PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS NOMBRE DEL ALMUNO (A) ____________________________ OBJETIVO: Adiestrar al alumno en la preparación de diferentes medios de cultivo. MATERIAL Frasco Schot Autoclave Parrilla de agitación y calentamiento Baño maría Mecheros Fisher Espátula Tubos de ensayo 16X150 Vaso de precipitado de 500 ml Medios de cultivo Cajas de petri Agitador Asa de platino Papel estraza Algodón Papel aluminio Marcador permanente de punto fino Alcohol Rollo de plástico adherible Masking tape cubre bocas Cubre pelo INTRODUCCIÓN Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Por su aspecto físico. Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en: : Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y por su uso en: I.- Medios de cultivos básicos II:_ Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte. PROCEDIMIENTO: 1- Primeramente se desinfecta el área de trabajo con fenol al 5% o alcohol y se enciende el mechero. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS 1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria según el volumen requerido. 2.- Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua destilada en el volumen requerido, agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En el último paso se debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un baño maría para aumentar la solubilidad. 3.- Si se va a envasar en cajas de petri, es necesario conservar el medio en un frasco schot y esterilizarlo a 121·C durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente mantener el mechero encendido para formar un área de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de petri aproximadamente de 15 ml a 20 ml de medio de cultivo por caja procurando que no se forman burbujas. Tapar la caja inmediatamente. 4.- Si se desea que el Agar quede en tubos, entonces se esterilizará el Agar directamente en ellos a 121·C durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20 a 30 · sobre una varilla de vidrio. A) VACIADO EN CAJAS DE PETRI 3.- No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo. 4.- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área estéril al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la caja petri con la mano izquierda , sin soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml a 20 ml de Agar por caja procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente 5.- Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de petri y de manera rápida. Se procede a tapar la caja. 6.- Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo día se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar. CUESTIONARIO 1.- ¿Qué es un medio de cultivo? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________2.Qué es un cultivo de microorganismo? ________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 3.- Qué finalidad tiene utilizar medios de cultivo sólidos? ________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 4.- Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el laboratorio de microbiología. ________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 5.- De dónde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparación de medios de cultivos?_________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 6.- Por qué es necesario esterilizar la mesa entes de realizar el vaciado del medio de cultivo en las cajas de petri?______________________________________ ___________________________________________________________________________ 7.-Por qué la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona?_______________________________________________________ ____________________________________________________________________________8.Escribe la composición química un medio medio de cultivo que utilizaste.__________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ OBSERVACIONES. Dibuja todos los pasos realizados en la preparación de los medios de cultivo. CONCLUSIONES: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________ TÉCNICAS DE SEMBRADO NOMBRE DEL ALUMNO (A) OBJETIVOS - Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente, determinando las diferentes morfologías de colonias que se obtienen. - Los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri. MATERIAL Cajas de Petri estériles preparadas con medio de cultivo PDA Tubos de ensaye con tapón de rosca y agar incinado Mechero bunsen o de preferencia Fisher Asas de siembra Cinta pegante Marcador permanente o lápiz de cera Un desinfectante con 70% de solución de alcohol, 10% de una solución blanqueadora, jabón líquido Extran o alkox. INTRODUCCIÓN La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas. Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran más frecuentemente en la oscuridad, en objetos húmedos que a menudo entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetación. Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hábitat requiere técnicas que permitan conocer y ordenar la compleja población mixta o cultivo mixto, separándole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una población de células derivadas todas ellas de una célula parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material que se inocula sobre el medio se denomina inóculo mediante alguna técnica (siembra por estría en placa o siembra en masa en placa). Durante la incubación a 37˚C, las células microbianas individuales se reproducen tan rápidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de células denominadas colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Si dos células microbianas procedentes del inóculo original quedan muy cerca una de otra sobre el medio de Agar, la masa de células observables no será un cultivo puro. La mayoría de los microbios en nuestro cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero algunos son patógenos o causan enfermedad. Por esta razón, queremos controlar el número de microbios que nos rodea. La posibilidad de infectarnos aumenta con el número de microbios en los objetos circundantes. Pero ¿qué podemos hacer para reducir el número de microbios en las superficies que nos rodean? PROCEDIMIENTO A partir de una suspensión bacteriana o cultivo mixto: - Agotamiento, con asa de platino y en placa de AN. Tomar una muestra del cultivo mixto, con ayuda del asa de siembras previamente flameada. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de tomar la muestra. La muestra se extiende con suavidad con el asa sobre la superficie del medio de agar nutritivo en placa Petri. Para ello la placa se destapa ligeramente en las proximidades del Mechero bunsen. Una vez finalizado se vuelve a tapara la placa y está se dispone en posición invertida para llevar a incubar. Este es el proceso general para la siembra de placas. - Estrías escocesas, con asa de platino y en placa de AN Para obtener colonias aisladas por este procedimiento, según se indique en el esquema, se realizan una serie de estrías sobre la superficie del medio, tras lo cual se cierra la placa y se flamea el asa. Con el asa estéril se realizan nuevas estrías arrastrando células de las estrías anteriores, y por tanto diluyendo la muestra. El proceso se repite varias veces, flameando el asa entre cada nuevo paso de estrías. Al final se puede realizar un pequeño agotamiento. La placa se lleva a incubar, invertida, como en el caso anterior. Ello permitirá obtener colonias aisladas. Incubar a 27º C. Ver esquema: CUESTIONARIO 1.- Qué es un cultivo puro de microorganismos? ___________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 2.Qué es in inóculo? ___________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 3.Físicamente en un medio de cultivo de microorganismos cuando se dice que no forma un cultivo puro?_____________________________________________ ___________________________________________________________________________ 4.Qué tipo de técnica empleaste para la siembra de microorganismos? ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ 5.- ¿En cuál caja crecieron más y más grandes las colonias? ¿Por qué piensas eso? _____________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 6.- ¿Cómo podemos controlar la contaminación microbiana? ___________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ OBSERVACIONES: Dibuja todos los pasos empleados en el sembrado de las cajas de petri con Agar nutritivo. CONCLUSIONES_______________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________