Ingeniería Genética y Biotecnología

Genética II
Ingeniería genética y biotecnología
Tema 12 de Biología NS
Diploma BI
Curso 2012-2014
Introducción
Desde siempre, los humanos han intentado mejorar la producción de un
alimento, tanto por la calidad como por la cantidad. Por ello, se han
seleccionado razas o variedades de distintas especies.
Estos individuos se han
cruzado de forma inducida
con el fin obtener buenos
resultados. La selección y
el cruzamiento de estos
individuos ha consistido
realmente en la selección y
combinación
de
informaciones genéticas.
Biotecnología
Concepto: Conjunto de procesos industriales que utilizan microrganismos o
células procedentes de animales o vegetales para la obtención de productos
de interés.
Aunque el término Biotecnología
es moderno, desde tiempos
inmemoriales se usan seres
vivos para lograr productos a
partir de una materia prima. Un
ejemplo de estos usos es la
obtención de cerveza a partir de
cereales utilizando levaduras
desde antes del año 6.000 a.C.
Con la aplicación de la Biotecnología no sólo se persigue la obtención de
alimentos elaborados. También se consiguen medicamentos, mejora de
especies vegetales y animales, regeneración de medio ambiente dañado
e, incluso, proteínas humanas que ayudan a paliar enfermedades como
anemia, enanismo o diabetes. La consecución de estos logros se debe a la
aparición de las técnicas de ingeniería genética.
Ingeniería Genética
La Genética molecular ha sido la pieza central de los estudios de Biología
desde que James Watson y Francis Crick dieron a conocer la estructura del
ADN en 1953.
Video1
A partir de 1970 se desarrolla un conjunto de técnicas que se denomina
ingeniería genética y que consiste en manipular y transferir el ADN de un
organismo a otro, obteniendo con ello una nueva variedad biológica con
nuevas características, o bien la corrección de defectos genéticos.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de
ingeniería genética desarrollada por Kary Mullis (Premio Nobel en 1993) y
consistente en la obtención de múltiples copias de la secuencia de ADN
concreta.
Si recogemos una pequeña muestra de ADN, podemos usar la PCR para
amplificarla, ya que utiliza la enzima ADN polimerasa para hacer más copias
del ADN molde.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La PCR consta de un ciclo de
tres fases: calentamiento,
enfriamiento y replicación :
1. Elevando la temperatura a 94ºC,
se desnaturaliza el ADN mediante
la rotura de los puentes de
hidrógeno.
2. Disminuyendo la temperatura a
54ºC, se promueve que se unan
(hibriden) primers/cebadores al
comienzo y final de la sección de
ADN que se quiere amplificar.
3. Elevando la temperatura a 72ºC,
las cadenas de ADN se mantienen
desnaturalizadas de manera que la
ADN polimerasa añade nucleótidos
complementarios amplificando la
secuencia del ADN específico.
Animación1
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
5′′
3′′
Target
sequence
3′′
Genomic DNA
Cycle 1
yields
2
molecules
3′′
3′′
5′′
Extension:
DNA polymerase
adds nucleotides to
the 3′′ end of each
primer
Cycle 2
yields
4
molecules
Cycle 3
yields 8
molecules;
2 molecules
(in white boxes)
match target
sequence
Este ciclo es repetido más de 35 veces
para producir suficiente ADN para ser
usado en el laboratorio, ya que el ADN
es amplificado de forma exponencial.
La ADN polimerasa utilizada debe ser
termoestable, por lo que se usa la
enzima
de
la
bacteria
Thermus
aqueaticus (taq polimerasa).
5′′
5′′
Denaturation:
Heat briefly
to separate DNA
strands
Annealing:
Cool to allow
primers to form
hydrogen bonds
with ends of
target sequence
Primers
New
nucleotides
Web Sumanasinc
La PCR se suele usar para amplificar
una
pequeña
muestra
de
ADN
encontrada en el escenario de un crimen
para ser usado como evidencia en
perfiles de ADN.
Electroforesis de ADN
La electroforesis en gel de agarosa es una técnica comúnmente usada en
biología molecular para separar los fragmentos que componen una mezcla de
ADN, que dependiendo de su tamaño, tendrán distinta velocidad de
desplazamiento en un campo eléctrico.
