Técnicas de Light Scattering para la caracterización de nanopartículas y moléculas Oscar Díez Lorenzo E-mail: oscar.diez@iesmat.com oscar.diez@iesmat.com • Zetasizer Nano Modelos, tecnologías y rangos. • Principios de Medida Dynamic Light Scattering (Tamaño de nanopartículas). Laser Doppler Electrophoresis (Potencial Z). Static Light Scattering (Peso molecular promedio). Difusion Barrier Method (Movilidad electroforética de proteínas). Microrheology (Propiedades visco-elásticas). • Zetasizer Nano Células y accesorios. • Medida experimental Tamaño de nanopartículas de una muestra ejemplo. Potencial Z de una muestra ejemplo. oscar.diez@iesmat.com Zetasizer Nano - Tecnologías Tamaño de nanopartícula Dynamic Light Scattering Non Invasive Back Scattering (NIBS) Potencial Z Laser Doppler Electrophoresis Mixed Mode Measurement Phase Analysis Light Scattering (M3-PALS) oscar.diez@iesmat.com Zetasizer Nano - Tecnologías Pesos moleculares promedio Static Light Scattering Movilidad electroforética de proteínas Diffusion Barrier Method (DLS+PALS) Propiedades Visco-elásticas Microrheology (DLS+PALS) oscar.diez@iesmat.com Zetasizer Nano - Otros parámetros - Melting point de proteínas y polímeros. - Concentración micelar crítica (CMC). - Temperatura micelar crítica (TMC). - Segundo coeficiente virial (A2). - Índice de polidispersidad (Pdi). - Movilidad electroforética. - Punto isoleléctrico. - Conductividad. oscar.diez@iesmat.com Zetasizer Nano - Tecnologías oscar.diez@iesmat.com Tamaño de Nanopartícula DLS-NIBS™ Potencial Z M3-PALS™ Peso Molecular Promedio SLS Tamaño de Nanopartícula DLS-NIBS™ Potencial Z M3-PALS™ Peso Molecular Promedio SLS Tamaño de Nanopartícula DLS-NIBS™ - Peso Molecular Promedio SLS - Potencial Z M3-PALS™ - Tamaño de Nanopartícula DLS a 90º Potencial Z M3-PALS™ Peso Molecular Promedio SLS Tamaño de Nanopartícula DLS a 90º - Peso Molecular Promedio SLS Zetasizer Nano - Rangos oscar.diez@iesmat.com 0,3-10.000 nm DLS-NIBS™ 3,8nm-100 µm M3-PALS™ 980-2·107 Da SLS 0,3-10.000 nm DLS-NIBS™ 3,8nm-100 µm M3-PALS™ 980-2·107 Da SLS 0,3-10.000 nm DLS-NIBS™ - 980-2·107 Da SLS - 3,8nm-100 µm M3-PALS™ - 0,3-5.000 nm DLS a 90º 3,8nm-100 µm M3-PALS™ 9.800-2·107 Da SLS 0,3-5.000 nm DLS a 90º - 9.800-2·107 Da SLS Zetasizer Nano - Actualizaciones 1. Tamaño Nanopartícula 0,3-10.000 nm DLS-NIBS™ 2. Potencial Z 3,8-100 µm M3-PALS™ 3. Peso Molecular Promedio 980-2·107 Da SLS 1. Tamaño Nanopartícula 0,3-5.000 nm DLS a 90º 2. Potencial Z 3,8-100 µm M3-PALS™ 3. Peso Molecular Promedio 9.800-2·107 Da SLS oscar.diez@iesmat.com Zetasizer Nano - Actualizaciones 1. Tamaño Nanopartícula 0,3-10.000 nm DLS-NIBS™ 2. Potencial Z 3,8-100 µm M3-PALS™ 3. Peso Molecular Promedio 980-2·107 Da SLS 4. Movilidad electroforética de proteínas Diffusion Barrier Method 5. Prop. Viscoelásticas Microrreología 6. Conexión SEC Opción Flow Mode oscar.diez@iesmat.com Dynamic Light Scattering Tamaño de nanopartícula • Dynamic Light Scattering (Difusión de luz dinámica). • Photon Correlation Spectroscopy (Espectroscopía de correlación de fotones). • Quasi-Elastic Light Scattering (Difusión de luz quasielástica). • Es una técnica para la medida de tamaño a nivel submicrónico. Mide el movimiento Browniano de las nanopartículas y lo relaciona con su tamaño nanométrico. oscar.diez@iesmat.com Movimiento Browniano Movimiento aleatorio de las nanopartículas o moléculas en suspensión La velocidad del movimiento Browniano depende de: • Tamaño de las nanopartículas. • Temperatura. • Viscosidad