análisis bioinformático de un homólogo amibiano parecido a

Revista Aristas: Investigación Básica y Aplicada. Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería. UABC.
Recibido: 03/02/2014 Aceptado: 30/07/2014
ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE UN HOMÓLOGO AMIBIANO PARECIDO A
PROTEÍNAS TOR/FRAP
Bioinformatic analysis of an amebic TOR/FRAP-like homologue
RESUMEN
Los polipéptidos TOR/FRAP (Target of Rapamycin / FKBP12-Rapamycin
Associated Protein) pertenecen a la familia de proteínas PIKK (cinasas
relacionadas a la fosfatidilinositol-3-cinasa), están altamente conservadas
en organismos eucariotas, y participan en vías de señalización que
controlan el crecimiento celular y la organización del citoesqueleto.
Entamoeba histolytica, el agente etiológico de la amibiasis en humanos,
contiene una secuencia genómica que codifica para un polipéptido
homólogo a TOR/FRAP (EhFRAP, EHI_155160). Mediante el uso de
herramientas bioinformáticas, hemos demostrado que EhFRAP posee: (i)
una organización de dominios similar a homólogos funcionales, y (ii) dos
dominios que exhiben patrones de plegamiento similares a los mostrados
por secuencias ortólogas. Por lo tanto, consideramos que EhFRAP tiene un
gran potencial como molécula diana para el desarrollo de fármacos antiamibianos.
Palabras clave: Bioinformática, Entamoeba
comparativa-funcional, TOR/FRAP,
histolytica,
Genómica
PATRICIA LILIÁN ALEJANDRA
MUÑOZ MUÑOZ
Química Farmacobióloga, M.C.
Estudiante de Doctorado
Universidad Autónoma de Baja California
lilian.munoz@uabc.edu.mx
ROSA ELENA
MARES ALEJANDRE
Química Farmacobióloga, Dra.
Profesora-Investigadora
Universidad Autónoma de Baja California
rmares@uabc.edu.mx
SAMUEL GUILLERMO
MELÉNDEZ LÓPEZ
Químico Farmacobiólogo, Dr.
Profesor-Investigador
Universidad Autónoma de Baja California
samuelmelendez@uabc.edu.mx
ABSTRACT
The TOR/FRAP polypeptides (Target of Rapamycin, FKBP12-Rapamycin
Associated Protein) belong to the PIKK protein family (kinases related to
phosphatidylinositol-3-kinase), are highly conserved in eukaryotes, and are
involved in signal pathways that control cell growth and cytoskeletal
organization. Entamoeba histolytica, the causative agent of human
amebiasis, contains a genomic sequence encoding a TOR/FRAP-like
homologue (EhFRAP, EHI_155160). By using bioinformatics tools, we
have demonstrated that EhFRAP has: (i) an organization of domains
similar to functional homologues, and (ii) two domains that exhibit folding
patterns similar to those displayed by sequence orthologues. Hence,
EhFRAP showed great potential as a target for the development of antiamebic drugs.
MARCO ANTONIO
RAMOS IBARRA
Químico Farmacobiólogo, Dr.
Profesor-Investigador
Universidad Autónoma de Baja California
mramos@uabc.edu.mx
Keywords: Bioinformatics, Comparative-functional genomics, Entamoeba
histolytica, TOR/FRAP.
importante conocer los mecanismos biológicos que
mantienen el ciclo vital y la virulencia del parásito.
1. INTRODUCCIÓN
La amibiasis está definida como una infección intestinal
o extra-intestinal causada por el parásito protozoario
Entamoeba histolytica. En México, la amibiasis es una
de las 20 causas principales de morbilidad, ocupando
ente el quinto y sexto lugar anualmente, similar a lo
observado en otros países en vías de desarrollo [1, 2].
Tanto para el desarrollo de estrategias terapéuticas,
nuevas o alternas, como para el control de la amibiasis es
Las proteínas TOR/FRAP pertenecen a la familia de STcinasas conocidas como PIKK (cinasas relacionadas a la
fosfatidilinositol-3-cinasa). Estas proteínas fueron
descritas por primera vez en la levadura Saccharomyces
cerevisiae, Tor1p y Tor2p, las cuales son componentes
esenciales de dos complejos funcionalmente distintos,
TORC1 y TORC2 [3, 4].
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El complejo TORC1 (sensible a rapamicina),
conformado por Tor1p o Tor2p en conjunto con otras
proteínas, es requerido para el inicio de la traducción y
para la progresión de la etapa G1 del ciclo celular, ambos
en respuesta a la biodisponibilidad de nutrientes.