Cathode
Power
source
Mixture
of DNA
molecules
of different sizes
Shorter
molecules
Gel
Glass
plates
Anode
Longer
molecules
El gel conduce la electricidad, por lo
que los fragmentos de ADN, al
poseer carga negativa, se desplazan
en el gel hacia el electrodo positivo,
con mayor velocidad cuanto menor
sea su tamaño.
Electroforesis de ADN
Se toma muestra de ADN
En el primer pocillo se
carga un patrón de
pesos moleculares para
determinar el tamaño de
nuestros fragmentos.
La PCR amplifica el
ADN para tener una
cantidad suficiente
Las enzimas de
restricción cortan el
ADN en fragmentos
de distinta longitud
Se añade al gel una
sustancia que produzca
fluorescencia bajo luz
UV, y permita identificar
los fragmentos.
Se emplea en técnicas de
análisis
de
ADN,
como
buscar un número de bandas
compartidas (paternidad) o
el total de coincidencias
(evidencia crimen).
Web DNA Learning Centre
Las muestras son cargadas en pocillos
al comienzo del gel.
Análisis de ADN
En
las
regiones
cromosómicas
intergénicas, especialmente cerca de
los
centrómeros,
existen
repeticiones polimórficas siempre
en parejas, es decir, una en cada
cromosoma homólogo.
En el locus de un polimorfismo, se
localiza
un
número
diferente
repeticiones de una misma secuencia
de nucleótidos.
Estas repeticiones pueden ser regiones variables
de 9-80 nucleótidos repetidas en tándem
(VNTRs) o bien
pequeñas repeticiones en
tándem de 2-8 nucleótidos (SNTs).
Cada persona hereda el patrón de VNTRs y
SNTRs de sus padres, en un cromosoma
materno y otro paterno.
Análisis de ADN
La huella de ADN (DNA fingerprint) hace uso de estas variaciones o
polimorfismos consistentes en secuencias repetidas de ADN.
La probabilidad de que 2 personas que no son genéticamente idénticas
tengan la misma huella de ADN es extremadamente improbable.
Los marcadores polimórficos usados en la huella de ADN tienen muchos
alelos diferentes con cientos o miles de genotipos.
Análisis de ADN
DNA + enzimas de restricción
Fragmentos
de restricción
Ι
Heavy
weight
Nitrocellulose
paper (blot)
ΙΙ ΙΙΙ
ΙΙΙ
Gel
Sponge
I Alelo
normal
gen X
ΙΙ Alelo
mutado
gen X
ΙΙΙ Heterocigoto
Preparación de fragmentos de restricción.
Paper
towels
Alkaline
solution
Gel electroforesis.
Blotting.
Animación2
Sonda marcada
radioactivamente
para el gen X
se añade al
filtro de nylon
Ι
ΙΙ ΙΙΙ
ΙΙΙ
La sonda se une
mediante puentes de
hidrógeno a los fragmentos
que contienen el gen X
Ι
ΙΙ ΙΙΙ
ΙΙΙ
Fragmento del
alelo mutante
Paper blot
Hibridación con sonda radioactiva.
Película
Revelada
del
paper blot
Fragmento del
alelo normal
Autoradiografía.
Análisis de ADN en evidencias criminales
La electroforesis en gel de ADN se emplea en técnicas de
análisis del ADN, como el análisis forense, donde se usa la
huella de ADN obtenida a partir de tejidos o fluidos corporales.
Análisis de ADN en evidencias criminales
1. Obtención de la huella de ADN o huella genética.
Web pbs-NOVA
Análisis de ADN en evidencias criminales
2. Comparación de las huellas de ADN con la evidencia inculpatoria.
Análisis de ADN en evidencias criminales
¿Qué sospechoso es el culpable de la violación?
Debajo se comparan dos muestras de sangre
encontradas en un crimen con el ADN de la
victima y los sospechosos. ¿A quiénes
pertenecen?
Web dnai.org
Análisis de ADN en pruebas de paternidad
La electroforesis en gel de ADN también se emplea en pruebas de paternidad.
