Nutrición y metabolismo bacteriano. Nutrientes bacterianos. Por su utilidad: síntesis, energía, equilibrio osmótico. Por su necesidad: obligados y facultativos. Por su cantidad: macronutrientes (son necesarios en grandes cantidades) y micronutrientes (oligoelementos). Las bacterias tienen que mantener su estructura organizada en un medio que tiende al caos y adaptan el medio para crecer en tamaño y nº. Para ello toman nutrientes del medio que, mediante rutas metabólicas, les proporcionan la energía necesaria. La mayoría de las bacterias obtienen su energía por oxidación obtienen el C de los nutrientes del entorno. Clasificación de los tipos de nutrición: En función de la fuente de energía: Fototrofia: se obtiene la energía de la luz (organismos fotosintéticos, ej: cianobacterias) Quimiotrofia: se obtiene la energía por oxidación del C. Los organismos pueden ser: - Litotrofos: oxidan materia inorgánica. Organotrofos: oxidan materia orgánica. En función de la fuente de C: Autotrofia: utilizar C inorgánico (CO2) para sintetizar materia orgánica. Serían las bacterias fotosintéticas. Heterotrofia: sólo se puede utilizar C orgánico para sintetizar materia orgánica. La mayoría de las bacterias son quimioorganotras. La oxidación desde el P.V. químico consiste en una liberación de e-, que van hacia otra molécula denominada aceptor de e-. Según cual sea el aceptor la oxidación puede ser: Aerobia: el aceptor es el O2. Anaerobia: el aceptor es cualquier cosa que no sea O2. El metabolismo. El metabolismo es un conjunto de reacciones químicas espontáneas que acontecen a una velocidad compatible con la vida. Estas reacciones por si solas serían muy lentas (y por lo tanto incompatibles con la vida), para acelerarlas se utilizan enzimas, que son biocatalizadores. Estos enzimas pueden ser: Constitutivos: se sintetizan por la célula de forma constante. Inducidos: se sintetizan o no según sean o no necesarios. El metabolismo se divide en dos grandes ramas: Reacciones de mantenimiento: conjunto de reacciones que tienen como objetivo proporcionar energía a la célula. Sería el catabolismo. Reacciones de crecimiento: sería el anabolismo. Está formado por: Reacciones biosintéticas. Reacciones de polimerización. (proteínas, lípidos, ác. Nucleicos…) Reacciones de ensamblaje. Las moléculas se unen entre sí para dar las estructuras celulares. Transporte de nutrientes. Sin consumo de energía (transporte pasivo). Para no consumir energía sólo se transporta a favor de gradiente (de más concentrado a menos concentrado). Por difusión simple: las moléculas atraviesan directamente la membrana (O2, CO2, glicerol, H2O). No es un transporte saturable, por lo que la velocidad de transporte es directamente proporcional a la diferencia de concentración. Por difusión facilitada: mediante permeasas, que permiten el paso a través de la membrana de sustancias que no serían capaces de atravesarla por sí solas (ej: para el H2O--- acuaporinas). Requiere transportadores, por lo que es saturable. Con consumo de energía (transporte activo). Son capaces de generar un gradiente de concentración (van en contra de gradiente). Primario: directamente asociado a una ATPasa. Secundario: asociado a un gradiente de H+ (fuerza protomotriz), ya que al deshacerse el gradiente se libera energía. Transporte por translocación de grupos: es un transporte fundamentalmente de azúcar. Transforma las sustancias de tal manera que en el propio transporte transforma la sustancia en otra que sea impermeable y no pueda salir de la célula. En realidad no se llega a generar un gradiente porque lo que entra es una sustancia distinta y no puede salir. Transporte por translocación de grupo (Sistema de las fosfotransferasas) El fosfoenolpiruvato (PEP) fosforila al enzima 1, que a su vez para el gupo fosfato a una proteína rica en histidina y esta fosforila el enzima 2. El enzima 2 fosforilado activa a una permeasa específica para un azúcar, que puede ser para el paso de manitol, glucosa o manosa. Ej.: la glucosa se une al receptor y, entonces, ya se le puede unir el enzima 2 fosforilado, que pierde el grupo fosfato y se libera energía, que posibilita el paso de glucosa al interior de la