del medio dispersante. oscar.diez@iesmat.com DLS mide las fluctuaciones de intensidad a lo largo del tiempo, para determinar el coeficiente de difusión traslacional (D), y posteriormente el diámetro hidrodinámico (DH). Ecuación de Stokes-Einstein. D= kT 3DH k = Constante Boltzmann T = Temperatura = Viscosidad La fluctuación de intensidad es dependiente del tamaño de partícula. oscar.diez@iesmat.com DLS mide las fluctuaciones de intensidad a lo largo del tiempo, para determinar el coeficiente de difusión traslacional (D), y posteriormente el diámetro hidrodinámico (DH). Ecuación de Stokes-Einstein. D= kT 3DH k = Constante Boltzmann T = Temperatura = Viscosidad La fluctuación de intensidad es dependiente del tamaño de partícula. oscar.diez@iesmat.com oscar.diez@iesmat.com oscar.diez@iesmat.com Función de correlación El tiempo en el que la señal de la función de correlación empieza a decaer, nos da la información sobre el diámetro medio de partícula. La linea base nos da información sobre La presencia de partículas grandes o agregados. La pendiente nos da información sobre la polidispersidad de la distribución oscar.diez@iesmat.com Intensidad, Volumen y Número Distribución en número Distribución en volumen ~ 4/3 π r3 Distribución en intensidad ~ d6 1.000.000 1 1 1000 1 5 10 50 100 Diámetro (nm) 5 10 1 50 100 Diámetro (nm) 5 10 50 100 Diámetro (nm) Mezcla que contiene igual número de partículas esféricas de 5 y 50 nm. oscar.diez@iesmat.com Configuración óptica - S90 y ZS90 Configuración óptica DLS tradicional (90 grados). oscar.diez@iesmat.com Configuración óptica - ZSP, ZS y S Configuración óptica DLS - Non Invasive Back Scattering™ (173 grados). oscar.diez@iesmat.com 90º Vs. NIBS™ DLS 90º DLS-NIBS™ Alta Láser Concentración Detector Detector Láser Detector Láser Detector Baja Láser oscar.diez@iesmat.com 90º Vs. NIBS™ oscar.diez@iesmat.com Laser Doppler Electrophoresis Potencial Z • Potencial Z: Es una medida de la magnitud de la repulsión o atracción entre las partículas, y por lo tanto puede ser utilizado para predecir su estabilidad. • Depende tanto de las condiciones químicas de la superficie de la partícula como del dispersante. Pequeños cambios de pH o concentración provocan cambios en el potencial Z. • Valores altos/bajos de potencial Z se traducen en fuerzas de repulsión altas/bajas, y por lo tanto las partículas tienden a repelerse/ataerse entre ellas. oscar.diez@iesmat.com • Las partículas adquieren una carga superficial opuesta a la de la partícula en sí. • Esta carga modifica la distribución de iones del medio que le rodea. • El Potencial Z es la carga de la partícula en un medio específico y a una cierta distancia (doble capa). • El conjunto de partículas con su capa en movimiento browniano proporcionan el potencial Z global de la dispersión. oscar.diez@iesmat.com Configuración óptica - ZSP, ZS, ZS90 y Z Configuración óptica Phase Analysis Light Scattering (13 grados). oscar.diez@iesmat.com • El Potencial Z se calcula a través de la movilidad electroforética que es el movimiento de una partícula cargada relativa al líquido, cuando se le aplica un campo eléctrico. • La muestra es introducida en una célula capilar donde se aplica un campo eléctrico alterno. Las partículas son atraídas hacia el electrodo de carga opuesta. oscar.diez@iesmat.com v=0 f/Hz v>0 f/Hz • El haz de rayo láser incide sobre las partículas en movimiento y provocan un cambio de frecuencia (efecto Doppler). • La tecnología Laser