Esta cuatro imágenes son
secciones del mismo gel
de electroforesis.
El fragmento 1 es el mayor
(próximo al inicio). El
fragmento 15 es el menor.
¿Comparte
el
hombre
suficientes bandas con el
bebé
como
para
ser
considerado su padre?
El perfil de ADN es
mejor demostrando la
inocencia
que
la
culpabilidad.
Análisis de ADN en pruebas de paternidad
Para los siguientes niños A-F, indica cuál de ellos es fruto de ambos padres
(padre y madre).
¿Son los padres biológicos?
Análisis de ADN en exámenes del BI
Análisis de ADN en exámenes del BI-Mayo 2010
Análisis de ADN y TdC
Hay toda una serie de implicaciones sociales motivadas por los análisis de
ADN, como:
- Problemas de identidad de un hijo que descubre de improviso quién es su padre
biológico;
- Problemas de autoestima de quien descubre que no es padre de los que creía
sus hijos;
- Problemas en la relación de pareja si él
descubre que no fue quien engendró un
hijo;
- Alivio que supone para las víctimas de
delitos el hecho de que los delincuentes
sean identificados y condenados, en
algunos casos varias décadas después de
haberse perpetrado el delito.
También es discutible la dificultad de evaluar la probabilidad de que dos
individuos tengan el mismo perfil, así como la admisión de un análisis de ADN
como prueba contundente en algunos casos judiciales famosos de los últimos
años.
Web dnai.org
Proyecto Genoma Humano
Fue completado en abril de 2003 y consistió en un esfuerzo de colaboración
internacional para secuenciar completamente el genoma humano. Aparte de la
cooperación internacional y la información compartida, el PGH alcanzó
resultados muy valiosos para la Ciencia:
- Determinación del número de genes
(sólo 30 000) de nuestro genoma.
- Ubicación (loci) de genes específicos,
lo que ha permitido realizar investigación
dirigida para el diagnóstico, tratamiento y
farmacología.
- Descubrimiento de nuevas proteínas
y sus funciones.
Comparación
entre
genes
de
diferentes especies para obtener más
información acerca de la historia evolutiva.
- Nacimiento de la bioinformática:
Aplicación de tecnología informática en la
gestión y análisis de datos biológicos.
Web genome
Proyecto Genoma Humano: Número de genes
El PGH ha permitido conocer el número total de genes humanos, muy
inferior al que se pensaba en un primer momento, al tener el genoma
haploide humano un tamaño de 3200 millones de pares de bases (3200 Mb).
El genoma humano presenta una
densidad de genes muy inferior a la
que inicialmente se había predicho, con
sólo en torno al 1,5% de su longitud
compuesta por exones codificantes de
proteínas.
Un 70% está compuesto por ADN
extragénico y un 30% por secuencias
relacionadas con genes (intrones,
reguladoras, pseudogenes, UTR, otros).
Del
total
de
ADN
extragénico,
aproximadamente un 70% corresponde
a repeticiones dispersas, de manera
que, más o menos, la mitad del
genoma
humano
corresponde
a
secuencias repetitivas de ADN.
Proyecto Genoma Humano: Locus de los genes
El PGH ha permitido conocer la localización de los genes humanos.
Web ncbi
Proyecto Genoma Humano: Diagnóstico médico
El PGH ha impulsado la investigación médica y
ayudándonos a ver las causas reales de las enfermedades.
En un primer momento, se creyó que
muchas enfermedades, como el cáncer de
pulmón, la obesidad y discapacidad de
aprendizaje, tenían un origen genético.
Al descifrar el genoma humano y localizar los
genes que fallan en el caso de muchas de
estas enfermedades, podemos conocer quien
está más en riego bajo ciertas condiciones.
¿Cuáles son las implicaciones morales, éticas
y legales de este conocimiento? (TdC)
Web elmundo.es
farmacéutica,
Proyecto Genoma Humano: Nuevas proteínas
El PGH ha permitido conocer nuevas proteínas y sus funciones, algo
absolutamente necesario, ya que es lo que diferencia a dos tipos celulares de
una misma especie/individuo.
