acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas.

OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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11 Número de publicación: 2 258 955
51 Int. Cl.:
C12N 15/55 (2006.01)
C12N 9/18 (2006.01)
A61K 38/46 (2006.01)
C07K 16/40 (2006.01)
C12Q 1/68 (2006.01)
ESPAÑA
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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 00128728 .3
86 Fecha de presentación : 06.10.1994
87 Número de publicación de la solicitud: 1096016
87
Fecha de publicación de la solicitud: 02.05.2001
54 Título: Acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas.
30 Prioridad: 06.10.1993 US 133803
73 Titular/es: ICOS CORPORATION
22021 20th Avenue, S.E.
Bothell, Washington 98201, US
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.09.2006
72 Inventor/es: Cousens, Laurence, S.;
Le Trong, Hai;
Eberhardt, Christine D.;
Tjoelker, Larry W.;
Gray, Patrick W. y
Wilder, Cheryl L.
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Cañadell Isern, Roberto
ES 2 258 955 T3
16.09.2006
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas.
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La presente invención se refiere en general a la acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas y, más específicamente, a nuevos polinucleótidos purificados y aislados que codifican la acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas
del plasma humano, a los productos de acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas codificados por los polinucleótidos, a materiales y métodos para la producción recombinante de productos de acetilhidrolasa del factor activador de
plaquetas y a anticuerpos específicos para la acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas.
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El factor activador de plaquetas (PAF) es un fosfolípido biológicamente activo sintetizado por diversos tipos de
células. In vivo y a concentraciones normales de 10−10 a 10−9 M, el PAF activa las células diana tales como plaquetas y
neutrófilos, uniéndose a receptores específicos de la superficie celular acoplados a la proteína G [Venable y colaboradores, J. Lipid Res., 34; 691-701 (1993)]. El PAF tiene la estructura 1-Q-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina. Para
una óptima actividad biológica, la posición sn-1 del esqueleto de glicerol del PAF debe estar en un enlace éter con un
alcohol graso y la posición sn-3 debe tener un grupo fosfocolina de cabeza.
El PAF funciona en procesos fisiológicos normales (p. ej. inflamación, hemostasia y parto) e interviene en las
respuestas inflamatorias patológicas (p. ej. asma, anafilaxia, choque séptico y artritis) [Venable y colaboradores, véase
más arriba, y Lindsberg y colaboradores, Ann. Neurol., 30: 117-129 (1991)]. La probabilidad de la intervención del
PAF en respuestas patológicas ha generado intentos de modular la actividad del PAF y el mayor centro de atención de
tales intentos ha sido el desarrollo de antagonistas de la actividad del PAF, los cuales interfieren con la unión del PAF
a los receptores superficiales celulares. Véase, p. ej. Heuer y colaboradores, Clin. Exp. Allergy, 22: 980-983 (1992).
La síntesis y secreción del PAF, así como su degradación y eliminación parecen estar estrechamente controlados,
hasta el grado de que las acciones inflamatorias patológicas del PAF son el resultado del fracaso de los mecanismos de
regulación del PAF que dan lugar a una producción excesiva, a una producción inadecuada o a la falta de degradación.
Un medio alternativo de modular la actividad del PAF comprendería imitar o aumentar el proceso natural a través del
cual se produce la resolución de la inflamación. Se ha comunicado que los macrófagos [Stafforini y colaboradores,
J. Biol. Chem., 26(17): 9682-9687 (1990)], los hepatocitos y la línea celular del hepatoma humano HepG2 [Satoh y
colaboradores, J. Clin. Invest., 87: 476-481 (1991) y Tarbet y colaboradores, J. Biol. Chem., 266(25): 16667-16673
(1991)] liberan una actividad enzimática, la PAF acetilhidrolasa (PAF-AH), que inactiva el PAF. Además de inactivar
el PAF, la PAF-AH inactiva también los fosfolípidos oxidativamente fragmentados, tales como productos de la cascada
del ácido araquidónico que median la inflamación. Véase Stremler y colaboradores, J. Biol. Chem., 266(17): 1109511103 (1991). La inactivación del PAF por la PAF-AH tiene lugar principalmente por hidrólisis del grupo acetilo sn-2
del PAF y la PAF-AH metaboliza los fosfolípidos oxidativamente fragmentados eliminando los grupos acilo sn-2.
Se han identificado dos tipos de PAF-AH: las formas citoplásmicas, halladas en diversos tipos de células y tejidos,
tales como las células endoteliales y eritrocitos, y una forma extracelular hallada en el plasma y suero. La PAG-AH
plasmática no hidroliza fosfolípidos intactos, excepto el PAF, y esta especificidad de sustrato permite que la enzima
circule in vivo en un estado plenamente activo sin efectos adversos. La PAF-AH plasmática parece explicar toda la
degradación de PAF en la sangre humana ex vivo [Stafforini y colaboradores, J. Biol. Chem., 269(9): 4223-4230
(1987)].
En tanto que las formas citoplásmica y plasmática de la PAF-AH parecen tener la misma especificidad de sustrato, la PAF-AH plasmática posee características bioquímicas que la distinguen dé la PAF-AH citoplásmica y de otras
lipasas caracterizadas. De manera específica, la PAF-AH plasmática se asocia con partículas de lipoproteína, es inhibida por el fluorofosfato de diisopropilo, no resulta afectada por los iones de calcio, es relativamente insensible a la
proteolisis y tiene un peso molecular aparente de 43.000 daltons. Véase Stafforini y colaboradores (1987), más arriba.
El mismo artículo de Stafforini y colaboradores describe el procedimiento para la purificación parcial de la PAF-AH
a partir del plasma humano y la composición de aminoácidos del material plasmático obtenido por el uso de dicho
procedimiento. La PAF-AH citoplásmica ha sido purificada a partir de eritrocitos, como se informa en Stafforini y
colaboradores, J. Biol. Chem., 268(6): 3857-3865 (1993) y en el artículo se describen también diez residuos aminoterminales de PAF-AH citoplásmica. Hattori y colaboradores, J. Biol. Chem., 268(25): 18748-18753 (1993) describen
la purificación de PAF-AH citoplásmica a partir de cerebro bovino. Posteriormente a la presentación de esta solicitud
de patente, la secuencia de nucleótidos de la PAF-AH citoplásmica de cerebro bovino se publicó en Hattori y colaboradores, J. Biol. Chem.- 269(237): 23150-23155 (1994). Hasta la fecha, no se ha publicado ninguna secuencia de
nucleótidos para la forma plasmática de la PAF-AH.
La producción recombinante de PAF-AH permitiría utilizar PAF-AH exógena para imitar o aumentar los procesos
normales de resolución de la inflamación in vivo. La administración de PAF-AH proporcionaría una ventaja fisiológica
sobre la administración de antagonistas de los receptores de PAF, puesto que la PAF-AH es un producto encontrado
normalmente en el plasma. Es más, debido a que los antagonistas de receptores de PAF, que están estructuralmente
relacionados con el PAF, inhiben la actividad de la PAF-AH nativa, se impediría el metabolismo deseable del PAF y
de los fosfolípidos oxidativamente fragmentados. Así, la inhibición de la actividad de PAF-AH por los antagonistas
de receptores de PAF contrarresta el bloqueo competitivo del receptor de PAF por parte de los antagonistas. Véase
Stremler y colaboradores, más arriba. Además, en las localizaciones de la inflamación aguda, p. ej. la liberación de
oxidantes da como resultado una inactivación de la enzima PAF-AH nativa, lo que, a su vez, da como resultado
niveles locales elevados de PAF y compuestos semejantes al PAF, los cuales competirían con cualquier antagonista
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de receptores de PAF administrados de forma exógena, por la fijación a los receptores de PAF. Por el contrario, el
tratamiento con PAF-AH recombinante aumentaría la actividad de la PAF-AH endógena y compensaría cualquier
enzima endógena inactivada.
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Por consiguiente, existe en la técnica la necesidad de identificar y aislar secuencias de polinucleótidos que codifiquen PAF-AH plasmática humana, desarrollar materiales y métodos útiles para la producción recombinante de PAFAH y generar reactivos para la detección de PAF-AH en plasma.
La presente invención proporciona nuevos polinucleótidos purificados y aislados (es decir, cadenas sentido y antisentido de ADN y ARN) que codifican PAF-AH plasmática humana, o fragmentos enzimáticamente activos de la
misma. Las secuencias preferidas de ADN de la invención incluyen secuencias de ADN genómico y de ADNc, así
como secuencias de ADN químicamente sintetizadas de forma total o parcial. La invención contempla la secuencia de
ADN que codifica PAF-AH representada en la SEC ID NO: 7 y las secuencias de ADN que hibridan con la cadena no
codificante del mismo bajo condiciones convencionales estrictas o que podrían hibridar, excepto por la redundancia
del código genético. La invención también contempla las réplicas biológicas (es decir, copias de secuencias aisladas
de ADN obtenidas in vivo o in vitro) de secuencias de ADN de la invención. También se proporcionan las construcciones recombinantes de replicación autónoma, tales como vectores de ADN de plásmidos y de virus que incorporan
secuencias de PAF-AH y, en especial, los vectores en los que el ADN que codifica PAF-AH está operativamente unido
a una secuencia de ADN de control de la expresión endógena o exógena, así como un terminador de transcripción.
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De acuerdo con otro aspecto de la invención, células hospedantes procariotas o eucariotas se transforman de manera
estable con secuencias de ADN de la invención de forma tal que permiten la expresión de la PAF-AH deseada. Las
células hospedantes que expresan productos de PAF-AH pueden servir para diversos propósitos útiles. Tales células
representan una valiosa fuente de inmunógeno para el desarrollo de anticuerpos específicamente inmunorreactivos
con PAF-AH. Las células hospedantes de la invención son particularmente útiles en métodos para la producción a
gran escala de PAF-AH en los que las células se cultivan en medio adecuados de cultivo y se aíslan los productos
polipeptídicos deseados a partir de las células o del medio en el que se han cultivado las células por, por ejemplo,
purificación por inmunoafinidad.
Un método no inmunológico contemplado por la invención para purificar la enzima PAF-AH, a partir del plasma
incluye las etapas siguientes: (a) aislar partículas de lipoproteínas de baja densidad; (b) solubilizar dichas partículas
de lipoproteínas de baja densidad en un tampón que comprende CHAPS 10 mM para obtener una primera solución
de la enzima PAF-AH; (c) aplicar dicha primera solución de enzima PAF-AH a una columna de intercambio aniónico
DEAE; (d) lavar dicha columna de intercambio aniónico DEAE utilizando un tampón de pH aprox. 7,5 y que comprende CHAPS 1 mM; (e) eluir la enzima PAF-AH de dicha columna de intercambio aniónico DEAE en fracciones,
usando tampones de pH aprox. 7,5 que comprenden un gradiente de NaCl 0 a 0,5 M; (f) reunir las fracciones eluidas de
dicha columna de intercambio aniónico DEAE que posee actividad enzimática PAF-AH; (g) ajustar dichas fracciones
activas reunidas de la citada columna de intercambio aniónico DEAE a CHAPS 10 mM para generar una segunda
solución de enzima PAF-AH; (h) aplicar dicha segunda solución de enzima PAF-AH a una columna de afinidad de
ligando de tinción azul; (i) eluir la enzima PAF-AH de dicha columna de afinidad de ligando de tinción azul utilizando
un tampón que comprende CHAPS 10 mM y una sal caotrópica; (j) aplicar el eluato de dicha columna de afinidad
de ligando de tinción azul a una columna de afinidad de ligando de Cu; (k) eluir la enzima PAF-AH a partir de dicha
columna de afinidad de ligando de Cu utilizando un tampón que comprende CHAPS 10 mM e imidazol; (1) someter
el eluato de dicha columna de afinidad de ligando de Cu a SDS-PAGE; y (m) aislar la enzima PAF-AH de aproximadamente 44 KDa a partir del gel de SDS-poliacrilamida. Preferentemente, el tampón de la etapa (b) es Tris-HCl 25
mM, CHAPS 10 mM, pH 7,5; el tampón de la etapa (d) es Tris-HCl 25 nM, CHAPS 1 mM; la columna de la etapa (h)
es una columna de Blue Sepharose Fast Flow; el tampón de a etapa (i) es Tris-HCl 25 mM, CHAPS 10 mM, KSCN
0,5 M, pH 7,5; la columna de la etapa (j) es una columna de Cu Chelating Sepharose; y el tampón de la etapa (k) es
Tris-HCl 25 mM, CHAPS 10 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 50 mM a un pH en el intervalo de aprox. 7,5-8,0.
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Un método contemplado por la invención para purificar PAF-AH enzimáticamente activa, a partir de células E.
coli productoras de PAF-AH incluye las etapas de: (a) preparar un sobrenadante de centrifugación de E. coli lisados
productores de enzima PAF-AH; (b) aplicar dicho sobrenadante de centrifugación a una columna de afinidad de ligando de tinción azul; (c) eluir la enzima PAF-AH a partir de dicha columna de afinidad de ligando de tinción azul
utilizando un tampón que comprende CHAPS 10 mM y una sal caotrópica; (d) aplicar dicho eluato de dicha columna
de afinidad de ligando de tinción azul a una columna de afinidad de ligando de Cu; y (e) eluir la enzima PAF-AH a
partir de dicha columna de afinidad de ligando dé Cu utilizando un tampón que comprende CHAPS 10 mM e imidazol.
Preferentemente, la columna de la etapa (b) es una columna Blue Sepharose Fast Flow; el tampón de la etapa (c) es
Tris-HCl 25 mM, CHAPS 10 mM, KSCN 0,5 M, pH 7,5; la columna de la etapa (d) es una columna Cu Chelating
Sepharose; y el tampón de la etapa (e) es Tris-HCl 25 mM, CHAPS 10 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 100 mM, pH 7,5.
Otro método contemplado por la invención para purificar PAF-AH enzimáticamente activa, a partir de células E.
coli productoras de PAF-AH incluye las etapas de: (a) preparar un sobrenadante de centrifugación de E. coli lisados
productores de enzima de PAF-AH; (b) diluir dicho sobrenadante de centrifugación en un tampón de bajo pH que
comprende CHAPS 10 mM; (c) aplicar dicho sobrenadante de centrifugación diluido a una columna de intercambio
catiónica equilibrada a aprox. pH 7,5; (d) eluir la enzima PAF-AH de dicha columna de intercambio catiónico una
sal 1 M; (e) elevar el pH de dicho eluato de dicha columna de intercambio catiónico y ajustar la concentración de sal
de dicho eluato a aprox. sal 0,5 M; (f) aplicar dicho eluato ajustado de dicha columna de intercambio catiónico a una
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columna de afinidad de ligando de tinción azul; (g) eluir la enzima PAF-AH de dicha columna de afinidad de ligando
de tinción azul utilizando un tampón que comprende una sal aprox. 2 M a aprox. 3 M; y (h) dializar dicho eluato de
dicha columna de afinidad de ligando de tinción azul utilizando un tampón que comprende aprox. 0,1% de Tween.
Preferentemente, el tampón de la etapa (b) es MES 25 mM, CHAPS 10 mM, EDTA 1 mM, pH 4,9; la columna de la
etapa (c) es una columna S Sepharose equilibrada en MES 25 mM, CHAPS 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM, pH
5,5; PAF-AH se eluye en la etapa (d) usando NaCl 1 mM; el pH del eluato en la etapa (e) se ajusta a pH 7,5 utilizando
una base Tris 2M; la columna de la etapa (f) es una columna de sefarosa; el tampón de la etapa (g) es Tris 25 mM,
CHAPS 10 mM, NaCl 3 M, EDTA 1 mM, pH 7,5; y el tampón de la etapa (h) es Tris 25 mM, NaCl 0,5 M, Tween 80
al 0,1%, pH 7,5.
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Los productos de PAF-AH se pueden obtener como aislados de fuentes celulares naturales o pueden estar sintetizados químicamente, pero preferentemente se producen por procedimientos recombinantes en los que intervienen células
hospedantes procariotas o eucariotas de la invención. Se contemplan los productos de PAF-AH que tienen parte o toda
la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID NO: 8. Cabe esperar que el uso de células hospedantes de mamíferos proporcione modificaciones post-traduccionales (p. ej. miristolación, glicosilación, truncamiento, lipidación
y fosforilaciónide tirosina, serina o treonina) que pueden ser necesarias para conferir una óptima actividad biológica
sobre los productos de expresión recombinante de la invención. Los productos de PAF-AH de la invención pueden ser
polipéptidos de longitud completa, fragmentos o variantes. Las variantes pueden comprender análogos de PAF-AH en
los que se elimina o sustituye uno o más de los aminoácidos especificados (es decir, codificados de forma natural), o en
los que se añade uno o más aminoácidos no especificados: (I) sin pérdida de una o más de las actividades enzimáticas
o características inmunológicas específicas de PAF-AH; o (2) con incapacitación específica de una actividad biológica
particular de PAF-AH. Para la modulación de su actividad se pueden utilizar proteínas u otras moléculas que se unen
a PAF-AH.