célula. El fosfato liberado se une a la glucosa mientras esta está entrando en la célula (no cuando ya está dentro, lo que entra el glucosa-P). De esta forma lo que hay en el interior de la célula no es glucosa, sino glucosa-P. Es un mecanismo relativamente lento pero funciona incondiciones de baja energía, ya que se forman azúcares-P, que son los que intervienen en las reacciones del metabolismo. El enzima 2 también tiene otro efecto: cuando está fosforilado activa a la adenilato ciclasa, por lo que aumenta la concentración de AMPc intracelular. Los mecanismos vistos hasta ahora permiten el paso de sustancias más o menos pequeñas. Para que puedan pasar moléculas más grandes éstas se tienen que romper en moléculas más sencillas mediante exoenzimas para que puedan ser transportadas. Estos mecanismos en las bacterias gram (+) se centran en la m.p., donde se forman poros a través de los cuales pasan las sustancias. En las gram (-) el transporte se produce también en la membrana externa, donde también es fundamentalmente a través de poros (porinas), que forman canales iónicos de unos 600 Da. En las gram (-) el transporte activo se produce a través del enlace de las permeasas de la m.p. y la membrana externa. Esta unión se produce en el espacio periplásmico, donde hay gran cantidad de proteínas que unen sustancias que han atravesado el poro de la membrana externa y las llevan a permeasas de la m.p. Metabolismo heterótofo quimioorganotrofo. La gran mayoría de las bacterias de interés sanitario son quimiorganotrofas heterótrofas y el metabolito fundamental es la glucosa. Rutas oxidativas (reacciones de mantenimiento para la obtención de energía). Embdern- Meyerhoff (glucolisis). 2 Glucosa + 2ADP + 2NAD + 2Pi → 2 Pirúvico + 2ATP + 3NADH + 2H+ + 2H2O Cuando la materia se oxida los e-, hasta que llegan al aceptor, se acumulan en la célula de forma temporal en los nicotín nucleótidos: NAD y NADP. Los dos son intercambiables de forma general, pero la mayoría de los que se almacenan en NAD son para la obtención de ATP y la mayoría de los que se almacenan en NADP son para la obtención de biomasa. Existe una modificación de esta ruta que es la de Embdern- Doudoroff: Glucosa + ADP + 2NAD + Pi → 2Pirúvico + ATP + 2NADH + 2H+ + H2O Quien sigue E. Meyerhoff o sigue E. Douduroff y viceversa. Ambas están orientadas hacia la obtención de energía. Rutas oxidativas de la glucosa GLucosa Glucosa+2ADP+2NAD++2Pi ATP NAD+ ADP G6P NADH+H+ 2Pirúvico+2ATP+2NADH+2H++2H20 Embdern-Meyerhoff 6PG Entner-Doudoroff KDGP6P F6P Glucosa+ADP+2NAD++Pi 2Pirúvico+ATP+2NADH+2H++H20 ATP ADP Pirúvico F16dP ATP ADP DHAP GA3P NAD+ 13dPG NADH+H+ 3PG ADP 2PG ATP PEP H2O Pi Ruta de las pentosas. Glucosa + 12NADP + 6H2O → 6CO2 + 12NADPH + 12H+ Lo que se obtiene es NADPH, por lo que esta ruta está orientada hacia la reducción de sustancias oxidadas en las reacciones biosintéticas. Esta vía permite la obtención de azúcares de 4, 5, 6 y 7 át.C. Rutas oxidativas de la glucosa 6GLucosa Pentosas 6ATP 6ADP+6Pi 6(G6P) 6(NADP+) 6H2O Glucosa+12NADP+6H20 6CO2+12NADPH+12H+ 6(NADPH+H+) 6(6PG) 5(G6P) 6(NADP+) 6(NADPH+H+) 6(CO2) 6(Rb5P) 2(R5P) 2(X5P) 2(X5P) 2(SH7P) 2(GA3P) 2(F6P) 2(E4P) F6P 2(F6P) 2(GA3P) Las bacterias podrían vivir eternamente consumiendo glucosa por la vía de Meyerhoff si no fuera porque se quedarían sin NAD o explotarían por la acumulación de NADH, por eso las bacterias necesitan un mecanismo para recuperar el NAD (volver a oxidar el NADH + H+ en NAD). Si tiene que volver a oxidarse, tiene que devolver los e- que captó. Para ello hay dos posibilidades: La célula utiliza alguna molécula externa al metabolismo general como aceptor. Lo más típico: el O2 Que existan moléculas externas al metabolismo general (nitritos, azufre…) que también puedan aceptar los e- aunque no sea O2. Cuando existen moléculas que captan los e- hablamos de respiración. Si la molécula es O2 hablamos de respiración aerobia y si no es O2, anaerobia. GLUCOSA Glucolisis NAD+ NADH+H PIRÚVICO Acetaldehido Láctico Etanol Fermentación NADH+H NAD Acetoína OAA Fórmico Butanodiol Succínico H2+CO2 Propiónico AcCoa Acetoacetato Acético Butírico Butanol Hay bacterias que no tienen moléculas externas