Muchas proteínas una vez sintetizadas son
modificadas por la unión de otras moléculas,
tales como fosfatos, acilos, azucares, lípidos,
etc., moléculas que se unen de forma
estable y pueden modificar radicalmente la
actividad biológica de la proteína.
Entonces,
si
consideramos
las
modificaciones postranscripcionales (edición
de ARN) y postraduccionales (fosforilación,
glicosilación, adenilación, unión a lípidos,
etc.) vemos que se pueden originar
proteínas de actividad biológica muy diversa
partiendo de un mismo gen.
Se calcula que en el ser humano existen
algo así como 30 000 genes, que generan no
menos de 70 000 ARN mensajeros,
resultando luego en 300 000.
Proyecto Genoma Humano: Relaciones evolutivas
Investigaciones recientes indican que existen evidencias
genómicas que muestran que el cromosoma 2 humano
es en realidad una fusión de dos cromosomas
ancestrales, explicando por qué el otro gran simio tiene
24 pares de cromosomas, pero nosotros solo 23.
Varias son las evidencias:
- Los cromosomas análogos (2p y 2q) en los grandes
simios no humanos, al acoplarse muestran un idéntico
patrón de bandeo que el cromosoma humano 2.
- Las secuencias teloméricas (extremos) de estos
cromosomas se localizan en el medio del cromosoma
humano 2 donde los cromosomas ancestrales se han
fusionado.
- El centrómero del cromosoma humano 2 se alinea con
el centrómero del cromosoma 2p del chimpancé.
Video2
Proyecto Genoma Humano: Bioinformática
El PGH le ha dado un grandísimo impulso
(Genómica), al dar una visión completa del genoma.
Escaneando un set completo de marcadores
genéticos,
se
puede
completar
la
investigación y diagnosis mucho más
rápidamente: Chip de ADN.
Un chip de ADN (del inglés DNA microarray)
es una superficie sólida a la cual se une una
colección de fragmentos de ADN.
Se usan para analizar la expresión diferencial
de genes, monitorizándose los niveles de
miles de ellos de forma simultánea. Su
funcionamiento consiste en medir el nivel de
hibridación entre la sonda específica y la
molécula diana, indicándose generalmente
mediante fluorescencia y analizándose por
análisis de imagen, lo cual nos indicará el
nivel de expresión del gen.
a
la
bioinformática
Proyecto Genoma Humano: Bioinformática
Suelen utilizarse para identificar genes con una expresión diferente bajo
condiciones distintas. Por ejemplo, para detectar genes que producen ciertas
enfermedades mediante la comparación de los niveles de expresión entre
células sanas y células que están desarrollando ciertos tipos de enfermedades.
Video3
Transferencia de genes entre especies
Cuando se transfieren genes entre distintas especies, la secuencia de
aminoácidos de los polipéptidos traducida a partir de dichos genes no varia
dado que el código genético es universal.
Todos los seres vivos, salvo alguna
excepción,
poseen
el
mismo
código genético, posibilitando que
la secuencia de bases (gen) pueda
ser transferida de un organismo a
otro sin que cambie su función.
Por tanto, podríamos coger el gen
de la insulina de un humano e
insertarlo
en
un
plásmido
bacteriano, de manera que la
bacteria pudiera ahora producir
insulina humana.
Transferencia de genes entre especies
En las técnicas de transferencia génica, se identifica en un organismo el gen
que codifica para una característica favorable y es transferido a otro
organismo.
La transferencia de genes entres especie, puede usarse en:
- Fármacos; para producir grandes volúmenes
de una proteína deseada, como la insulina o
factores de coagulación.
- Agricultura; para modificar genéticamente
(adquiriendo
características
favorables),
organismos de interés agrícola como el arroz
dorado rico en nutrientes.
Video4
Transferencia de genes entre especies
La transferencia de genes implica los siguientes elementos:
- Un vector.
- Enzima de restricción.
- Enzima ADN ligasa.
- Célula hospedadora.
Pasos en la transferencia de genes
Step 1. Extraer un plásmido bacteriano (o comprarlo comerciales) que posea un
gen de resistencia a un antibiótico.
Animación3
Step 2. Cortar dicho plásmido con una enzima de restricción (endonucleasas)
que reconoce unas secuencias específicas en el ADN.