La presente invención comprende, además, anticuerpos (p. ej. anticuerpos monoclonales o policlonales, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados en CDR y similares) y otras proteínas de unión
específicas para la PAF-AH. Proteínas de unión que ilustran específicamente la invención son los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas 90G11D y 90F2D depositados en la American Type Culture Collection (ATCC),
12301 Parkdawn Drive, Rockville, MD 20852 el 30 de septiembre de 1994 y con números de acceso HB 11724 y HB
11725, respectivamente. Se pueden identificar proteínas u otras moléculas (p. ej. lípidos o pequeñas moléculas) que se
unen específicamente a PAF-AH utilizando PAF-AH aislada de plasma, PAF-AH recombinante, variantes de PAF-AH
o células que expresan tales productos. Por su parte, las proteínas de unión son útiles en composiciones para la inmunización, así como para la purificación de PAF-AH, siendo de utilidad además para la detección o cuantificación de
PAF-AH en muestras de fluidos y tejidos mediante procedimientos inmunológicos conocidos. Se contemplan también
anticuerpos anti-idiotípicos específicos para anticuerpos específicos para PAF-AH.
El valor científico de la información aportada por las descripciones de las secuencias de ADN y aminoácidos de
la presente invención es evidente. Tal como una serie de ejemplos, el conocimiento de la secuencia de un ADNc para
PAF-AH hace posible el aislamiento por hibridación ADN/ADN de secuencias de ADN genómico que codifican PAFAH y especifican secuencias de regulación del control de expresión de PAF-AH tales como promotores, operadores y
similares. Cabe esperar que los procedimientos de hibridación de ADN/ADN llevados a cabo con secuencias de ADN
de la invención bajo condiciones convencionales estrictas del estado de la técnica permitan igualmente el aislamiento
de ADNs que codifiquen variantes alélicas de PAF-AH, otras proteínas estructuralmente relacionadas que compartan
una o más de las propiedades bioquímicas y/o inmunológicas de PAF-AH y proteínas de especies no humanas homólogas a PAF-AH. La información sobre la secuencia de ADN que ofrece la presente invención permite asimismo el
desarrollo, por estrategias de recombinación homóloga o “knockout” [véase p. ej. Kapecchi, Science, 244: 1288-1292
(1989)], de roedores que no expresan una enzima PAF-AH funcional o que expresan una variante de la enzima PAFAH. Los polinucleótidos de la invención, una vez adecuadamente marcados, son útiles en ensayos de hibridación para
detectar la capacidad de las células para sintetizar PAF-AH. Los polinucleótidos de la invención pueden representar,
asimismo, la base para métodos de diagnóstico de utilidad en la identificación de alteración(es) genética(s) en el locus
de PAF-AH subyacente(s) a uno o varios estados patológicos. La invención pone a punto igualmente polinucleótidos
antisentido.importantes para regular la expresión de PAF-AH en aquellas células que normalmente la expresan.
Se contempla la administración de preparaciones de PAF-AH de la invención a mamíferos, especialmente humanos,
con el fin de mejorar afecciones inflamatorias patológicas. Basándose en la intervención del PAF en estados inflamatorios patológicos, la administración de PAF-AH está indicada, p. ej. en el tratamiento del asma [Miwa y colaboradores,
J. Clin. Invest., 82:1983-1991 (1988); Hsieh y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol., 91: 650-657 (1993); y Yamashita y colaboradores, Allergy, 49: 60-63 (1994)], anafilaxia [Venable y colaboradores, más arriba], choque [Venable
y colaboradores, más arriba], lesiones de reperfusión e isquemia del sistema nervioso central [Lindsberg y colaboradores, (1991), más arriba], artritis inducida por antígenos [Zarco y colaboradores, Clin. Exp. Immunol., 88:318-323
(1992)], aterogénesis [Handley y colaboradores, Drug Dev. Res., 7:361-375 (1986)], enfermedad de Crohn [Denizot
y colaboradores, Digestive Diseases and Sciences, 37(3): 432-437 (1992)], necrosis intestinal isquémica/enterocolitis
necrotizante [Denizot y colaboradores, más arriba y Caplan y colaboradores, Acta Paediatr., Suppl. 396: 11-17 (1994)],
colitis ulcerativa [Denizot y colaboradores, más arriba], ataque isquémico [Satoh y colaboradores Stroke, 23: 10901092 (1992)], lesión cerebral isquémica [Lindsberg y colaboradores, Stroke, 21: 1452-1457 (1990) y Lindsberg y colaboradores (1991), más arriba], lupus eritematoso sistémico [Matsuzaki y colaboradores, Clinica Chimica Acta, 210:
139-144 (1992)], pancreatitis aguda [Kald y colaboradores, Pancreas, 8(4): 440-442 (1993)], septicemia [Kald y colaboradores, más arriba], glomerulonefritis post-estreptocócica aguda [Mezzano y colaboradores, J. Am. Soc. Nephrol.,
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4: 235-242 (1993)], edema pulmonar resultante del tratamiento con IL-2 [Rabinovici y colaboradores, J. Clin. Invest.,
89: 1669-1673 (1992)], inflamación alérgica [Watanabe y colaboradores, Br. J. Pharmacol., 111: 123-130 (1994)],
insuficiencia renal isquémica [Grino y colaboradores, Annals of Internal Medicine, 121(5): 345-347 (1994)], parto
prematuro [Hoffman y colaboradores, Am. J. Obstr. Gynecol., 162(2): 525-528 (1990) y Maki y colaboradores, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 85: 728-732 (1988)]y síndrome de distrés respiratorio del adulto [Rabinovici y colaboradores,
J. Appl. Physiol., 74(4): 1791-1802 (1993); Matsumoto y colaboradores, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 19: 509-515
(1992); y Rodríguez-Roisin y colaboradores, J. Clin. Invest., 93: 188-194 (1994).
En el estado de la técnica se han descrito modelos animales para muchos de los estados patológicos anteriormente
mencionados. Por ejemplo, en el Ejemplo 16 se describe un modelo animal de ratón para asma, rinitis y eccema;
un modelo de conejo para la artritis aparece en Zarco y colaboradores, más arriba; modelos de rata para necrosis
intestinal isquémica/enterocolitis necrotizante se describen en Furukawa y colaboradores, Ped. Res. 34(2): 237-241
(1993) y Caplan y colaboradores, más arriba; en Lindsberg y colaboradores (1990) más arriba, se describe un modelo
de conejo para la embolia cerebral; en Matsuzaki y colaboradores, más arriba, se describe un modelo de ratón para el
lupus; en Kald y colaboradores, más arriba, se describe un modelo de rata para la pancreatitis aguda; en Rabinovici
y colaboradores, más arriba, se describe un modelo de rata para el edema pulmonar resultante del tratamiento con
IL-2; en Watanabe y colaboradores, más arriba, se describe un modelo de rata de inflamación alérgica; en Watson
y colaboradores, Transplantation, 56(4): 1047-1049 (1993) se describe un modelo canino de aloinjerto renal; y en
Rabinovici y colaboradores, más arriba, se describe un modelo de rata del síndrome de distrés respiratorio del adulto.
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De forma específica, se contemplan composiciones de PAF-AH de la invención para utilizar en métodos de tratamiento de mamíferos susceptibles o que sufren estados patológicos mediados por el PAF, que comprenden la administración de PAF-AH de la invención al mamífero en cantidad suficiente para suplementar la actividad de PAF-AH
endógena e inactivar las cantidades patológicas de PAF en el mamífero.
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Las composiciones terapéuticas contempladas por la invención incluyen PAF-AH de la invención y un diluyente
o vehículo fisiológicamente aceptable, pudiendo incluir también otros agentes con un efecto antiinflamatorio. Las
cantidades de dosificación indicadas serían suficientes para suplementar la actividad de PAF-AH endógena e INACtivar
las cantidades patológicas de PAF. En relación con las consideraciones generales de dosificación, véase Remington’s
Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, Mack Publishing Co., Eastbn, PA (1990). Las dosificaciones variarán entre
aprox. 0,1 hasta aprox. 1000 µg de PAF-AH/kg de peso corporal. Las composiciones terapéuticas de la invención se
pueden administrar por diversas vías, dependiendo del estado patológico a tratar. Por ejemplo, la administración puede
ser intravenosa, subcutánea, oral, por supositorio y/o por vía pulmonar.
Para afecciones pulmonares, la administración de PAF-AH por vía pulmonar está especialmente indicada. Se contempla el uso en la administración pulmonar de una amplia gama de dispositivos, incluidos, p. ej. nebulizadores,
inhaladores de dosis medidas e inhaladores de polvo, que son convencionales en la técnica. El suministro de diversas
proteínas a los pulmones y al sistema circulatorio por inhalación de formulaciones en aerosol ha sido descrito por
Adjei y colaboradores, Pharm. Res., 7(6): 565-569 (1990) (acetato de leuprolida); Braquet y colaboradores, J. Cardio.
Pharm., 13 (sup. 5): pág. 143-146 (1989) (endotelina-1); Hubbard y colaboradores, Annals of Internal Medicine, 111
(3), 206-212 (1989) (α1-antitripsina); Smith y colaboradores, J. Clin. Invest., 84: 1145-1146 (1989) (inhibidor de la
α-l-proteinasa); Debs y colaboradores, J. Immunol., 140:3482-3488 (1993) (interferón gamma recombinante y factor
alfa de necrosis tumoral); Tratado de Cooperación de Patentes (PCT) Publicación Internacional n◦ WO 94/20069,
publicado el 15 de septiembre de 1994 (factor recombinante pegilado estimulante de colonias de granulocitos).
45
Otros muchos aspectos y ventajas de la invención resultarán evidentes de la siguiente descripción detallada de la
misma, que hace referencia a los dibujos, en los que:
Fig. 1: fotografía de una membrana PVDF que contiene PAF-AH purificada de plasma humano;
50
Fig. 2: gráfico que muestra la actividad enzimática de la PAF-AH recombinante de plasma humano;
Fig. 3: dibujo esquemático que representa fragmentos de PAF-AH recombinante y su actividad catalítica;
55
Fig. 4: gráfico de barras que muestra el bloqueo del edema de la pata de la rata inducido por PAF mediante PAFAH recombinante de la invención administrada localmente;
Fig. 5: gráfico de barras que ilustra el bloqueo del edema de la pata de la rata inducido por PAF mediante PAF-AH
administrada por vía intravenosa;
60
Fig. 6: gráfico de barras que muestra que la PAF-AH bloquea el edema inducido por PAF, pero no el edema
inducido por zimosano-A;
65
Figs. 7A y 7B: presentan resultados de respuesta a la dosis de la actividad antiinflamatoria de PAF-AH en el edema
de la pata de la rata;
Figs. 8A y 8B: presentan resultados que indican la eficacia in vivo de una sola dosis de PAF-AH en el tiempo;
5
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Fig. 9: gráfico de líneas que representa la farmacocinética de PAF-AH en la circulación de la rata; y
Fig. 10: gráfico de barras que muestra los efectos antiinflamatorios de PAF-AH en comparación con los efectos
menores de los antagonistas del PAF en el edema de la pata de la rata.
5
10
15
20
Los siguientes ejemplos ilustran la invención. El Ejemplo 1 expone un nuevo método para la purificación de
PAF-AH a partir de plasma humano. El Ejemplo 2 describe la microsecuenciación de aminoácidos de la PAF-AH
purificada de plasma humano. La clonación de un ADNc de longitud total que codifica PAF-AH de plasma humano
se describe en el Ejemplo 3. En el Ejemplo 4 se describe una variante de unión putativa del gen de la PAF-AH de
plasma humano. En el Ejemplo 5 se describe la clonación de secuencias genómicas que codifican PAF-AH de plasma
humano. El Ejemplo 6 describe la clonación de ADNc canino, murino, de roedor y macaco homólogos al ADNc
de la PAF-AH de plasma humano. El Ejemplo 7 presenta los resultados de un ensayo que pone de manifiesto la
actividad enzimática de la PAF-AH recombinante expresada temporalmente en células COS 7. El Ejemplo 8 describe
la expresión de PAF-AH humana en E. coli y S. cerevisiae. El Ejemplo 9 presenta un protocolo para la purificación
de PAF-AH recombinante a partir de E. coli y ensayos que confirman la actividad enzimática. El Ejemplo 10 describe
diversos productos de PAF-AH recombinante, incluidos análogos por sustitución de aminoácidos y productos amino
y carboxitruncados. En el Ejemplo 11 se presentan los resultados del ensayo Northern blot para la expresión de ARN
de PAF-AH de plasma humano en diversos tejidos y líneas celulares, mientras que en el Ejemplo 12 se exponen los
resultados de la hibridación in situ. El Ejemplo 13 describe el desarrollo de anticuerpos monoclonales específicos para
la PAF-AH de plasma humano. Los Ejemplos 14, 15 y 16 describen, respectivamente, el efecto terapéutico in vivo
de la administración de productos de PAF-AH recombinante de la invención sobre la inflamación aguda, la pleuresía
y el asma en la rata. El Ejempló 17 presenta los resultados de inmunoensayos de suero de pacientes humanos que
muestran un déficit de actividad de PAF-AH y describe la identificación de una lesión genética en los pacientes que es
aparentemente responsable de dicho déficit.
25
Ejemplo 1
Se purificó PAF-AH a partir de plasma humano para proporcionar el material para la secuenciación de aminoácidos.
30
35
40
A. Optimización de las Condiciones de Purificación
Inicialmente, se precipitaron partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en plasma con fosfotungstato, se
solubilizaron en Tween 20 al 0,1% y se sometieron a cromatografía en una columna de DEAE (Pharmacia, Uppsala,
Suecia) de acuerdo con el método de Stafforini y colaboradores, (1987), véase más arriba, pero la falta de constancia
en la elución de PAF-AH de la columna de DEAE requirió una segunda evaluación de la solubilización y de las
condiciones de purificación posteriores.
El Tween 20, el CHAPS (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) y el octil glucósido se evaluaron por centrifugación
y cromatografía de exclusión molecular con respecto a su capacidad de solubilizar las partículas de LDL. CHAPS
proporcionó un 25% más de recuperación de actividad solubilizada que Tween 20 y un 300% más de recuperación
que el octil glucósido. El precipitado de LDL solubilizado con CHAPS 10 mM después se fraccionó en una columna
de DEAE Sepharose Fast Flow Column (una columna de intercambio aniónico; Pharmacia) con tampón que contenía
CHAPS 1 mM para proporcionar un conjunto grande de PAF-AH parcialmente purificada (“el conjunto de DEAE”)
para la evaluación de más columnas.
45
50
55
60
El conjunto de DEAE se usó como material de partida para ensayar una diversidad de columnas cromatográficas
con respecto a su utilidad en la purificación adicional de la actividad PAF-AH. Las columnas ensayadas incluyeron:
Blue Sepharose Fast Flow (Pharmacia), una columna de afinidad de ligando de colorante; S-Sepharose Fast Flow
(Pharmacia), una columna de intercambio catiónico; Cu Chelating Sepharose (Pharmacia), una columna de afinidad
de ligando metálico; Fractogel S (EM Separations, Gibbstown, NJ), una columna de intercambio catiónico; y Sephacryl-200 (Pharmacia), una columna de exclusión molecular. Todos estos procedimientos cromatográficos produjeron
niveles bajos e insatisfactorios de purificación cuando se hicieron funcionar en CHAPS 1 mM. La posterior cromatografía de exclusión molecular en Sephacryl S-200 en CHAPS 1 mM generó una fracción enzimáticamente activa que
eluyó en un amplio intervalo de tamaños en lugar de en el tamaño aproximado a 44 kDa esperado. En conjunto, estos
resultados indicaron que las proteínas LDL se agregaban en solución.
Por lo tanto, se evaluaron diferentes muestras de LDL por cromatografía de exclusión molecular analítica con
respecto a la agregación de la actividad PAF-AH. Se analizaron muestras procedentes del conjunto de DEAE y del
precipitado de LDL recién solubilizado en Superose 12 (Pharmacia) equilibrada en tampón con CHAPS 1 mM. Las
dos muestras se eluyeron en un intervalo muy amplio de pesos moleculares, eluyendo la mayor parte de la actividad
por encima de 150 kDa. Cuando las muestras se analizaron posteriormente en Superose 12 equilibrada con CHAPS 10
mM, la mayor parte de la actividad eluyó a aproximadamente 44 kDa, como era de esperar para la actividad PAF-AH.