para donar los e-. La solución es hacer reacciones red-ox entre un át.C de la glucosa y otro át.C de la glucosa (de un át a otro de la molécula que se está oxidando. Es lo que se conoce como fermentación, y es siempre anaerobia. En las rutas de fermentación la glucosa genera pirúvico y NAD(P)H + H+. Este pirúvico puede oxidarse y el NADH + H+ cede sus e- al pirúvico y se regenera el NAD. Hay muchas reacciones de recuperación de NAD, que es una característica importante en la taxonomía de las bacterias y muy importante a nivel sanitario. Ej.: la producción de ác. Láctico es un mecanismo patogénico generador de infección. Como tiene que oxidar un átomo y reducir otro, no puede llegar a oxidar todos sus átomos, por lo que no hay síntesis neta de NADH y ATP a partir del pirúvico. Ciclo de Krebs. Las bacterias que utilizan aceptor de e- pueden oxidar lo 6 át.C de la glucosa a CO2. Las bacterias respiratorias utilizan el ciclo de Krebs. Por cada molécula de pirúvico que entra en le ciclo de Krebs se obtienen: 3CO2 , 4 NADH + H+, 2FADH2, 2GTP. CICLO DE KREBS NAD+ NADH/H+ Pirúvico CoA AcCoA CO2 NADH/H+ OAA Cítrico CoA Isocítrico NAD+ NAD+ Málico CO2 + Pirúvico+4NAD +FAD+GDP+Pi NADH/H+ Cetoglutárico 3CO2+4NADH+4H++FADH2+GTP CoA NAD+ H2 O CO2 Fumárico Succinil-CoA Succínico FADH2 FAD NADH/H+ GDP GTP Pi CoA En caso de que la bacteria obtuviera el pirúvico por la vía de Meyerhoff, para saber el total obtenido por una molécula de glucosa, habría que multiplicar todo esto por dos, ya que se obtienen 2 moléculas de pirúvico, y habría que sumarle 2NADH + H+ que se obtuvieron en la oxidación de la glucosa. Fosforilación oxidativa o transporte de e-. El problema es que aún tengo más NADH + H+ acumulado (10 por molécula de glucosa), por lo que para recuperar NAD se utiliza la fosforilación oxidativa o transporte de e-. En la m.p. existe un conjunto de proteínas que actúan como transportadores de e- por lo que el NADH + H+ se une al 1º transportador en forma oxidada y le cede sus e-, de forma que lo reduce. Este paso de e- está asociado a la salida de un H+, por lo que salen al exterior celular 2H+. El transportador-1 reduce al transportador-2 y así sucesivamente hasta llegar al transportador-n, que cede sus e- a ½ O2 (en caso de que sea respiración aerobia) y se forma H2O, que se expulsa al exterior celular. Sin embargo la obtención de agua nos es directa. Utiliza como intermediario en ión superóxido y se obtiene H2O2, sobre la que actúa una catalasa (o peroxidasa) y se transforma en H2O. Que el agua oxigenada y el ión superóxido sean intermediarios obliga a las bacterias a tener mecanismos de protección: la superóxido dismutasa y la catalasa o peroxidasa. TRANSPORTE ELECTRONICO Y GRADIENTE DE H + INTERIOR CELULAR NADH/H+ FADH 2 NAD+ 2H + 1/2 O2 + 2H + FAD+ T1 ox T1 red 2H + T2 red Tn ox T2 ox Tn red 2H + HO 2 EXTERIOR CELULAR Hay otro acumulador temporal de e-: FAD, aunque este tiene un potencial de oxidación menor, por lo que el que capta los e- tiene que tener una gran afinidad por estos. Como el NADH tienen un potencial de oxidación mayor, tiene poca afinidad por los e- y los cede con más facilidad que el FAD. 1NADH + H+ bombea 3 pares de H+ 1FADH2 bombea 2 pares de H+ En el caso de la respiración anaerobia el aceptor se encuentra más a la izq. del O2, por lo que se genera sólo dos pares de H+ en el caso del NADH y un par en el caso del FADH2. Cuando los H+ vuelven a entrar al interior celular para equilibrar el gradiente lo hacen mediante el complejo proteico ATP fosforilasa, que genera 1ATP por cada para de e- (H+) que reentra en la célula. EXAMEN: ¿Cuántos ATPs genera una molécula de glucosa por respiración aerobia? - oxidación de ác. Grasos. Se oxida el C con producción de NADH + H+ y liberación de acetil-CoA. Los ác. Grasos van perdiendo pares de át. C del extremo acilo, liberados en forma de acetil-CoA (en vez de pirúvico) con producción de NADH y FADH 2 por cada par. BETA-OXIDACION DE ACIDOS GRASOS H 3C-(CH2)n -CH2 -CH2 -COOH CoA O H3C-(CH2 )n-2-CH 2-CH 2-C-CoA = = O H 3C-(CH2)n -CH2 -CH2 -C-CoA FAD + FADH2 Ac-CoA H3C-(CH2 ) n-CH =CH -C-CoA H2O H C-(CH2 )n-CHOH-CH -C-CoA 3 NAD+ NADH + H + CoA O = = O H C-(CH ) -C-CH -C-CoA 3 2 n 2 Ciclo del glioxilato. El ciclo de Krebs permite tanto la obtención de energía como de biomasa. Las bacterias utilizan un sistema que permite la entrada de Ac-CoA en el ciclo de Krebs para la obtención de de sustancias: el ciclo del glioxilato, que es como un atajo del ciclo de Krebs. Permite la entrada de át.C al ciclo de Krebs en forma de Ac-CoA. CICLO DEL GLIOXILATO AcCoA OAA Cítrico Isocítrico Málico AcCoA Glioxilato Cetoglutárico Fumárico Succinil-CoA Succínico Metabolitos intermediarios. METABOLITOS INTERMEDIARIOS GLUCOLISIS PENTOSAS CICLO DE KREBS G6P F6P DHAP R5P AcCoA 3PG PEP PYR E4P Alfa-Cetoglutárico Succinil-CoA OAA Ciclo de Krebs dividido. ¿Qué sucede con las bacterias fermentadoras, que no pueden introducir el pirúvico en le ciclo de Krebs? Utilizan el ciclo de Krebs dividido: CICLO DE KREBS DIVIDIDO CO2+ATP Rama reductora Pirúvico NAD+ CoA NADH/H+ ADP NADH/H+ CO2 OAA Rama oxidativa Cítrico Isocítrico NAD+ NAD+ Málico 3 Pirúvico CO2 NADH/H+ Cetoglutárico -cetoglutarato+Succinato 2 Fumárico Succínico FADH2 FAD Pirúvico → cetoglutarato (oxidación) Pirúvico → succinico (reducción) La oxidación neta es cero, pero se producen igualmente los principales metabolitos. Reacciones de crecimiento. Rutas biosintéticas: Gluconeogénesis. GLUCONEOGENESIS CO2 CO2 Pirúvico OAA ATP ADP PEP ATP Glucolisis Inversa G6P ADP PIRUVICO G6P PEP La G6P por la ruta glucolítica se transforma en PEP, que da lugar a pirúvico. La glucogenogénesis sería al revés, pero hay un paso que no es reversible: el paso de piruvato a PEP, ya que la energía que se libera en la rotura del ATP no es suficiente. Para solucionarlo se hace un rodeo mediante la incorporación de CO2 para obtener ác. Oxalacético (con consumo de un ATP) y este ác. Oxalacético se oxida para la formación de PEP????? Síntesis de ác. Grasos. Es como la β-oxidación pero al revés: el crecimiento de la cadena carbonada se hace por pares, que se incorporan en forma de acetil-CoA. Síntesis de aas. ¿Cómo incorporan los grupos amino? Por α- transaminación: un aa cede su grupo amino a un α-cetoácido de tal manera que se intercambian los grupos amino y cetónico. Ej: SINTESIS DE AMINOACIDOS O HOOC-CH-CH -C-C-OH 2 2 Glutámico NH = = = O HOOC-CH2-CH2-CH -C-OH O Alfa-transaminación 2 + -Cetoglutárico + O HOOC-CH -CH-C-OH = = O HOOC-CH2-C-C-OH = 2 OAA O Aspártico NH 2 Desaminación oxidativa NADP+H2O NADPH+NH3 = O HOOC-CH-CH -C-C-OH 2 2 O -Cetoglutárico = = O HOOC-CH 2-CH2-CH -C-OH Glutámico NH2 NADP+H2O NADPH+NH3 Aminación reductora El problema es que así la síntesis neta de aa es cero. Para ello hay otra reacción: la aminación reductora: un α-cetoácido (normalmente αcetoglutárico o OAA) se reduce con cesión de e- por parte del transportador temporal NADP, y esta reducción incorpora un grupo amino y pierde una molécula de agua, transformándose en el ácido correspondiente. Cuando la concentración de amonio es baja se hace un rodeo para aprovecharlo. Esquema Un α-cetoglutárico con un ión amonio da un glutamato. Desaminación oxidativa. Es más bien una ruta de mantenimiento. Es la inversa de la aminación reductora: un ác. Glutámico pierde el grupo NH2 y se genera NADPH +H+ y el αcetoácido correspondiente. Funciona sobre todo con glutámico, OAA y aspártico. La desaminación permite la entrada de los aa en el ciclo de Krebs para la obtención de energía, lo cual permite que las bacterias puedan vivir con aa como fuente de energía sin necesidad de azúcar. Síntesis de ncleótidos. Síntesis de nucleótidos Púricos Glutamina R5P + ATP 5PRibosilamina 5PRPP = O Gly + ATP NH N Glutamato N10formilTHF N Gln + ATP CO2 + (Asp + ATP) + N10formil THF O HOH2C IMP THF Glu + ADP+PI+H2O 5aminoimidazolRibonucleótido H H OH Pi +ADP OH (ADP + Pi + Fumarato + THF + H2O Las bases púricas se cierran sobre un anillo de ribosa preformado al que se le unen grupos carbonados. Para las bases pirimidínicas: se ribosila una pirimidina ya preformada. * La mutilación de ambas bases utiliza como transportador del grupo metilo el Fe y el ác. Fólico. Polimerización de azúcares. Los azúcares polimerizan formando enlaces glucosídicos entre grupos alcohólicos que son (1,6) y (1,4,), según la situación del