Endonucleasas de restricción
Las enzimas o endonucleasas de restricciónes aquella que puede
reconocer una secuencia concreta de entre 4 y 12 nucleótidos dentro de una
molécula de ADN y cortarlo en ese punto determinado, llamado sitio de
restricción.
El mecanismo de corte de DNA se
realiza a través de la ruptura de dos
enlaces fosfodiéster en la doble
hebra, lo que da lugar a dos extremos
de DNA. Éstos pueden ser romos
(cuando los enlaces rotos coinciden)
o cohesivos, que tienen tendencia a
volver a unirse de modo espontáneo.
Animación4
Pasos en la transferencia de genes
Step 3. El gen de interés es cortado con la misma enzima de restricción,
generando extremos cohesivos, por lo que puede ser insertado en el plásmido
mediante la enzima ADN ligasa. Si el gen de interés es eucariota, como la
insulina, posee intrones, por lo que a partir de su ARNm aislado, se produce
ADNc mediante la enzima transcriptasa inversa, que posteriormente en forma
de doble cadena se inserta en el plásmido.
Pasos en la transferencia de genes
Step 4. El plásmido con el gen de la insulina es introducido por transformación
en la bacteria (el hospedador). Para seleccionar los transformantes, se cultivan
en medio con antibiótico, de manera que solo las bacterias que hayan
incorporado el plásmido, sobrevivirán.
Pasos en la transferencia de genes
Step 5. Las bacterias transformantes seleccionadas se cultivan en grandes
tanques de cultivo con el medio apropiado. Comienzan a dividirse, poseyendo
cada una de ellas el plásmido con el gen de interés (clonación) y a producir
insulina, la cual puede ser purificada.
Animación5
Pasos en la transferencia de genes
Cultivos genéticamente modificados
Cultivos de arroz transgénico (Golden rice) enriquecido en betacaroteno,
que puede convertirse en vitamina A en el organismo y prevenir la ceguera.
Plantas de tomate transgénico con tolerancia a una mayor salinidad.
Cultivos de maíz transgénico resistente a hongos de manera que los
agricultores no pierdan sus cosechas, o de remolacha azucarera tolerante
al herbicida glifosato.
Animales genéticamente modificados
Producción del factor de coagulación IX en la leche de ovejas
transgénicas, que es extraido y purificado para el tratamiento de
hemofílicos.
Aspectos éticos de la modificación genética
La idea de producir organismos genéticamente modificados es duramente
debatida y está muy dividida. Los beneficios potenciales de la ingeniería
genética son grandes, aunque debemos querer aceptar la responsabilidad de
sus riesgos y posibles consecuencias.
Veamos un ejemplo concreto, el de un cultivo de
maíz
genéticamente
modificado
para
ser
resistente a la plaga de la oruga del taladro del
maíz. Esta oruga se distribuye por el tallo y hojas
del maíz, dañando los haces vasculares e
interrumpiendo el transporte de agua y nutrientes
a lo largo de la planta.
El maíz Bt contiene un gen de la bacteria Bacillus
thuringiensis que produce una proteína tóxica
para la oruga del taladro.
Aspectos éticos de la modificación genética
Beneficios del uso del maíz Bt:
- Se reduce el daño causado por la plaga.
- Se reduce el uso de plaguicidas, ahorrando dinero.
- Un menor uso de plaguicidas, implica un menor impacto sobre el
medioambiente.
- Menor necesidad de revisiones periódicas para detectar signos de la plaga.
Riesgos del uso del maíz Bt:
- Eliminará a otros insectos, alterando las redes tróficas de los ecosistemas.
- Los insectos pueden desarrollar resistencia a la toxina Bt, al estar
continuamente expuesta a ella, con las consiguientes consecuencias que
ello conlleva.
- Posibilidad de polinización cruzada, propagando el gen de producción de la
toxina Bt a otros cultivos o plantas silvestres.
Clones
Definición de clon: Grupo de organismos genéticamente idénticos o grupo
de células obtenidas a partir de una única célula progenitora.
Incluye a los gemelos monocigóticos e individuos generados por reproducción
asexual.
