
Las pruebas ELISA son del tipo de doble anticuerpo en sandwich, que emplean anticuerpos monoclonales
y/o policlonales contra varias proteínas víricas en el suero, en la fracción leucocitaria de la sangre o en
1
A.
Solución de cromógeno del substrato
Solución base de cromógeno: 0,4% de 3-amino-9-etil carbazol; N, N-dimetil-formamida (1 ml). Cuidado, compuesto
TÓXICO. Esas dos sustancias con cancerígenas y producen irritación en los ojos, la piel y el aparato respiratorio
B.
Acetato sódico 0,05 M, pH 5,0; 19 ml (esterilizados por filtración con membrana).
C.
Solución base de substrato (peróxido de hidrógeno al 30%).
Mantener las soluciones base A y C a 4°C en la oscuridad y la solución B a temperatura ambiente. La solución base A puede
mantenerse a 4°C durante al menos 6 meses y la solución C 1 año. Inmediatamente antes de su uso, diluir 1 ml de la solución
A en 19 ml de la solución B. Añadir después 10 µl de la solución base C. Mezclar bien y teñir los cortes.
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Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
sangre completa anticoagulada; además, se pueden utilizar algunos kits de prueba para probar
homogeneizados titulares clarificados (8). La técnica es relativamente simple de realizar, no requiere
servicios de cultivo de tejidos, se puede automatizar y se pueden conseguir los resultados en medio día. La
desventaja de que es menos sensible que el aislamiento del virus, sobre todo en cerdos adultos y en casos
suaves o subclínicos, puede compensarse probando todos los cerdos de la piara sospechosa con pirexia.
No obstante, debe tenerse también en cuenta la baja especificidad de estas pruebas. La prueba no es
apropiada para el diagnóstico de la PPC en un solo animal.
b)
Aislamiento de virus
El aislamiento de virus en cultivos celulares es un método de diagnóstico de PPC más sensible, pero más
lento, que la inmunofluorescencia con cortes congelados. El aislamiento se realiza mejor en células PK-15,
que se dividen rápidamente, y que se siembran sobre cubres simultáneamente con una suspensión de las
amígadalas al 2% en medio de cultivo. Para el aislamiento del CSFV se pueden utilizar otras líneas
celulares, pero deberían ser por lo menos tan sensibles como las células PK-15. Los cultivos se examinan
para focos fluorescentes por IFD después de 24–72 horas o, después de 4 días de incubación, se fijan por
tinción con inmunoperoxidasa.
Para fines de diagnóstico, el órgano más adecuado para aislar el virus de los cerdos muertos o sacrificados
son las amígdalas. Alternativamente, también se pueden utilizar el bazo, el riñón, el íleon o los nódulos
linfáticos.
Un procedimiento detallado del aislamiento de virus es el siguiente:
i)
Se prepara una solución base concentrada 100 veces de glutamina-antibiótico: disolver la glutamina
(2,92 g) en 50 ml de agua destilada (solución A) y se esteriliza por filtración. Se disuelve cada uno de
los siguientes antibióticos en 5–10 ml de agua destilada estéril: penicilina (106 Unidades
Internacionales [UI]; estreptomicina (1 g); mycostatín (5 × 105 U); polimixina B (15 × 104 U); y
kanamicina (1 g). Se juntan estas soluciones (solución B). Se mezclan asépticamente las soluciones A
y B, y se completa hasta 100 ml con agua destilada estéril y se guarda a –20°C en alícuotas de 5 ml.
La constitución exacta del antibiótico no es definitiva siempre que se consiga la esterilidad y las
células no estén afectadas.
ii)
Se cortan en trozos pequeños 1–2 g de tejido y se machacan en un mortero u otro aparato con arena
estéril y un pequeño volumen de medio de cultivo hasta formar una pasta homogénea.
Alternativamente, se puede utilizar una trituradora a 4°C.
iii)
Se hace una suspensión al 20% (p/v) añadiendo solución salina equilibrada de Hanks (BBS) o medio
mínimo esencial de Hanks (MEM); por cada 10 ml de suspensión, se añade 1 ml del base de
glutamina-antibiótico. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente hasta 1 hora.
iv)
Se centrifuga a 1.000 g durante 15 minutos
v)
Se tripsiniza una monocapa de células PK-15, se centrifuga la suspensión celular a 160 g durante
10 minutos y se resuspende para que contenga aproximadamente 2 × 106 células/ml en medio de
cultivo (MEM de Eagle con sales de Earle; 5% de suero bovino fetal libre de pestivirus de rumiantes y
de anticuerpos contra pestivirus; y 0,2 ml de la solución stock de glutamina-antibiótico por cada 10 ml
de la suspensión celular). Como guía, una botella de 75 cm2 dará aproximadamente 50 ml de
suspensión celular a una concentración adecuada.
vi)
O bien:
Inoculación con la suspensión. Se mezclan nueve partes de la suspensión celular (del paso (v)) y una
parte del sobrenadante (del paso (iv)) y se inocula 1,0–1,5 ml en 6–8 tubos Leighton con cubres, o en
otros recipientes apropiados de cultivo celular. Tres tubos se inoculan como controles con solo 1,0–
1,5 ml de suspensión celular. Después de completar las inoculaciones de la muestra, se inoculan tres
tubos como controles positivos con CSFV. Hay que tener cuidado en evitar la contaminación con esta
suspensión vírica positiva. También deben prepararse cultivos negativos. Se incuba a 37º.
