Expresión de DNA recombinante in vivo CAPÍTULO 9 - U

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CAPÍTULO 9
Expresión de DNA recombinante in vivo
Expresión del DNA clonado en células
•
•
Caracterización del producto génico
Análisis funcional de DNA clonado
Expresión del DNA clonado en organismos
Análisis funcional de genes en individuos completos
Manupulación de genes/Inactivación de genes
Creación de individuos transgénicos
Seres vivos como biorreactores
Caracterización del producto génico
mediante expresión funcional en células
Células utilizadas como sistema para la
expresión funcional de genes “de interés”
Procariotes
(Ej. E. coli)
USO
Analítico /productivo
Preferentemente genes de procariotes o
aquellos de eucariotes que no requieran
procesamiento post-transcripcional o posttraduccional
Vectores con promotores fuertes: trp, lac, PL,
tac (sintético)
Operador, permite control de la expresión
Eucariotes Procesamiento de transcritos
Modificaciones postraduccionales
1.-Levaduras
USO
Analítico /productivo
Expresión de proteínas secretadas
Sistema del doble híbrido (interacción de
proteínas o dominios de proteínas solubles)
Gal 4
presa
carnada
Sistema del doble híbrido
Promotor-reportero
Incorporación en
levaduras
Selección
Actividad del
reportero
La “carnada”, mediante el sistema de doble-híbrido, permite
encontrar la proteína “presa” con la se une directamente
2.- Ovocitos de sapo
USO
Analítico
Expresión de proteínas de membrana
Gran superficie (esferas de 1-2 mm ø)
Expresión en células individuales
Inyección de DNA en el núcleo
Inyección de mRNA en el citoplasma
3.- Líneas celulares de insecto
USO
”Productivo”/analítico
Expresión de grandes cantidades de
proteínas secretadas con propósitos
esencialmente analíticos
4.-Líneas celulares de mamífero
USO
Principalmente
analítico
Análisis funcional de proteínas
nativas o modificadas
Sobrexpresión transitoria o
permanente de gen “de interés”
Análisis funcional de promotores
y secuencias reguladoras
Vectores derivados de genomas virales:
SV-40 (simian virus)
CMP(citomegalovirus)
BMP(papiloma bovino)
Adenovirus
Retrovirus
Lentivirus
ANALISIS FUNCIONAL IN VIVO
Expresión funcional del gen clonado
Gen de interés
promotor
Análisis
Análisis de secuencias reguladoras de la
expresión génica (Promotores)
CAT
Secuencia de interés
Sustratos:
cloramfenicol
gen reportero:
extracto
celular
luciferasa
GFP
β galactosidasa
CAT
cloramfenicol acetil
transferasa
+
*Acetil-CoA
cromatografía
Cloramfenicol
acetilado
Reporteros:
Reacción catalizada por la luciferasa
luciferin
oxiluciferin
luciferase
Emisión de luz
Proteína Fluorescente Verde (GFP)
Proteína Fluorescente Roja
(RFP)
Identificación de promotores y
elementos regulatorios cis
gen reportero
región reguladora de
la expresión génica
GGGCAGAGCATATAAGGTGAGGT
Actividad
normalizada
1
0
n1 n2 n3 n4………………………………………………………………………………………………nn
a
c
t
i
v
i
d
a
d
Nucleot.