Y claro, el más comúnmente entendido significado del término clon es el
producto de la transferencia de un núcleo diferenciado.
Clones usando células animales diferenciadas
En 1996 nacía en el Instituto Roslin, en Escocia, una
oveja con el nombre de Dolly. Era el primer clon
cuyo material genético no procedía de un óvulo
fecundado.
Se realizó utilizando una técnica conocida como:
Transferencia
Nuclear
Celular
Somática
(SCNT), donde se extrae el núcleo de un óvulo
donado, y se le transfiere el núcleo de una célula del
organismo que se quiere clonar.
Video 5
Utilizando sustancias químicas o una
descarga eléctrica suave, el óvulo se
verá forzado a dividirse; creando de
esta manera un nuevo embrión.
Posteriormente, este embrión será
transferido al útero del organismo
huésped.
Técnica de clonación usando células animales diferenciadas
4) Se extrae el núcleo de una célula
2) Se le quita el núcleo
3) Donador de núcleos
Células extraídas de la ubre
y mantenidas en fase G0
5) El nuevo núcleo se fusiona con
el óvulo donado
1) Donador de óvulo
Óvulo extraído de un
donador
6) El óvulo fusionado se implanta
en el útero de una madre de alquiler,
donde se desarrollará el feto
MÁS EJEMPLOS:
Nace la oveja clónica. Su ADN es
exactamente idéntico al del donador nuclear.
Tipos de clonación
Existen dos tipos de clonación bien diferenciadas que se encuentran
reguladas por leyes distintas: clonación reproductiva y clonación terapéutica.
La clonación reproductiva es llevada a cabo con la intención expresa de crear
otro organismo. Este organismo pasará a ser el duplicado exacto de uno que ya
existe o de uno que ha existido en el pasado. La clonación de plantas o de
animales, como la oveja Dolly entra en la clasificación de clonación
reproductiva.
La clonación terapéutica
es llevada a cabo, no para
producir otro organismo,
sino para cosechar células
madre embrionarias que
deberán ser utilizadas en
tratamientos médicos. Las
mismas puede ser usadas
para producir una gran
cantidad
de
diferentes
células, entre las que se
incluyen tejidos, músculos,
etc. Animación6
Aspectos eticos de la clonación terapéutica
Por tanto, la clonación terapéutica consiste en la creación de un embrión
para proveer una línea de células madre genéticamente idénticas al paciente,
las cuales serán reprogramadas para producir el tipo de tejido deseado.
Es legal en algunos países, como en España. Deben distinguirse las cuestiones
sobre clonación reproductiva de las cuestiones sobre clonación terapéutica.
Algunos grupos se oponen con vehemencia a ambos tipos de clonación.
Posibles beneficios:
Argumentos en contra:
tener hijos
enfermedad
- Objeciones religiosas a “jugar a ser Dios”
mediante la creación de lo que muchos
consideran vidas humanas.
- Riesgo reducido de rechazo a
trasplantes.
- Recomendaciones de la ONU contra la
clonación reproductiva no ratificada por todos
los países (riesgo de clonación humana).
- No hay necesidad de esperar a
que un donante muera para dar
los órganos.
- La clonación humana podría facilitar la
creación de una raza superior.
- Existen éxitos en la clonación
terapéutica que la avalan.
- Las técnicas son experimentales y no
fiables, con el resultado de embriones y
bebés muertos.
- Oportunidad de
libres
de
una
genética.
Uso terapéutico de células madre y TdC
La investigación con células
plantea problemas éticos.
madre
El uso de células madre embrionarias
implica la muerte del embrión en estadio
temprano, pero si se desarrolla la
clonación terapéutica con éxito se podría
aliviar el sufrimiento de los pacientes que
sufren distintas afecciones.
Uso de células madre iPS
Usando cuatro genes, se ha conseguido
“reprogramar” células diferenciadas de un
individuo adulto y volver a su estado de célula
madre, restaurando su capacidad de división,
convirtiéndose
en
células
madre
pluripotenciales inducidas (iPS).
Con la utilización de este tipo de células madre
inducidas, puede reducirse la necesidad de
células madre embrionarias.
Video6