O:
Inoculación por monocapas preformadas: para cada tejido, inocular 1,0–1,5 ml de suspensión de
células (preparadas como en el paso (v)) en 6–8 tubos de Leighton con cubres u otros frascos de
cultivo celular apropiados. Se Incuba a 37°C durante un mínimo de 4 horas y un máximo de 36. Luego
se escurre el medio, se inocula 0,2 ml de líquido sobrenadante (del paso (iv)), se incuba durante
1 hora a 37°C, se lava y se recubre con 1 ml de medio de crecimiento y se incuba a 37°C.
vii)
6
En los días 1, 2 y 3 post-inoculación, se lavan dos cultivos, junto con un cultivo control positivo y otro
negativo, dos veces durante 5 minutos cada vez con BBS de Hanks, MEM de Hanks o PBS, se fijan
con acetona fría (de grado analítico) durante 10 minutos, y se tiñen con un conjugado directo anti-
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Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
CSFV a la dilución de trabajo apropiada, o bien se tiñen indirectamente, como se describe en la
Sacción B.1.a.
Si la suspensión de amígdalas al 2% resulta tóxica para las células, la prueba debe repetirse utilizando
una dilución mayor u otro órgano. El uso del método en el que se emplean monocapas preformadas
(indicado antes) nos ayudará a evitar la repetición de la prueba.
viii) Después de lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una, los cubres se montan en 90% de
glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, pH>8,0, y se examinan para focos de fluorescencia.
En lugar de tubos Leighton, pueden utilizarse placas de 6 pocillos con cubres. Alternativamente, pueden
usarse también para el aislamiento del virus cultivos en placas de microtitulación de fondo plano o placas
M24. En tal caso, las placas se fijan y se tiñen como se describe más adelante para la prueba de
neutralización ligada con peroxidasa (NPLA).
La sangre completa (tratada con heparina o EDTA) de cerdos clínicamente enfermos es una muestra
adecuada para diagnosticar PPC. Se puede utilizar la fracción de leucocitos u otros componentes, pero por
razones de sensibilidad y sensibilidad, es preferible la sangre completa (10). El procedimiento es el
siguiente:
i)
Se congela una muestra de sangre completa a –20°C y se descongela en un baño a 37°C.
ii)
Se inoculan 300 µl de sangre hemolizada en una monocapa de células PK-15 crecidas hasta un 75%
de confluencia2 en una placa M24, y se permite la adsorción durante 1 hora a 37°C.
iii)
Se elimina el inóculo, se lava la monocapa una vez con BBS de Hanks o MEM de Hanks, y se añade
medio de cultivo.
iv)
Después de una incubación de 3–4 días, las placas se lavan, se fijan y se tiñen, como se describe
más adelante para NPLA, utilizando en cada paso un volumen de 300 µl para compensar la mayor
superficie celular.
Nota: este método es menos sensible que el aislamiento convencional del virus para la detección de PPC
aguda.

Reacción en cadena de la polimerasa de trascripción inversa
Se han descrito muchos métodos de (RT-PCR) y otros se están aún desarrollando (20). Este método
aceptado internacionalmente es rápido y más sensible que los ELISA de captura de antígeno, el aislamiento
vírico o la RT-PCR, lo que lo hace particularmente adecuado para el diagnóstico preclínico. Se han descrito
varios protocolos de PCR convencionales y en tiempo real (14, 20, 24, 26, 27) y se puede obtener un
protocolo adecuado en la literatura o en los laboratorios de referencia de la OIE para la PPC (véase el
cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres). Debido a su rapidez y sensibilidad, la RT-PCR
posee un enfoque adecuado para analizar casos sospechosos de enfermedad y está aceptada por varios
países y por la Unión Europea (1). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que pueden ocurrir resultados
positivos falsos debidos a la contaminación del laboratorio así como resultados negativos falsos debidos a
los inhibidores contenidos en la muestra. Cualquier resultado positivo de brotes deberían confirmarse
siempre con otras pruebas. Es obligatorio incluir un número adecuado de controles positivos y negativos en
cada serie; también es recomendable que se incluyan controles internos. Para posteriores detalles sobre las
técnicas de PCR, véase el capítulo 1.1.5. Validación y control de calidad de los métodos de reacción en
cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
La prueba puede aplicarse a muestras de sangre individual o colectiva así como a órganos sólidos, y se ha
utilizado con éxito para controlar brotes.
La epidemiología molecular de la PPC se basa en la comparación de diferencias genéticas entre los virus
aislados. La amplificación del ARN del CSFV por RT-PCR y la secuenciación nucleotídica es el método más
simple de obtener los datos de secuencias para hacer estas comparaciones. Se pueden analizar varias
regiones diferentes del genoma del CSFV para estudios epidemiológicos moleculares (23). Se han
estudiado en particular dos regiones que permiten suministrar muchos datos de la secuencia para comparar
nuevos aislamientos. Una de estas zonas se encuentra en la región 5’ no codificante (5’NCR) del genoma
(150 nucleótidos) y la otra en el gen de la glicoproteína mayor E2 (190 nucleótidos). En resumen, el método
usado consiste en extraer el ARN vírico de cultivos de células PK-15, realizar una RT-PCR para amplificar
una o ambas zonas dentro de 5’NCR o del gen E2, y luego determinar la secuencia nucleotídica de los
productos y comparar con la información acumulada en las bases de datos. En el Laboratorio de Referencia
de la OIE para PPC (Hanover, Alemania) existe una base de datos disponible de estas secuencias. Los
CSFV aislados de brotes primarios deben enviarse a un laboratorio de referencia de la OIE para
2
La inoculación simultánea, aunque ligeramente más sensible, es menos adecuada pues el anticoagulante puede interferir
con la adhesión de las células a la superficie.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
7
Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
investigación epidemiológica molecular. Se debe obtener un permiso de importación antes de su envío.