grupo OH. Pueden ser α o β según los azúcares estén del mismo lado o invertidos. La energía naecesaria para el enlace glucosídico está dada por la rotura de los UDP. Los propios monómeros tienen la energía necesaria porque muchas veces se forman los polímeros en el exterior celular. Esquema. Polimerización para dar ác. Nucleicos. Polimerización de desoxinucleótidos: ADN (replicación) Polimerización de ribonucleótidos: ARN (transcripción) Tiene que seguir la secuencia de nucleótidos preformada almacenada en el ADN ADN Replicación Retrotranscripción Transcripción ARN Traducción Proteínas ? La retrotranscripción la realizan los retrovirus, el virus de la hepatitis B y también lo utilizan las células eucariotas. Cuando la información fluye de proteínas a proteínas: priones Transcripción. El molde para la síntesis de ARN es una cadena de ARN y el enzima encargado en una ARN polimerasa. Para que el enzima se pueda unir al ADN este tiene que estar desenrollado. Para que se abra el ADN son necesarias proteínas que eliminen el superenrollamiento, lo giren y lo estabilicen: topoisomerasas, girasas y proteínas estabilizadoras. Después se une la ARNp al promotor de la transcripción del ADN. Una vez unido, el enzima empieza a captar nucleótidos y unirlos al extremo 3’, los empareja con la base del ADN que tiene delante y así hasta llegar a una señal de finalización de la transcripción, que se corresponde con secuencias de ADN donde es complementario y forma un enlace sobre si mismo. * Replicación. Las cadenas sólo pueden actuar de molde para la síntesis de una cadena nueva si están abiertas, por lo que son necesarias topoisomerasas, girasas y proteínas estabilizadoras, que forman una horquilla en la que las cadenas de ADN están separadas. Las cadenas son antiparalelas, por lo que cuando se empieza a replicar: Dibujo La burbuja se va desplazando y hay una cadena líder que sigue el desplazamiento de la horquilla y otra cadena retardada que se forma en sentido contrario. Esta última cadena se va formando a fragmentos denominados fragmentos de Okazaki. Como la replicación del ADN es bidireccional todo el ADN tiene fragmentos de Okazaki. La cadena líder no tiene problema, da toda la vuelta al cromosoma (el ADN es una molécula circular), llega a donde empezó y cierra. Sin embargo en la cadena retardada hay que unir todos los fragmentos de Okazaki y la ADNp no puede unir un desoxinucleótido a otro para formar un didesoxinucleótido, lo que sí puede hacer es unir a una cadena de 12-15 nucleótidos un desoxinucleótido, por eso por cada fragmento de Okazaki una ARNp forma una cadena y luego la ADNp sigue uniendo desoxinucleótidos. Como la ADNp no puede unir el ADN a la cadena de ARN siguiente, tiene que actuar un enzima extra: la exoribonucleasa 5’ 3’, que cuando llega al extremo 5’ del ARN, rompe la cadena de ribonucleótidos y une el desoxiribonucleótido. Por último una ADN ligasa cierra la cadena. La replicación del ADN es uno de los mecanismos biológicos más fiables. La fiabilidad se basa en: 1. La propia complementariedad estructural de las bases. 2. La ADNp tiene cierta especificidad de unión para escoger el nucleótido complementario (comete un error cada 106 veces) 3. La ADNp tiene una 3ªactividad: exonucleasa 3’ 5’, que corrige los errores que pudiera cometer. Esto hace que la ADNp vaya más lenta. Escinde el nucleótido que acaba de unir, lo elimina y vuelve a intentarlo. Esto hace que la probabilidad de error sea de uno cada1000·106 de veces. Síntesis de proteínas: traducción. 1. Activación: un ARNt se une a un aa con consumo de ATP y se forma aminoacilARNt. 2. Iniciación: la subunidad 30s del ribosoma se une a la cadena de ARNm naciente. Cada 3 pares de bases se traduce en un aa. Hay codones de terminación que no codifican para ningún aa (UAA, UAG y UGA) y de iniciación (AUG), que siempre va a dar formilmetionina, por lo que todas las proteínas sintetizadas por bacterias van a empezar por formilmetionina (en eucariotas es la metionina). La presencia de formalpéptidos es indicativo de procariotas, por lo que si encontramos formilpéptidos quiere decir que hay infección. La formal-met. se une al sitio p del ribosoma una vez unido a la subunidad 50s. 3. Elongación. 