Sin embargo, las muestras contenían parte de la actividad PAF-AH en la región de alto peso molecular correspondiente
a los agregados.
65
Otras muestras eluyeron la actividad PAF-AH exclusivamente en un intervalo aproximado a 44 kDa cuando se
ensayaron posteriormente por exclusión molecular. Estas muestras eran un precipitado de LDL solubilizado en CHAPS
10 mM en presencia de NaCl 0,5 M y un conjunto de DEAE reciente que se ajustó en CHAPS 10 mM después de la
6
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
elución desde la columna de DEAE. Estos datos indican que se requiere una concentración de CHAPS de al menos 10
mM para mantener PAF-AH sin agregación. El aumento de la concentración de CHAPS de 1 mM a 10 mM después
de la cromatografía en DEAE, pero antes de las posteriores etapas cromatográficas, produjo diferencias notables en
la purificación. Por ejemplo, el grado de purificación de PAF-AH en S-Sepharose Fast Flow aumento de 2 veces a 10
veces. La actividad PAF-AH se unió a la columna Blue Sepharose Fast Flow irreversiblemente en CHAPS 1 mM, pero
la columna proporcionó el máximo nivel de purificación en CHAPS 10 mM. La cromatografía en DEAE no mejoró
con la adición previa de CHAPS 10 mM.
La cromatografía en Cu Chelating Sepharose después de la columna Blue Sepharose Fast Flow concentró la actividad PAF-AH 15 veces. Esto también determinó que la actividad PAF-AH podía recuperarse de un gel de SDSpoliacrilamida reducido, siempre que las muestras no hirvieran. La actividad del material eluido de la columna Cu
Chelating Sepharose cuando se sometió a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida coincidió con una banda proteica principal cuando el gel se tiñó con plata.
B. Protocolo de Purificación de PAF-AH
Por lo tanto, el nuevo protocolo utilizado para purificar PAF-AH para la secuenciación de aminoácidos comprendía
las siguientes etapas, que se realizaron a 4◦ C. Se dividió plasma humano en alícuotas de 900 ml en frascos Nal-gene
de 1 litro y se ajustaron a pH 8,6. Después se precipitaron las partículas de LDL añadiendo 90 ml de fosfotungstato
sódico al 3,85% seguido de 23 ml de MgCl2 2 M. El plasma después se centrifugó durante 15 minutos a 3600 g. Los
sedimentos se resuspendieron en 800 ml de citrato sódico al 0,2%. Lis partículas de LDL se precipitaron de nuevo
añadiendo 10 g de NaCl y 24 ml de MgCl2 2 M. Las partículas de LDL se sedimentaron por centrifugación durante
15 minutos a 3600 g. Este lavado se repitió dos veces. Los sedimentos después se congelaron a -20◦ C. Las partículas
de LDL procedentes de 5 l de plasma se resuspendieron en 5 1 de tampón A (Tris-HCl 25 mM, CHAPS 10 mM, pH
7,5) y se agitaron durante una noche. Las partículas de LDL solubilizadas se centrifugaron a 3600 g durante 1,5 h.
Se combinaron los sobrenadantes y se filtraron con papel de filtro Whatman 113 para eliminar todos los sólidos que
quedaran. El sobrenadante de LDL solubilizadas se introdujo en una columna DEAE Sepharose Fast Flow (11 cm x
10 cm; volumen de resina 1 l; 80 ml/minuto) equilibrada en tampón B (Tris-HCl 25 mM; CHAPS 1 mM, pH 7,5).
La columna se lavó con tampón B hasta que la absorbancia volvió al nivel inicial. La proteína se eluyó con 8 1 de un
gradiente de NaCl de 0-0,5 M y se recogieron fracciones de 480 ml. Esta etapa era necesaria para conseguir la unión a
la columna Blue Sepharose Fast Flow posterior. En las fracciones se ensayó la actividad acetilhidrolasa esencialmente
por el método descrito en el Ejemplo 4.
Se reunieron las fracciones activas y se añadió suficiente CHAPS para que el conjunto tuviera una concentración de
CHAPS aproximadamente 10 mM. El conjunto de DEAE se introdujo durante una noche, a un caudal de 4 ml/minuto,
en una columna Blue Sepharose Fast Flow (5 cm x 10 cm; volumen del lecho 200 m) equilibrada en tampón A que
contenía NaCl 0,5 M. La columna se lavó con el tampón de equilibrio a un caudal de 16 ml/minuto hasta que la
absorbancia volvió al nivel inicial. La actividad PAF-AH se eluyó por etapas con tampón A que contenía KSCN
(una sal caotrópica) 0,5 M a un caudal de 16 ml/minuto y se recogió en fracciones de 50 ml. Esta etapa produjo una
purificación más de 1000 veces mayor. Se reunieron las fracciones activas y el conjunto se ajustó a pH 8,0 con TrisHCl 1 M, pH 8, 0. El conjunto activo procedente de la cromatografía con Blue Sepharose Fast Flow se introdujo en
una columna Cu Chelating Sepharose (2,5 cm x 2 cm; volumen del lecho 10 ml; caudal 4 ml/minuto) equilibrada
en tampón C [Tris-HCl 25 mM, CHAPS 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0 (también se trabajó a pH 7,5)] y la columna
se lavó con 50 ml de tampón-C. La actividad PAF-AH se eluyó con 100 ml de imidazol 50 mM en tampón C y se
recogió en fracciones de 10 ml. Se reunieron las fracciones que contenían las fracciones de PAF-AH y se dializaron
frente a tampón A. Además de proporcionar una concentración 15 veces mayor de la actividad PAF-AH, la columna
Cu Chelating Sepharose proporcionó poca purificación. El conjunto de Cu Chelating Sepharose se redujo en DTT 50
mM durante 15 minutos a 37◦ C y se introdujo en un gel de poliacrilamida al 7,5%, de 0’75 mm. Las porciones de gel
se cortaron cada 0,5 cm y se pusieron en tubos de microcentrífuga desechables que contenían 200 µl de Tris-HCl 25
mM, CHAPS 10 mM y NaCl 150 mM. Las porciones se trituraron y se dejaron en incubación durante una noche a
4◦ C. Depués, en el sobrenadante de cada porción de gel se ensayó la actividad PAF-AH para determinar qué banda
proteinica de la SDS-PAGE contenía la actividad PAF-AH. La actividad PAF-AH se encontró en una banda de aprox.
44 kDa. La proteína de un gel duplicado se electrotransfirió a una membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore) y se
tiñó con Azul de Coomassie. En la Figura 1 se presenta una fotografía de la membrana PVDF.
Como se presenta en la Tabla I, mostrada a continuación, se purificaron aprox. 200 µg de PAF-AH 2 x 106 veces
más a partir de 5 1 de plasma humano. En comparación, en Stafforino y colaboradores, (1987), véase más arriba, se
describe una purificación de la actividad PAF-AH 3 x 104 veces mayor.
60
65
7
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TABLA 1
Muestra
5
10
15
20
Plasma
LDL
DEAE
Blue
Cu
SDS-PAGE
Vol
ml
Actividad
(cpm x
106 )
Actividad
total
(cpm x
106 )
Conc.
de
prot.
mg/cm
Actividad
Espec.
cpm x
106
% de Recup.
de
Actividad
Etapa
Acum.
Factor de
multiplicación
de la
Purificación
Etapa
Acum.
5000
4500
4200
165
12
---
23
22
49
881
12700
---
116
97
207
14
152
---
62
1,76
1,08
0,02
0,15
---
0,37
12
46
54200
82200
---
100
84
212
70
104
---
1
33
3,7
1190
1,5
∼ 10
100
84
178
126
131
---
1
33
124
1,5 x 105
2,2 x 105
2,2 x 106
En resumen, las siguientes etapas fueron únicas y críticas para la purificación satisfactoria de PAF-AH plasmática
para la microsecuenciación: (1) solubilización y cromatografía en CHAPS 10 mM, (2) cromatografía en una columna
de afinidad de ligando azul tal como Blue Sepharose Fast Flow, (3) cromatografía en una columna de afinidad de
ligando de Cu tal como Cu Chelating Sepharose, y (4) elución de PAF-AH de SDS-PAGE.
Ejemplo 2
25
30
Para la secuenciación de aminoácidos, la banda proteica de aprox. 44 kDa de la membrana PVDF que contenía
PAF-AH descrita en el ejemplo 1 se escindió y secuenció usando un secuenciador de proteínas Applied Biosystems
473A. El análisis de la secuencia N-terminal. de la banda proteica de ∼44 kDa correspondiente a la actividad PAFAH indicó que la banda contenía dos secuencias principales y dos secuencias minoritarias. La relación de las dos
secuencias principales era de 1:1 y, por lo tanto, eran difíciles de interpretar los datos de secuencia.
Para distinguir las secuencias de las dos proteínas principales que se habían resuelto en el gel de SDS, se cortó por
la mitad una membrana PVDF duplicada que contenía la banda de aprox. 44 kDa, de forma que la parte superior y la
parte inferior de la membrana se sometieron a la secuenciación por separado.
35
La secuencia N-terminal obtenida para la mitad inferior de la membrana fue:
SEC ID NO: 1
40
FKDLGEENFKALVLIAF
Una investigación de la base de datos de proteínas reveló que esta secuencia era un fragmento de la alúmina de
suero humano. También se secuenció la mitad superior de la misma membrana PVDF y la secuencia de aminoácidos
N-terminal determinada fue:
45
SEC ID NO: 2
IQVLMAAASFGQTKIP
50
Esta secuencia no corresponde a ninguna proteína de la base de datos investigada y era diferente de la secuencia
de aminoácidos N-terminal:
SEC ID NO: 3
55
MKPLVVFVLGG
que se había identificado como la PAF-AH citoplásmica de eritrocitos en Stafforini y colaboradores (1993), véase
más arriba. La nueva secuencia (SEC ID NO: 2) se utilizó para la clonación de ADNc de PAF-AH de plasma humano
como se describe más adelante en el Ejemplo 3.
60
Ejemplo 3
Se aisló un clon de longitud completa que codificaba el PAF-AH de plasma humano a partir de una biblioteca de
ADNc de macrófagos.
65
8
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A. Construcción de una Biblioteca de ADNc de Macrófagos
5
Se recogió ARN Poli A+ a partir de macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica. Se generó un ADNc
de extremos romos, de doble cadena, usando el equipo Invitrogen Copy (San Diego, CA) y se unieron adaptadores
BstXI al ADNc antes de la inserción en el vector de expresión de mamíferos pRc/CMV (Invitrogen). Los plásmidos
resultantes se introdujeron en la cepa XL-1 Blue de E. coli por electroporación. Las bacterias transformadas se cultivaron a una densidad de aproximadamente 3000 colonias por placa de agarosa en un total de aprox. 978 placas. El
ADN plasmídico preparado por separado a partir de cada placa se mantuvo en conjuntos individuales y también. se
combinó en conjuntos mayores que representaban 300.000 clones cada uno.
10
B. Selección de la Biblioteca por PCR
15
La biblioteca de macrófagos se seleccionó mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando un cebador
de PCR oligonucleotídico de sentido contrario, degenerado, basado en la nueva secuencia de aminoácidos N-terminal
descrita en el Ejemplo 2. La secuencia del cebador se indica más adelante en la nomenclatura de la IUPAC, siendo “I”
una inosina.
SEC ID NO: 4
20
25
30
5’ACATGAATTCGIATCYTTIGTYTGICCRAA3’
Se usaron las tablas de elección de codones de Wada y colaboradores, Nuc. Acids. Res., 19S: 1981-1986 (1991)
para seleccionar los nucleótidos en la tercera posición de cada codón del cebador. El cebador se usó en combinación
con un cebador específico para las secuencias promotoras SP6 o T7, flanqueando estas dos secuencias el sitio de
clonación de pRc/CMV, para seleccionar los conjuntos de bibliotecas de macrófagos de 300.000 clones. Todas las
reacciones de PCR contenían 100 ng de ADNc molde, 1 µg de cada cebador, 0,125 mM de cada dNTP, Tris-HCl 10
mM pH 8, 4, MgCl2 50 mM y 2,5 unidades de Taq Poimerasa. Una etapa de desnaturalización inicial a 94◦ C durante
4 minutos se continuó por 30 ciclos de amplificación de 1 minuto a 94◦ C, 1 minuto a 60◦ C y 2 minutos a 72◦ C. El
producto de PCR resultante se clonó en pBluescript SK− (Stratagene, La Jolla, CA) y su secuencia de nucleótidos se
determinó por el método de terminación de cadena didesoxi. El producto de PCR contenía la secuencia prevista por la
nueva secuencia peptídica y corresponde a los nucleótidos 1 a 331 de la SEC ID NO: 7.
Después se diseñaron los cebadores de PCR indicados a continuación, que son específicos para el fragmento de
PCR clonado descrito anteriormente, para identificar un clon de longitud completa.
35
Cebador con sentido (SEC ID NO: 5)
5’TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG3’
40
Cebador con sentido opuesto (SEC ID NO: 6)
5’ CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC3’
45
Se realizaron las reacciones de PCR utilizando los cebadores como se ha descrito anteriormente para seleccionar
primero los conjuntos de ADNc de 300.000 clones y después la subserie apropiada de los conjuntos más pequeños de
3000 clones. Después se usaron 3 conjuntos de 3000 clones que produjeron un producto de PCR del tamaño esperado
para transformar las bacterias.
C. Selección de la Biblioteca por Hibridación
50
55
60
65
El ADN de las bacterias transformadas posteriormente se seleccionó por hibridación usando el fragmento de PCR
clonado original como sonda. Las colonias se transfirieron a nitrocelulosa y se pre-hibridaron e hibridaron en un
50% de formamida, cloruro sódico 0,75 M, citrato sódico 0,075 M, fosfato sódico 0,05 M pH 6,5, 1% de polivinil
pirrolidina, 1% de Ficoll, 1% de albúmina de suero bovino y 50 ng/ml de ADN de esperma de salmón sonicado. La
sonda de hibridación se marcó mediante cebado con hexámeros aleatorios. Después de la hibridación durante una
noche a 42◦ C, las manchas de transferencia se lavaron minuciosamente en cloruro sódico 0,03 M, citrato sódico 3 mM
y 0,1% de SDS a 42◦ C. Se determinó la secuencia de nucleótidos de 10 clones que hibridaron. Uno de los clones, el
clon sAH 406-3, contenía la secuencia prevista por la secuencia peptídica original de la actividad PAF-AH purificada
a partir de plasma humano. En las SEC ID NOs: 7 y 8 se indican, respectivamente, la secuencia de ADN y la secuencia
de aminoácidos deducida de la PAF-AH de plasma humano.
El clon sAH-406-3 contiene un inserto de 1,52 kb con una fase de lectura abierta que codifica una proteína prevista
de 441 aminoácidos. En el extremo amino, un fragmento relativamente hidrófobo de 41 restos precede al aminoácido
N-terminal (la isoleucina en la posición 42 de la SEC ID NO: 8) identificado por microsecuenciación de proteínas. Por
lo tanto, la proteína codificada puede tener una secuencia señal J1arga o una secuencia señal más un péptido adicional
que se escinde para producir la enzima funcional madura. La presencia de una secuencia señal es una característica de
las proteínas de secreción. Además, la proteína codificada por el clon sAH 406-3 incluye el motivo consenso GxSxG
(aminoácidos 271-275 de la SEC ID NO: 8) que se cree que contiene la serina del sitio activo de todas las lipasas de
9
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mamífero, lipasas microbianas y proteasas de serina conocidas. Véase Chapus y colaboradores, Biochimie, 70: 12231224 (1988) y Brenner, Nature, 334; 528-530 (1988).
5
La Tabla 2 que se presenta a continuación es una comparación de la composición de aminoácidos de la PAF-AH de
plasma humano de la invención, prevista a partir de la SEC ID NO: 8, y la composición de aminoácidos del material
supuestamente purificado descrito por Stafforini y colaboradores, (1987), véase más arriba.
TABLA 2
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Ala
Asp y Asn
Cys
Glu y Gln
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Met
Pro
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr
Clon sAH 406-3
Stafforini y colaboradores
26
48
5
36
22
29
13
31
26
40
10
15
18
27
20
13
7
14
24
37
14
42
12
58
24
17
50
26
7
11
16
36
15
14
No determinado
13
La composición de aminoácidos de la forma madura de la PAF-AH de plasma humano de la invención y la composición de aminoácidos del material previamente purificado que supuestamente era la PAF-AH de plasma humano
son claramente distintas.
