Regulación enzimática

Tema 13
Regulación enzimática
Ya sabemos que todos los procesos celulares están regulados, esta regulación necesaria, se basa en la
posibilidad de aumentar o disminuir el flujo a través de una vía. El flujo se entiende como la velocidad de
conversión del primer metabolito en el último. La regulación de una etapa no es más que modificar la
actividad de la enzima que la controla.
Mecanismos de regulación
• Generales: Se basan en la disponibilidad de sustrato o producto. Por ejemplo, la disponibilidad de
glucosa aumenta el flujo de la glucolisis, de igual forma que si eliminamos el piruvato.
• Específicos: La regulación de la actividad de una o varias de las enzimas de la vía. Ya que lo que se
modifica es la velocidad, veamos las ecuaciones que la rigen. V = K [S]; Vruta = [E] [metabolíto]. A
través de ella podemos hacernos una idea de lo que se modifica.
Enzimas reguladoras del flujo
En una ruta hay dos tipos principales de enzimas, las que denominamos reguladoras del flujo, que son
aquellas que al aumentar su cantidad de enzima activa aumentamos el flujo, y aquellas que no son reguladas
de forma específica.
El grado de influencia sobre el flujo a través de la vía se denomina Coeficiente de control de flujo
Esto es así porque no podemos aumentar más el flujo de la vía que la actividad de la enzima que estamos
regulando específicamente. Para poner un ejemplo: Una hormona puede aumentar la cantidad de enzima
activa de 100 a 500 veces, de modo, que el denominador sería 400/100 = 4. Como mucho, entonces
(recordemos que no puede ser mayor que 1), el numerador puede ser 4, pero pongamos que es 2. De esta
forma tendríamos un
de 2/4 = 0,5.
Cuanto mayor coeficiente presente, más importante será la enzima en el control del flujo a través de la vía
metabólica. Estas enzimas reguladoras catalizan etapas lentas ya que la cantidad de la cantidad de enzima
activa que está presente es menor que el de la s demás de la ruta, por ello, las etapas lentas (limitantes) son
irreversibles.
Un ejemplo claro de esto es la etapa de la glucolisis catalizada por la PFK, que requiere ATP. La bajada de la
concentración del producto debido al drenaje del a vía haría que faltara mucho para conseguir el equilibrio y,
por tanto, la reacción es espontanea. En cuanto a la ruta en general, el paso de Glu a Pyr produce ATP con una
*Go' de "15,3 Kcal/mol, y el inverso, consumiendo ADP de .4,2 Kcal/mol. Ambas son espontaneas, por lo que
se estarían dando a la vez, algo realmente estúpido para la célula. En la realidad, algunas de las enzimas que
catalizan etapas irreversibles están reguladas, como por ejemplo la que veíamos antes, la PFK, que requiere
otra enzima para la reacción inversa, la F1,6Bpasa, de esta forma, cuando se requiere glucosa aumenta la
actividad de la fosfatasa y disminuye la de la kinasa, de forma inversa a lo que ocurre cuando hay demanda de
1
energía.
La regulación de la enzima se puede conseguir a dos niveles:
• Regulación de la cantidad de proteína enzimática: mediante la síntesis y degradación de la enzima. Este
control como es lógico, es a largo"medio plazo.
• Regulación de la actividad catalítica: Se trata de un control muy fino y a muy corto plazo. Esta a su ves
se subdivide en:
• Cambios en la estructura covalente de la enzima de forma reversible, como por ejemplo la fosforilación,
metilación o farnesilación.
• Cambios conformacionales de la enzima por la unión de moléculas reguladoras. Se trata del modelo típico
de regulación alostérica, también es reversible.
De este modo, recordamos los distintos tipos de regulación:
• General
• Específica
• Cantidad de proteína activa
• Regulación de la actividad
• Modificación covalente de la enzima
• Unión de ligandos
Tipos de enzimas y su importancia en regulación
Podríamos preguntarnos si una enzima michaeliana puede llevar a cabo el control a través de una vía
metabólica. Para intentar dilucidarlo, no hay más que escoger un valor para [S] pequeño y un grande
en relación con Km (de forma equivalente a como lo hacíamos para determinar [S] para Vmax, en
función de Km). La diferencia de coger [S] como Km/9 o 9·Km es de 0,1Vmax a 0,9 Vmax. Esto que
significa, pues que un aumento de aproximadamente 9 veces requiere añadir sustrato en 81 veces,
algo que fisiológicamente no pasa, ya que las concentraciones de los metabolitos son pequeñas y no
pueden variar tanto ya que romperían el equilibrio osmótico. De hecho lo que se observa es que
pequeñas variaciones en [S] promueven variaciones de hasta 200 veces en la actividad de una enzima.