4. Translocación. Traducción (Activación e iniciación) ATP ACTIVACIÓN ACTIVACIÓN ADP ARNt + Aa Aa-ARNt P INICIACIÓN INICIACIÓN fMet-ARNt 30S fMet fMet GDP + IFs A ARNm 30S+IFs IF3 30S GTP + IF1,2 50S Traducción (Elongación y translocación) P P P A Aa1-ARNt fMet fMet A A fMet fMet Aa1 Aa1 ELONGACIÓN ELONGACIÓN GDP + EF GTP + EF 30S P 30S+EF-GTP 30S P A A P A GTP-EF TRASLOCACIÓN TRASLOCACIÓN fMet fMet Aa1 Aa1 fMet Aa1 GDP + EF 30S 30S 30S Formación de la pared bacteriana. Se inicia en el citosol a partir de la fructosa-6-P, que reacciona con el UDP y forma UDP-NAM, que reacciona con el ác. PEP. El PEP es el sustrato con el enlace más energético que hay en la célula, más incluso que el ATP. A continuación se unen 5aa (3aa y 2D-Ala) que formarán el tetrapéptido. Se sintetiza entonces el UDP-NAM-pp (pp= pentapéptido), que se acerca a la cara interna de la m.p. e interacciona con el fosfato bactroprenol, que solubiliza los azúcares para que puedan atravesar la membrana. En el proceso se libera 1 UDP y se forma el NAMpp-PP-bactroprenol (PP= pirofosfato). Este en la cara interna de la m.p. se une a una UDP-NAG y se forma una unidad de mureína: NAG-NAMpp unido por PP al bactroprenol. En las gram (+) se une un n-acilARNt (se unen aa). Durante esta reacción el bactroprenol pasa la mureína de la cara interna de la m.p. a la cara externa. En realidad toda la pared bacteriana es una única molécula de mureína. Son segmentos más o menos largos de NAM unidos por puentes cruzados entre los tetrapéptidos. Para poder crecer la bacteria la pared se tiene que romper, pero para evitar la lisis osmótica no se abre de golpe, sino que se va cortando periódicamente por determinados puntos mediante autolisinas, en ese punto se añade el NAM recién formado y se vuelve a formar el enlace. El PP-bactroprenol queda en la m.p. La fosfatasa libera el Pi y se recupera el bactroprenol para que se pueda iniciar el ciclo y añadir otra unidad de mureína. (UNDP: undecaprenol= bactroprenol) Ahora se tienen que formar los puentes cruzados mediante traspeptidación. La rutura del enlace D-Ala del pentapéptido con liberación de un D-Ala permite el enlace del D-Ala que queda unido al grupo NH2 del otro tetrapéptido. La energía necesaria para formar el enlace fuera de la membrana está incluida en la propia molécula que sale de la célula, porque el ATP no puede salir de la célula. (El enlace D-D tiene mayor energía que el enlace D-L) Regulación del metabolismo. Hay rutas que son anfibólicas, es decir, sirven tanto para el catabolismo como para el anabolismo. Ej: ciclo de Krebs. Glucosa Pirúvico Ac. Grasos AcCoA Aminoacidos OAA Cítrico Isocítrico Aminoacidos Málico Cetoglutárico Fumárico Succinil-CoA Succínico Porfirinas Las bacterias se alimentan de nutrientes simples que vienen del exterior y que atraviesan directamente la membrana y también de moléculas más complejas que por sí solas no son capaces de atravesar la membrana porque son muy grandes y son necesarias exoenzimas, que rompen las rompen en otras más pequeñas y así pueden atravesar la membrana mediante un mecanismo de transporte para participar en las reacciones de mantenimiento y generar energía (ATP), poder reductor (NADH) y los 12 anabolitos intermediarios, que inician las reacciones de crecimiento para originar azúcares, ác. Grasos, aa y nucleótidos. Estos por polimerización formarán polisacáridos, mureína, lípidos, proteínas y ác. Nucleicos, que se ensamblarán entre ellos para formar la pared bacteriana, etc. El metabolismo tiene que estar muy bien regulado para sacar el máximo partido de los nutrientes. La regulación es enzimática. Hay dos tipos de enzimas: constitutivas e inducidas, y ambas son necesarias Modificación de la actividad de enzimas constitutivas. Alosterismo (al unirse a un cofactor aumenta o disminuye su actividad) - Inducción (lactato deshidrogenada, piruvato quinasa) Represión (biosíntesis de sustancias) Una proteína alostérica es aquella que puede tener conformaciones espaciales alternativas según esté unida o no a algo. El alosterismo puede aumentar o disminuir la actividad enzimática. Ej: si hay poca actividad glucolítica no funciona