Resumen: E-046 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Producción de anticuerpos específicos anti pla2 en conejos 1 1 2 Rodríguez, Juan P. - Leiva, Laura C. - Acosta, Ofelia 1. Cátedra de Química Biológica I, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, U.N.N.E. Av. Libertad 5400, Corrientes. TE 03783 457996 Int 112. e-mail: lcleiva@exa.unne-.edu.ar 2. Cátedra de Patología Médica, Facultad de Ciencias Veterinarias, U.N.N.E. Sgto. Cabral 2139, (3400) Corrientes. Argentina. TE 03783 452753. Int 169 e-mail: patmed@vet.unne.edu.ar ANTECEDENTES En la intoxicación por veneno de Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) de Sud América se presentan efectos sobre sistema nervioso (Vital Brasil, 1972). El veneno constituye un paquete de sustancias tóxicas tales como: crotoxina, crotamina, convulsina y giroxina. Tanto la crotamina como la crotoxina son las que causan alteraciones en la neurotransmisión periférica (Habermann, E. and Breithaupt, 1978). La crotoxina, principal componente del veneno, exhibe actividad neurotóxica (Brazil, 1966). Es un complejo formado por dos proteínas unidas de modo no covalente, una básica y otra acídica. El componente básico (crotoxina B) con un pI de 8.6 (Horst et al, 1972) o 9.7 (Breithaupt et al, 1975) es una fosfolipasa A2. Esta enzima puede reproducir todos los efectos farmacodinámicos de la crotoxina aunque a dosis más altas de las requeridas por el complejo crotoxina (Rübsamen et al, 1971; Frenkel-Conrat y Singer, 1956; Habermann y Breithauopt, 1978). El componente acídico (crotoxina A), denominado crotapotín, con un pI de 3.4-3.7 (Horst et al, 1972; Breithauopt et al, 1974) es un polipéptido que no presenta actividad enzimática ni posee toxicidad. En presencia de la fosfolipasa A2, la proteína acídica, crotapotín forma un complejo en el cual se restablecen las propiedades fisicoquímicas y la alta toxicidad que exhibe la crotoxina, aunque reduce la actividad que exhibe la fosfolipasa A2 cuando está libre (Breithaupt and Habermann, 1972). La crotoxina también presenta actividad hemolítica (Rosenfeld, 1971). Este efecto es debido principalmente a los productos formados por la acción fosfolipásica sobre glicerofosfolípidos, esto es, ácidos grasos y lisofosfolípidos. Los lisofosfolípidos emulsionan los fosfolípidos de la membrana, alterando así la estructura de la membrana del eritrocito, lo que conlleva a la lisis celular. Por lo tanto, se trata de una hemólisis indirecta. El veneno de C. d. t. tiene una letalidad elevada, medida a través de la dosis letal 50 (LD50, cantidad de veneno que produce la muerte del 50% de animales inoculados 48hs antes), correspondiéndole un valor 0,073 µg/g ratón (Santoro et al, 1999), mientras que ensayos realizados en nuestro laboratorio, correspondientes a especimenes que habitan la región nordeste de Argentina, arrojan una dosis aún menor, de 0,048 µg de veneno por gramo de ratón. La crotoxina es un componente letal, principalmente responsable de la toxicidad del veneno, (Canziani et al 1982) determinaron su LD50 (0,050 + 0,03 µg/g ratón) siendo marcadamente menor que la de la fosfolipasa A2 (crotoxina B) (0,54 + 0,15 µg/g ratón). Los sueros actualmente disponibles en el comercio son heterólogos, por lo que están constituidos por gran variedad de inmunoglobulinas capaces de reconocer y neutralizar los distintos componentes del veneno. Si bien este tipo de suero genera una protección inmediata frente a la toxicidad del veneno, puede generar secuelas dado que simultáneamente se convierten en un paquete proteico exógeno contra los cuales el organismo ha de reaccionar formando inmunocomplejos. Estos complejos pueden depositarse en riñón y desencadenar daño renal a largo plazo. Es de interés producir un suero específico contra el componente letal del veneno a fin de anular su acción y con ello evitar el suministro excesivo de proteínas heterólogas. Teniendo en cuenta que la PLA2 (crotoxina B) posee una toxicidad menor que el complejo que ésta forma con el crotapotín (crotoxina A), lo cual permite suministrar mayor dosis de antígeno con menor riesgo de muerte en animales de experimentación, en este trabajo se han de producir anticuerpos anti-PLA2 del complejo crotoxina de Crotalus durisus terrificus y evaluar su capacidad neutralizante