Doppler Electrophoresis es capaz de medir esa diferencia de frecuencia que es directamente proporcional a la movilidad electroforética, y por lo tanto, proporcional al valor de Potencial Z a través de la ecuación de Henry. oscar.diez@iesmat.com v=0 f/Hz v>0 f/Hz Laser Doppler Electrophoresis f1 f2 oscar.diez@iesmat.com Phase Analysis Light Scattering f1 f2 A Interferencia constructiva A B B Interferencia destructiva f1 - f2 = f Las interferencias producen un haz modulado de frecuencia menor e igual a la diferencia de f1 y f2 oscar.diez@iesmat.com Phase Analysis Light Scattering • Laser Doppler Electrophoresis (LDE), tradicionalmente la diferencia de frecuencia se calcula mediante Transformada de Fourier (FT). • Phase Analysis light Scattering (PALS), calcula la diferencia de fase, en vez de la diferencia de frecuencia (LDE). Proporciona una sensibilidad de hasta 100 veces mayor que mediante tecnologías tradicionales (FT). • Mixed Mode Measurement-Phase Analysis Light Scattering (M3-PALS™). Permite la medida de muestras con conductividades muy altas mediante dos modos de medida (FFR y SFR), evitando el efecto Joule y el efecto de la electroósmosis. oscar.diez@iesmat.com M3-PALS™ • Modo FFR (Fast Field Reversal). Elimina la electroósmosis aplicando un campo eléctrico alterno a muy alta frecuencia. Proporciona el valor medio de Potencial Z (Ep). • Modo SFR (Slow Field Reversal). Aplica un campo eléctrico invirtiéndolo lentamente. Proporciona la distribución de Potencial Z (Eo+Ep). oscar.diez@iesmat.com Static Light Scattering Pesos moleculares promedio • Static Light Scattering (Difusión de luz estática). • La intensidad de luz dispersa de una macromolécula (proteína o polímero) es directamente proporcional al producto de su peso molecular por la concentración. I α Mw · C oscar.diez@iesmat.com Static Light Scattering I (MWt) (C) Ecuación de Rayleigh KC 1 2 A2C P R MW K = Optical constant MW = Molecular weight A2 = 2nd Virial coefficient oscar.diez@iesmat.com C = Concentration R = Rayleigh Ratio of the sample P() = Shape factor Pesos moleculares y 2º Coef. Virial • Para P=1, la ecuación de Rayleigh queda simplificada: • Si se representan los valores de KC/R frente a la concentración, por extrapolación se obtiene el valor del peso molecular (intersección con el cero) y el valor del 2º coef. virial A2 (pendiente). oscar.diez@iesmat.com Diffusion Barrier Method Movilidad Electroforética de Proteínas Las proteínas no se degradan por el hecho de aplicarles una campo eléctrico, se desnaturalizan o comienzan a agregarse por el hecho de estar en contacto con los electrodos de la célula de medida. La medida de movilidad electroforética de proteínas debe de combinarse con la técnica de difusión de barrera que protege a la muestra durante la medida introduciendo una distancia física entre la proteína y los electrodos. oscar.diez@iesmat.com Diffusion Barrier Method Movilidad Electroforética de Proteínas Se utiliza como barrera física el mismo tampón en el que se encuentra la proteína evitando así el contacto directo con los electrodos. Se depositan en el fondo de la célula de potencial Z volúmenes pequeños de muestra (20-50 µL) con la ayuda de pipetas especiales de gel electroforesis. oscar.diez@iesmat.com Diffusion Barrier Method Movilidad Electroforética de Proteínas Se utiliza como barrera física el mismo tampón en el que se encuentra la proteína evitando así el contacto directo con los electrodos. Se depositan en el fondo de la