la lactato deshidrogenesa y funcionan otras rutas: fermentación. Modificación enzimática por fosforilación Regulación de la transcripción (operones). Los operones son estructuras del genoma que funcionan por proteínas que son capaces de unir ciertas zonas del ADN para regular su transcripción (inducirla o reprimirla). Proteínas que unen ADN (inductoras y represoras). Interferencias de la traducción en la transcripción (atenuación). En eucariotas esto no pasa porque ocurren en lugares diferentes pero en procariotas no hay membrana nuclear, por lo que un ARN que se está transcribiendo puede empezar a ser traducido. Alteraciones en la síntesis proteica: modificación de la afinidad por proteínas ribosómicas. Modificación en la propia estructura del ADN: variaciones de fase que regulan la síntesis de dos posibles alternativas de flagelina, por ejemplo. Regulación enzimática. REGULACIÓN ENZIMÁTICA Retroinhibición por producto final A B A C B D P1 E P2 C Retroinhibición simple Retroinhibición secuencial E1 B A E2 D P1 E P2 C Enzimas isofuncionales A B D P1 E P2 C Retroinhibición concertada Retroinhibición secuencial. Cuando se acumula P1 no puede parar la producción de C porque este sigue haciendo falta para P2. P1 lo que hace es inhibir el primer enzima de su ruta. Si se acumula P1 y P2 se acumularía también C y este inhibiría la transformación de A en B. Este mecanismo es poco eficaz, por lo que hay sistemas más eficaces: Retoinhibición concertada. P1 bloquea el primer enzima específico de su ruta y P2 la suya, pero si se acumulan los dos, la unión de P1 y P2 inhibe ya el enzima de A sin que tenga que acumularse C. Enzimas isofuncionales. Genéticamente es más caro porque necesita más enzimas. El paso de A a B está regulados por dos enzimas E1 y E2. La afinidad de ambos enzimas no es la misma, el 80% de A B está catalizado por E1 y el 20% por E2. El mecanismo funciona como dos retroinhibiciones secuenciales: se acumula P1 y se inhibe sólo el 80% del paso de A B y el otro 20% se sigue generando para formar P2. Operones. Es el mecanismo fundamental de regulación de los enzimas inducibles. Sólo existe en procariotas porque el ADN procariota es policistrónico. Un operón es un conjunto de genes funcionalmente relacionados que se transcriben en un mismo ARN. El operador (O) se encuentra entre la región promotora y la primera secuencia codificada y es una secuencia de ác. Nucleico que es reconocida específicamente por una proteína reguladora. Dibujo El ARN no tiene operón. Funcionamiento por inducción y por represión. OPERONES P O E1 E2 E3 E4 E5 P. reguladora P. reguladora + Correpresor P. reguladora P. reguladora + Inductor Operón por represión. La secuencia en ausencia de la molécula reguladora tiene el operador vacío, por lo que la ARNp se une al promotor, pasa por encima del operador y pasa a transcribir las secuencias codificantes, con lo que el enzima se está produciendo. Cuando a la proteína reguladora se le une el correpresor, sufre un cambio conformacional y se abre un punto de unión al operador. La proteína reguladora en estado nativo no es capaz de unirse al operador, es necesario que se una un correpresor para cambiar su estructura tridimensional (es una proteína alostérica). Operón por inducción. La proteína reguladora en estado normal está unida al operador e inhibe la transcripción. Si a la proteína se une una molécula inductora, la proteína cambia su estructura tridimensional y deja libre el operador, empezando la transcripción. Operón lactosa Atenuación. Es un mecanismo de modificación de la transcripción que sólo puede operar en procariotas y sólo puede funcionar en operones que regulan la biosíntesis de aa. Cuando hay aa no interesa su síntesis y no se transcribe. Independientemente que exista una regulación por atenuación, a la vez puede existir una regulación por operador. Atenuación COMPLETAR POR FOTOCOPIAS (al final del tema) Regulación de la síntesis de proteínas ribosómicas. Se basa en que existe una proteína represora capaz de unir ác. Nucleico, en este caso ARN en vez de ADN. Esa proteína represora es capaz de unirse tanto al ARNr como al ARNm de las proteínas ribosómicas. De qué depende? De