De este modo parece quedar claro que la regulación por [S] pertenece casi exclusivamente a los
enzimas alostéricos que, además, también se regulan por efectores. Una de las características más
importantes de estos enzimas es la cooperatividad, de la que hablaremos más adelante.
Estudio de primeras enzimas de una ruta
Monod, Changeux y Jacob estudiaron las características comunes de enzimas que catalizaban la
primera reacción de una vía o ruta metabólica inhibida por el producto final de la misma:
• El ligando regulador (efector activador o inhibidor) es distinto estructuralmente al sustrato o al
producto de la reacción.
• Muchas de ellas presentaban cinética sigmoide (algunas enzimas son reguladoras pero con cinética
michaeliana), pero hay que tener en cuenta que hay enzimas con cinética sigmoide per no son
reguladoras.
• Varios tratamientos fisico"químicos (Tº, reducción de puentes disulfuro) desestabiliza la enzima
frente al efector, sin pérdida de la actividad catalítica. Esto es debido a la menos posibilidad de
transmitir cambios conformacionales en estructuras más flexibles, (similar a la mejor transmisión de
los sonidos por sólidos o líquidos que por el aire).
• Suelen ser hetero u oligoméricas.
2
La conclusión a sacar es que el efector se une a un sitio distinto del C.A. generando cambios
conformacionales en la enzima que causa un cambio en la estructura del C.A., lo que provoca
cambios en las propiedades cinéticas de la enzima. De este trabajo surgió en término alosterísmo, no
como respuesta a una cinética sigmoide, sino a una regulación por ligando.
Cooperatividad
Se trata de la propiedad que permite responder con gran sensibilidad a cambios relativamente
pequeños en la [S], O2 para nuestro ejemplo, la Hg y Mg. Como hacemos siempre al describir una
propiedad cinética, hay que caracterizarla matemáticamente, por ello definimos Y como el grado de
saturación, definido por el nº de sitios ocupados por el ligando dividido entre el nº total de sitios de
unión.
Mioglobina
Se trata de una única cadena polipeptídica con cinética hiperbólica y un único sitio de unión por
cadena. Mediante el desarrollo de las constantes de la reacción (constante de disociación, de
equilibrio, Y) llamando P a la proteína y A al O2 se llega a la conclusión de que Y no puede ser mayor
que 1, acercándose sólo en el caso de [A]
, cuando todos los sitios están ocupados por el ligando.
Hemoglobina
Se trata de un tetrámeno (2, 2) con un sitio de unión por subunidad, lo que hace un total de 4. Para
esta proteína
, que se denomina curva de saturación sigmoide. El exponente h para la hemoglobina es de 2,6.
Cooperatividad infinita
Imaginamos que inmediatamente y simultaneamente, las subunidades unen ligandos (algo que no
ocurre en la Hg). La 1ª molécula que se une aumenta la afinidad de unión del resto por parte de la
proteína. El desarrollo de K, nos lleva a una ecuación, similar a la de Hill, pero que ahora presenta n
en lugar de h, definiendo n como el nº e sitios de unión dividido entre la molécula (P). es el caso de la
Hg, n = 4, que obviamente es distinto de 2,6. Esto es debido a que no hay un equilibrio todo o nada en
la unión de ligando. Hay estadíos intermedios (Hg con 1, 2, 3, 4 sitios ocupados). Afirmamos que en
la Hg hay cooperatividad positiva, teniendo en cuenta, además, que h<n, nunca igual.
Definimos h como una medida de lo fuerte que es la cooperatividad, en mis palabras, la fuerza que
hay que ejercer para provovar un estado más receptivo en las subunidad de al lado. Cuando h sea
próximo a n, indicará una cooperatividad infinita, que indicará que inmediatamente de la unión del
ligando se induce la unión del resto. Para h>1 es positiva, para h=1 no hay cooperatividad (recordad
las prácticas) y para h<1 es negativa, lo que significa que la unión de un ligando disminuye la afinidad
del resto de las subunidades por el ligando.