Actividad del gen reportero
vs
posición modificada en la secuencia
Expresión de proteínas fusionadas
Estudios de la función de dominios
determinados en una proteína
marcador
Adición de señales
de destinación subcelular
a una proteína reportera
Expresión funcional de “quimeras”
cDNA 1
cDNA 2
Isoformas
de proteína
cDNA 1 /cDNA 2
cDNA 2 /cDNA 1
*
Actividad
relativa
1.0
0.5
0
1
1/2
2/1
“quimeras”
2
Evaluación del efecto de mutación puntual
Análisis funcional
(requisito:
disponer de ensayo apropiado)
Actividad (%)
Actividad relativa de mutantes
Efecto de la supresión
de la expresión de genes
DNA o RNA antisentido
RNA antisentido
Formación de molécula de hebra doble entre el mRNA y
ácido nucleico complementario, que impide su traducción
gen x
transcripción
traducción
in vivo
Producto génico
Función
gen x
P
transcripción
traducción
Supresión de la función
o
in vitro
transcripción
in vivo
in vivo
Silenciamiento de genes
RNA de interferencia o RNA interferente
(RNAi)
•Silenciamiento génico post transcripcional
(PTGS)
•Mecanismo natural (micro RNAs o miRNAs)
verificado en toda la escala evolutiva: protozoos,
nemátodos, insectos, plantas y animales superiores
Opera en distintos procesos celulares : regulación
endógena de expresión de genes específicos y
defensa contra ácidos nucleicos invasores (virus)
Herramienta para la
supresión de la expresión
de genes específicos
Núcleo
miRNA
“artificial”
shRNA
mRNA
traducción
Supresión de la función
siRNA
RNA interferente pequeño (corto)
Mediador fundamental del silenciamiento génico
•
ds RNA (hebra doble)
•
Longitud 21 a 25 nucleótidos
•
Complementario a secuencia
génica sujeta a silenciamiento
(especificidad)
Mecanismo de silenciamiento génico
mediante siRNA
Vía del RNA interferente (RNAi)
2. El dsRNA largo es procesado por
la enzima DICER (actividad
ribonucleasa) para generar
fragmentos de 20-25 nucleótidos
de longitud (siRNA)
3. El siRNA se incorpora a un
complejo multiproteico que se
denomina “Complejo Silenciador
Inducido por RNA” (RISC)
4. RISC genera cortes en el RNA
codificante (mRNA).
5. Los fragmentos son degradados
por exonucleasas especializadas
Especificidad
dsRNA
DICER
siRNA
Al constituirse el RISC, las hebras
complementarias (sentido y
antisentido) del siRNA son
desapareadas
El siRNA desapareado (hebra
antisentido) guía al complejo
RISC hacia su blanco (mRNA,
hebra complementaria)
El siRNA desapareado antisentido
se asocia (pareamiento de las
bases complementarias) con el
RNA “blanco”
Actividad de endorribonucleasa
corta el RNA blanco en la
porción media de la región
pareada.
Exonucleasas completan la
degradación
siRNA como herramienta para
silenciamiento de genes específicos
en células de mamífero
•Diseño de los siRNAs
–
Selección de la secuencia blanco en el gen de
interés
–
Es requisito que no tenga homología con
otros genes
–
Es requisito que no tenga tendencia a formar
estructura secundaria
–
Debe tener un contenido GC menor a 55%
(40-55)
•Sintesis química de las hebras complementarias
Aplicación en terapia
Ensayos clínicos
Nature Reviews-Genetics 12: 329-340, 2011
Incorporación del siRNA a las células
•Inyección de dsRNA (sintetizado químicamente o
transcrito in vitro)
•Bombardeo con partículas recubiertas del siRNA
•Nanopartículas
•Bacterias
•Virus
Nature Reviews-Genetics 12: 329-340, 2011
Vectores para expresión de
short hairpin RNA (sh RNA) in vivo
(generación persistente de siRNA)
Secuencia que codifica shRNA de interés está bajo el
control transcripcional del promotor para la RNA pol III
Estructura del transcrito típico
Tallo:
Asa o “loop”
Extemo 3´
25-29 nucleótidos de longitud
4-23 nucleótidos de longitud
con 2 nucleótidos desapareados
Oligonucleótido F
Sentido
5’ GATCCCC secuencia ttcaagaga
anti sentido
secuencia TTTTTGGAAA
Oligonucleótido R
Sentido
secuencia
anti sentido
tctcttgaa
secuencia
P
5’ AGCTTTTCCAAAAA
transcrito
Evaluación
GGG
P
P
P
shRNA-ERK1
shRNA-ERK2
1,6
ERK1
1,4
ERK2
1,2
1,0
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0 ,0
ER K1
ER K2
sh R N A
SC R
Recombinación Homóloga
Mecanismo biológico: intercambio de información genética
entre secuencias homólogas
Como herramienta para manipulación genética:
Inactivación o ablación (knock out) de genes
Inserción de genes
“GENE TARGETING”
Recombinación homóloga
DNA genómico
gen “X” funcional
gen “X” con inserción
(no funcional)
recombinación
gen “X” no funcional
Secuencia que “interrumpe”
Marcador de selección (Ej. gen de
resistencia a antibiótico)bajo control
transcripcional del promotor del gen X
Sustitución de un gen (o parte de él)
recombinación
gen “X” funcional
gen “X” funcional
gen “X” funcional
Inserción de DNA en el gen blanco (diana)
vector
gen
marcador y
gen “X”
Α
Β
recombinación
∗
∗
∗
Incorporación del gen “x”
dentro del gen y
(inactivación del gen y)
Interrupción del gen x
con otras secuencias
(Inactivación del
gen x endógeno)
Incorporación del transgen en las
células germinales
Huevo
fertilizado
transgen
Microinyección en
pronúcleo
Implantación
en hembra
seudopreñada
Incorporación del transgen al genoma
mediante recombinación homóloga
¿Cuáles crías incorporaron el transgen en su genoma?