Recientes descubrimientos sobre el análisis de secuencias de los pestivirus de los rumiantes destacan la
necesidad de analizar múltiples regiones con el fin de clasificar las cepas por este método (15).
2.
Pruebas serológicas
La detección de los anticuerpos específicos contra el virus es útil cuando se sospechan infecciones con cepas de
PPC de baja virulencia. Debido al efecto inmunosupresor del VPCC, no se pueden detectar anticuerpos hasta
21 días post-infección. Las investigaciones serológicas dirigidas a detectar focos residuales de infección,
especialmente en piaras de producción, pueden ser también útiles para la erradicación de PPC en una fase
terminal.
Como la incidencia de la infección con pestivirus de rumiantes puede ser elevada en instalaciones de cría, solo
resultan útiles las pruebas que discriminen entre anticuerpos contra PPC y contra DVB/EF. Las pruebas NV y
ELISA que utilizan MAbs satisfacen los requisitos de sensibilidad, pero los resultados positivos deberían
confirmarse por pruebas NV comparativas.
Las pruebas de neutralización se realizan en cultivos celulares utilizando un método virus constante/suero
variable. Como el CSFV no es citopático, cualquier virus no neutralizado debe detectarse, tras su multiplicación,
por un sistema indicador. La NPLA (29) y la prueba de neutralización vírica con anticuerpo fluorescente (FAVN)
(18) son las técnicas más ampliamente utilizadas. Ambas pruebas se pueden llevar a cabo en microplacas. El
sistema NPLA es actualmente el preferido, es fácil de leer y tiene la ventaja de que puede determinarse mediante
el uso de un microscopio de luz invertida, aunque puede realizarse a simple vista una primera valoración del
título.
a)
Prueba de la neutralización ligada a la peroxidasa (prueba obligada para el comercio
internacional)
La NPLA se realiza en placas de microtitulación de fondo plano. Los sueros se inactivan antes a 56°C
durante 30 minutos. A efectos del mercado internacional, es mejor probar una dilución inicial de suero de
1/5 (dilución final 1/10). Para los programas de seguimiento en un país, puede ser suficiente una dilución al
1/10. En cada prueba deben incorporarse los controles apropiados para asegurar la especificidad y la
sensibilidad de las reacciones.

Procedimiento de la prueba
i)
En dos pocillos de una placa de microtitulación se depositan 50 µl de diluciones de suero en medio de
crecimiento (MEM de Eagle, suero fetal bovino al 5% y antibióticos). El suero fetal bovino debe estar
libre de BVDV y de anticuerpos contra dicha enfermedad. Para cada muestra se puede incluir un
tercer pocillo con suero y sin virus como un control del suero (para citotoxicidad y/o tinción
inespecífica).
ii)
Se añade a los pocillos 50 µl de suspensión vírica, diluida en un medio de crecimiento hasta contener
aproximademente 100 DICT50/50 µl, y se mezcla el contenido en un agitador de microplacas durante
20 segundos.
iii)
Se incuban las placas en un incubador de CO2 durante 1 hora a 37°C.
iv)
Se añaden a todos los pocillos 50 µl de medio de crecimiento con 2 × 105 células/ml.
v)
Se dejan crecer las células a 37º en una atmósfera con un 5% de CO2 hasta confluencia, normalmente
en 3–4 días.
vi)
Se elimina el medio de crecimiento y se lavan las placas una vez con NaCl 0,15 M.
vii)
Se secan las placas en papel absorbente.
viii) Las monocapas celulares pueden fijarse por uno de los siguientes métodos:
8
•
Se incuban las placas 45 minutos a 37°C, y luego a –20°C durante al menos 45 minutos. Se
sacan las placas del congelador, se llenan los pocillos con 100 µl de paraformaldehido al 4% en
PBS y se reincuban a temperatura ambiente durante 5–10 minutos. Se elimina el
paraformaldehido y las placas se lavan con NaCl 0,15M; o
•
Se incuban las placas a 70–80°C durante 1–2 horas; o
•
Se fijan las placas en acetona al 80% y se incuban a 70–80º durante una hora; o
•
Se fijan las placas en acetona al 20% en PBS durante 10 minutos seguidos de un secado total a
25–30°C durante 4 horas. (Esto se puede acelerar mediante la ayuda de un secador de pelo – se
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
obtiene un secado completo después de 3–5 minutos – según se observa por el color
blanquecino de la monocapa celular).
ix)
Se añade a cada pocillo 50 µl de un suero porcino hiperinmune contra la PPC o un anticuerpo
monoclonal, diluido en NaCl 0,5 M que contiene 1% de Tween 80 + 0,1 ml de azida sódica, pH 7,6.