Determinación del valor de h
Al igual que sucedía con la cinética michaeliana, la linearización de la curva de velocidad permite
obtener unos valores mucho más reales. Por ello, comenzamos describiendo 1"Y como la fracción de
sitios de unión libres, al ser 1 el máximo grado de saturación. A partir de ahí y mediante una serie de
desarrollos matemáticos llegamos a una ecuación logarítmica:
3
La representación del primer término Vs log [A] nos da una pendiente igual a n y un corte en
ordenadas que nos da el "log de K. A este representación se la denomina representación de Hill.
Como ya vimos en prácticas, los datos que obtenemos experimentalmente no es Y, sino la curva de
velocidad, por ello, cogiendo los puntos del tramo central, más lineal, representamos la siguiente
ecuación:
El cambio de n por h se debe a la partida de un supuesto falso, una cooperatividad infinita, al coger el
tramo lineal. Definimos ahora K = K0,5 como análoga a Km, es decir, la concentración de sustrato
para alcanzar la mitad de la velocidad máxima.
Modelo concertado o de simetría
Monod, Wyman y Changeux dilucidan este modelo para explicar el alosterísmo. En el propio título se
explican varias cosas, concertado implica que las dos subunidades cambian de conformación a la vez
y la simetría nos indica que las dos subunidades tienen la misma conformación y la misma constante
de disociación. Para enunciarlo partieron de las siguientes premisas:
• La proteína es un oligómero.
• Existe en dos posibles estados conformacionales T de tenso y R de relajado. La primera predomina
cuando el ligando no está unido.
• La conformación R tiene más afinidad por el ligando, lo que significa que la constante de disociación
de T es mayor que la de R y, por lo tanto, el ligando se une preferentemente a R.
• Todos los sitios de unión en cada estado son equivalentes (ya lo habíamos dicho, es la condición de
concertado) y tienen idénticas constantes de disociación por los ligandos (resultado de la simetría). En
definitiva, todas las subunidades cambian de conformación a la vez
Parámetros
♦
♦
♦
: El grado de saturación.
: Fracción de proteína en estado R
♦
♦
. En ausencia de ligando L>1.
. De modo que, en concordancia con lo que dijimos antes C<1.
Origen de la cooperatividad
4
La base es que la proteína predomina en ausencia de ligando en estado T, pero el ligando se une
preferentemente a R. Por esto, nos preguntamos:
¿Cómo puede aumentar
?
• Aumentando la concentración de ligando
• Aumentando el estado R
• Las dos
Al aumentar el ligando, se satura el estado R, más receptivo, lo que lleva al equilibrio entre las dos
formas a desplazarse, aumentando a su vez el nº de sitios activos. De este modo a mayor L (más T y
menos R en situación inicial, necesaria para que se produzca un desplazamiento, ya que si toda la
proteína se encuentra en un solo estado no hay posibilidad de cooperatividad) y menor C (KT > KR),
mayor será el efecto cooperativo (mayor h)
Regulación por interacciones alostéricas
El efecto alostérico bien sea positivo o negativo, modifica la razón del equilibrio R"T estabilizando
uno u otro.
♦ Activador: se une preferentemente a R aumentando su concentración, lo que provoca los
efectos mencionados en el apartado anterior.
♦ Inhibidor: se une preferentemente al estado T disminuyendo R y, por tanto, el nº de sitios
activos, lo que conlleva la disminución de
.
El efecto que tienen estos dos tipos de efectores sobre las curvas de saturación alostéricas ya los
conocemos por prácticas. Si el efector alostérico se une sólo (no preferentemente) a uno de los dos
estados se pierde la cooperatividad, obteniendo una curva de saturación hiperbólica.
Efectos alostéricos
♦ Homotrópicos: Son los producidos por interacciones entre moléculas idénticas del sustrato.
Se trata de cooperatividad.
♦ Heterotrópicos: Son los producidos por interacciones entre los efectores alostéricos
(moléculas distintas ala sustrato) y el sustrato. Se trata de la regulación alostérica en sentido
estricto.
Enzimas alostéricas
Hay dos sistemas, el K y el V, que detallaremos a continuación:
Sistemas K
Se caracteriza por tener afinidades diferentes tanto por sustrato como por ligando. Su actividad se
regula (positiva o negativamente) por cambios en la afinidad por el sustrato. Kcat no cambia, siendo
Vmax constante, sólo cambia K0,5, como se observa en la gráficas de las hojas.