Cuando se intentó alinear las secuencias de núcleotidos de Hattori y colaboradores, véase más arriba, y las secuencias de aminoácidos deducidas de PAF-AH citoplásmica de cerebro bovino con las secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos de la PAF-AH de plasma humano de la invención, no se observaron parecidos estructurales significativos
en las secuencias.
Ejemplo 4
Se detectó una supuesta variante de unión del gen de PAF-AH humano cuando se realizó una PCR en ADNc de
PBMC de macrófagos y estimulado usando cebadores que hibridaban con la región 5’ no traducida (nucleótidos 31 a
52 de la SEC ID NO: 7) y la región que incluía el codón de terminación de la traducción en el extremo 3’ del ADNc
de PAF-AH (núcleotidos 1465 a 1487 de la SEC ID NO: 7). Las reacciones de PCR produjeron dos bandas en un gel,
correspondiendo una al tamaño esperado de ADNc de PAF-AH del Ejemplo 3 y siendo la otra aproximadamente 100
bp más corta. La secuenciación de las dos bandas reveló que la banda mayor era el ADNc de PAF-AH del Ejemplo
3, mientras que la banda más corta carecía del exon 2 (Ejemplo 5 mostrado más adelante) de la secuencia de PAFAH que codifica las supuestas secuencias señal y pro-péptido de la PAF-AH en plasma. En el clon más corto estaban
presentes la tríada catalítica prevista y todas las cisteínas, por lo tanto, es probable que la actividad bioquímica de la
proteína codificada por el clon corresponda a la de la enzima plasmática.
Ejemplo 5
60
65
También se aislaron secuencias genómicas de la PAF-AH de plasma humano. La estructura del gen de PAF-AH
se determinó aislando clones del fago lambda y del fago P1 que contenían ADN genómico y humano por hibridación
de ADN en condiciones muy rigurosas. Los fragmentos de los clones de los fagos se subclonaron y secuenciaron
usando cebadores diseñados para templar el clon de ADNc sAH-406-3 a intervalos regulares a lo largo de toda su
longitud. Además, se usaron nuevos cebadores de secuenciación diseñados para templar las regiones dd intrones que
flanqueaban los exones, para secuenciar los límites exon-intrón con la intención de confirmar las secuencias. Los
límites exon/intrón se definieron como los puntos en los que divergían las secuencias genómicas y de ADNc. Estos
análisis revelaron que el gen de PAF-AH humano comprende 12 exones.
10
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5
10
15
20
Los exones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y parte del 7 se aislaron a partir de una biblioteca placentaria fetal masculina construida
en lambda FIX (Stratagene). Las placas del fago se transfirieron sobre nitrocelulosa y se prehibridaron e hibridaron en
un 50% de formamida, cloruro sódico 0,75 M, citrato sódico 75 mM, fosfato sódico 50 mM (pH 6,5), 1% de polivinil
pirrolidina, 1% de Ficoll, 1% de albúmina de suero bovino y 50 ng/ml de ADN de esperma de salmón sonicado. La
sonda de hibridación usada para identificar un clon del fago que contenía los exones 2-6 y parte del 7 constaba del
clon de ADNc entero sAH 406-3. Se identificó un clon que contenía el exon 1 usando un fragmento derivado del
extremo 5’ del clon de ADNc (nucleótidos 1 a 312 de la SEC ID NO: 7). Las dos sondas se marcaron con 32 P por
cebado aleatorio con hexámeros. Después de una hibridación durante una noche a 42◦ C, las manchas de transferencia
se lavaron minuciosamente en cloruro sódico 30 mM, citrato sódico 3 mM y 0,1% de SDS a 42◦ C. En las SEC ID
NOs: 9, 10, 11, 12, 13 y 14 se indican, respectivamente, las secuencias de ADN de los exones 1, 2, 3, 4, 5 y 6 junto
con las secuencias parciales de los intrones circundantes.
El resto del exon 7, así como los exones 8, 9, 10, 11 y 12 se subclonaron a partir de un clon P1 aislado de una
biblioteca genómica humana de P1. Las placas del fago P1 se transfirieron sobre nitrocelulosa y se pre-hibridaron e
hibridaron en cloruro sódico 0,75 M, fosfato sódico 50 mM, (pH 7,4), EDTA 5 mM, polivinil pirrolidina al 1%, Ficoll
al 1%, albúmina de suero bovino al 1%, 0,5% de SDS y 0,1 mg/ml de ADN humano total. La sonda de hibridación,
marcada con 32 P por cebado aleatorio con hexámeros, constaba de un fragmento EcoR1 de 2,6 kb del ADN genómico
derivado del extremo 3’ de un clon lambda aislado anteriormente. Este fragmento contenía el exon 6 y la parte del exon
7 presente en el clon del fago. Después de una hibridación durante una noche a 65◦ C, las manchas de transferencia se
lavaron como se ha descrito anteriormente. En las SEC ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19 y 20 se indican, respectivamente,
las secuencias de ADN de los exones 7, 8, 9, 10, 11 y 12 junto con la secuencia parcial de los intrones circundantes.
Ejemplo 6
25
30
35
Se aislaron clones de ADNc de la PAF-AH plasmática de longitud completa a partir de bibliotecas de ADNc de
bazo de ratón y canino y se aisló un clon parcial de roedor a partir de una biblioteca de ADNc de timo de rata. Los
clones se identificaron por hibridación de baja rigurosidad (las condiciones de hibridación fueron las mismas que se
han descrito para los exones 1 a-6 en el Ejemplo 5 anterior, con la excepción de que se usó un 20% de formamida en
lugar de un 50% de formamida). Como sonda se usó un fragmento HindIII de 1 kb del clon de ADNc de PAF-AH
sAH-406-3 (nucleótidos 309 a 1322 de la SEC ID NO: 7). Además, se aisló un clon parcial de mono a partir de ADNc
de cerebro de macaco por PCR usando los cebadores basados en los nucleótidos 285 a 303 y 851 a 867 de la SEC
ID NO: 7. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida de los clones de ADNc de ratón, perro, rata y
macaco se indican en las SEC ID NOs: 21, 22, 23 y 24, respectivamente.
Una comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de los clones de ADNc con el clon de ADNc humano
produce los valores de identidad de -aminoácidos en porcentaje indicados en la Tabla 3 mostrada a continuación.
TABLA 3
40
Perro
Ratón
Mono
Rata
45
50
55
60
65
Humano
Perro
Ratón
80
66
92
74
64
82
69
69
82
Ejemplo 7
Para determinar si el clon de ADNc de PAF-AH plasmática humana sAH-406-3 (Ejemplo 3) codifica una proteína
que tiene actividad PAF-AH, se expresó de forma transitoria la construcción de expresión pRc/CMV en células COS
7. Tres días después de la transfección por el método de DEAE Dextrano, en el medio de células COS se ensayó la
actividad PAF-AH.
Las células se sembraron a una densidad de 300.000 células por placa de cultivo de tejidos de 60 mm. Al día
siguiente, las células se incubaron en DMEM que contenía 0,5 mg/ml de DEAE dextrano, cloroquina 0,1 mM y 510 µg de ADN plasmídico durante 2 horas. Las células después se trataron con DMSO al 10% en solución salina
tamponada con fosfato durante 1 minuto, se lavaron. con medio y se incubaron en DMEM que contenía un 10% de
suero de ternero fetal previamente tratado con diisopropil fluorofosfato (DFP) para inactivar la PAF-AH de suero
bovino endógeno. Después de tres días de incubación, en los medios de las células transfectadas se ensayó la actividad
PAF-AH. Los ensayos se realizaron en presencia y ausencia de EDTA 10 mM o DFP 1 mM para determinar si
la enzima recombinante era independiente del calcio y se inhibía por el inhibidor esterasa de serina DFP como se
ha descrito previamente para la PAF-AH plasmática por Stafforini y colaboradores (1987), véase más arriba. Los
controles negativos incluyeron células transfectadas con pRc/CMV que carecían del inserto o que tenían el inserto
sAH 406-3 en la orientación inversa.
11
ES 2 258 955 T3
5
10
15
La actividad PAF-AH presente en los sobrenadantes de los transfectantes se determinó por el método de Stafforini
y colaboradores (1990), véase más arriba, con las siguientes modificaciones. En resumen, la actividad PAF-AH se
determinó midiendo la hidrólisis de 3 H-acetato a partir de [acetil-3 H]PAF (New England Nuclear, Boston, MA). El
3
H-acetato libre acuoso se separó del sustrato marcado por cromatografía en columna de fase inversa sobre cartuchos
de gel de octadecilsílice (Baker Research Products, Phillipsburg, PA). Los ensayos se realizaron usando 10 µl del
sobrenadante de los transfectantes en tampón HEPES 0,1 M, pH 7,2, en un volumen de reacción de 50 µl. Se usó un
total de 50 pmoles de sustrato por reacción con una relación de PAF marcado: frío de 1:5. Las reacciones se incubaron
durante 30 minutos a 37◦ C y se interrumpieron mediante la adición de 40 µl de ácido acético 10 M. La solución
después se lavó a través de los cartuchos de gel de octadecilsílice, que después se aclararon con acetato sódico 0,1
M. El eluato acuoso de cada muestra se recogió y se contó en un contador de centelleo líquido durante un minuto. La
actividad enzimática se expresó en cuentas por minuto.
Como se muestra en la Figura 2, los medíos de células transfectadas con sAH-406-3 contenían actividad PAF-AH
a niveles 4 veces mayores que el nivel de fondo. Esta actividad no se vio afectada por la presencia de EDTA, pero se
anuló por la presencia de DFP 1 mM. Estas observaciones demuestran que el clon sAH-406-3 codifica una actividad
consistente con la enzima plasmática humana PAF-AH.
Ejemplo 8
20
Se usó la PCR para generar un fragmento codificante de proteínas de ADNc de la PAF-AH plasmática humana a
partir del clon sAH-406-3, que era muy susceptible a la subclonaión en un vector de expresión de E. coli. El segmento
sublonado comenzaba en el extremo 5’ del gen humano con el codón que codifica Ile42 (SEC ID NO: 8), el resto Nterminal de la enzima purificada a partir de plasma humano. El resto del gen hasta el codón de terminación nativo se
incluyó en la construcción. El cebador de PCR 5’ con sentido utilizado fue:
25
SEC ID NO: 25
5’TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG 3’
30
y contenía un sitio de clonación XbaI así como un codón de iniciación de la traducción (subrayado). El cebador 3’
con sentido opuesto utilizado fue:
SEC ID NO: 26
35
40
45
50
55
60
5’ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG3’
e incluía el codón de terminación de sAH 406-3 y contenía un sitio de clonación EcoRV. Las reacciones de PCR
se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 3. El producto de PCR resultante se digirió con XbaI y
EcoRV y se subclonó en un vector pBR322 que contenía el promotor Trp [deBoer y colaboradores, PNAS, 80:2125 (1983)] inmediatamente cadena arriba del sitio de clonación. La cepa XL-1 Blue de E. coli se transformó con la
construcción de expresión y se cultivó en caldo L que contenía 100 µg/ml de carbenicilina. Los transformantes de los
cultivos de una noche se sedimentaron y resuspendieron en tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5,
NaCl 50 mM, CHAPS 10 mM, EDTA 1 mM, 100 µg/ml de lisozima y 0,05 unidades inhibidoras de tripsina (TIU)/ml
de Aprotinina. Después de una incubación de 1 hora en hielo y sonicación durante 2 minutos, los lisados se ensayaron
con respecto a la actividad PAF-AH por el método descrito en el Ejemplo 4. Las células E. coli transformadas con la
construcción de expresión (denominada trp AH) generaron un producto con actividad PAF-AH. Véase la Tabla 6 del
Ejemplo 9.
También se utilizaron construcciones que incluían tres promotores adicionales, el promotor tacII (deBoer, véase
más arriba), el promotor B de arabinosa (ara) de Salmonella typhimurium [Holrwitz y colaboradores, Gene, 14: 309319 (1981)] y el promotor del bacteriófago T7, para dirigir la expresión de las secuencias de PAF-AH humana en
E. coli. Las construcciones que comprendían el promotor Trp (pUC trp AH), el promotor tacII (pUC tac AH) y el
promotor araB (pUC ara AH) se montaron en el plásmido pUC19 (New England Biolabs, MA), mientras que la
construcción que comprendía el promotor de T7 (pET AH) se montó en el plásmido pET15B (Novagen, Madison,
WI). Una construcción que contenía un promotor híbrido, pHAB/PH, que constaba del promotor araB fusionado a los
sitios de unión a ribosomas de la región del promotor de T7 también se montó en pET15B. Todas las construcciones
de E. coli producían actividad PAF-AH dentro de un intervalo de 20 a 50 U/ml/DO600 . Esta actividad correspondía a
una masa de proteína recombinante total de 1% de la proteína celular total.
La PAF-AH humana recombinanté también se ha expresado en Sacharomyces cerevisiae. Se usó el promotor ADH2
de levadura para dirigir la expresión de rPAF-AH y produjo 7 U/ml/DO600 (Tabla 4 mostrada a continuación).
65
12
ES 2 258 955 T3
TABLA 4
Construcción
5
10
15
20
25
pUC tac AH
pUC trp AH
pUC ara AH
pET AH
tac
trp
araB
T7
pHAB/PH
pYep ADH2 AH
araB/T7
ADH2
Cepa
Actividad Enzimática (U/ml/DO)
E. coli W3110
E. coli W3110
E. coli W3110
E. coli BL21 (DE3)
(Novagen)
E. coli XL-1
Levadura BJ2.28
30
40
20
50
34
7
También se evaluaron varias construcciones de expresión de E. coli que producían PAF-AH con el extremo amino extendido. El extremo N-terminal de la PAF-AH plasmática natural se identificó como Ile42 por secuenciación
de aminoácidos (Ejemplo 2). Sin embargo, la secuencia inmediatamente cadena arriba de Ile92 no corresponde a los
aminoácidos encontrados en los sitios de escisión de la secuencia señal [es decir, no se sigue la “regla -3-1-”, ya que
la lisina no se encuentra en la posición -1; véase von Heijne, Nuc. Acids. Res., 14:4683-4690 (1986)]. Presumiblemente, el sistema de secreción celular reconoce una secuencia señal más clásica (M1 - A17 ) y después produce una
escisión endoproteolítica. La secuencia codificante entera para PAF-AH que comenzaba en la metionina de iniciación
(nucleótidos 162 a 1487 de la SEC ID NO: 7) se modificó por ingeniería genética para la expresión en E. coli usando
el promotor de trp. Como se muestra en la Tabla 5, con esta construcción se obtuvo PAF-AH activa, pero la expresión
estuvo a aproximadamente un quinto del nivel de la construcción original que comenzaba en Ile42 . Otra construcción de expresión, que comenzaba en Valla (nucleótidos 213 a 1487 de la SEC ID NO: 7), produjo PAF-AH activa a
aproximadamente un tercio del nivel de la construcción original. Estos resultados sugieren que las extensiones amino
terminales no son críticas o necesarias para la actividad de la PAF-AH recombinante producida en E. coli.
TABLA 5
30
Construcción
pUC trp AH
pUC trp AH Met1
pUC trp AH Val18
35
40
Actividad PAF-AH (U/ml/DO600 )
Lisado
Medio
177,7
3,1
54,6
0,030
0,003
0,033
Ejemplo 9
Se purificó PAF-AH plasmática humana recombinante (comenzando en Ile42 ) expresada en E. coli en una sola banda de SDS-PAGE teñida con Coomassie por diversos métodos, y se ensayó con respecto a las actividades presentadas
por la enzima PAF-AH nativa.
45
50
55
60
A. Purificación de PAF-AH Recombinante
El primer procedimiento de purificación utilizado es similar al descrito en el Ejemplo 1 para la PAF-AH nativa. Las
siguientes etapas se realizaron a 4◦ C. Se lisaron sedimentos de 50 ml de E. coli que producía PAF-AH (transformada
con la construcción de expresión trp AH) como se describe en el Ejemplo 8. Los sólidos se retiraron por centrifugación
a 10.000 g durante 20 minutos. El sobrenadante se introdujo a un caudal de 0,8 ml/minuto en una columna Blue
Sepharose Fast Flow (2,5 cm x 4 cm; volumen del lecho 20 ml) equilibrada en tampón D (Tris-HCl 25 mM, CHAPS
10 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,5). La columna se lavó con 100 ml de tampón D y se eluyó con 100 ml de tampón A
que contenía KSCN 0,5 M a 3,2 ml/minuto. Se introdujo una fracción activa de 15 ml en una columna Cu Chelating
Sepharose de 1 ml equilibrada en tampón D. La columna se lavó con 5 ml de tampón D y después se eluyó con 5
ml de tampón D que contenía imidazol 100 mM produciéndose el flujo por gravedad. Las fracciones que contenían la
actividad PAF-AH se analizaron por SDS-PAGE.