de la letalidad del veneno. MATERIALES Y MÉTODOS Obtención del antígeno El antígeno, PLA2, enzima presente en el veneno de C. d. t. se aisló y purificó mediante técnicas de cromatografía en columna según adaptación de la técnica de Landucci et al (1994). La técnica adaptada empleada constó de una sola etapa, en la que se realizó una cromatografía de exclusión molecular, en Columna de Sephadex G-75. Resumen: E-046 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 Detección de la actividad enzimática. La detección y cuantificación de la actividad fosfolipásica en el veneno entero, en las fracciones recolectadas durante el aislamiento y en la enzima purificada, se llevaron a cabo con el test de coagulación de la yema de huevo (Vidal y Stoppani, 1971). Los tubos que contenían la enzima volvieron incoagulable la solución de yema de huevo, indicando elevada actividad fosfolipásica. Preparación de la vacuna Un mg. del antígeno (PLA2) se disolvió en 5 mL de buffer PBS. A esta solución se le agregaron 100 µL de Tween 20, y luego gota a gota, sobre el vórtex, se agregaron 5 mL de FCA. Se agitó hasta formar una emulsión evitando que se separe el aceite del adyuvante en una fase y, el PBS, en otra. Las vacunaciones de refuerzo, se realizaron de la misma manera, con la utilización de FIA. Obtención del antisuero. (Suero hiperinmune de conejo) Animales: se trabajó con conejos mestizos machos en grupos de 5 (cinco), distribuidos en dos grupos. Protocolo de inmunización: los conejos se inmunizaron mediante la inoculación de 0.6 mL intramuscular en cada pata y 0,8 mL aplicados en 3 inyecciones subcutáneas en distintos lugares del lomo. A los 15, 21, 30 y 40 días se aplicaron los refuerzos de igual volumen de vacuna. A los 60 días se sangraron los conejos por vena yugular. Los sueros de los respectivos conejos inmunizados se mezclaron en un pool, sometiendo el mismo a test de detección de anticuerpos. Purificación de Anticuerpos: (gammaglobulina anti-PLA2) Para separar las inmunoglobulinas del resto de las proteínas séricas, a 3 mL de suero inmune se agregó lentamente SO4(NH4)2 hasta completar igual volumen al del suero, efectuando la mezcla en un vórtex. Se ajustó el pH a 7.8 y se dejó en reposo en heladera dos horas. Se centrifugó a 5000 r.p.m. durante 30 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en una solución de SO4(NH4)2 al 50% .Este procedimiento se repitió hasta que el sobrenadante a descartar fuera límpido. El precipitado final obtenido se reconstituyó en agua destilada, y luego se desionizó en columna de Sephadex G-25. Igual procedimiento se llevó a cabo con pool de suero de conejos control. Detección de anticuerpos producidos: Electroforesis en acetato de celulosa. Se corrió un suero control, junto al suero hiperinmune. Se utilizó la técnica semimicro. Tiempo de corrida: 45 minutos en Buffer Veronal sódico (8,24 g/l) pH: 8.6. Intensidad de corriente: 1.5 mA por tira. Precipitación en medios gelosados (Método de Ouchterlony). En caja de Petri estéril se depositaron 5 mL de agar fundido (2%, en solución buffer de NaOH y H3BO3, pH= 8.6) y una vez enfriado se agregaron 15 mL de agar fundido al 1% a 60 °C. Se dejó solidificar y se confeccionaron pares de orificios de 5 mm de diámetro, que se separaron 1 cm entre sí. En los distintos orificios se sembraron 0,1 mL de antígeno enfrentados a 0,1 mL de suero hiperinmune de conejo a testear y a 0,1mL de gammaglobulina anti-PLA2 obtenida por precipitación, en dicho suero. Las placas se mantuvieron en cámaras húmedas. Las lecturas de los resultados se efectuaron a las 24-72 horas Neutralización de la actividad hemolítica del veneno de C. d t. En placas plásticas, se depositaron 25 mL de agar al 1% (previamente fundido y enfriado a 50 °C) pH: 7,2 conteniendo 0,3 mL de solución 1:3 de yema de huevo en solución Fisiológica, 0,3 mL de paquete del glóbulos rojos, 0,25 mL de CaCl2 0,01M y 5 mg. de Azida sódica. Se dejo solidificar y se confeccionaron 4 pares de orificios con un sacabocados de 3 mm de diámetro. En cada uno de los pares de orificios se sembraron diluciones del veneno entero y diluciones de veneno entero preincubadas durante 30 minutos a 37°C en partes iguales, con el suero hiperinmune de conejo obtenido, y con gammaglobulina anti-PLA2 obtenida. Las placas fueron