Análisis de Southern
para la identificación de los animales que portan el transgen
+/-
+/+
-/-
+/-
homocigotos
Línea de
animales
transgénicos
homocigotos
+/-
+/-
-/-
-/-
Sistema Cre loxP:
(Procariote a Eucariote)
Ablación (Knock out) dirigida de un
gen determinado
Creación de ratón transgénico A
loxP
A
loxP
Se incorpora el “gen de interés” acotado por
sitios lox P (34 pb) en el genoma de los ratones A
Creación de ratón transgénico B
B
Se incorpora el “gen Cre” unido al promotor
específico para un tipo celular determinado en el
genoma de los ratones B
P
gen Cre
Promotor para
expresión
tejido-específica
Cre es recombinasa (de bacteriófago)
específica para sitios lox P.
Su expresión queda circunscrita a un
tejido específico (según el promotor
escogido)
Cruza de ratones A y B genera los ratones C
A
B
C
En el tejido de los ratones C, donde el promotor P es funcional…
se expresará la enzima Cre, que cataliza la recombinación de
los sitios loxP
Eliminación de gen de interés sólo en el
tejido donde se expresa la recombinasa Cre
Análisis de la(s) consecuencias de la
ablación de genes (Knock out)
Morfogénesis en el curso
del desarrollo embrionario
Mutante Bithorax de
Drosophila
Epecimen nativo de
Drosophila
Mutante
Antenapedia de
Drosophila
Drosophila nativa
Incorporación de tranagen en el genoma
de células somáticas
Ex vivo
Selección
Descendencia
normal
Incorporación de transgen en células
troncales embrionrias
. . ..
.
.
blastocisto.
..
..
.. . ... ...
....
Células de la
masa interna
Ex vivo
Selección
... ..
...
.
..
.
.
. .. .. .. ..
Implantación en el útero
madre
Desarrollo
embrionario
descendencia
Expansión ex vivo
Células troncales adultas
Terapia
celular
Diferenciación in vitro
Terapia
génica
modificación
Transferencia génica ex vivo
Transferencia in vivo del transgen
Transferencia génica
…..A considerar:
•Vector
•Transgen de interés
•Tejido o célula de destino
Desafíos:
Destinación específica
Expresión prolongada de transgen
(persistencia del vector)
Nivel de expresión adecuado a los propósitos
perseguidos
Vectores para transferencia génica en humanos
•Retrovirales
•Lentiviraless
•Adenovirales
Ensayos clínicos de transferencia de trangenes
usando adenovirus en seres humanos
Enfermedad
Hereditaria
Transgen
α1 antitrypsin deficiency
α1 antitrypsin
Intramuscular
Batten’s disease
CLN2
Direct intracranial administration
Canavan’s disease
Aspartoacylase
Direct intracranial administration
Cystic fibrosis
CFTR
Haemophilia B
Factor IX
Direct instillation to maxillary sinus,
bronchoscopy to right lower lobe,
aerosol to whole lung
Intramuscular Hepatic Intravenous
LPL deficiency
LPL
Intramuscular
Pompe’s disease
GAA
Series of intradiaphragmatic injections
Muscular dystrophy:
Duchenne
Microdystrophin
Intramuscular
Muscular dystrophy:
limb girdle
α-sarcoglycan
Injections into the selected muscle
Enfernmedad
adquirida
Severe heart failure
SERCA2a
Antegrade epicardial coronary artery infusion
Parkinson’s disease
AADC
GAD
Neutrophin
Intracranial
Macular degeneration
sFLT01
No publicado
Rheumatoid arthritis
TNFR-Fc
Intra-articular
Vía de administración
Nature Reviews - Genetics 12: 341-353, 2011
Problemas enfrentados
Silenciamiento del transgen (Ej metilación)
Mutagénesis indeseada por inserción del transgen
en sitios que codifican funciones importantes
Toxicidad resultante de la sobre-expresión del transgen
Gatillamiento de respuesta inmune contra la proteína
codificada por el transgen
Transmisión indeseada del transgen entre humanos vía
fluidos corporales (suero, orina, semen)
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