Los resultados de la purificación se muestran en la Tabla 6, en la que una unidad equivale al número de µmoles
de hidrólisis de PAF por hora. El producto de purificación obtenido a 4◦ C aparecía en SDS-PAGE como una sola
banda intensa por debajo del marcador de 43 kDa, con alguna tinción difusa directamente por encima y por debajo
de este marcador. El material recombinante es significativamente más puro y presenta más actividad específica en
comparación con las preparaciones de PAF-AH plasmática como se describe en el Ejemplo 1.
65
13
ES 2 258 955 T3
TABLA 6
Muestra
Vol
ml
Actividad
uds/
ml
Act.
Total
uds x
103
Conc.
Prot
mg/ml
Act.
Específ.
uds/mg
Lisado
Blue
Cu
4,5
15
1
989
64
2128
4451
960
2128
15,6
0,07
0,55
63
914
3869
5
% Recup.
actividad
Etapa
Acum.
10
100
22
220
100
22
48
Factor de
multiplic.
de la
Purificación
Etapa
Acum.
1
14,4
4,2
1
14,4
61
15
20
25
30
35
Cuando se realizó el mismo protocolo de purificación a temperatura ambiente, además de la banda por debajo
del marcador de 43 kDa, aparecía un grupo de bandas por debajo del marcador de 29 kDa correlacionadas con la
actividad PAF-AH de las porciones de gel ensayadas. Estas bandas de menor peso molecular pueden ser fragmentos
proteolíticos de PAF-AH que retienen la actividad enzimática.
También se realizó un procedimiento de purificación diferente a temperatura ambiente. Se resuspendieron sedimentos (100 g) de células E. coli que producían PAF-AH (transformadas con la construcción de expresión pUC trp
AH) en 200 ml de tampón de lisis (Tris 25 mM, CHAPS 20 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, 50 µg/ml de benzamidina, pH 7,5) y se lisaron pasándolos tres veces a través de un microfluidizador a 15.000 psi. Los sólidos se retiraron
por centrifugación a 14.300 x g durante 1 hora. El sobrenadante se diluyó 10 veces en tampón de dilución [MES 25
mM (ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico), CHAPS 10 mM, EDTA 1 mM, pH 4,9] y se introdujo a un caudal de 25
ml/minuto en una Columna S Sepharose Fast Flow (200 ml) (una columna de intercambio catiónico) equilibrada en
Tampón E (MES 25 mM, CHAPS 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5). La columna se lavó con 1 litro de
Tampón E, se eluyó con NaCl 1 M y el eluato se recogió en fracciones de 50 ml que se ajustaron a pH 7,5 con 0,5
ml de base Tris 2 M. Las fracciones que contenían la actividad PAF-AH se reunieron y ajustaron a NaCl 0,05 M. El
conjunto de S se introdujo a un caudal de 1 ml/minuto en una columna Blue Sepharose Fast Flow (2,5 cm x 4 cm; 20
ml) equilibrada en Tampón F (Tris 25 mM, CHAPS 10 mM, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, pH 7,5). La columna se lavó
con 100 ml de Tampón F y se eluyó con 100 ml de Tampón F que contenía NaCl 3 M a un caudal de 4 ml/minuto.
Después se repitió la etapa de cromatografía en Blue Sepharose Fast Flow para reducir los niveles de endotoxinas de
la muestra.
Las fracciones que contenían la actividad PAF-AH se reunieron y dializaron frente a Tampón G (Tris 25 mM, pH
7,5, NaCl 0,5 M, Tween 80 al 0,1% y EDTA 1 mM).
40
Los resultados de la purificación se muestran en la Tabla 7, en la que una unidad equivale al número de pinoles de
hidrólisis de PAF por hora.
TABLA 7
45
Muestra
Vol
ml
Actividad
uds/
ml
Act.
Total
uds x
103
Conc.
Prot
mg/ml
Act.
Específ.
uds/mg
Lisado
S
Blue
200
111
100
5640
5742
3944
1128
637
394
57,46
3,69
0,84
98
1557
4676
50
55
% Recup.
actividad
Etapa
Acum.
100
57
35
100
56
62
Veces de
purificación
Etapa
Acum.
1
16
3
1
16
48
60
El producto de purificación obtenido apareció en la SDS-PAGE como una sola banda intensa por debajo del marcador de 43 kDa con alguna tinción difusa directamente por encima y por debajo del marcador. El material recombinante
es significativamente más puro y presenta una actividad específica mayor en comparación con las preparaciones de
PAF-AH plasmática como se describe en el Ejemplo 1.
65
Otro procedimiento de purificación contemplado por la presente invención implica las siguientes etapas de lisis
celular, clarificación y primera columna. Las células se diluyen 1:1 en tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150
mM, Tween 80 y EDTA 2 mM). La lisis se realiza en un microfluidizador enfriado a 15.000-20.000 psi con tres fases
del material para producir > 99% de rotura celular. El lisado se diluye a 1:20 en tampón de dilución (Tris 25 mM, pH
8,5, EDTA 1 mM) y se aplica a una columna rellena de medio de cromatografía Q-Sepharose Big Bead (Pharmacia)
14
ES 2 258 955 T3
equilibrado en Tris 25 mM, pH 8,5, EDTA 1 mM, y 0,015% de Tween 80. El eluato se diluyd a 1:10 en MES 25 mM
pH 5,5, sulfato amónico 1,2 M y EDTA 1 mM y se aplica a medio de cromatografía de Butyl Sepharose (Pharmacia)
equilibrado en el mismo tampón. La actividad PAF-AH se eluye en MES 25 mM, pH 5,5, 0,1% de Tween 80 y EDTA
1 mM.
5
B. Actividad PAF-AH Recombinante
10
15
20
25
30
35
La propiedad más destacada del PAF acetilhidrolasa es su notable especificidad por sustratos con un resto corto en
la posición sn-2 del sustrato. Esto distingue la especificidad estricta del PAF acetilhidrolasa de otras formas de PLA2 .
Así pues, para determinar si la PAF-AH recombinante degrada los fosfolípidos con ácidos grasos de cadena larga en la
posición sn-2, se ensayó la hidrólisis de 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (araquidonoilPC), ya que
éste es el sustrato preferido para una forma bien caracterizada de PLA2 . Como se prevé por los estudios previos con la
PAF-AH nativa, este fosfolípido no se hidrolizó cuando se incubó con PAF-AH recombinante. En otros experimentos,
se incluyó araquidonoilPC en un ensayo convencional de hidrólisis de PAF a concentraciones que variaban de 0 a 125
µM para determinar si inhibía la hidrólisis de PAF por PAF-AH recombinante. No hubo inhibición de la hidrólisis
de PAF incluso a la mayor concentración de PAF-AH, que era 5 veces mayor que la concentración de PAF. Así
pues, la PAF-AH recombinante presenta la misma selectividad de sustrato que la enzima nativa; no se reconocen los
sustratos de cadena larga. Además, la enzima PAF-AH recombinante degrada rápidamente un fosfolípido oxidado
(glutaroilPC) que había sufrido escisión oxidativa del ácido graso sn-2. La PAF-AH plasmática nativa tiene otras
diversas propiedades que la distinguen de otras fosfolipasas, que incluyen la independencia de calcio y la resistencia a
compuestos que modifican los grupos sulfhidrilo o rompen enlaces disulfuro.
Tanto la enzima PAF-AH plasmática recombinante como la nativa son sensibles a DFP, lo que indica que una serina
constituye parte de sus sitios activos. Una característica poco habitual del PAF acetilhidrolasa plasmático nativo es que
está muy asociado con lipoproteínas circulantes, y su eficacia catalítica está influenciada por el medio lipoproteico.
Cuando la PAF-AH recombinante de la invención se incubó con plasma humano (previamente tratado con DFP para
anular la actividad enzimática endógena), se asoció con lipoproteínas de baja y de alta densidad de la misma manera
que la actividad nativa. Este resultado es significativo, porque existen indicios sustanciales de que la modificación
de las lipoproteínas de baja densidad es esencial para la deposición de colesterol observada en los ateromas, y de
que la oxidación de los lípidos es un factor de iniciación de este proceso. La PAF-AH protege a las lipoproteínas
de baja densidad de la modificación en condiciones oxidantes in vitro y puede tener un papel similar in vivo. Así
pues, la administración de PAF-AH está indicada para la supresión de la oxidación de las lipoproteínas en placas
ateroscleróticas así como para resolver una inflamación.
Todos estos resultados confirman que el clon de ADNc sAH 406-3 codifica una proteína con las actividades de la
PAF acetilhidrolasa de plasma humano.
Ejemplo 10
40
Se expresaron en E. coli otros diversos productos de PAF-AH recombinante. Los productos incluían análogos de
PAF-AH que tenían mutaciones de un solo aminoácido y fragmentos de PAF-AH.
A. Productos de Sustitución de Aminoácidos de PAF-AH
45
50
55
60
65
La PAF-AH es una lipasa porque hidroliza el fosfolípido PAF. Aunque no gxiste ninguna analogía evidente entre
PAF-AH y otras lipasas caracterizadas, se han encontrado residuos conservados en comparaciones de lipasas caracterizadas estructuralmente. Se ha identificado una serina como miembro del sitio activo. La serina, junto con un resto de
aspartato y un resto de histidina, forman una tríada catalítica que representa el sitio activo de la lipasa. Los tres restos
no están adyacentes en la secuencia primaria de la proteína, pero ciertos estudios estructurales han demostrado que los
tres restos están adyacentes en el espacio tridimensional. Las comparaciones de las estructuras de las lipasas de mamífero sugieren que el resto Asp generalmente está a una distancia de veinte aminoácidos en posición C-terminal con
respecto a la serina del sitio activo. Además, la histidina generalmente está a una distancia de 109 a 111 aminoácidos
en posición C-terminal con respecto a la serina del sitio activo.
Mediante mutagénesis de localización dirigida y PCR, se modificaron codones individuales de la secuencia codificante de la PAF-AH humana para codificar restos de alanina y se expresaron en E. coli. Como se muestra en la Tabla 8
mostrada a continuación, en la que, por ejemplo, la abreviatura “S108A” indica que el resto de serina en posición 273
se cambió por una alanina, las mutaciones puntuales de Ser273 , Asp296 o His351 destruyen completamente la actividad
PAF-AH. Las distancias entre los restos de sitios activos es similar para PAF-AH (de Ser a Asp, 23 aminoácidos; de
Ser a His, 78 aminoácidos) y otras lipasas. Estos experimentos demuestran que la Ser273 , el Asp296 y la His351 son restos
críticos para la actividad y que, por lo tanto, son candidatos probables de restos de tríadas catalíticas. Las cisteínas a
menudo son críticas para la integridad funcional de las proteínas a causa de su capacidad de formar enlaces disulfuro. La enzima PAF-AH plasmática contiene cinco cisteínas. Para determinar si alguna de las cinco es crítica para la
actividad enzimática, cada cisteína se mutó individualmente a una serina y los mutantes resultantes se expresaron en
E. coli. Como se muestra a continuación en la Tabla 8, se obtuvo una pérdida significativa pero no total de actividad
PAF-AH por la conversión de Cys229 o Cys291 en serina. Por lo tanto, estas cisteínas parecen ser necesarias para la
actividad PAF-AH completa. Otras mutaciones puntuales tuvieron un efecto pequeño o nulo sobre la actividad catalítica de PAF-AH. En la Tabla 8, “++++” representa la actividad PAF-AH de tipo silvestre de aproximadamente 40-60
15
ES 2 258 955 T3
U/ml/DO600 , “+++” representa una actividad de aproximadamente 20-40 U/ml/DO600 , “++” representa una actividad
de aproximadamente 10-20 U/ml/DO600 , “+” representa una actividad de 1-10 U/ml/DO600 y “-” indica una actividad
< 1 U/ml/DO600 .
5
TABLA 8
10
15
20
25
Mutación
Actividad PAF-AH
Tipo silvestre
S108A
S273A
D296A
D338A
H351A
H395A, H399A
C67S
C229S
C291S
C334S
C407S
++++
++++
++++
++++
+++
+
+
++++
+++
B. Productos de Fragmentos de PAF-AH
30
Se prepararon deleciones C-terminales digiriendo el extremo 3’ de la secuencia codificante de PAF-AH con la
exonucleasa III durante diversos periodos de tiempo y después uniendo la secuencia codificante acortada al ADN
plasmídico que codificaba codones stop en las tres fases de lectura. Se caracterizaron tres construcciones de deleción
diferentes por análisis de la secuencia de ADN, expresión de proteínas y actividad PAF-AH. La eliminación de veintiún
a treinta aminoácidos C-terminales redujo en gran medida la actividad catalítica y la eliminación de cincuenta y dos
restos destruyó completamente la actividad. Véase la Figura 3.
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Se realizaron deleciones similares en el extremo amino terminal de PAF-AH. Se prepararon fusiones de PAF-AH
con tiorredoxina de E. coli en el extremo N-terminal para facilitar un alto nivel de expresión constante de actividad
PAF-AH [LaVallie y colaboradores, Bio/technology, 11: 187-193 (1993)]. La eliminación de diecinueve aminoácidos del extremo N-terminal procesado de forma natural (Ile2 ) destruyó completamente la actividad enzimática en la
proteína de fusión. Véase la Figura 3.
Ejemplo 11
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Se realizó un análisis preliminar de los modelos de expresión de ARNm de PAF-AH de plasma humano en tejidos
humanos por hibridación de transferencia de Northern.
El ARN se preparó a partir de corteza cerebral humana, corazón, riñón, placenta, timo y amígdalas usando ARN
Stat 60 (Tel-Test “B”, Friendswood, TX). Además, se preparó ARN a partir de la línea de células de tipo precursor
hematopoyético humano, THP-1 (ATCC TIB 202), que se indujo para diferenciar un fenotipo de tipo macrófago
usando el éster de forbol miristilacetato de forbol (PMA). El ARN tisular y el ARN preparado a partir de la línea de
células THP-1 premielocítica antes y de 1 a 3 días después de la inducción se sometieron a electroforesis a través de un
gel de agarosa y formaldehído al 1,2% y posteriormente se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. El ADNc
de PAF-AH de plasma humano de longitud completa, sAH 406-3, se tiñó mediante cebado aleatorio y se hibridó con
la membrana en condiciones idénticas a las descritas en el Ejemplo 3 para la selección de la biblioteca. Los resultados
iniciales indican que la sonda de PAF-AH hibridaba con una banda de 1,8 kb presente en el ARN del timo, de las
amígdalas y, en un menor grado, en el ARN placentario.
60
También se examinó la expresión del ARN de PAF-AH en monocitos aislados a partir de sangre humana y durante
su diferenciación espontánea en macrófagos en cultivo. En los monocitos recientes se detectó poco o nada de ARN,
pero la expresión se indujo y mantuvo durante la diferenciación en macrófagos. Hubo una acumulación concomitante
de actividad PAF-AH en el medio de cultivo de las células en diferenciación. La expresión del transcrito de PAFAH en plasma humano también se observó en el ARN de las células THP-1 en el día 1, pero no 3 días después de la
inducción. Las células THP-1 no expresaban ARNm para PAF-AH en el estado basal.
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Ejemplo 12
La expresión de PAF-AH en tejidos humanos y de ratón se examinó por hibridación in situ.
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Se obtuvieron tejidos humanos del National Disease Research Interchange y la Cooperative Human Tissue Network. El cerebro y la médula espinal de ratones normales, y las médulas espinales de ratones con EAE de fase 3 se
extrajeron a partir de ratones S/JLJ. Los embriones de ratones S/JLJ normales se extrajeron de once a dieciocho días
después de la fertilización.
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Las secciones tisulares se pusieron en criomoldes Tissue Tek II (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) con una
pequeña cantidad de compuesto OCT (Miles, Inc., Elkhart, IN). Se centraron en el criomolde, el criomolde se rellenó
con compuesto OCT, después se puso en un recipiente con 2-metilbutano [C2 H5 CH(CH3 )2 , Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI] y el recipiente se puso en nitrógeno líquido. Una vez congelados el tejido y el compuesto
OTO en el criomolde, los bloques se almacenaron a -80◦ C hasta que se seccionaron. Los bloques de tejido se seccionaron con espesores de 6 µm, se adhirieron a portaobjetos recubiertos con Vectabond (Vector Laboratories, Inc.,
Burlingame, CA), se almacenaron a -70◦ C, se pusieron a 50◦ C durante aproximadamente 5 minutos para calentarlos y
eliminar la condensación, y después se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a 4◦ C, se deshidrataron
(70%, 95%, 100% de etanol) durante 1 minuto a 4◦ C en cada grado, y después se dejaron secar al aire durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se desnaturalizaron durante 2 minutos a 70◦ C en formamida al 70% (2X
SSC, se aclararon dos veces en 2X SSC, se deshidrataron y después se secaron al aire durante 30 minutos. Los tejidos
se hibridaron in situ con ARNm de una sola cadena radiomarcado generado a partir de ADN derivado de un fragmento
HindIII interno de 1 kb del gen PAF-AH (nucleótidos 308 a 1323 de la SEC ID NO: 7) mediante incorporación de 35 SUTP en la transcripción de ARN in vitro (AMER-sham).