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3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.1. El genoma de Entamoeba histolytica codifica para
proteínas parecidas a TOR/FRAP
En nuestro país, la amibiasis sigue siendo un problema
de salud pública prevalente [17], por lo que el desarrollo
de tecnologías que apoyen al diagnóstico y tratamiento
de la infección será de gran utilidad para asegurar el
éxito terapéutico [18, 19, 20]. Diferentes estrategias
experimentales han sido desarrolladas para identificar
moléculas con posible actividad anti‐amibiana, desde el
uso de extractos de productos naturales [21] hasta el
escrutinio de inhibidores sintéticos de la proliferación
celular [22].
Por otro lado, el complejo TORC2 (insensible a
rapamicina), conformado por Tor2p en conjunto con
otras proteínas, participa en el control del aspecto
espacial del crecimiento y en la polarización del
citoesqueleto de actina [4, 5].
Mediante un análisis post-genómico de la base de datos
AmoebaDB, se identificó una secuencia amibiana que
codifica para un polipéptidos con homología a proteínas
TOR/FRAP, denominado EhFRAP (EHI_155160).
Por otro lado, algunas proteínas amibianas han sido
identificadas como posibles moléculas diana para el
diseño
racional
de
fármacos,
como
la
gliceraldeído‐3‐fosfato deshidrogenasa (EhG3PDH) [23],
la cisteína proteinasa 4 (EhCP4) [24], la proteína
disulfuro isomerasa (EhPDI) [25] y la O‐acetil‐L-serina
sulfhidralasa (EhOASS) [26]. Estas proteínas participan
en diferentes procesos celulares, importantes para el
crecimiento, supervivencia y estilo de vida del parásito.
Interesantemente, el análisis estructural de EhFRAP
reveló una organización de dominios similar a la
observada en secuencias homólogas de otros organismos;
además, la predicción de la estructura terciaria de dos
dominios, uno de unión a rapamicina (RBD) y otro
catalítico ST‐cinasa (PI3Kc), mostró un plegamiento
similar al adoptado por dominios ortólogos.
A pesar de que están pendientes los estudios funcionales
que establezcan la función celular del homólogo
amibiano, el análisis bioinformático apoya la hipótesis
que señala a EhFRAP como una molécula diana con
potencial para el diseño de nuevos agentes terapéuticos
anti-amibianos.
2. METODOLOGÍA
Con el fin de identificar una nueva molécula diana,
particularmente una proteína parecida a proteínas
TOR/FRAP, se realizó una búsqueda en la base de datos
del genoma de E. histolytica, depositada y anotada en el
servidor AmoebaDB [6]. Como resultado, tres secuencias
fueron identificadas: EHI_155160, EHI_169320, y
EHI_013010.
La identificación de secuencias amibianas parecidas a
TOR/FRAP se realizó mediante una búsqueda en la base
de datos AmoebaDB (http://amoebadb.org/amoeba) [6]
usando la palabra clave “rapamycin”.
La secuencia EHI_155160, localizada en el fragmento
cromosómico DS571162 (5,523-13,158 nt) y anotada
como posible proteína FRAP, codifica para un
polipéptido de 292 KDa.
El análisis comparativo e identificación de dominios
estructurales fue realizado utilizando los programas
BLAST y CD Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) [7,
8], PFam (http://pfam.sanger.ac.uk), y Superfamily
(http://supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMILY) [9, 10].
La secuencia EHI_169320, localizada en el fragmento
cromosómico DS571219 (47,529-54,617 nt) y anotada
como posible proteína Tor2, codifica para un polipéptido
de 270 KDa.
La secuencia EHI_013010, localizada en el fragmento
cromosómico DS571168 (29,548-39,497 nt) y anotada
como proteína hipotética, codifica para un polipéptido de
386 KDa.
Las secuencias repetidas fueron identificadas usando el
programa REP (http://www.bork.embl.de/~andrade/
papers/rep) [11]. Los alineamientos fueron obtenidos
usando los programas ClustalX y BioEdit [12, 13], en
versiones locales para PC.
EHI_155160 y EHI_169320 mostraron características
estructurales similares a proteínas TOR/FRAP, de
acuerdo a la comparación funcional (mediante ontología
génica). Sin embargo, EHI_013010 presentó poca
similitud, por lo que fue descartada de los análisis
posteriores.
La predicción de la estructura secundaria fue realizada
mediante el servidor PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.
ac.uk/psipred) [14]. Las estructuras tridimensionales
fueron inferidas usando los servidores Swiss‐Model
(http://swissmodel.expasy.org) y Modeller (http://salilab.
org/modeller) [15, 16].
