Uso de las variantes del PCR en el estudio del virus del síndrome

Sistema de Revisiones en Investigación
Veterinaria de San Marcos
USO DE LAS VARIANTES DEL
PCR EN EL ESTUDIO DEL
VIRUS DEL SÍNDROME
RESPIRATORIO Y
REPRODUCTIVO PORCINO
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA - 2011
Autor:
Mercy G. Ramírez Velásquez
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Facultad de Medicina Veterinaria
TABLA DE CONTENIDO
1.
2.
2.1.
2.2.
2.3.
3.
4.
5.
PRESENTACIÓN .................................................................................................... 2
CARACTERISTICAS VIRALES ............................................................................ 2
Taxonomía ................................................................................................................ 2
Genotipos .................................................................................................................. 3
Organización genómica .......................................................................................... 3
EL PCR Y SUS VARIANTES................................................................................. 3
CONCLUSIONES .................................................................................................... 5
BIBLIOGRAFÍA CITADA: ....................................................................................... 5
Postgrado – Autor: Mercy G. Ramírez Velásquez
USO DE LAS VARIANTES DEL PCR EN EL
ESTUDIO DEL VIRUS DEL SÍNDROME
RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO
Mercy G. Ramírez Velásquez (mercyvet@gmail.com,)
1. PRESENTACIÓN
En los últimos años, el uso de las
técnicas
convencionales
como
ensayo
inmunoabsorvente
ligada
El presente artículo tiene por
el
objetivo hacer una breve revisión sobre
a
los estudios que se han realizado para
enzimas (ELISA) y la inmunoperoxidasa
identificar
el
VPRRS
utilizando
en monocapa (IPMA) han servido para
principales variantes del PCR.
las
el diagnóstico del virus del Síndrome
Respiratorio y Reproductivo Porcino
Palabras clave: PCR, virus PRRS,
(VPRRS) en hatos o granjas porcinas;
nested PCR, multiplex PCR, tiempo real
sin embargo estas pruebas serológicas
PCR
no permiten diferenciar a los animales
vacunados
infectados
vacuna),
de
(en
ni
los
naturalmente
regiones
recién
donde
se
infectados,
ni
2. CARACTERISTICAS VIRALES
2.1. Taxonomía
El PRRS es causado por el virus
portadores que no producen anticuerpos
del
detectables por estas pruebas. Las
Reproductivo
pruebas moleculares como la reacción
VPRRS
en cadena de la polimerasa (PCR) es
Arteriviridae, junto al virus de la arteritis
una
y
viral equina, al virus elevador de lactato
y
deshidrogenasa del ratón y al virus de la
diferenciar genotipos virales por lo que
fiebre hemorrágica del simio. La familia
es
Arteriviridae
prueba
permiten
altamente
identificar,
considerada
una
sensible
cuantificar
herramienta
diagnóstica más precisa y confiable.
Síndrome
Respiratorio
Porcino
pertenece
junto
(VPRRS).
a
con
la
la
y
El
familia
familia
Coronaviridae forma el nuevo y estable
Postgrado – Autor: Mercy G. Ramírez Velásquez
orden
Nidovirales
(Snijder,
1998;
Meulenberg, 2000; Morilla 2005).
de 8 marcos
lecturas
abiertas
(ORFs), 6 de los cuales son expresados
para
2.2. Genotipos
la
formación
de
ARNs
subgenómicos (Guarino et al., 1999).
El VPRRS está dividido en dos
genotipos
de
pero
y
polimerasa viral, los ORFs 2-6 codifica
genéticamente distinguibles: el genotipo
proteínas estructurales (GP2, GP3, Gp4,
1, el Europeo, también conocido como
GP5 y M) y ORF7 la proteína de la
virus Lelystad, y el genotipo 2 o
nucleocápside (N) (Guarino et al., 1999;
Americano (Guarino et al., 1999; OIE,
Meulemberg, 2000). Hay tres principales
2008; Spilman et al., 2009). Existe una
proteínas estructurales: la proteína GP5,
considerable variabilidad entre ambos
M y N, siendo la proteína GP5 la más
genotipos, inclusive entre cepas del
abundante glicoproteína de envoltura y
mismo genotipo 2 (Kleiboeker et al.,
la principal inductora de anticuerpos
2005). Dependiendo del respectivo gen
neutralizantes (Meulemberg, 2000; Yang
bajo investigación, estos dos genotipos
et al., 2000; Zheng et al., 2007).
difieren
la
Mientras que la proteína N es la más
secuencia de su ARN (Truyen et al.,
abundante proteína del virion y es
2006), teniendo solo cerca del 50-60%
altamente
antigénica,
de
utilizada
para
hasta
identidad
antigénica
Los ORFs 1a y 1b codifican el ARN
en
un
entre
50%
sus
en
secuencias
(Spilman et al., 2009).
la
por
esto
detección
es
de
anticuerpos específicos al virus y para el
diagnóstico de la enfermedad (Dea et
2.3. Organización genómica
El
genoma
del
VPRRS
al., 2000).
está
contenido en una molécula simple de
3. EL PCR Y SUS VARIANTES
ARN poliadenilado de polaridad positiva
El PCR es una técnica molecular
asociado a una cubierta proteica y a una
altamente sensible y específica utilizada
envoltura externa (Kleiboeker et al.,
para
2005; OIE, 2008). Su genoma consiste
enfermedades
Postgrado – Autor: Mercy G. Ramírez Velásquez
el
diagnóstico
de
infecciosas.