la abundancia relativa de esos dos ARN. Si aumentan los niveles de ARNr libre a la célula, le hacen falta proteínas ribosómicas para ensamblar ribosomas. Como hay mucho ARNr, la proteína represora se une al ARNr. Qué está libre? ARNm, que es el que se transcribe y permite la síntesis de proteínas ribosómicas que se unen el ARNr. entonces, la concentración de ARNr libre empieza a bajar y aumenta la de ARNm, por lo que el represor se une al ARNm y no hay síntesis de proteínas ribosómicas. Regulación genética por variación de fase. La variación de fase consiste en alteraciones estructurales pero reversibles del ác. Nucleico. Ejemplo: Existen dos tipos de flagelina: H1 y H2, codificadas en zonas distintas del cromosoma. Un operón contiene dos genes: un gen de la H2 y un gen represor. Este operón tiene un promotor pero que está puesto del revés, por lo que no es reconocido por la ARNp y no se transcriben ni el gen de H2 ni el represor. El gen que se transcribe es el de la flagelina 1. Cada 1000 divisiones este promotor se invierte y se coloca en el sentido correcto, por lo que se transcribe el gen de la flagelina 2 y también el gen represor, que inhibe la síntesis de flagelina 1 y así domina la flagelina 2. Otra vez al las 1000 divisiones se vuelve a invertir el promotor porque tiene en sus dos extremos regiones repetidas. Complementarias. Niveles de regulación del metabolismo bacteriano ALTERACION ADN INVERSION DE FASE REGULACION TRANSCRIPCION ADN OPERONES ALTERACIONES DE LA TRADUCCIÓN ARNm AFINIDAD Ribosoma-ARNm Proteína (enzima) INHIBICION ENZIMATICA ALOSTERISMO ALT. ENZIMATICA Producto final Redes globales de regulación (regulones). Regulones: sistema de regulación que regula varios operones a la vez. Proteínas activadoras de promotores. Mecanismo de unión proteínaADN que funciona justo al revés que en los operones: se une al promotor o cerca y lo activa. Ej: proteína activada por CAP. Reemplazar el factor de la ARNp, que es el que reconoce el promotor. Si la bacteria tiene varios factores alternativos, puede tener varias estructuras de promotor distintas. Cuando la célula produce, por ej, factor de tipo 1, los promotores activados son de tipo 1. Ej: cuando la célula recibe señales externas de que es necesario esporular, la célula estimula la transcripción de un tipo de factor y los promotores de ese factor se activan y empieza todo el proceso. Formación de factores de restricción o 2º mensajeros (AMPc). Ej: factor de restricción en ausencia de aa. Transducción de señales. La fosforilación de PK puede influir en varias proteínas que actúan en rutas distintas pero relacionadas entre sí. Represión por catabolito. Bacterias capaces de utilizar otro azúcar distinto a la glucosa, que tienen un operón lactosa y le ponemos en un medio lactosa y glucosa, la bacteria utiliza glucosa y no expresa los genes de los enzimas necesarios para la metabolización de la lactosa. Existe una proteína activada por catabolito que cuando se une a AMPc se activa, se une al promotor y empieza la transcripción. El enzima 2 encargado de al translocación de grupos, cuando no hay glucosa está más tiempo fosforilada, por lo que aumenta el AMPc y mucho AMPc es indicativo de pocos nutrientes. La bacteria si tiene glucosa bloquea todos los sistemas de metabolismo de nutrientes alternativos y si no hay glucosa, los activa. Regulón por CAP ARNpol no se une ARNm Glucosa en el medio Translocación de grupo P O E1 E2 E3 E4 E5 SIN Lactosa EII NO fosforilada Represor activo ARNpol no se une ARNm CON P O E1 E2 E3 E4 E5 Lactosa Represor inactivo Bajo AMPc ARNpol no se une ARNm P O E1 E2 E3 E4 E5 SIN Maltosa Represor activo PAC inactiva ARNpol no se une CON ARNm P O E1 E2 E3 E4 E5 Maltosa Represor inactivo Regulón por CAP Sin Glucosa en el medio ARNpol no se une No Translocación de grupo SIN EII SI fosforilada Lactosa P O E1 E2 E3 E4 E5 ARNm Operón lactosa Represor activo ARNpol se une CON ALto AMPc P O E1 E2 E3 E4 E5 ARNm Operón lactosa Lactosa Represor inactivo ARNpol no se une SIN PAC inactiva P O E1 E2 E3 E4 E5 Operón maltosa Maltosa ARNm Represor activo PAC activa ARNpol se une CON Maltosa P O E1 E2 E3 E4 E5 Operón maltosa ARNm Represor inactivo