célula de potencial Z volúmenes pequeños de muestra (20-50 µL) con la ayuda de pipetas especiales de gel electroforesis. oscar.diez@iesmat.com Las medidas de movilidad electroforética se realizan a través de un SOP que combina medidas de tamaño de partícula y potencial Z para asegurar que no se forman agregados durante la medida que indiquen la degradación de la muestra. Realiza un ajuste automático del voltaje aplicado para reducir la degradación. Las medidas se ejecutan en grupos con pausas para evitar el calentamiento y degradación de la muestra. oscar.diez@iesmat.com Diffusion Barrier Vs. Full cell Distribución de tamaño antes y después de las medidas A.- HSA 10 mg/ml Distribución de tamaño antes de las medidas de potencial Z. B.- HSA 10 mg/ml Distribución de tamaño después de las medidas de potencial Z convencionales (Full cell). C.- HSA 10 mg/ml Distribución de tamaño después de las medidas de potencial Z (Difussion Barrier). oscar.diez@iesmat.com Diffusion Barrier Vs. Full cell Movilidad Electroforética - HSA 10 mg/ml - 10mM NaCl Buena repetibilidad indica Poca repetibilidad indica buena calidad de las medidas. agregación de la proteína. oscar.diez@iesmat.com Microrheology Medida de las propiedades visco-elásticas Las medidas de microrreología se realizan utilizando partículas trazables de tamaño conocido para medir la relación entre el esfuerzo y la deformación. El esfuerzo es aplicado a través del movimiento Browniano de las partículas trazables, y la deformación se mide a través de los cambios de posición de dichas partículas trazables. La función de correlación es directamente proporcional al Mean Square Displacement (MSD ). A través del MSD y utilizando la ecuación de Stokes-Einstein se pueden calcular el módulo viscoso G’’, el módulo elástico G’, y la viscosidad compleja ƞ*. oscar.diez@iesmat.com oscar.diez@iesmat.com oscar.diez@iesmat.com oscar.diez@iesmat.com oscar.diez@iesmat.com oscar.diez@iesmat.com Células de medida • Célula de potencial Z en base acuosa. • Célula de potencial Z en base solvente “Universal Dip Cell”. • Célula de potencial Z de alta concentración. • Célula de potencial Z en superficie. • Célula de tamaño en base acuosa (Volúmenes 1mL, 100µL, y 40µL). • Célula de tamaño en base solvente (Volúmenes 1mL, 12µL, y 2µL). • Célula de flujo. oscar.diez@iesmat.com Autovalorador MPT-2 • Los factores que afectan el Potencial Z son el pH, la Conductividad y la Concentración. • El autovalorador MPT-2 permite realizar barridos de pH, concentración o conductividad automáticamente para la búsqueda del punto isoeléctrico. oscar.diez@iesmat.com Autovalorador MPT-2 • Zona de estabilidad 2 < pH < 4 Pot.Z > 30mV • Zona de inestabilidad 4 < pH < 7,5 -30mV < Pot.Z < 30mV • Zona de estabilidad 7,5 < pH < 12 Pot.Z < -30mV • Punto isoeléctrico pH=5,5 oscar.diez@iesmat.com Vibro-Viscómetro SV-10 • Medida de viscosidad de medios dispersantes con gran exactitud (0,3-10.000 mPas). • Control de temperatura. oscar.diez@iesmat.com Zetasizer APS y Zetasizer μV • Proteínas y biomoléculas. • Tamaño molecular 0,15-1.000 nm (radio), pesos moleculares (342-2·107 Da), melting point, etc... • Zetasizer APS (Auto Plate Sampler). 96 ó 386 muestras. • Zetasizer μV. Volumen de muestra 2μL y conexión a sistema GPC/SEC. oscar.diez@iesmat.com SOLICITUD DE CERTIFICADO DE ASITENCIA admin@iesmat.com IESMAT, S.A. Parque Empresarial Miniparc II Caléndula, 95 Alcobendas - 28109 (Madrid) SOLICITUD DE ESTA PRESENTACIÓN oscar.diez@iesmat.com