CROMATOGRAFÍA
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CROMATOGRAFÍA La palabra cromatografía significa gráfica de colores y fue diseñada por Michael Tswett en el 1903. Tswett llevó a cabo una extracción de una mezcla de pigmentos de hojas verdes y luego pasó este extracto a través de un tubo de vidrio empacado con carbonato de calcio; de esta forma logró separar los pigmentos presentes en las hojas. Actualmente cromatografía es el nombre que se le da a un grupo de técnicas utilizadas en la determinación de la identidad de sustancias, en la separación de componentes de las mezclas y en la purificación de compuestos. Esta técnica es muy efectiva y por lo tanto se utiliza tanto a nivel de investigación como a nivel industrial. Este método puede variar de técnica en técnica, pero siempre se basa en el mismo principio: Todos los sistemas de cromatografía contienen una fase estacionaria y una fase móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido que se queda fijo en la misma posición. La fase móvil puede ser un líquido o un gas que corre a través de una superficie y de la fase estacionaria. Las sustancias que están en un sistema de cromatografía interaccionan tanto con la fase estacionaria como con la fase móvil. La naturaleza de estas interacciones depende de las propiedades de las sustancias así como también de la composición de la fase estacionaria. La rapidez con que viaja una sustancia a través del sistema de cromatografía depende directamente de la interacción relativa entre las sustancias y las fases móvil y estacionaria. En el caso de una mezcla, si cada componente interacciona diferente con la fase móvil y la fase estacionaria, cada uno de ellos se moverá diferente. En la siguiente tabla se observan diferentes fases móviles y fases estacionarias en diferentes técnicas de cromatografía: Técnica Fase móvil Fase estacionaria Gas Sólido o líquido Cromatografía líquida en fase inversa Líquido (polar) Sólido o líquido (menos polar) Cromatografía líquida en fase normal Líquido (menos polar) Sólido o líquido (polar) Cromatografía líquida de intercambio iónico Líquido (polar) Sólido Cromatografía líquida de exclusión Líquido Sólido Cromatografía líquida de adsorción Líquido Sólido Cromatografía de fluidos supercríticos Líquido Sólido Cromatografía de gases En la cromatografía se tiene en cuenta la velocidad del soluto y la del eluente para poder determinar la siguiente relación. A continuación se describirán las diferentes técnicas de cromatografía: Cromatografía de papel: es un proceso donde el absorbente lo constituye un papel de Filtro. Una vez corrido el disolvente se retira el papel y se deja secar, se trata con un reactivo químico con el fin de poder revelar las manchas. Cromatografía de capa fina: basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio la fase móvil que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para eluír a las moléculas en la muestra. Debido a que las distintas moléculas en la muestra presentan diferente coeficiente, la fase móvil a los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que en la fase móvil serán eluídos más rápido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria. Cromatografía de columna: Los elementos básicos en la cromatografía de columna son una son la fase estacionaria y la fase móvil. La fase estacionaria la forma un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrió. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna. La Cromatografía en columna se emplea para la separación de sustancias en escala preparativa. Cromatografía gaseosa: La muestra es vaporizada e introducida en un flujo de un gas apropiado denominado de fase móvil o gas de arrastre. Este flujo de gas con la muestra vaporizada pasa por un tubo conteniendo la fase estacionaria, donde ocurre la separación de la mezcla. La fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente o, más comúnmente, una película de un líquido poco volátil, soportado sobre un sólido inerte o sobre la propia pared del tubo. Las sustancias separadas salen de la columna disueltas en el gas de arrastre y pasan por un detector; dispositivo que genera una señal eléctrica proporcional a la cantidad del material eluido. La Cromatografía Gaseosa es una técnica utilizada para la separación y análisis de mezclas de sustancias volátiles. Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Introducción Significa "Escribir en Colores“. Los componentes de una mezcla pueden presentar una tendencia diferente a permanecer en cualquiera de las fases involucradas. Es la separación de dos o más compuestos químicos en un medio Conceptos generales La cromatografía se basa en un conjunto de técnicas asociadas al principio de retención selectiva. − Permite separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Posee: − Fase móvil: consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico). − Fase estacionaria: se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan en forma diferente con la fase estacionaria y con la fase móvil. − Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Tipos de cromatografía Cromatografía plana: La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son: − Cromatografía en papel − Cromatografía en capa fina Cromatografía en columna: La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen: − Cromatografía de líquidos − Cromatografía de gases − Cromatografía de fluidos supercríticos Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía Cromatografía en papel Tiene como soporte un papel de celulosa. Es una técnica sencilla y presenta la ventaja de poder utilizar cantidades pequeñas de muestra (miligramos y microgramos). Cromatografía en capa fina Lograron separar mezclas de tinturas farmacéuticas. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte (silica). Stahl estandarizó el método para elaborar capas finas por métodos mecánicos. Cromatografía de columna Consiste en la aplicación de una muestra compleja a una columna de cristal. Contiene una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. Se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las diferentes mezclas se van retrasando de manera distinta según sus interacciones con la matriz. Se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamaño o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida. . Términos relacionados con el proceso Matriz de la columna Longitud de la columna Volumen de la columna: volumen total de gel. ‘Run Throught’: volumen de muestra mas solvente. Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía Cromatografía de intercambio iónico Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial. Tenía la finalidad de separar los elementos alcalinotérreos y los elementos de transición. En 1938 Taylor y Urey utilizan este método para separar isótopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. Se usa en la separación de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánico Funcionamiento En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las muestras que tengan una carga complementaria a la de la matriz de la gel, siendo eluidas las restantes. Para eluir las muestras retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la muestra de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a la muestra en la columna. Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía Cromatografía de gel-filtración − Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles se puede separar polímeros sintéticos de alto peso molecular. Cromatografía de afinidad. − Porath en 1967 utiliza un péptido o proteína unida covalentemente a un ligando y la utiliza para la separación de moléculas proteicas. Cromatografía de gas. − Es una de las técnicas más utilizadas e importantes. − Ha revolucionado el campo de la química analítica. Cromatografía de exclusión o La cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel, separa las muestras en base a su tamaño. o La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. o Las muestras de mayor tamaño migran a lo largo de la columna con mayor velocidad que las de tamaño pequeño. o Las muestras de menor tamaño, entran en los poros y se mueven a lo largo de la columna lentamente porque tienen que atravesar los laberintos que se encuentran en el interior de las bolas de polímero en su marcha a lo largo de la columna. o Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: − a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. o Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc. Características de las matrices Deben ser estables. Tener bajo contenido en grupos iónicos. Uniformidad de poro y tamaño. Los compuestos utilizados pueden ser derivados de: Dextranos (Sephadex) Agarosa (Sepharosa) Acrilamidas (Biogel P) Esferas de vidrio Cromatografía de afinidad Permite la separación de mezclas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. Las muestras que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las muestra que no se unen al ligando son lavadas o eluídas a través de la columna, la muestra de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye (se libera) mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína ligandos de afinidad Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Se clasifican según su: o Naturaleza -pueden ser macromoléculas biológicas o bien moléculas de bajo peso molecular. o Actuación -se fundamenta en la selectividad de la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad. Se distinguen dos grandes grupos: − Ligandos específicos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto. − Ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos. Términos empleados en cromatografía5 • • • • Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografía. Cromatografía analítica se emplea para determinar la existencia y posiblemente también la concentración de un analito en una muestra. Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículas de soporte o a las paredes internas de la columa. Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada. En el eje X se representa el tiempo de retención, y en el eje Y una señal (obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema óptimo, la señal es proporcional a la concentración del analito específico separado. • • • • • Cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada. Por ejemplo, un cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos. Cromatografía es el método físico de separación en el cual los componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida. Efluente es la fase móvil que atraviesa la columna. Serie eluotrópica es una lista de disolventes clasificados según su poder de dilución. Fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre partículas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna. Cromatograma correspondiente a una cromatografía liquida en fase reversa para compuestos fenólicos • Fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases) o un fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La fase móvil • • • • • • consiste en la muestra que está siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el interior de la columna. En el caso de la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, la fase móvil es un disolvente no-polar como el hexano (fase normal) o bien algún disolvente polar (cromatografía de fase reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase móvil se mueve a través de la columna de cromatografía (fase estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase estacionaria y se separa. Cromatografía preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para un uso posterior, más que para análisis. Tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito particular en pasar a través del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas. Muestra es la materia que va a hacer analizada en la cromatografía. Puede consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso del análisis, la fase o fases que contienen los analitos de interés es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya separación no resulta de interés es llamada residuo. Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado. Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la fase líquidamóvil en cromatografía de líquidos. Fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición en el procedimiento de la cromatografía. Un ejemplo es la capa de silica en la cromatografía en capa fina.