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Las sondas se usaron a longitudes variables de 250-500 pb. La hibridación se realizó durante una noche (1216 horas) a 50◦ C; al tampón de hibridación se añadieron las ribosondas marcadas con 35 S (6 x 105 cpm/sección),
ARNt (0,5 µg/sección) y agua tratada con dietilpirocarbonato (depc) para llevarlo a una concentración final de 50%
de formamida, NaCl 0,3 M, Tris 20 mM, pH 7,5, 10% de sulfato de extrano, 1X de solución de Denhardt, ditiotreitol
(DTT) 100 mM y EDTA 5 mM. Después de la hibridación, las secciones se lavaron durante 1 hora a temperatura
ambiente en 4X SSC/DTT 10 mM, después durante 40 minutos a 60◦ C en 50% de formamida/1X SSC/DTT 10 mM,
30 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC, y 30 minutos a temperatura ambiente en 0,1X SSC. Las secciones se
deshidrataron, se secaron al aire durante 2 horas, se revistieron con emulsión fotográfica Kodak NTB2 y se secaron
al aire durante 2 horas, se revelaron (después del almacenamiento a 4◦ C en la oscuridad completa) y se tiñeron con
hematoxilina/eosina como colorantes de contraste.
A. Cerebro
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Cerebelo. Tanto en el cerebro de ratón como en el cerebro humano, se observó una señal fuerte en la capa de
células de Purkinje del cerebelo, así como en los cuerpos de las células neuronales individuales del núcleo dentado
(uno de los cuatro núcleos profundos del cerebelo). Además, se observó una señal en las células individuales de las
capas granular y molecular de la materia gris.
Hipocampo. En la sección de hipocampo humano, las células individuales presentes a lo largo de toda la sección,
que parecen ser cuerpos de células neuronales, mostraron señales fuertes.
Tallo Cerebral. Tanto en las secciones de tallo cerebral humano como en las de ratón, se observó una señal fuerte
en las células individuales de la materia gris.
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Corteza. En las secciones de corteza humana tomadas de las cortezas cerebral, occipital y temporal, y en las
secciones de cerebro entero de ratón, las células individuales presentes a lo largo de toda la corteza mostraron señales
fuertes. No parece haber diferenciación en el modelo de expresión en las diferentes capas de la corteza. Estos resultados
de hibridación in situ son diferentes de los resultados para la corteza cerebral obtenidos por transferencia de Northern.
Probablemente, la diferencia se debe a la mayor sensibilidad de la hibridación in situ en comparación con la de la
Transferencia de Northern.
Pituitaria. Se observó una señal algo más débil en células individuales dispersas del pars distalis de la sección de
tejido humano.
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B. Colon Humano
Tanto el colon normal como el colon con la enfermedad de Crohn presentaron señales en las agregaciones linfáticas
presentes en la mucosa de las secciones, siendo el nivel de señal ligeramente mayor en la sección del paciente con
la enfermedad de Crohn. El colon con la enfermedad de Crohn también tenía una señal fuerte en la lámina propia.
Análogamente, se observó un alto nivel de señal en una sección enferma del apéndice, mientras que el apéndice
normal presentaba una señal menor pero detectable. Las secciones procedentes de un paciente con colitis ulcerosa no
mostraron ninguna señal evidente ni en las agregaciones linfáticas ni en la lámina propia.
C. Amígdalas y timos humanos
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Se observaron señales fuertes en grupos dispersos de células individuales dentro de los centros germinales de las
amígdalas y dentro del timo.
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D. Ganglios linfáticos humanos
Se observó una señal fuerte en la sección de ganglio linfático tomada a partir de un donante normal, mientras que
se observó una señal algo débil en los ganglios linfáticos de la sección de un donante con choque séptico.
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E. Intestino delgado humano
Tanto el intestino delgado normal como el intestino delgado con la enfermedad de Crohn tuvieron señales débiles
en las placas de Peyer y la lámina propia en las secciones, siendo la señal ligeramente mayor en el tejido enfermo.
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F. Bazo y pulmón humanos
No se observó señal en ninguno de los tejidos de bazo (secciones normales y de abscesos esplénicos) ni de pulmón
(secciones normales y de enfisema).
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G. Médula espinal de ratón
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Tanto en las médulas espinales de ratones normales como en las médulas espinales de ratones con EAE de fase
3, hubo una señal fuerte en la materia gris de la médula espinal, siendo la expresión ligeramente mayor en la médula
espinal de los ratones con EAE de fase 3. En la médula espinal de los ratones con EAE de fase 3, las células de la
materia blanca y los manguitos perivasculares, probablemente macrófagos y/u otros leucocitos infiltrantes, mostraron
señales que estaban ausentes en la médula espinal normal.
F. Embriones de ratón
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En el embrión de 11 días fue evidente una señal en el sistema nervioso central en el cuarto ventrículo, que permaneció a lo largo de todo el periodo de tiempo hasta que se desarrolló el cerebelo y el tallo cerebral. Según maduraban los
embriones, la señal se hizo evidente en el sistema nervioso central en la médula espinal (día 12), en la corteza primaria
y en ganglio de Gasser (día 14) y en la hipófisis (día 16). Se observó una señal en el sistema nervioso periférico (desde
el día 14 ó 15) o en los nervios que salían de la médula espinal y, en el día 17, apareció una señal fuerte alrededor de
los filamentos del embrión. También se observó expresión en el hígado y pulmón en el día 14, en el intestino (desde el
día 15) y en la porción posterior de la boca/garganta (desde el día 16). En el día 18, el modelo de expresión se había
diferenciado en señales en la corteza, metencéfalo (cerebelo y tallo cerebral), nervios que dejan la región lumbar de la
médula espinal, la porción posterior de la boca/garganta, el hígado, el riñón y una posible señal débil en el pulmón y
el intestino.
G. Resumen
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La expresión del ARNm de PAF-AH en las amígdalas, timo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, apéndice y
agregados linfáticos de colon es coherente con las conclusiones de que la fuente predominante probable in vivo de
PAF-AH es el macrófago, porque todos estos tejidos tienen altas poblaciones de macrófagos que sirven como células
fagocíticas y procesadoras de antígenos.
La expresión de la PAF-AH en tejidos inflamados sería coherente con la hipótesis de que un papel de los macrófagos derivados de monocitos es resolver la inflamación. Sería de esperar que la PAF-AH inactivara el PAF y los
fosfolípidos pro-inflamatorios, regulando así negativamente la cascada inflamatoria de acontecimientos iniciados por
estos mediadores.
El PAF se ha detectado en tejido cerebral entero y se secreta por las células de los gránulos cerebelares de rata en
cultivo. Ciertos experimentos in vitro e in vivo han demostrado que PAF se une a un receptor específico de los tejidos
neurales e induce cambios funcionales y fenotípicos tales como movilización de calcio, regulación positiva de genes
activadores de la transcripción y diferenciación de la línea de células precursoras neurales, PC12. Estas observaciones
sugirieron un papel fisiológico para PAF en el cerebro y, de forma coherente con esto, ciertos experimentos recientes
que usan cultivos de secciones tisulares del hipocampo y análogos y antagonistas de PAF, han implicado al PAF como
un mensajero retrógado importante en la potenciación del hipocampo a largo plazo. Por lo tanto, además de su efecto
patológico en la inflamación, el PAF parece participar en el proceso de señalización neuronal rutinario. La expresión
del PAF-AH extracelular en el cerebro puede servir para regular la duración y magnitud de la señalización mediada
por PAF.
Ejemplo 13
Se generaron anticuerpos monoclonales específicos para la PAF-AH de plasma humano recombinante usando PAFAH producida por E. coli como inmunógeno.
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El ratón n◦ 1342 se inyectó en el día 0, en el día 19 y en el día 40 con PAF-AH recombinante. Para el refuerzo
de prefusión, se inyectó al ratón el inmunógeno en PBS. Cuatro días después el ratón se sacrificó, se extrajo su
bazo de forma estéril y se puso en 10 ml de RPMI 1640 sin suero. Se formó una suspensión de una sola célula
triturando el bazo entre los extremos deslustrados de dos portaobjetos de microscopio de vidrio sumergidos en RPMI
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1640 sin suero, suplementado con L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina y 100
µg/ml de estreptomicina (RPMI) (Gibco, Canadá). La suspensión celular se filtró a través de un tamiz de células
Nitex de malla 70 estéril (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) y se lavó dos veces por centrifugación a 200
g durante 5 minutos, resuspendiendo el sedimento en 20 ml de RPMI sin suero. Los timocitos tomados a partir de
tres ratones Balb/c sobre los que no se había experimentado previamente, se prepararon de una forma similar. Las
células de mieloma NS-1, mantenidas en fase logarítmica en RPMI con un 11% de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone
Laboratories, Inc., Logan, Utah) durante tres días antes de la fusión, se centrifugaron a 200 g durante 5 minutos y el
sedimento se lavó dos veces como se describe en el párrafo anterior.
Se reunieron 1 x 108 células de bazo con 2,0 x 107 células NS-1, se centrifugaron y el sobrenadante se aspiró.
El sedimento celular se desprendió tapando el tubo y añadiendo 1 ml de PEG 1500 (50% en HEPES 75 mM, pH
8,0) (Boehringer Mannheim) a 37◦ C, con agitación durante 1 minuto, seguido de la adición de 7 ml de RPMI sin
suero durante 7 minutos. Se añadieron 8 ml más de RPMI y las células se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos.
Después de desechar el sobrenadante, el sedimento se resuspendió en 200 ml de RPMI que contenía un 15% de FBS,
hipoxantina sódica 100 µM, aminopterina 0,4 µM, timidina 16 µM (HAT) (Gibco), 25 uds/ml de I:L-6 (Boehringer
Mannheim) y 1,5 x 106 timocitos/ml y se cultivó en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano Corning
(Corning, Corning N.Y.).
En los días 2, 4 y 6, después de la fusión, se retiraron 100 µl de los pocillos de las placas de fusión y se reemplazaron
con medio nuevo. En e], día 8, la fusión se investigó por ELISA, ensayando la presencia de unión de IgG de ratón a
la PAF-AH recombinante. Se recubrieron placas Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) durante 2 horas a 37◦ C con
100 ng/pocillo de PAF-AH recombinante diluida en TRIS 25 mM, pH 7,5. La solución de recubrimiento se aspiró,
se añadieron 200 µl/pocillo de solución bloqueante [gelatina de piel de pescado al 0,5% (Sigma) diluida en CMFPBS] y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 37◦ C. Las placas se lavaron tres veces con PBS con Tween 20 al
0,05% (PBST) y se añadieron 50 µl de sobrenadante de cultivo. Después de la incubación a 37◦ C durante 30 minutos
y del lavado como se ha indicado anteriormente, se añadieron 50 µl de IgG(fc) anti-ratón de cabra conjugada con
peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) diluida a 1:3500 en PBST. Las
placas se incubaron como se ha indicado anteriormente, se lavaron cuatro veces con PBST y se añadieron 100 µ1 de
sustrato, que constaba de 1 mg/ml de o-fenilendiamina (Sigma) y 0,1 µl/ml de H2 O2 al 30% en Citrato 100 mM, pH
4,5. La reacción coloreada se interrumpió en 5 minutos con la adición de 50 µl de H2 SO4 al 15%. La A490 se leyó en
un lector de placas (Dynatech).
Los pocillos de fusión seleccionados se clonaron dos veces por dilución en placas de 96 pocillos y se evaluó visualmente el número de colonias/pocillo tras 5 días. Los hibridomas clonados fueron 90D1E, 90E3A, 90E6C, 90G11D
(ATCC HB 11724) y 90F2D (ATCC HB 11725).
Los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas se isotipificaron usando el sistema Isostrip (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Los resultados demostraron que todos los anticuerpos monoclonales producidos
por los hibridomas a partir de la fusión 90 fueron IgG1 .
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Ejemplo 14
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Se llevaron a cabo estudios experimentales para evaluar los efectos terapéuticos in vivo de PAF-AH recombinante
de la invención sobre la inflamación aguda, utilizando un modelo de edema de pata de la rata [Henriques y colaboradores, Br. J. Pharmacol., 106: 579-582 (1992)]. Los resultados de estos estudios demostraron que la PAF-AH bloquea el
edema inducido por PAF. Se realizaron estudios paralelos para comparar la eficacia de PAF-AH con dos antagonistas
comercialmente disponibles del PAF.
A. Preparación de PAF-AH
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Se lisaron en un microfluidizador células E. coli transformadas con el vector de expresión de PAF-AH puc trp
AH, se retiraron los sólidos por centrifugación y los sobrenadantes celulares se introdujeron en una columna de SSepharose (Pharmacia). La columna se lavó exhaustivamente con tampón formado por NaCl 50 mM, CHAPS 10 mM,
MES 25 mM y EDTA 1 mM, pH 5,5. La PAF-AH se eluyó mediante un aumento de la concentración de NaCl en
el tampón a 1 M. A continuación, se utilizó cromatografía de afinidad con una columna Blue Sepharose (Pharmacia)
como etapa adicional de la purificación. Antes de cargar la preparación de PAF-AH en la columna Blue Sepharose,
la muestra se diluyó 1:2 para reducir la concentración de NaCl a 0,5M y el pH se ajustó a 7,5. Después de lavar
exhaustivamente la columna Blue Sepharose con tampón formado por NaCl 0,5M, Tris 25 mM, CHAPS 10 mM y
EDTA 1 mM, pH 7,5, la PAF-AH se eluyó incrementando la concentración de NaCl a 3,0M.
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65
La pureza de la PAF-AH aislada de esta manera fue en general del 95% según la evaluación por SDS-PAGE, con
actividad en el intervalo de 5000-10.000 U/ml. Los controles adicionales de calidad realizados en cada preparación
de PAF-AH incluyeron la determinación de niveles de endotoxina y actividad hemolítica en eritrocitos de rata recién
obtenidos. Un tampón que contenía Tris 25 mM, CHAPS 10 mM, NaCl 0,5M, pH 7,5 actuó como medio de almacenamiento de la enzima, así como vehículo para la administración. Las dosificaciones utilizadas en los experimentos se
basaron en ensayos de actividad enzimática llevados a cabo inmediatamente antes de los experimentos.
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B. Inducción del edema
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En todos los ensayos se utilizaron ratas Long Evans hembras de seis a ocho semanas de edad (Charles River,
Wilmington, MA), de 180-220 gramos de peso. Antes de las manipulaciones experimentales, los animales fueron
anestesia- dos con una mezcla de los anestésicos Ketaset (Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA), Rompun (Miles,
Shawnee Mission, KS) y Ace Promazine (Aveco, Fort Dodge, IA), administrada por vía subcutánea a una dosis de
aproximadamente 2,5 mg de Jetaset, 1,6 g de Rompun, 0,2 mg de Ace Promazine por animal y dosis. El edema
se indujo en la pata mediante la administración de PAF o zimosan, de la forma siguiente. Se utilizó PAF recién
preparado (Sigma No P-1402) para cada experimento a partir de una solución madre de 19,1 mM almacenada en
clorbformo/metanol (9:1) a -20◦ C. Los volúmenes requeridos se secaron bajo N2 , se diluyeron 1:1000 en un tampón
que contenía NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,5 y BSA al 0,25%, y se sonicaron durante 5 minutos. Los animales
recibieron 50 µl de PAF (dosis final de 0,96 nmoles) por vía subcutánea entre las almohadillas de la pata trasera y el
edema se evaluó después de 1 hora y nuevamente después de 2 horas en algunos experimentos. Se preparó Zymosan A
(Sigma No. A-8800) para cada experimento en forma de una suspensión de 10 mg/ml en PBS. Los animales recibieron
50 µl de zymosan (dosis final 500 µg) por vía subcutánea entre las almohadillas de la pata trasera y el edema se evaluó
después de 2 horas.