Incubar a 37°C durante 15 minutos. La dilución de trabajo del antisuero debe determinarse mediante
titulación previa: es decir, un suero con un título por NPLA de 1/30.000 puede utilizarse a 1/100.
x)
Se lavan cinco veces las placas con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6.
xi)
Se añaden a cada pocillo 50 µl de un conjugado de Ig-HRPO anti-cerdo o anti-ratón (según
convenga), diluido a su dilución de trabajo con NaCl 0,5 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6, y
luego se incuba durante 10 minutos a 37°C.
xii)
Se lavan las placas cinco veces con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6.
xiii) Se añaden 50 µl de solución de cromógeno del substrato a cada pocillo y teñir durante 15–30 minutos
a temperatura ambiente. Esta solución se describe en la Sección B.1.a. “Diferenciación de pestivirus
mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa”.
xiv) Se lee la prueba visualmente. Las capas celulares infectadas se tiñen total o parcialmente de color
marrón rojizo. Debe examinarse la monocapa por microscopía a baja resolución para determinar el
punto final de la titulación. El citoplasma de las células infectadas se tiñe de rojo oscuro.
xv)
En la prueba se incluyen los siguientes controles: control de células, de suero positivo y de titulación
del virus problema. La titulación del virus debe confirmar que el virus se ha utilizado a una
concentración entre 30 y 300 DICT50/ 50 µl.
Nota: El tiempo de incubación dado anteriormente es solo como orientación. Para conservar los reactivos,
pueden utilizarse tiempos de incubación mayores con diluciones de reactivos adecuadas a dichos tiempos.
b)
Prueba de neutralización vírica con anticuerpos fluorescentes (prueba prescrita para el comercio
internacional)
i)
Se siembra una suspensión de células PK-15 a una concentración de 2 × 105 células/ml en tubos
Leighton con un cubre.
ii)
Se incuban los cultivos 1–2 días a 37°C hasta que alcancen el 70–80% de confluencia.
iii)
Se inactivan los sueros durante 30 minutos a 56°C. A efectos del mercado internacional, es mejor
probar con una dilución inicial del suero de 1/5 (dilución final 1/10).
iv)
Se incuban durante 1–2 horas a 37°C volúmenes iguales de suero diluido y de suspensión vírica que
contenga 200 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) por 0,1 ml durante 1–2 horas a
37ºC. De esta forma se utiliza una cantidad constante de CSFV de 100 DICT50 por cada pocillo de
reacción.
v)
Se retiran los cubres de los tubos Leighton, Se lavan brevemente en medio sin suero, Se cubre la
capa celular con la mezcla virus/suero (del paso iv) e incubar durante 1 hora a 37°C en una atmósfera
húmeda.
vi)
Se colocan los cubres en un tubo Leighton limpio y se incuban los cultivos en un medio de
mantenimiento durante dos días más.
vii)
Se retiran los cubres de los tubos Leighton, se lavan las monocapas dos veces con PBS, pH 7,2,
durante 5 minutos cada vez, se fijan con acetona pura durante 10 minutos y se tiñen con la solución
de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37°C antes de lavar.
viii) Se montan los cubres en portas sin grasa con 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato,
pH > 8,0, y se examinan para flluorescencia.
Cuando la prueba FAVN se realiza en placas de microtitulación, se puede seguir el procedimiento para la
NPLA (ver más adelante) hasta el paso (viii). Las placas se tiñen a continuación con la dilución de trabajo
del conjugado durante 30 minutos a 37°C y se examinan para fluorescencia. Nota: cuando se detecte la
fluorescencia, las microplacas se examinan mejor desde arriba, utilizando una lente objetivo de longitud
focal larga.
En ocasiones, los sueros de cerdos infectados con el BVDV o el BDV reaccionan a baja dilución en las
pruebas FAVN o NPLA como si estuvieran infectados por el CSFV. La intensidad de la reacción cruzada
depende de la cepa de pestivirus del rumiante que esté implicada y del intervalo entre la infección y el
tiempo de muestreo (37). Los altos niveles de anticuerpos que se alcanzan normalmente después de
exposición a la infección por PPC, incluso con cepas de baja virulencia, permiten el uso de diluciones
relativamente altas en las pruenas NPLA para anticuerpos contra PPC, lo que evita muchas, aunque no
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
9
Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
todas, las reacciones cruzadas (29, 30). En caso de duda continuada, son útiles las pruebas comparativas
que utilizan una cepa de CSFV, una cepa de BVDV y una cepa de BDV que sean representativas del país o
de la región. Las pruebas comparativas de neutralización son titulaciones a punto final en las que la misma
serie de diluciones dobles de la muestra de suero sospechoso se prueba por duplicado contra 100 DICT50
de cada cepa vírica seleccionada. Las pruebas comparativas se realizan según los protocolos descritos
para FAVN o NPLA; las líneas celulares deben ser adecuadas para el BVDV y el DVB. Los títulos de
neutralización se expresan como el inverso de la dilución más alta de suero que evita el crecimiento celular
en el 50% de dos pocillos duplicados. Una diferencia de tres veces o más entre los puntos finales de dos
titulaciones debe considerarse decisiva para una infección por la especie de virus que da el título más alto.
Para obtener un resultado definitivo, podría ser necesario utilizar diferentes cepas del mismo genotipo, y/o
probar varios cerdos de una piara infectada.
c)
Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional)
Las técnicas competitivas, bloqueantes e indirectas pueden utilizarse con cualquier soporte adecuado y se
han descrito varias de ellas (por ejemplo: 5, 13, 17, 21, 34). Las pruebas utilizadas deben minimizar las
reacciones cruzadas con el BVDV y otros pestivirus. Sin embargo, el sistema de prueba debe asegurar la
identificación de todas las infecciones de PPC, y a todas las fases de la respuesta inmune a la infección.