Mediante un análisis comparativo múltiple, se observó
que las secuencias amibianas EHI_155160 (EhFRAP) y
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Tabla I. Análisis de homología de las secuencias amibianas parecidas a TOR con
respecto a las proteínas TOR1 y TOR2 de levadura.
EHI_169320 (EhTor2) son homólogas a las proteínas
TOR1 y TOR2 de levadura, con un alto grado de
conservación en el extremo carboxilo terminal (a partir
del residuo 1300). Además, el análisis comparativo
binario global (Tabla I) mostró una identidad de 32‐35%
y una similitud de 51‐54%.
repetidos HEAT, los dominios FAT y FATC, y los
dominios funcionales (RBD, de unión a rapamicina; y
PI3Kc, catalítico ST-cinasa).
Previo al estudio de la relación estructura‐función de los
dominios RBD y PI3Kc, se realizó un análisis de
repetidos HEAT (cuya estructura y organización es poco
conservada) usando un algoritmo iterativo basado en
estimaciones estadísticas [11]. Un patrón de repetidos
HEAT fue identificado en EhFRAP (residuos 193-1957),
muy similar al observado en los homólogos de levadura
(ScTOR2: residuos 765-1919; ScTOR1, residuos 1241916) y humano (mTOR/HuFRAP: residuos 25-1980).
Además, el análisis comparativo global con la proteína
mTOR de humano reveló valores de 33 y 53% de
identidad y similitud (muy parecidos a los observados en
el comparativo con la proteína TOR2 de levadura).
Por otro lado, un péptido de 17 aminóacidos
(AEM*ITELEEIIEM*KK) con homología a la proteína
EhFRAP (residuos 1600‐1614) fue identificado mediante
un análisis proteómico del fagosoma amibiano,
evidenciando su expresión activa in vivo.
3.3. EhFRAP contiene un dominio estructural de
unión a rapamicina
Mediante comparación en diferentes bases de datos, se
identificó una secuencia de 105 residuos (E2002-N2106)
en EhFRAP con características estructurales similares al
dominio RBD (Figura 2A). El alineamiento mostró una
conservación del 40% y la presencia de 3 residuos
conservados (S2022, W2094, Y2101), presumiblemente
necesarios para la unión a rapamicina [27].
Con base al conjunto de evidencias descritas, EhFPAP
(EHI_155160) fue considerada como candidato para el
estudio de la relación estructura-función de una proteína
amibiana parecida a TOR/FRAP, la cual pudiera
representar una excelente molécula diana para el
desarrollo racional de fármacos anti‐amibianos.
Además, la predicción de la estructura secundaria reveló
un patrón altamente conservado de 4 α‐hélices, donde
destaca la presencia de una horquilla (entre las α-hélices
3 y 4) más larga de lo común. Adicionalmente, la
predicción de la estructura terciaria basada en homología
de secuencias ratificó algunas de las características
estructurales descritas previamente (Figuras 2B y 2C).
3.2. EhFRAP presenta una arquitectura estructural
similar a las proteínas TOR/FRAP
Una característica estructural de la familia de proteínas
TOR/FRAP es la conservación de la organización de
dominios. EhFRAP no fue la excepción, ya que presentó
el arreglo característico de esta familia (Figura 1): los
Figura 1. Representación esquemática de la organización de dominios de EhFRAP. Los repetidos
HEAT, los dominios FAT y FATC, así como los dominios de unión a rapamicina (RBD) y
Ser/Thr‐cinasa (PI3Kc) se indican en diferentes colores.
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Figura 2. Predicción de la estructura terciara del dominio de unión a rapamicina (RBD) de la
proteína EhFRAP. (A) Alineamiento binario de las secuencias FRAP homólogas de amiba y
humano. Los residuos conservados se muestran sombreados en gris. Las cuatro alfa‐hélices
inferidas se muestran en la parte superior. Además, los residuos aparentemente implicados en la
unión a rapamicina se indican con un asterisco. (B) Representación tubular del trayecto seguido por
los carbonos alfa de la estructura terciaria de EhFRAP (inferida) en comparación con la estructura
cristalográfica de HuFRAP (PDB_1AUE). La secuencia de humano se muestra en azul, en tanto la
amibiana en rojo. (C) Representación en listones del plegamiento inferido de la secuencia EhFRAP.
La secuencia (amino a carboxilo) se indica en progresión de los colores del espectro visible (azul a
rojo).
patrón de plegamiento adoptado por la predicción del
dominio PIK3c de EhFRAP mostró un alto nivel de
conservación en las estructuras secundarias (α-hélices y
β‐plegadas); sin embargo, fue evidente una amplia
divergencia en las horquillas. Por otro lado, el
alineamiento de estructuras secundarias reiteró un patrón
altamente conservado; incluso, se evidenció la presencia
de las horquillas funcionales antes mencionadas.