muchas
Hay
numeroso estudios que señalan el uso
VPRRS por un PCR convencional y
de
la
PCR nested usando 6 pares de primers
reacción en cadena de la polimerasa
de diferentes regiones del genoma viral,
(RT-PCR) para la identificación del
con el objetivo de identificar primers
ácido nucleico del VPRRS en muestras
universales que permitan amplificar el
de tejidos, suero y semen (Rovira et al.,
genoma de todos o de la mayoría de los
2007). Las variantes del PCR más
aislados del VPRRS. Ellos demostraron
utilizadas
del
que el ORF 7 es un blanco exitoso para
VPRRS son el PCR nested, el PCR
el diagnóstico del virus y que permitió la
multiplex y el PCR en tiempo real.
amplificación
la
transcriptasa
para
la
reversa
de
identificación
de
los
fragmentos
En 1997 Gilbert et al. describió a
correspondientes en todos los aislados
la técnica del PCR multiplex y del PCR
probados. Sin embargo, mencionan que
nested multiplex para la diferenciación
la
de genotipos Europeos y Americanos
disminuyó con muestras de suero, esto
del VPRRS, con el fin de determinar el
puede estar relacionado a pérdidas en
más bajo limite de detección viral por
el
PCR. Ellos mostraron que la prueba del
degradación del RNA por contaminación
PCR nested multiplex es capaz de
con
detectar 10 dosis infectivas en Cultivo
suero.
sensibilidad
de
procedimiento
ribonucleasas
algunos
de
primers
extracción
presentes
en
o
el
de Tejido 50 (TCID50) en comparación
con 103TCID50 que pudo detectar el
Otra variante del PCR empleada
PCR multiplex en muestras de suero de
para la detección del VPRRS es el PCR
animales experimentalmente infectados.
en tiempo real (RRT-PCR) que tiene la
La más alta sensibilidad del PCR nested
ventaja, sobre el RT- PCR convencional,
multiplex
de consumir menos tiempo durante su
tiene
como
ventaja
la
genotipificación directa del VPRRS.
desarrollo y disminuir la probabilidad de
contaminación de los amplificados de
Guarino et al 1999, analizó 24
diferentes
asilados
de
campo
del
ADN.
El uso de una técnica como el
RRT-PCR ofrece
Postgrado – Autor: Mercy G. Ramírez Velásquez
la oportunidad de
detectar fácil y rápidamente ARN viral.
Asimismo, puede monitorear amplicones
4. CONCLUSIONES
• Las
variantes
del
PCR
más
acumulados directamente, durante el
utilizadas para la identificación
proceso de amplificación del ADN (Yang
molecular del VPRRS son el PCR
et al., 2006).
nested, PCR multiplex y el PCR
Un estudio realizado por
Yang et al., 2006 compararon los
resultados obtenido de un RRT-PCR en
en tiempo real.
• Que el PCR en tiempo real es
tiempo real utilizando SYBR green I con
una
un
RT-PCR
sensibilidad
del
técnica
molecular
convencional.
La
confiable
RRT-PCR
fue
identificación del VPRRS.
y
segura
más
para
la
encontrada por ser de 10-100 veces
más alta que el convencional RT-PCR.
5. BIBLIOGRAFÍA CITADA:
Otro estudio desarrollado por Rovira et
1. Dea S, Gagnon CA, Mardassi H,
al., 2007 evaluó la sensibilidad del RRT-
Pirzadeh B, Rogan D. 2000.
PCR en diferentes muestras biológicas,
Current
probadas individualmente y en mezcla
structural
de 3 a 5 muestras. Los resultados de
reproductive
and
este estudio sugieren que el suero es la
syndrome
(PRRS)
virus:
mejor muestra para detectar el VPRRS
comparison
of
North
en verracos durante la infección aguda y
American and European isolates.
que el trabajo en mezcla de 3 a 5
Arch Virol 145: 659–688.
knowledge
proteins
on
of
the
porcine
respiratory
the
muestras disminuye la sensibilidad del
2. Gilbert SA, Larochelle R, Magar
RT-PCR; ya que, cerca del 6% de las
R, Cho HJ, Deregt D. 1997.
muestras que pudieran ser detectadas
Typing of porcine reproductive
por RT-PCR en muestras de suero
and respiratory syndrome viruses
individuales pueden ser pérdidas si ellas
by a multiplex PCR assay. J. Clin.
fueran corridas en una mezcla de 5
Microbiol. 35: 264-267.
muestras.
3. Guarino H, Goyal SM, Murtaugh
MP, Morrison RB, Kapur V.
Postgrado – Autor: Mercy G. Ramírez Velásquez
1999.
Detection
reproductive
syndrome
of
and
virus
porcine
8. Rovira
Clement
T,
Christopher-Hennings
respiratory
by
A,
J,
Thompson B, Engle M, Reicks
reverse
D,
reaction using different regions of
Evaluation of the sensibility of
the viral genome. J vet Invest 11:
reverse transcription polymerase
27-33.
chain reacción to detect porcine
4. Kleiboeker SB, Schommer SK,
Muñoz-Zanzi
2007.
transcription- polymerase chain
reproductive
and
Cl.
respiratory
Lee SM, Watkins S, Chittick W,
syndrome virus on individual and
Polson D. 2005. Simultaneous
pooled samples from boars. J Vet
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European porcine reproductive
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real-time
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Co-expressing
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and
M
proteins under different promoters
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virus
ankara
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Postgrado – Autor: Mercy G. Ramírez Velásquez