Modelos Celulares
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Modelos Celulares para Estudios de Toxicidad y Metabolismo de Xenobióticos Xenobióticos Xenobióticos 1 TOXINAS Intrínsecas Efecto en todos los individuos expuestos Efecto dosis-dependiente Efecto predecible en animales Idiosincrásicas Efecto solo en algunos individuos No dosis-dependiente:hipersensibilidad Dosis-dependiente: idiosincrasia metabólica Polimorfismo genético Inducción de los CYPs Efecto No predecible en animales Clasificación mecanística de las TOXINAS Activas Son tóxicas per se y no requieren ser biotransformadas para ejercer su efecto tóxico. Efecto dosis-dependiente en los individuos expuestos Latentes Requieren ser biotransformadas para ejercer su efecto tóxico. 2 XENOBIOTICO Metabolito estable BIOTRANSFORMACION Reacciones Fase II Estrés oxidativo Generación de ROS Reacciones Fase I Metabolito reactivo Peroxidación lipídica Alteración de la homeostasis del Ca2+ Deplección de GSH Unión covalente ATP Inactivación de biomoléculas Detoxificación Alteraciones metabólicas ELIMINACION APOPTOSIS NECROSIS RESPUESTA INMUNE "... un determinado experimento no se realizará realizará en animales, si existe otro mé método disponible que sea razonable, realizable y cientí científicamente satisfactorio para obtener los mismos resultados y que no requiera el uso de animales...” animales...” “.... se utilizará utilizará el mínimo nú número de animales y aquel procedimiento que produzca el mí mínimo y menos prolongado dolor y sufrimiento...” ...” Parlamento Europeo (Directiva 86/609/CEE) 3 Ventajas de los Modelo In Vitro Ø Se evitan interferencias de la respuesta del organismo Ø Versatilidad en el diseño experimental Ø Ahorro de tiempo y coste económico Ø Posibilidad de automatización, robotización, miniaturización Ø Necesidad de poca cantidad de producto en estudio Ø Se puede utilizar material biológico humano Ø Reducción del número de animales Inconvenientes de los Modelo In Vitro Ø Simplicidad: Información a veces parcial Ø Dificultad de interpretación de los resultados Ø Dificultad para extrapolar al hombre Ø No sustituyen del todo los ensayos in vivo Ø No se pueden detectar efectos secundarios Ø Necesidad de validación formal Ø Todavía no están aceptados legalmente, ni incorporados en los protocolos oficiales para el registro de nuevos fármacos 4 2-3 g de tejido 25 x 106 células 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A A B C B D 35 C E D G F H 190 1.000 Evaluación del riesgo de toxicidad Î Productos que se desarrollan para el uso o consumo humano (aditivos alimentarios, cosméticos, medicamentos, biomateriales, etc.) Î Clasificación y etiquetaje de productos químicos (disolventes,detergentes, etc) Î Medioambiente: Ecotoxicología (plaguicidas, metales pesados, etc) 5 Estudios de toxicidad Xenobióticos Xenobióticos Medicamentos Fases en el desarrollo de un nuevo medicamento Fase Preclínica •Fase Química •Fase biológica en animales • Metabolismo • Toxicología • Farmacocinética Molecula candidata • Actividad farmacológica SEGURIDAD Balance BENEFICIO Terapeú Terapeútico entre RIESGO Tóxico Fase Clínica Fase I: Voluntarios Fase II: Ensayo clí clínico Fase III: Estudios multicé multicéntricos Fase IV: Registro y comercializació comercialización 6 Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Elección de un modelo biológico adecuado Evaluación de los parámetros adecuados para estudiar los efectos tóxicos Correcta interpretación de los resultados: Valor predictivo del modelo y extrapolación in vitro - in vivo Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Organismo entero Perfusión de órganos Cultivo de órganos/slices Cultivos primarios Líneas celulares Homogenados de tejidos Fracciones subcelulares Enzimas purificados Relevancia Complejidad Elección de un modelo biológico adecuado 7 Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Elección de un modelo biológico: Cultivos celulares Cultivos Primarios Líneas celulares Líneas celulares manipuladas geneticamente Co-cultivos Cultivos organotípicos Cultivos Primarios Aquellos formados por células derivadas directamente del tejido u órgano donante. Pueden ser proliferantes (fibroblastos, etc) o no proliferantes (hepatocitos) A B C D 8 Cultivos de Células de Sistema Nervioso Humano para Estudios de Fármaco-Toxicología Neuronas Astrocitos Oligodendrocitos Cél. de Schwann Microglí Microglía Cél.Cromafines 9 Líneas Celulares Contínuas Caracterí Características: Células inmortales Transformadas mediante virus, etc o de origen tumoral Heteroploides Estabilidad fenotípica Ventajas: Manejo fácil Comercializadas en las colecciones de células (ECACC, ATCC) Inconvenientes: Pérdida de funciones diferenciadas Células manipuladas genéticamente Expresión de un gen de interés É Integració Integración en el genoma de un gen de interé interés mediante retrovirus Inmortalización de los hepatocitos Expresión de isoenzimas del citocromo P450 (CYP) Expresión de otros genes de interés É Expresió Expresión transitoria de un gen de interé interés mediante adenovirus 10 Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Evaluación de los parámetros adecuados para estudiar los efectos tóxicos Estudios de citotoxicidad general: general Efectos sobre funciones vitales de la células. Toxicidad órganorgano-especí específica: Efectos sobre funciones diferenciadas de las células del órgano diana. Mecanismos moleculares de toxicidad Fármacos Xenobióticos 24-72 h HEPATOCITOS EN CULTIVO VIABILIDAD FUNCIONES BIOQUÍMICAS 11 Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Estudios de citotoxicidad general: general Alteraciones de las funciones vitales de la células. Criterios: Criterios Ensayos de viabilidad celular (MTT, RN, LDH, GOT, GPT, ATP, etc) Modelos: Lineas celulares y cultivos primarios Objetivo: Determinar la máxima concentración no tóxica A 100 75 50 25 IC10 IC50 0 100 250 500 1000 Concentration (µM) -log(Viability) (% of control) Viability (% of control) (MCNT), y las IC10 e IC50 6 B 4 2 0 -2 -4 IC50 IC10 -3 -2 -6 -4 -1 logit(Concentration) (µM) 12 Los IC’s, parámetros de comparación relativa 110 100 100 % viable % del Control 90 80 70 60 < 5 % viable 50 40 30 20 10 IC10 IC50 0 Concentración 13 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 o. origen=.3060 pendiente=.9320 r ²=.7434 log(Human lethal concentration) log(Human lethal concentration) Relación entre la toxicidad in vitro y la in vivo 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 o. origen=.4523 pendiente=.8848 r ²=.7745 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 log (Rat Hepatocytes IC50) log (HepG2 IC50) Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Estudios de toxicidad órgano-específica: fica Alteraciones de funciones diferenciadas del órgano diana a concentraciones que no comprometen la viabilidad celular. Criterios: Criterios Evaluación de funciones diferenciadas a concentraciones sub-citotóxicas (⊆MCNT o IC10) Modelos: Cultivos primarios Objetivo: Determinar efecto tóxico y mecanismo de toxicidad 14 Tipos celulares Hígado Sistema nervioso Musculo liso y estriado Células de la piel Riñón Páncreas Pulmón Células oculares Células vasculares Células óseas Células sanguíneas Intestino Otros tejidos Estudios sobre los tejidos/órganos diana Biotransformación. Efectos beneficiosos o tóxicos a nivel celular o molecular sobre funciones celulares específicas. Biocompatibilidad. Irritación/corrosividad. Acción farmacológica. Carcinogénesis/mutagénesis. Cultivo de células de diferentes tejidos humanas y de especies animales Modelos celulares de origen humano Estudios In Vitro predictivo para el hombre Los modelos celulares de origen humano están llamados a desempeñar un papel puente entre los ensayos preclínicos en animales y los ensayos clínicos en el ser humano 15 Cultivo de Células Humanas Experimentación Animal Ayuda para la selección de la especie animal más adecuada para los estudios pre-clínicos In Vitro In vivo Estudios pre-clínicos a nivel fisiológico que requieren el organismo entero. Permite obtener resultados a nivel bioquímico, metabólico y funcional muy predictivos para el hombre. In vivo Ensayos Clínicos Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Correcta interpretació interpretación de los resultados: Valor predictivo del modelomodelo-Riesgo de toxicidad Relevancia del efecto observado Reversibilidad del efecto tóxico observado Diferencia de sensibilidad interespecies Aspectos farmacociné farmacocinéticos del compuesto Diferencias en el metabolismo interespecies 16 RIESGO DE TOXICIDAD RT =Concentración Plasmática /IC50 Pico en plasma tras administración terapéutica RIESGO DE TOXICIDAD RT =Con. Plasmática/IC50 Viabilidad Buprenorfina Conc. Plasmática (mM) LDH (IC50) RT 0.7-1.7 x 10-5 0.1 0.7-1.7 x 10-4 Morfina 3 x 10-4 Heroína 6 x 10-2 --3x Metadona 4.5 6.6 x 10-5 3.1 1.3 x 10-2 --- 10-3 9.7 x 2 x 10-3 5 x 10-2 3.9 1 x 10-4 0.65 4 x 10-3 Sínt. Albúmina (IC50) 2.1 x 10-2 3.3-8.1 x 10-3 10-1 3.9 x 10-4 9.6 x 10-1 7.8 x 10-2 --- 7.7 x 3.1 x 10-3 10-4 5.1 x 10-4 1.3 x 10-2 3.1 x 10-1 1.5 x 10-4 5.6 x 10-3 6.2 x 10-3 RT --- --- --- Meperidina Funcionalidad 6.5 x 10-3 1.6 x 10-1 1.8 x 10-2 7.1 x 10-1 17 ESTUDIOS DE REVERSIBILIDAD IN VITRO Estudio de la hepatotoxicidad in vitro 3) Extrapolación In vitro-In vivo / Evaluacion del riesgo Ø Relevancia de la función metabólica alterada Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Reversibilidad del efecto Mecanismos de toxicidad implicados Interacción con otros fármacos Identificación de los CYPs implicados en el metabolismo Induccion/inhibicion del CYP ¿Participan en el metabolismo CYPS con polimorfismo genetico? Evaluación del riesgo de hepatotoxicidad 18 Aplicaciones de los Modelo In Vitro • • • • • • • • • • • Clasificación y etiquetado de sustancias químicas Biocompatibilidad de materiales Carcinogénesis y mutagénesis Test de irritación ocular y cutánea Fototoxicidad Toxicología del desarrollo Toxicidad órgano-específica Toxicidad a nivel sistémico Mecanismos moleculares de toxicidad Metabolismo y toxicidad de fármacos Evaluación de interacciones entre fármacos • Ecotoxicología 19