Antígeno: El antígeno debe derivar de, o corresponder a, proteínas víricas de una de las cepas
recomendadas de CSFV. Las células utilizadas para preparar antígeno deben estar libres de cualquier otra
infección con Pestivirus.
Antisueros: Los antisueros policlonales para pruebas competitivas o bloqueantes deben obtenerse de
cerdos o conejos infectados con una de las cepas recomendadas de CSFV o con la cepa C adaptada a
conejo. Los MAbs deben estar dirigidos contra una proteína vírica inmunodominante del CSFV. Los
ensayos indirectos deben utilizar una inmunoglobulina anti-cerdo que detecte tanto IgG como IgM.
La sensibilidad de la prueba ELISA debe ser lo bastante grande como para considerar positivo cualquier
suero de animal convaleciente, es decir, que reaccione en la prueba de neutralización al menos 21 días
después de la inoculación. La prueba ELISA solo puede utilizarse con muestras de suero o plasma
derivadas de cerdos individuales. Si el procedimiento ELISA empleado no es específico para la PPC, las
muestras positivas deben analizarse además por pruebas diferenciales para distinguir entre PPC e
infecciones por otros pestivirus.
El ELISA bloqueante de captación de complejos (5) es un método de un solo paso muy adecuado para
utilizar en sistemas ELISA automatizados. Los sueros se emplean sin diluir. La prueba es rápida y fácil de
realizar, y detecta anticuerpos contra las cepas de CSFV de baja virulencia en las primeras fases de la
infección. Como los MAbs son específicos para el CSFV, el ELISA bloqueante de captación de complejos
detectará anticuerpos contra el BVDV solo muy raramente, aunque los anticuerpos contra EF pueden ser
más problemáticos. Los sueros positivos se vuelven a probar por NPLA para confirmación.
Recientemente se ha descrito un nuevo ELISA que utiliza proteínas de fusión derivadas de péptidos víricos
(19). Se alega que esta prueba proporciona una mayor sensibilidad y una detección de anticuerpos más
rápida que las obtenidas mediante el ELISA convencional, pero, en este momento, se desconoce su
reactividad con el anticuerpo causada por diversas cepas de la PPC.
Se puede obtener más información sobre los kits comerciales de los laboratorios de referencia de la OIE.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
No existen vacunas eficaces con virus completo inactivado contra la PPC.
C1. vacunas con virus vivos modificados
Las vacunas de tipo MLV se producen con cepas de CSFV que se atenúan mediante pases en cultivo celular o
en una especie hospedadora adecuada que no pertenezca a la familia Suidae. La producción se lleva a cabo en
cultivos celulares o en no-Suidae basándose en un sistema de lotes de siembra. Este debe ser validado respecto
a identidad, esterilidad, pureza, seguridad, ausencia de transmisión, estabilidad e inmunogenicidad.
Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el capítulo 1.1.8 Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el capítulo 1.1.8 son de naturaleza general y
puede suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
10
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
El servicio de producción de vacunas debe funcionar bajo adecuadas medidas y prácticas de bioseguridad. Si se
utiliza el CSFV para producción de vacunas o para estudios de desafío de las vacunas, la parte del servicio
donde se realiza este trabajo debe cumplir los requisitos de Contención del Grupo 4 de patógenos como se
señala en el capítulo 1.1.2.
Para producir un lote de siembra y una vacuna final de alta calidad, se deben determinar las condiciones
óptimas para la obtención del virus. Para las vacunas producidas en cultivos celulares, se deben hacer
experimentos con curvas de crecimiento para estudiar el efecto de la composición del medio, de la regulación del
pH y del contenido atmosférico del CO2, la concentración inicial de células sembradas, la relación entre la
superficie de la capa celular y el volumen de medio, la fase de crecimiento de las células al tiempo de la infección
vírica, condición estacionaria o rotatoria del cultivo durante la replicación vírica, etc. Para las vacunas producidas
en animales, los factores que deben ser investigados para determinar el máximo de crecimiento vírico y los
tejidos a recoger son, entre otros, la edad, raza, peso, tamaño del inóculo (número de ID50 animal [dosis
infecciosa del 50%]), patogénesis de la infección, y síntomas clínicos.
Cualquiera que sea el método de producción, el substrato debe recogerse en condiciones asépticas y someterse
a un ciclo de congelación y descongelación para liberar los virus asociados a las células. Los elementos
celulares grandes o los restos de tejidos se eliminan por filtración o centrifugación a baja velocidad. Se añade un
estabilizador, como lactosa, a una concentración final de 5%. La vacuna se homogeniza antes de su liofilización
para asegurar un lote uniforme.
En el producto final, el virus vacunal no debe diferir del material utilizado para validar el lote de siembra en más
de cinco pases. La vacuna comercial debe producirse en lotes en forma liofilizada como un producto homogéneo.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Para validar un lote de siembra de una vacuna MLV contra la PPC, las muestras del inóculo de siembra
deben superar primero varios experimentos piloto. Excepto para pruebas de confirmación de identidad,
esterilidad, pureza y estabilidad de la atenuación, los experimentos piloto también deben realizarse con
muestras representativas del producto comercial final. Estas muestras se deben originar del mismo lote de
siembra probado antes.