El edema se cuantificó midiendo el volumen de la pata inmediatamente antes de la administración de PAF o
zymosan y en un momento indicado posterior a la inducción con PAF o zymosan. El edema se expresa como el
incremento del volumen de la pata en milímetros. Se realizaron mediciones de desplazamiento del volumen en los
animales anestesiados utilizando un pletismómetro (UGO Basile, modelo n◦ 7150) que mide el volumen de agua
desplazado por la pata sumergida. Con el fin de asegurar que la inmersión de la pata era comparable de un momento a
otro de medición, las patas traseras se marcaron con tinta indeleble en el punto en que la línea de pelo se une con el
talón. Las mediciones repetidas de la misma pata utilizando esta técnica indican que la precisión se encontraba dentro
del 5%.
C. Vías de Administración de PAF-AH y Dosificaciones
30
La PAF-AH se inyectó de forma local entre las almohadillas de la pata, o de forma sistemática por inyección IV en
la vena caudal. Para la administración local, las ratas recibieron 100 µl de PAF-AH (4000-6000 U/ml) administrados
por vía subcutánea entre las almohadillas de la pata trasera derecha. La pata izquierda sirvió como control mediante la
administración de 100 µl de vehículo (solución salina tamponada). Para la administración sistémica de PAF-AH, las
ratas recibieron las unidades indicadas de PAF-AH en 300 µl de vehículo, administrados por vía IV en la vena caudal.
Los controles recibieron el volumen apropiado de vehículo IV en la vena caudal.
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D. Administración local de PAF-AH
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Se inyectaron a las ratas (N=4) 100 µl de PAF-AH (4000-6000 U/ml) por vía subcutánea entre las almohadillas de
la pata derecha. En la pata izquierda se inyectaron 100 µl de vehículo (solución salina tamponada). En otras cuatro
ratas se inyectó solamente el vehículo. Todas las ratas fueron estimuladas inmediatamente con PAF a través de una
inyección subcutánea en la pata y los volúmenes de las patas se evaluaron 1 hora después de la inyección. La Figura
4, en la que el edema se expresa como un incremento medio del volumen de la pata (ml) ± SEM para cada grupo
de tratamiento, ilustra que el edema de pata inducido por PAF se bloquea por la administración local de PAF-AH. El
grupo que recibió tratamiento local de PAF-AH antes de la estimulación con PAF mostró una inflamación reducida
comparada con el grupo con inyección de control. Se observó un incremento del volumen de la pata de 0,08 ml ±
0,08 (SEM) en el grupo de PAF-AH, frente a 0,63 ± 0,14 (SEM) en los controles tratados con vehículo. El aumento
del volumen de la pata fue resultado directo de la inyección de PAF, puesto que los animales en los que se inyectó
únicamente el vehículo no exhibieron incremento alguno del volumen de la pata.
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E. Administración Intravenosa de PAF-AH
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Se pretrataron ratas (N=4 por grupo) por vía IV con PAF-AH (2000 U en 300 pl de vehículo) o vehículo solo, 15
minutos antes de la estimulación con PAF. El edema se evaluó 1 y 2 horas después de la estimulación con PAF. La
Figura 5, en la que el edema se expresa como incremento medio en volumen (ml) ± SEM para cada grupo de tratamiento, ilustra que la administración IV de PAF-AH bloqueó el edema de pata inducido por PAF tanto una como dos
horas después del estímulo. El grupo que recibió 2000 U de PAF-AH administradas por vía IV mostró una reducción
de la inflamación durante el ciclo de dos horas. El incremento medio en el grupo tratado con PAF-AH a las dos horas
fue de 0,10 ml ± 0,08 (SEM), frente a 0,56 ml ± 0,11 para los controles tratados con vehículo.
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F. Comparación de la Protección Conferida por PAF-AH en el Edema Inducido por PAF o Zymosan
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Se pretrataron ratas (N=4 por grupo) por vía IV con PAF-AH (2000 U en 300 µl de vehículo) o vehículo solo.
Quince minutos después del pretratamiento, los grupos recibieron PAF o zymosan A y se evaluó el volumen de la pata
después de 1 y 2 horas, respectivamente. Tal como se muestra en la Figura 6, en la que el edema se expresa como
incremento medio de volumen (ml) ± SEM para cada grupo de tratamiento, la administración sistémica de PAF-AH
(2000 U) fue eficaz en reducir el edema de la pata inducido por PAF, pero fracasó en el bloqueo del edema inducido
por zymosan. Se registró un incremento medio de volumen de 0,08 ± 0,02 en el grupo tratado con PAF-AH frente a
0,49 ± 0,03 para el grupo de control.
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G. Titulación Eficaz de la Dosis de la Protección de PAF-AH
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En dos experimentos separados, se pretrataron grupos de ratas (N=3 a 4 por grupo) por vía IV con diluciones
seriadas de PAF-AH o vehículo de control en un volumen de 300 µl, 15 minutos antes de la estimulación con PAF.
Ambas patas fueron estimuladas con PAF (como se ha descrito anteriormente) y el edema se evaluó después de 1 hora.
La Figura 7, en la que el edema se expresa como el incremento medio en volumen (ml) ± SEM para cada grupo de
tratamiento, ilustra el aumento de protección contra el edema inducido por PAF en ratas inyectadas con dosis crecientes
de PAF-AH. En los experimentos, la DI50 de PAF-AH administrada por vía IV resultó ser de entre 40 y 80 U por rata.
H. Eficacia In vivo de PAF-AH como Función del Tiempo Tras la Administración
En dos experimentos separados, se pretrataron dos grupos de ratas (N=3 a 4 por grupo) por vía IV con PAF-AH
(2000 U en 300 µl de vehículo) o vehículo solo. Tras la administración, los grupos recibieron PAF en puntos de tiempo
que oscilaban desde 15 minutos hasta 47 horas después de la administración de PAF-AH. A continuación, se evaluó el
edema 1 hora después de la estimulación con PAF. Tal como se muestra en la Figura 8, en la que el edema se expresa
como el incremento medio en volumen (ml) ± SEM para cada grupo de tratamiento, la administración de 2000 U de
PAF-AH protege a las ratas contra el edema inducido por PAF durante al menos 24 horas.
I. Farmacocinética de PAF-AH
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Cuatro ratas recibieron 2000 U de PAF-AH por inyección IV en 300 µl de volumen. Se recogió el plasma en
diversos momentos y se almacenó a 4◦ C, determinándose las concentraciones de PAF-AH por ELISA, utilizando un
ensayo de captura de doble mAb. En resumen, el anticuerpo monoclonal 90G11D (Ejemplo 13) se diluyó en tampón
carbonato 50 mM a pH 9,6 a 100 ng/ml y se inmovilizó sobre placas ELISA Immulon 4 durante una noche a 4◦ C.
Después de un lavado exhaustivo con PBS que contenía Tween 20 al 0,05%, las placas se bloquearon durante una
hora a temperatura ambiente con 0,5% de gelatina de piel de pescado (Sigma) diluida en PBS. Las muestras de suero,
diluidas en PBS con CHAPS 15 mM se añadieron por duplicado a la placa lavada de ELISA y se incubaron durante 1
hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió un conjugado de biotina de anticuerpo monoclonal 90F2D
(Ejemplo 13) a los pocillos a una concentración de 5 µg/ml diluido en PBS y se incubó durante 1 hora a temperatura
ambiente. Después del lavado, se añadieron 50 µl de una dilución 1:1000 de ExtraAvidin (Sigma) a los pocillos y se
incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, los pocillos se revelaron utilizando OPD como
sustrato y se cuantificaron. Después se calculó la actividad enzimática se calculó de una curva patrón. La Figura 9,
en la que los puntos de datos representan medias ± SEM, demuestra que los niveles en plasma al cabo de una hora
se aproximaron a la concentración prevista basada en el volumen de plasma de 5-6 ml para ratas de 180-200 gramos,
media = 374 U/ml ± 58,2. Después de una hora, los niveles en plasma disminuyeron de manera constante, alcanzando
una concentración media en plasma de 19,3 U/ml ± 3,4 a las 24 horas, que sigue siendo considerablemente superior
a los niveles endógenos de PAF-AH en la rata, que son de aproximadamente 4 U/ml según se determina por ensayos
enzimáticos.
J. Eficacia de PAF-AH frente a los Antagonistas de PAF
Se pretrataron grupos de ratas (N=4 por grupo) con uno de los tres antiinflamatorios potenciales: el antagonista de
PAF CV3988 (Biomol n◦ L-103), administrado por vía IP (2 mg en 200 µl de EtOH), el antagonista de PAF Alprazolam
(Sigma n◦ A-8800), administrado por vía IP (2 mg en 200 µl de EtOH), o PAF-AH (2000 U), administrada por vía IV.
Las ratas de control recibieron inyecciones de 300 µl de volumen de vehículo por vía IV. Los antagonistas del PAF
se administraron por vía IP porque estaban solubilizados en etanol. Las ratas inyectadas con CV3988 o Alprazolam
fueron estimuladas con PAF 30 minutos después de la administración de los antagonistas del PAF, para permitir que
éstos penetraran en la circulación, en tanto que las ratas tratadas con PAF-AH y el vehículo recibieron el estímulo de
PAF 15 minutos después de la administración de la enzima. Las ratas que recibieron la inyección de enzima PAF-AH
exhibieron una reducción del edema inducido por PAF mayor que la conferida por los antagonistas establecidos del
PAF CV3988 y Alprazolam. Véase la Figura 10, en la que el edema se expresa como el incremento medio de volumen
(ml) ± SEM para cada grupo de tratamiento.
En resumen, la PAF-AH es eficaz para bloquear el edema mediado por el PAF in vivo. La administración de PAFAH puede ser local o sistémica por inyección IV. En estudios de dosificación, las inyecciones IV en el intervalo de 1602000 U/rata demostraron reducir de forma llamativa la inflamación mediada por PAF, mientras que la dosificación de
DI50 parece estar en el intervalo de 40-80 U/rata. Los cálculos basados en el volumen en plasma para ratas de 180-200
gramos predicen que una concentración plasmática en el intervalo de 25-40 U/ml debería bloquear el edema inducido
por PAF. Estas predicciones vienen confirmadas por estudios farmacocinéticos preliminares. Se ha demostrado que una
dosificación de 2000 U de PAF-AH es eficaz en bloquear el edema mediado por PAF durante un mínimo de 24 horas.
A las 24 horas después de la administración de PAF-AH, las concentraciones en plasma de la enzima demostraron ser
de aproximadamente 25 U/ml. Se ha observado que la PAF-AH bloquea el edema inducido por PAF de forma más
eficaz que los dos antagonistas de PAF ensayados.
En su conjunto, estos resultados demuestran que la PAF-AH bloquea eficazmente la inflamación inducida por PAF,
pudiendo ser de valor terapéutico en enfermedades en las que el PAF es el principal mediador.
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Ejemplo 15
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15
Se ensayó la PAF-AH recombinante de la invención en un segundo modelo in vivo, la pleuresía inducida por PAF.
Se había demostrado anteriormente que el PAF producía filtración vascular cuando se introducía en el espacio pleural
[Henriques y colaboradores, más arriba]. En la vena caudal de ratas hembras (Charles River, 180-200 g) se inyectaron
200 µl de colorante azul de Evans al 1% en 0,9% con 300 µl de PAF-AH recombinante (1500 µmol/ml/hora, preparada
como se ha descrito en el Ejemplo 14), o con un volumen equivalente de tampón de control. Quince minutos más
tarde, las ratas recibieron una inyección de 100 µl de PAF (2,0 nmol) en el espacio pleural. Una hora después del
estímulo con PAF, las ratas fueron sacrificadas y se recogió el fluido pleural lavando la cavidad con 3 ml de solución
salina de tampón fosfato heparinizada. Se determinó el grado de filtración vascular por la cantidad de colorante azul
de Evans presente en el espacio pleural, que se cuantificó por absorbancia a 620 nm. Las ratas pretratadas con PAFAH demostraron tener una filtración vascular muy inferior a la de los animales de control (representando más de un
80% de reducción de la inflamación).
Los anteriores resultados avalan el tratamiento de sujetos que sufren pleuresía con la enzima PAF-AH recombinante
de la invención.
Ejemplo 16
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40
La eficacia de la enzima PAF-AH recombinante de la invención también se analizó en un modelo de acumulación
de eosinófilos inducida por antígenos. La acumulación de eosinófilos en lás vías respiratorias es característica de las
respuestas inmunes de fase tardía que se producen en el asma, la rinitis y el eccema. Se sensibilizaron ratones BALB/c
(Charles River) mediante dos inyecciones intraperitoneales consistentes en 1 µg de ovalbúmina (OVA) en 4 mg de
hidróxido de aluminio (Imject alum, Pierce Laboratories, Rockford, IL), administradas en un intervalo de 2 semanas.
Catorce días después de la segunda inmunización, los ratones sensibilizados fueron estimulados con OVA en aerosol
o con solución salina como control.
Antes de la estimulación, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos, con cuatro ratones/grupo.
Los ratones de los grupos 1 y 3 fueron pretratados con 140 de tampón de control, formado por Tris 25 mM, NaCl 0,5M,
EDTA 1 mM y Tween 80 al 0,1%, administrado por inyección intravenosa. Los ratones de los grupos 2 y 4 fueron
pretratados con 750 unidades de PAF-AH (actividad de 5.500 unidades/mi, administrada en 140 µl de tampón PAFAH). Treinta minutos después de la administración de PAF-AH o tampón, los ratones de los grupos 1 y 2 fueron
expuestos a PBS en aerosol, según se describe más adelante, mientras que los ratones1de los grupos 3 y 4 se expusieron a OVA en aerosol. Veinticuatro horas más tarde, los ratones fueron tratados por segunda vez con 140 µl de
tampón (grupos 1 y 3) o 750 unidades de PAF-AH en 140 µl de tampón (grupos 2 y 4), administrados por inyección
intravenosa.
La infiltración de eosinófilos de la tráquea se indujo en los ratones sensibilizados exponiendo a los animales a
OVA en aerosol. Los ratones sensibilizados se situaron en tubos de centrifugación cónicos de 50 ml (Corning) y se
les forzó a respirar OVA en aerosol (50 mg/mi) disuelta en solución salina al 0,9% durante 20 minutos, utilizando un
nebulizador (Modelo 646, DeVilbiss Corp., Sormerset, PA). Los ratones de control fueron tratados de forma similar,
excepto que en él nebulizador se utilizó solución salina al 0,9%. Cuarenta y ocho horas después de la exposición a
OVA o solución salina en aerosol, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron las tráqueas. Las tráqueas de cada
grupo se incluyeron en OCT y se almacenaron a -70◦ C hasta que se cortaron las secciones.
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Para evaluar la infiltración de eosinófilos en la tráquea, se tiñeron secciones de tejido de los cuatro grupos de
ratones con solución Luna y solución de hematoxilinaeosina o con peroxidasa. Se cortaron doce secciones de 6 µm
de espesor de cada grupo de ratones, numerándolas en consecuencia. Las secciones de número impar se tiñeron con
tinción Luna de la forma siguiente. Los cortes se fijaron en formal-alcohol durante 5 minutos a temperatura ambiente,
se lavaron tres veces con agua del grifo durante 2 minutos a temperatura ambiente y se volvieron a lavar con dos
cambios de H2 O destilada durante 1 minuto a temperatura ambiente. Los cortes de tejido se tiñeron con tinción Luna
5 minutos a temperatura ambiente (la tinción Luna está formada por 90 ml de hematoxilina de hierro de Weigert y 10
ml de Escarlata de Biebrich al 1%). Las secciones teñidas se sumergieron en alcohol ácido al 1% seis veces, se lavaron
con agua del grifo durante 1 minuto a temperatura ambiente, se sumergieron en solución de carbonato de litio al 0,5%
cinco veces y se lavaron con agua corriente durante 2 minutos a temperatura ambiente. Los cortes se deshidrataron
con etanol al 70%-95%-100% durante 1 minuto en cada uno, a temperatura ambiente y se enjuagaron a continuación
en dos cambios de xileno durante 1 minuto a temperatura ambiente y se montaron en Cytoseal 60.
Para la tinción de peroxidasa, los cortes con números pares se fijaron en acetona a 4◦ C durante 10 minutos y se
dejaron secar al aire. Se añadieron 200 µl de solución de DAB a cada corte y se dejó reposar durante 5 minutos a
temperatura ambiente. Las secciones se lavaron con agua del grifo durante 5 minutos a temperatura ambiente y se
aplicaron 2 gotas de ácido ósmico al 1% a cada sección durante 3-5 segundos. Las secciones se lavaron con agua
corriente durante 5 minutos a temperatura ambiente y se tiñeron con hematoxilina de Mayers como colorante de
contraste a 25◦ C a temperatura ambiente. A continuación, los cortes se lavaron con agua corriente durante 5 minutos
y se deshidrataron a través de etanol al 70%-95%-100% 1 minuto en cada uno a temperatura ambiente. Las secciones
se enjuagaron a través de dos cambios de xileno durante 1 minuto cada uno a temperatura ambiente y se montaron en
Cytoseal 60.