Sistemas V
Se caracteriza porque tanto R como T presentan la misma afinidad por el sustrato, con lo que se da en
enzimas alostéricas sin cooperatividad (recordemos las premisas). LA diferencia, por tanto, entre las
dos conformaciones es di distinta Kcat. Es esto lo que permite que estos sistemas tenga representación
5
sigmoide.
El trabajo del efector consiste en desplazar el equilibrio R"T, de modo que si predomina la forma de
menor Kcat, disminuye la velocidad, siendo entonces un inhibidor y viceversa.
Modelo secuencial
Este modelo más complicado enunciado por Koshland, Némethy y Filmer parte de dos premisas:
• En ausencia de ligando, la proteína existe en una única conformación (al contrario que ocurría con el
modelo de simetría).
• En presencia de ligando, el cambio de conformación es secuencial, subunidad por subunidad.
Origen de la cooperatividad
En este modelo, son las interacciones entre las subunidades, bien positivas o negativas, las que
favorecen o impiden la unión de ligando a la adyacente. De este modo llamamos cooperatividad
positiva a la interacciones favorecedoras de la unión de ligando y negativa a las desfavorecedoras.
Cooperatividad negativa o anticooperatividad
Este comportamiento sólo se puede explicar con el modelo secuencial. No se ajusta la modelo
concertado porque A estabiliza el estado de alta afinidad, por lo que no puede aumentar el estado de
baja afinidad.
Se caracteriza por una curva
Vs [A] sin tendencia a la saturación, con lo que no tiene nada que ver ni con la cinética hiperbólica ni
con una sigmoide, ya que a medida que se añade más sustrato hay que ir añadiendo más y más para
conseguir una subida que antes o en otros modelos se consigue con poca variación de concentración.
Se obtienen resultados equivalentes a diferentes sitios de unión de ligando con distintas afinidades y
no interactivos.
No es lo mismo cooperatividad negativa que regulador alostérico negativo, ya que el primero se
produce por la unión de sustrato y la segunda por la de in inhibidor distinto al sustrato. Además, un
efector alostérico negativo no produce cooperatividad negativa.
Representación de Scatchard
Una forma de dilucidar si nos enfrentamos a una cooperatividad es esta representación. Se basa en
estudios de unión de ligando a receptor, y suele utilizarse para ver si un mismo ligando se une a dos o
más tipos de receptores. Si partimos de una proteína con un solo tipo de unión, podemos hallar la
cantidad de ligando unido, a través de filtrado y posterior contabilización (como el centelleo). El
ligando unido depende de la cantidad total de proteína y de la fracción de saturación. De ahí se
obtiene la ecuación de una hipérbola. Ya que [E] << [A] podemos considerar, de forma equivalente a
como lo hacíamos en temas anteriores que la concentración de A libre es la total.
Si consideramos ahora una proteína oligomérica con n sitios de unión por molécula, se nos transforma
la ecuación anterior incorporando el término n multiplicando el segundo término. A partir de esta
ecuación y mediante un procesamiento se consigue linearizarla, representando la fracción de ligando
unido frente al total Vs lo unido. De esta forma, podemos calcular (como se ve en la gráfica de las
hojas) n y K, la constante de disociación.
6
Una vez conocida esta linearidad, podemos comparar lo que sucede si cogemos una población de dos
proteínas con distintas n y K (siendo K1 < K2). En este caso, la ecuación que nos define el ligando
unido será la suma de las dos hipérbolas. Si esto lo representamos podremos obtener dos tipos de
curvas, una descendente desde el primer momento, que nos indicará que hay dos poblaciones y que
también se corresponderá con una única población de una enzima alostérica con cooperatividad
negativa, ya que al cambiar K con la añadidura de ligando, la representación parece indicar que se
trata de dos poblaciones.
Si se obtiene una curva ascendente en primer lugar, indicará una verdadera suma de afinidad
conforme se aumenta el ligando unido, o lo que es lo mismo, una población con una cooperatividad
positiva.
Si se pudiera observar las dos poblaciones de forma independiente, éstas se corresponderían con las
dos rectas discontinuas.
Evidentemente aquí pasa algo, ya que si recordamos el las prácticas ese término era S0,5 y, además,
de la propia representación, es imposible que K tenga unidades de concentración ya que se trata de un
término adimensional. Por ello, y porque así lo demostró en el examen, designamos a partir de ahora
S0,5 como la concentración de sustrato para conseguir ½ de Vmax. K es la constante de disociación
No entra la ecuación de Adair.
ENZIMOLOGÍA
98
Regulación enzimática
7