A menos que se especifique de otro modo, todos los cerdos utilizados en pruebas piloto son cerdos sanos de
6–8 semanas de edad, sin anticuerpos contra CSFV y BVDV, de la misma raza y origen, agrupados al azar si
es necesario, y mantenidos en las mismas condiciones. Las cerdas gestantes deben ser de igual paridad.
El virus de siembra debe ser estéril e inducir anticuerpos neutralizantes que sean específicos contra una
cepa virulenta de CSFV en cerdos.
b)
Método de cultivo
La producción se realiza en cultivos celulares o en un hospedador adecuado de una especie que no
pertenezca a la familia Suidae.
c)
Validación como vacuna
i)
Pureza
La vacuna debe ser virológicamente pura.
Cada uno de tres cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus del
lote de siembra equivalente a diez veces la cantidad de virus contenido en una dosis de vacuna. Esto
se repite 3 semanas después utilizando la misma dosis y vía de administración. Se toman muestras de
suero 2 semanas después de la última inoculación y se analizan por el método más sensible para
ausencia de anticuerpos contra los virus de la peste porcina africana, enfermedad de Aujeszky, DVB,
fiebre aftosa (todos los tipos), gastroenteritis transmisible, enfermedad vesicular porcina, síndrome
porcino reproductivo y respiratorio, gripe porcina (tipos H1N1 y H3N2), y contra adenovirus porcinos,
teschovirus porcinos (tipos 1 y 2), parvovirus porcino y circovirus porcino (tipos 1 y 2)
ii)
Seguridad
Las vacunas deben ser probadas para cualquier efecto patogénico en cerdos sanos y también en
cerdos que pueden ser inmunodeprimidos debido a la presencia de infección o medicación
concurrente, y también deben probarse para garantizar que la vacuna no atraviesa la placenta en el
caso de cerdas preñadas.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
11
Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
En las pruebas de seguridad en cerdos convencionales, uno de cada diez cerdos seronegativos se
inocula intramuscularmente con diez dosis de vacuna. Otros diez cerdos sirven de control. Todos los
cerdos se observan durante las 3 semanas siguientes. Diariamente se anotan las temperaturas
corporales y se toman muestras de sangre con un anticoagulante durante la primera semana. Se
anotan sus pesos en el momento de la inoculación y 2 semanas más tarde. Ningún animal debe morir
o mostrar síntomas de enfermedad causada por el virus de la vacuna (lote de siembra). La
temperatura diaria media del cuerpo no debe alcanzar o superar los 40,5°C durante el período de la
prueba. El aumento diario de peso medio no debe descender significativamente (p< 0,05) respecto al
del grupo control. Se puede despreciar la leucopenia (número de leucocitos < 7 × 106 células/ml) si
solo ocurre en un cerdo durante 1 día.
Para garantizar el debilitamiento, incluso en los cerdos inmunodeprimidos, cada uno de diez cerdos se
inmunodeprime mediante inyecciones diarias con 2 mg de prednisolona/kg de peso corporal durante 5
días consecutivos. Al día 3 cada animal se inocula con el equivalente de una dosis de vacuna, y se
observa durante las tres semanas siguientes. Ningún animal debe morir o enfermar debido al virus
vacunal.
Para garantizar la inocuidad en animales preñados, cada una de diez cerdas gestantes de 25–35 días,
se inoculan intramuscularmente con el equivalente de una dosis de vacuna. Otros diez animales de la
misma paridad y gestación sirven de control. La vacunación no debe de interferir con la gestación a
término, y el número de lechones vivos nacidos del grupo de prueba no debe ser significativamente
menor (p<0,05) que el del grupo control.
Para ensayos de campo se utiliza un mínimo de 200 cerdos paridos y criados por al menos 20 cerdas,
y que sean seronegativos para CSF y BDV. Las camadas se distribuyen del mismo modo en dos
granjas por lo menos. La mitad de los lechones de cada camada se inoculan intramuscularmente a los
7–14 días de edad con el equivalente de una dosis de vacuna. Los lechones no inoculados son los
utilizados como controles. Todos los lechones se pesan al tiempo de la inoculación y 2 semanas más
tarde, y se observan durante 3 semanas. Una tasa de mortalidad que supera el 5% debido a causas
ajenas a la vacunación invalida la prueba. Ningún animal debe morir o mostrar signos de la
enfermedad debido al virus vacunal. El peso medio ganado por los lechones inoculados no debe ser
un 20% menor que el de los controles durante las 2 semanas post-inoculación.
iii)
Ausencia de transmisión
Para confirmar la ausencia de transmisión, se dividen 24 cerdos seronegativos en cuatro grupos
iguales. En cada grupo se inoculan cinco cerdos intramuscularmente con el equivalente de una dosis
de vacuna. El resto de los cerdos representa los controles. Todos los cerdos se inoculan 6 semanas
después como desafío con al menos 105 PID50 (dosis infecciosa del 50% de los cerdos) de una cepa
virulenta de CSFV. Todos los animales control deben ser serológicamente negativos al tiempo del
desafío, y morir después durante las 3 semanas siguientes. Todos los cerdos vacunados deben
permanecer sanos y sobrevivir.
iv)
Estabilidad de la atenuación
Para confirmar la estabilidad de la atenuación vírica, cada uno de dos cerdos se inocula
intramuscularmente con una cantidad de virus de lote de siembra equivalente a 100 dosis de vacuna y
se sacrifican 6–7 días después. Se juntan las amígdalas de ambos cerdos y se prepara una
suspensión al 10% en PBS, pH 7,2. Esto se usa para inocular intramuscularmente otros dos cerdos
con 2 ml y luego se sacrifican 6–7 después. Este protocolo se repite 5 veces. Durante estos pases, el
tejido de amígdalas se puede guardar a 4°C, si el almacenamiento es menor de 24 horas, o a –70°C
por períodos más largos. Al mismo tiempo, la presencia del antígeno de PPC se confirma en cada
pase por una prueba directa de IFD en cortes finos de las amígdalas o por aislamiento del virus en un
substrato adecuado. Si después de un cierto pase no se puede demostrar CSFV o antígeno, se realiza
una segunda serie de pases para mostrar infección, comenzando con los últimos dos cerdos de la
serie previa.