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5
10
Se evaluó el número de eosinófilos en el tejido submucoso de la tráquea. Se observó que las tráqueas de los ratones
de los grupos 1 y 2 tenían escasos eosinófilos dispersos a travésldel tejido submucoso. Tal como se esperaba, las
tráqueas de los ratones del grupo 3, que fueron pretratados con tampón y expuestos a OVA nebulizada, mostraron
tener grandes cantidades de eosinófilos en el tejido submucoso. Por el contrario, las tráqueas de los ratones del grupo
4, pretratados con PAF-AH y expuestos a OVA nebulizada, tenían muy pocos eosinófilos en el tejido submucoso,
comparable al registrado en los dos grupos de control, es decir, los grupos 1 y 2.
Por consiguiente, está indicado el tratamiento terapéutico con PAF-AH de pacientes con respuestas inmunes de
fase tardía que comprenden la acumulación de eosinófilos en las vías respiratorias, tal como ocurre en el asma, la
rinitis y el eccema.
Ejemplo 17
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50
Aproximadamente un cuatro por ciento de la población japonesa presenta niveles bajos o indetectables de actividad
PAF-AH en su plasma. Este déficit se ha correlacionado con graves síntomas respiratorios en niños asmáticos [Miwa
y colaboradores, J. Clin. Invest., 82: 1983-1991 (1988)], que parecen haber heredado el déficit de manera autosómica
recesiva.
Para determinar si el déficit es consecuencia de una enzima inactiva pero presente, o de una incapacidad para
sintetizar PAF-AH, se analizó plasma de múltiples pacientes con déficit de actividad PAF-AH tanto con respecto a la actividad PAF-AH (por el método descrito en el Ejemplo 10 para transfectantes) como con respecto a la
presencia de PAF-AH utilizando los anticuerpos monoclonales 90G11D y 90F2D (Ejemplo 13) en un ELISA de
sandwich de la forma siguiente. Se recubrieron placas Immulon 4 de fondo plano (Dynatech, Chantilly, VA) con
100 ng/pocillo de anticuerpo monoclonal 90G11D y se almacenaron durante una noche. Las placas se bloquearon
durante 1 hora a temperatura ambiente con gelatina de piel de pescado al 0,5% (Sigma) diluida en CMF-PBS y a
continuación se lavaron tres veces. El plasma del paciente se diluyó en PBS que contenía CHAPS 15 mM y se añadió a cada pocillo de las placas (50 µl/pocillo). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y
se lavaron cuatro veces. Se añadieron 50 µl de 5 µg/ml de anticuerpo monoclonal 90F2D, biotinilado por métodos
convencionales y diluido en PBST, a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente
y a continuación se lavaron tres veces. Seguidamente, se añadieron 50 µl de ExtraAvidin (Sigma) diluidos 1/1000
en CMF-PBST a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de su revelado.
Se observó una correlación directa entre la actividad PAF-AH y los niveles de enzima. La ausencia de actividad en
el suero de un paciente se reflejó en la ausencia de enzima detectable. De igual forma, las muestras de plasma con la
mitad de la actividad normal contenían la mitad de los niveles normales de PAF-AH. Estas observaciones sugirieron
que el déficit de actividad PAF-AH se debía a una incapacidad para sintetizar la enzima o era debida a una enzima
inactiva que no reconocían los anticuerpos monoclonales.
Otros experimentos revelaron que el déficit se debía a una lesión genética en el gen de la PAF-AH de plasma
humano. Se aisló ADN genómico de individuos con déficit de PAF-AH, utilizándolo como molde para reacciones
PCR con cebadores específicos del gen de la PAF-AH. Inicialmente se amplificó y se secuenció cada uno de los
exones de la secuencia codificante de un individuo. Se observó un único cambio de nucleótido dentro del exón 9 (un
cambio de G a T en la posición 996 de la SEC ID n◦ 7). El cambio de nucleótido da como resultado una sustitución
de aminoácido de valina por una fenilalanina en la posición 279 de la secuencia de PAF-AH (V279F). El exón 9 se
amplificó a partir de ADN genómico de once pacientes adicionales con déficit de PAF-AH, que presentaron la misma
mutación puntual.
Para analizar si esta mutación invalidaba la enzima, se generó una construcción de expresión de E. coli que contenía
la mutación, mediante métodos similares a los descritos en el Ejemplo 10. Al introducirla en E. coli, la construcción
de expresión no generó actividad PAF-AH, mientras que una construcción de control, exenta de la mutación, fue
totalmente activa. Esta sustitución de aminoácido da presuntamente como resultado una modificación estructural que
determina el déficit observado de actividad y la falta de inmunorreactividad con los anticuerpos contra PAF-AH de la
invención.
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Por consiguiente, se pueden utilizar anticuerpos específicos contra la PAF-AH de la invención en métodos de
diagnóstico para detectar niveles anormales de PAF-AH en suero (los niveles normales son de alrededor de 1 a 5
U/ml) y para realizar un seguimiento de la evolución del tratamiento de estados patológicos con PAF-AH. Es más, la
identificación de una lesión genética en el gen de PAF-AH permite la investigación genética del déficit de PAF-AH
exhibido por los pacientes japoneses. La mutación provoca la obtención de un sitio de endonucleasa de restricción
(Mae II) que permite así el análisis a través del método sencillo de Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de
Restricción (RFLP) para diferenciar entre alelos activos y mutantes. Véase Lenin, pág. 136-141 en Genes V, Oxford
University Press, Nueva York, Nueva York (1994).
La investigación del ADN genómico de doce pacientes con déficit de PAF-AH se llevó a cabo por digestión del
ADN con Mae II, transferencia de Southern e hibridación con una sonda del exón 9 (nucleótidos 1-396 de la SEC ID
NO: 17). Se encontró que todos los pacientes tenían RPLP coherentes con el alelo mutante.
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ES 2 258 955 T3
Otras características de la invención son las indicadas a continuación:
5
1. Método para el tratamiento de un mamífero susceptible de padecer o que padece una afección patológica mediada
por PAF, que comprende la administración de PAF-AH a dicho mamífero en una cantidad suficiente para suplementar
la actividad PAF-AH endógena e inactivar cantidades patológicas de PAF en dicho mamífero.
2. Método para el tratamiento de un mamífero susceptible de padecer o que padece pleuresía, que comprende
la administración de PAF-AH a dicho mamífero en una cantidad suficiente para suplementar la actividad PAF-AH
endógena e inactivar cantidades patológicas de PAF en dicho mamífero.
10
3. Método para el tratamiento de un mamífero susceptible de padecer o que padece asma, que comprende la administración de PAF-AH a dicho mamífero en una cantidad suficiente para suplementar la actividad PAF-AH endógena
e inactivar cantidades patológicas de PAF en dicho mamífero.
15
20
4. Método para el tratamiento de un mamífero susceptible de padecer o que padece rinitis, que comprende la administración de PAF-AH a dicho mamífero en una cantidad suficiente para suplementar la actividad PAF-AH endógena
e inactivar cantidades patológicas de PAF en dicho mamífero.
5. Método para el tratamiento de un mamífero susceptible de padecer o que padece eccema, que comprende la administración de PAF-AH a dicho mamífero en una cantidad suficiente para suplementar la actividad PAF-AH endógena
e inactivar cantidades patológicas de PAF en dicho mamífero.
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REIVINDICACIONES
5
1. Una composición terapéutica que comprende un polipéptido PAF-AH y un diluyente o vehículo fisiológicamente
aceptable y, opcionalmente, otro agente anti-inflamatorio, donde el polipéptido PAF-AH es:
(i) un polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por la secuencia de aminoácidos de
PAF-AH de plasma humano representada en SEC ID NO: 8; o
10
(ii) la variante de un polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por los aminoácidos 42
a 441 de SEC ID NO: 8, donde la variante es una variante de sustitución de aminoácidos que tiene una sustitución de
aminoácido en la secuencia de SEC ID NO: 8 elegida entre:
(a) S108A
15
(b) D338A
(c) H395A
20
(d) H399A
(e) C67S
(f) C334S; o
25
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35
(g) C407S
2. Polipéptido PAF-AH que se utiliza para mejorar estados inflamatorios patológicos o para tratar la pleuresía, el
asma, la rinitis, el eccema, la septicemia o el parto prematuro en un mamífero, especialmente para el tratamiento de un
mamífero susceptible de padecer o que padece una afección patológica mediada por PAF, mediante la administración
de dicho polipéptido PAF-AH a dicho mamífero en una cantidad suficiente para suplementar la actividad PAF-AH
endógena e inactivar cantidades patológicas de PAF en dicho mamífero, donde el polipéptido PAF-AH es:
(i) un polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por la secuencia de aminoácidos de
PAF-AH de plasma humano representada en SEC ID NO: 8; o
(ii) la variante de un polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por los aminoácidos 42
a 441 de SEC ID NO: 8, donde la variante es una variante de sustitución de aminoácidos que tiene una sustitución de
aminoácido en la secuencia de SEC ID NO: 8 elegida entre:
40
(a) S108A
(b) D338A
45
(c) H395A
(d) H399A
(e) C67S
50
(f) C334S; o
(g) C407S
55
60
3. Polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por los aminoácidos 42 a 441 de SEC ID
NO: 8, que se utiliza en el tratamiento de la septicemia o el parto prematuro.
4. Utilización de un polipéptido PAF-AH para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero susceptible de padecer o que padece una afección patológica mediada por PAF, mediante la administración de dicho
polipéptido PAF-AH a dicho mamífero en una cantidad suficiente para suplementar la actividad PAF-AH endógena e
inactivar cantidades patológicas de PAF en dicho mamífero, donde el polipéptido PAF-AH es:
(i) un polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por la secuencia de aminoácidos de
PAF-AH de plasma humano representada en SEC ID NO: 8; o
65
(ii) la variante de un polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por los aminoácidos 42
a 441 de SEC ID NO: 8, donde la variante es una variante de sustitución de aminoácidos que tiene una sustitución de
aminoácido en la secuencia de SEC ID NO: 8 elegida entre:
25
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(a) S108A
(b) D338A
5
(c) H395A
(d) H399A
(e) C67S
10
(f) C334S; o
(g) C407S
15
5. Utilización de un polipéptido PAF-AH para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la pleuresía,
el asma, la rinitis, el eccema, la septicemia o el parto prematuro en un mamífero, donde el polipéptido PAF-AH es:
(i) un polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por la secuencia de aminoácidos de
PAF-AH de plasma humano representada en SEC ID NO: 8; o
20
(ii) la variante de un polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por los aminoácidos 42
a 441 de SEC ID NO: 8, donde la variante es una variante de sustitución de aminoácidos que tiene una sustitución de
aminoácido en la secuencia de SEC ID NO: 8 elegida entre:
25
(a) S108A
(b) D338A
(c) H395A
30
(d) H399A
(e) C67S
35
(f) C334S; o
(g) C407S
40
6. Utilización de un polipéptido PAF-AH, purificado y aislado, constituido esencialmente por los aminoácidos 42 a
441 de SEC ID NO: 8 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la septicemia o el parto prematuro
en un mamífero.
7. Utilización según la reivindicación 5 o 6, donde el citado polipéptido PAF-AH es una cantidad suficiente para
suplementar la actividad PAF-AH endógena e inactivar cantidades patológicas de PAF en dicho mamífero.
45
8. Método para realizar la exploración genética tendente a descubrir la presencia o ausencia de una lesión genética
en un gen de PAF-AH de plasma humano de la muestra de un sujeto, que comprende las siguientes etapas:
(a) aislar por lo menos parte del ADN del gen de PAF-AH de plasma humano de dicha muestra de sujeto; y
50
(b) comparar el ADN de (a) con el ADN de SEC ID NO; 7, donde toda diferencia indica la presencia de una lesión
genética en al ADN de la muestra del sujeto.
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LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
5
(i) SOLICITANTE: ICOS Corporation
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 26
10
(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
(A) DESTINATARIO: Forrester & Böhmert
(B) CALLE: Franz-Joseph Strasse 38
15
(C) CIUDAD: D - 80801 Munich
(D) PAIS: Alemania
(v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
20
(A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release 1.0, Versión N◦ 1.25
25
(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
(A) NÚMERO DE SOLICITUD:
(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 octubre 1994
30
(C) CLASIFICACIÓN:
(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/113.803
35
(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-OCT-1993
(viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
(A) NOMBRE: Richardson, Kate
40
(B) NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: FB5444A
(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
(A) TELÉFONO: 089 384 07 20
45
(B) TELEFAX: 089 34 70 10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
50
(A) LONGITUD: 17 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
55
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
60
65
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala
1
5
10
15
Phe
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
1
ES 2 258 955 T3
(A) LONGITUD: 16 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
5
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
10
Ile Gln Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Lys Ile Pro
1
5
10
15
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:
15
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 11 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
20
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
25
Met Lys Pro Leu Val Val Phe Val Leu Gly Gly
1
5
10
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:
30
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 32 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
35
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN
40
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: Sitio-modificado
(B) LOCALIZACIÓN: grupo (13, 21, 27)
45
(C) OTRA INFORMACIÓN: /nota = “el nucleótido en cada una de estas posiciones es una inosina.”
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
ACATGAATTC GGNATCYTTG NGTYTGNCCR AA
32
50
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
55
(A) LONGITUD: 30 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
60
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
65
TATTTCTAGA AGTGTGGTGG AACTCGCTGG
2
30
ES 2 258 955 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 32 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
15
CGATGAATTC AGCTTGCAGC AGCCATCAGT AC
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7:
20
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1520 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
25
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(ix) CARACTERÍSTICAS:
30
(A) NOMBRE/CLAVE: CDSLOCALIZACIÓN: 162..1484
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
35
40
45
50
55
60
65
3
32
ES 2 258 955 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
4
ES 2 258 955 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8:
65
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 441 aminoácidos
5
ES 2 258 955 T3
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
5
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
6
ES 2 258 955 T3
5
10
15
20
25
30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9:
35
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 504 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
40
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
45
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
(B) LOCALIZACIÓN: 185..311
50
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
55
60
65
7
ES 2 258 955 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 417 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
15
(B) LOCALIZACIÓN: 145..287
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
20
25
30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11:
35
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 498 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
40
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
45
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
(B) LOCALIZACIÓN: 251..372
50
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
55
60
65
8
ES 2 258 955 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 433 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
15
(B) LOCALIZACIÓN: 130..274
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
20
25
30
35
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 486 pares de bases
40
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
45
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
50
(B) LOCALIZACIÓN: 164..257
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
55
60
65
9
ES 2 258 955 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 14:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 363 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
15
(B) LOCALIZACIÓN: 113..181
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
20
25
30
35
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 15:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 441 pares de bases
40
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
45
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
50
(B) LOCALIZACIÓN: 68..191
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
55
60
65
10
ES 2 258 955 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 16:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 577 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
15
(B) LOCALIZACIÓN: 245..358
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
20
25
30
35
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 17:
40
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 396 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
45
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
50
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
(B) LOCALIZACIÓN: 108..199
55
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
60
65
11
ES 2 258 955 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 18:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 519 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
15
(B) LOCALIZACIÓN: 181..351
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
20
25
30
35
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 19:
40
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 569 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
45
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
50
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
(B) LOCALIZACIÓN: 156..304
55
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
60
65
12
ES 2 258 955 T3
5
10
15
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 20:
20
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 469 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
25
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
30
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: exon
(B) LOCALIZACIÓN: 137..253
35
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
40
45
50
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 21:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
55
(A) LONGITUD: 1494 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
60
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(ix) CARACTERÍSTICAS:
65
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
(B) LOCALIZACIÓN: 117..1436
13
ES 2 258 955 T3
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
14
ES 2 258 955 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 22:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
55
(A) LONGITUD: 2191 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
60
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(ix) CARACTERÍSTICAS:
65
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
(B) LOCALIZACIÓN: 92..1423
15
ES 2 258 955 T3
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
16
ES 2 258 955 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
17
ES 2 258 955 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 23:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 517 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
15
(B) LOCALIZACIÓN: 2..514
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 24:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
65
(A) LONGITUD: 580 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
18
ES 2 258 955 T3
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
5
(ix) CARACTERÍSTICAS:
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
(B) LOCALIZACIÓN: 1..580
10
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24:
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 25:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
60
(A) LONGITUD: 41 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
65
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN
19
ES 2 258 955 T3
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:
TATTCTAGAA TTATGATACA AGTATTAATG GCTGCTGCAA G
5
41
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 26:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
10
(A) LONGITUD: 32 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
15
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:
20
ATTGATATCC TAATTGTATT TCTCTATTCC TG
25
30
35
40
45
50
55
60
65
20
32