3.4. EhFRAP contiene un dominio estructural
catalítico ST-cinasa
Mediante una búsqueda en diferentes bases de datos, se
identificó una secuencia de 278 residuos (I2146-I2422)
en EhFRAP con características estructurales similares a
los dominios catalíticos PI3Kc.
Para el análisis de la estructura primaria, se realizó un
alineamiento entre los dominios PI3Kc de EhFRAP y
PIKKc de HuFRAP, el cual reveló una similitud mayor a
85% (datos no mostrados) y la presencia de varios
residuos conservados, presumiblemente importantes para
la unión a ATP. Además, también se demostró la
formación de dos horquillas funcionales (una de
activación y otra de catálisis).
4. CONCLUSIONES
El genoma de Entamoeba histolytica codifica para un
gen, denominado EhFRAP, con alta homología a
proteínas de la familia TOR/FRAP. La estructura y
organización de dominios de EhFRAP son muy similares
a los observados en proteínas homólogas de humano y
levadura. Tanto el dominio de unión a rapamicina (RBD)
como el dominio catalítico ST‐cinasa (PI3Kc) muestran
un patrón de plegamiento similar al adoptado por
dominios ortólogos. Más aún, ambos dominios
presentaron características estructurales presumiblemente
importantes para su función.
Por otro lado, el análisis de la estructura secundaria y
terciaria se llevó a cabo mediante la predicción de la
estructura tridimensional basada en homología de
secuencias (Figura 3), usando como modelo al dominio
PI3Kc de la proteína p110δ de ratón (PDB_2WXG) [28].
Como se puede observar en las Figuras 3A y 3B, el
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Figura 3. Predicción de la estructura terciara del dominio PIK3c de la proteína EhFRAP. (A)
Representación tubular del trayecto seguido por los carbonos alfa de la estructura terciaria de
EhFRAP (inferida) en comparación con la estructura cristalográfica de p110δ (PDB_2WXG). La
secuencia de ratón se muestra en azul, en tanto que la amibiana en rojo. (B) Representación en
listones del plegamiento inferido de la secuencia EhFRAP. La secuencia (amino a carboxilo) se
indica en progresión de los colores del espectro visible (azul a rojo). (C) Alineamiento de las
secuencias PIK3c homólogas de amiba y de ratón. Los residuos conformando estructuras
secundarias α‐helice y β‐plegada se muestran sombreados en azul y verde, respectivamente.
Además, las horquillas funciones (cat, catalítica; act, activación) también se identifican.
A pesar de que es necesario realizar estudios funcionales
que establezcan claramente la función celular del
homológo amibiano, el presente análisis bioinformático
apoya la hipótesis que señala a la proteína EhFRAP
como una molécula diana con potencial para el diseño
racional de nuevos agentes terapéuticos anti-amibianos.
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Patricia Lilián Alejandra Muñoz Muñoz: Química Farmacobióloga
con estudios de Maestría en Ciencias (Bioquímica) por la Universidad
Autónoma de Baja California. Estudiante de Doctorado en Ciencias
(Bioquímica).
Rosa Elena Mares Alejandre: Química Farmacobióloga con estudios
de Maestría en Ciencias Químicas (Biotecnología) y Doctorado en
Ciencias (Bioquímica) por la Universidad Autónoma de Baja
California. Miembro del Sistema Nacional de Investigadores desde
2011, con reconocimiento de Investigador Nacional Nivel 1 desde
2014. Profesora a nivel licenciatura y posgrado con más de 12 años de
experiencia.
Samuel Guillermo Meléndez López: Químico Farmacobiólogo con
estudios de Maestría en Ciencias (Bioquímica) por la Universidad
Nacional Autónoma de México y Doctorado (Ph.D.) en Patología
Molecular por la Universidad de California en San Diego. Miembro del
Sistema Nacional de Investigadores desde 2008, con reconocimiento de
Investigador Nacional Nivel 1 desde 2011. Profesor a nivel licenciatura
y posgrado con más de 23 años de experiencia.
Marco Antonio Ramos Ibarra: Químico Farmacobiólogo por la
Universidad Autónoma de Baja California y Doctorado en Ciencias
(Bioquímica) por la Universidad Nacional Autónoma de México.
Miembro del Sistema Nacional de Investigadores desde 1997, con
reconocimiento de Investigador Nacional Nivel 2 desde 2014. Profesor
a nivel licenciatura y posgrado con más de 23 años de experiencia.
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Recibido: 03/02/2014 Aceptado: 30/07/2014