Se inoculan intramuscularmente cinco cerdos con el sexto pase del virus del lote de siembra,
equivalente a una dosis de vacuna o, si no se ha alcanzado este pase, con el pase más alto de las dos
series en que se detectó virus o antígeno vírico. Se inoculan de modo similar cinco cerdos adicionales
con una dosis de virus del lote de siembra, equivalente a una dosis de la vacuna. Todos los cerdos se
pesan al mismo tiempo de la inoculación y de nuevo 2 semanas más tarde. Se recoge sangre
diariamente con anticoagulante durante la primera semana, y todos los cerdos se mantienen bajo
observación durante 3 semanas. Ningún animal debe morir o enfermar por el virus de la vacuna. El
peso medio adquirido en los dos grupos durante las primeras 2 semanas no debe diferir
significativamente (p<0,05). Cuando mucho, se permite leucopenia (número de leucocitos < 7 × 106
células/ml) en un cerdo de cada grupo durante 1 día.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
v)
Inmunogenicidad
Para demostrar una inmunogenicidad adecuada, se inoculan diez cerdos con una cantidad de virus
equivalente a una dosis de vacuna cada uno, y otros dos cerdos se mantienen por separado no
inoculados como controles. Todos los cerdos se someten una inoculación de desafío 7 días después
con 105 PID50 de una cepa virulenta de CSFV. Solo deben morir los controles.
En una prueba para establecer la duración de la inmunidad, se inoculan diez cerdos con unas dosis de
vacuna cada uno y otros dos se mantienen por separado como control. Seis meses después, los
sueros de los cerdos inoculados se prueban para anticuerpos contra PPC; al menos ocho cerdos
deben resultar positivos. Todos los cerdos se inoculan después en desafío con al menos 105 PID50 de
una cepa virulenta de VPCC y se observan durante 3 semanas. Solo deben morir los controles.
Para determinar la protección al desarrollo del síndrome de la cerda portadora, se dividen al azar
20 cerdas grávidas en la misma fase de gestación en dos grupos. Un grupo se vacuna una o dos
veces con una cantidad equivalente a una dosis de vacuna, y cuatro semanas después de la última
inoculación se inoculan intranasalmente con una cepa de campo de baja virulencia, junto con las
cerdas control no vacunadas. Todas las cerdas se sacrifican 4 semanas después y los fetos se
examinan para presencia de CSFV o antígeno vírico. La vacunación debería reducir de modo
significativo la transmisión transplacentaria del virus.
En las condiciones de conservación prescritas por el fabricante para el producto final, un volumen de
virus equivalente a una dosis de vacuna debe mantener su inmunogenicidad por lo menos hasta el
final de la caducidad que se indique.
2.
Método de producción
Cada lote de vacuna de tipo MLV contra la PPC debe derivar del mismo lote de inóculo utilizado para las pruebas
piloto. Además, cada lote debe prepararse de acuerdo con el protocolo de producción y bajo las condiciones
expresadas para registrar el producto final. Las propiedades de cada lote y las del lote de siembra deben ser
uniformes.
3.
Control del proceso
El protocolo de producción dependerá de la cepa vacunal, del sistema de producción (animales o cultivos
celulares) y de los servicios disponibles. Las normas para vacunas obtenidas de cultivos celulares pueden variar
en función del sistema de producción, es decir, si proceden de cultivos primarios, líneas celulares, monocapas o
cultivos en suspensión.
4.
Control de lotes
Todos los cerdos utilizados en las pruebas de control deben tener 6–8 semanas y estar libres de anticuerpos
contra el CSFV o el BVDV. Deben tener un origen, raza, y crianza uniforme y, cuando sea necesario, estar
distribuidos en grupos aleatorios.
a)
Identidad
La vacuna debe inducir anticuerpos neutralizantes específicos contra una cepa viruenta de CSFV.
b)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación de materiales biológicos se presentan en el
capítulo 1.1.9
c)
Inocuidad
Se inoculan intramuscularmente tres cerdos con diez dosis cada uno de la vacuna reconstitiuida, en una
única inyección. Los cerdos se observan durante 3 semanas y se toma diariamente la temperatura corporal
durante la primera semana. Ningún cerdo debe morir o mostrar síntomas de la enfermedad atribuidos a la
vacuna, su temperatura corporal diaria no debe alcanzar nunca los 40,5°C o más, y deben crecer
normalmente.
d)
Pureza
El lote debe ser virológicamente puro. Para probar esto, se inoculan intramuscularmente tres cerdos con
diez dosis de vacuna cada uno. Se recogen muestras de suero al tiempo de la inoculación y 5 semanas
después. Los sueros se prueban para los anticuerpos contra el DVB (neutralización durante 1 hora a 37°C)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.8.3. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
y contra parvovirus porcinos (inhibición de la hemaglutinación utilizando cuatro unidades hemaglutinantes).