incubadas en cámara húmeda durante 20 hs. a 37°C., midiéndose luego los diámetros de los halos de hemólisis. Neutralización de la actividad letal del veneno de C. d t. Grupos de 6 ratones machos (20 + 2 g.) fueron inoculados con 0,5 mL i.p. de solución de veneno conteniendo una dosis de reto de 2 µg (dos veces la DL50) preincubados con gammaglobulina anti-PLA2 obtenida, 30 minutos a 37 ºC. Los ratones controles recibieron iguales cantidades de veneno entero preincubados con PBS. El número de muertes fue contabilizado a las 24 hs. y 48 hs. DISCUSIÓN DE RESULTADOS La metodología empleada para el aislamiento de la enzima, llevada a cabo en una sola etapa (Figura 1), permitió obtener el antígeno con alta pureza, cuya homogeneidad se comprobó por SDS-PAGE (Figura 2), con un peso molecular de 16 kDa, comparable con la obtenida por otros autores, 16,2 kDa (Habermann and Rübsamen, 1971; Omori-Satoh et al, 1975). El pH del buffer de elusión, permitió una adecuada disociación del complejo crotoxina, separándose la PLA2 del crotapotin. Este último debido a su menor peso molecular, (9 KD) eluyó en las fracciones posteriores (Figura 2, fracciones 22 y 23) El proteinograma del suero hiperinmune de conejo, mostró un aumento en la fracción de las gamaglobulinas respecto al de los conejos control, indicando probable respuesta inmune al antígeno inoculado (PLA2) (resultados no mostrados) El test para detección de anticuerpos específicos (método de Outcherlony) mostró una sola banda de precipitación para los anticuerpos del suero hiperinmune de conejo obtenido en este trabajo (Figura 3), lo cual no solo demuestra Resumen: E-046 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004 especificidad del suero para su correspondiente antígeno sino también la pureza antigénica inoculada. El mismo test realizado con gamaglobulina obtenida a partir del suero, con una concentración de 26 mg./mL, mostró bandas de precipitación mas intensas que aquellas que produjo el suero, estos resultados demuestran que el suero de conejo presenta menor tenor de inmunoglobulinas circulantes. La capacidad neutralizante de la actividad hemolítica del suero hiperinmune de conejo, fue demostrada por la considerable reducción de los halos de hemólisis que se obtuvieron al comparar la actividad hemolítica de diferentes diluciones del veneno entero, diferentes diluciones del veneno preincubado con el suero hiperinmune de conejo, y diferentes diluciones del veneno preincubados con gamaglobulina anti-PLA2 (Tabla 1). Ratones controles inoculados con la dosis de reto de veneno de C.d.t. murieron antes de las 24 hs., mientras que aquellos a los que se les suministró veneno preincubado con gamaglobulina anti-PLA2 mostraron una superviviencia del 100% a las 48 hs. de inyección. Estos resultados demuestran la efectividad de los anticuerpos producidos, capaces de neutralizar la letalidad del veneno. CONCLUSIONES Se obtuvo un suero de conejo hiperinmune constituidos por anticuerpos anti-PLA2 de C.d.t. capaz de neutralizar la actividad hemolítica, y letal del veneno. AGRADECIMIENTOS A la Secretaría General de Ciencia y Técnica de la UNNE por el apoyo financiero a través del Proyecto PI 610 y de la beca de Pre-Grado otorgada a J. P. Rodríguez. BIBLIOGRAFIA. - Brazil, O. V. (1966). Pharmacology of crystaline crotoxin. II. Neuromuscular blocking action. Mem. Inst. Butantan 33, 981-992. - Breithaupt, H., Habermann, E. Byochemistry and Pharmacology of phospholipase A and its complex from Crotaluss durissus terrificus venom as influenced by crotapotin. Toxicon 10, 525-526 (1972) - Breithaupt, H., Omori-Satoh, T and Lang, J (1975) Isolation and characterization of three phospholipases A from the crotoxin complex. Biochim. Biophys. 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Perfiles electroforéticos obtenidos a partir de cromatografía de filtración por gel. A: Veneno entero de Crotaluss durissus terrificus B: Fracciones 18 – 23 (de izquierda a derecha). Figura 3. Test de Oucherlony. PLA2 (1). Suero anti-PLA2 (2). Tabla 1: Neutralización de la Actividad hemolítica del veneno de C.d.t. expresado en % de neutralización. 0,8 0,4 0,2 Suero de Conejo 6.25 11.2 28.5 Gamaglobulina 56.25 78.57 83.3 Veneno (mg/mL) 0,1 36.6 100 0,05 0,025 0,0125 0.006 100 100 100 100 100 100 100 100