Los tres cerdos deben permanecer sin enfermedad. No es necesario realizar pruebas para pureza biológica
con vacunas producidas en conejos.
e)
Potencia
La potencia se expresa como el número de dosis protectoras del 50% (PD50) contenidas en una dosis de
vacuna. Una dosis de vacuna tiene al menos 100 PD50.
Se inoculan intramuscularmente dos grupos de cinco lechones de 6–8 semanas con una dilución 1/40 y
1/160 de la vacuna reconstituida, respectivamente, utilizando solución salina tamponada, pH 7,2. Dos
semanas después, los cerdos vacunados y dos cerdos control se inoculan intramuscularmente con
105 PID50 de una cepa virulenta de CSFV como desafío. Los cerdos se observan durante las dos semanas
siguientes, período en el que los controles deben morir. Usando métodos estadísticos normales, a partir de
los cerdos sobrevivientes que no muestran síntomas de PPC, se calcula el número de PD50 contenido en la
vacuna.
La prueba de potencia se puede reemplazar por una prueba de infectividad, siempre que el fabricante
pueda demostrar que existe una relación clara y reproducible entre el contenido del virus de la vacuna y la
protección que confiere a cerdos en una inoculación de desafío.
f)
Estabilidad
El período de validez de un lote de vacuna liofilizada contra la PPC no debe ser menor de 1 año.
C2. Vacunas marcadoras
Pese a la existencia de vacunas MLV seguras y eficaces contra la PPC, su uso no ha sido favorecido en la Unión
Europea y algunos otros países libres o casi libres de PPC, debido a que los anticuerpos que inducen tales
vacunas no pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural. Esta desventaja no se presenta en una
“vacuna marcadora” que permite distinguir entre los animales infectados y los vacunados (DIVA). Es capaz de
provocar una respuesta inmune protectora que puede distinguirse de la respuesta inmune inducida por el virus
natural. Un prerrequisito adicional de la estrategia de cualquier DIVA es la disponibilidad de una prueba
serológica acompañante que es muy discriminatoria para demostrar la ausencia de infección y para el rastreo de
infecciones residuales.
Las exigencias mínimas para las vacunas marcadoras contra la PPC y las pruebas discriminatorias
acompañantes se resumen del siguiente modo (5):
a)
Vacuna
La vacuna debe suministrar protección frente a cualquier contacto con el virus natural (es decir, puede
prevenir signos clínicos y la re-excreción del virus).
La eficacia de la vacunación debe demostrarse experimentalmente mediante estudios que analicen la
transmisión del virus natural en grupos de cerdos vacunados. El efecto protector de la vacunación debe
alcanzarse en el menor tiempo posible, preferiblemente antes de 2 semanas. Con preferencia, la protección
rápida y fiable debe obtenerse después de una única aplicación. Además, debe asegurarse que la infección
de cerdas gestantes vacunadas no ocasiona infección transplacentaria ni el nacimiento de crías con
infección congénita por CSFV. La duración de la inmunidad debe ser superior a 6 meses.
Hay muchas vacunas marcadoras contra la PPC en fase de desarrollo. En la Unión Europea se han
registrado hasta ahora dos. Ambas son vacunas con subunidades, que emplean como inmunógeno la
glicoproteína E2 del CSFV y que se han sometido a valoración independiente (9, 32). La subunidad E2 se
produce en células de insectos infectados por baculovirus modificados genéticamente, que contienen el gen
E2 del CSFV. Las vacunas, por tanto, no contienen ningún CSFV, y el baculovirus vector se inactiva
químicamente. La preparación final contiene aceites minerales como adyuvantes para formar una emulsión
doble (agua/aceite/agua) o simple (agua en aceite). Varios estudios acerca de la capacidad de las vacunas
DIVA E2 para prevenir la transmisión vertical y horizontal, han dado resultados contradictorios (3).
b)
Prueba discriminatoria en paralelo
La prueba serológica discriminatoria en paralelo debe ser muy sensible puesto que la vacunación reducirá
la prevalencia de la enfermedad. Lo ideal es que proporcione diferenciación dentro del mismo período de
tiempo en lo que se refiere al desarrollo del anticuerpo frente a la proteína inmunizadora y debe ser utilizada
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en primer lugar como una prueba en la población. Una sensibilidad elevada reduce la especificidad de la
prueba, ya comprometida por la presencia de anticuerpos contra otros pestivirus, por lo que se debe
disponer de pruebas confirmativas adecuadas y rápidas para diferenciar los resultados positivos de los
positivos falsos.
Las pruebas en paralelo DIVA que existen para las vacunas con subunidad E2 son pruebas ELISA basadas
en la detección de anticuerpos contra la proteína Erns (12, 16). Tales pruebas se han aprobado
recientemente por la Comisión Europea (2) para la determinar si las piaras vacunadas con una vacuna con
subunidad E2 también pueden haber estado expuestas al virus natural. Una valoración de su realización
(12) revela que ningún ELISA discriminatorio detectó de forma consistente individuos vacunados con
marcadores, cerdos destetados desafiados con PPC; de ahí la recomendación de utilizar tal estrategia
solamente a nivel de la piara.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la peste porcina clásica (véase el cuadro de la parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consúltese la lista actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int)
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