KIT COFACTOR de RISTOCETINA - Medica-Tec

Solución salina tamponada con Tris (TBS)
Conservar a temperaturas entre 2°C y 8°C. No utilizar una vez superada la fecha de caducidad
que figura en la etiqueta.
OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS
Anticoagulante
Utilizar tampón citrato sódico al 3,2%.
RISTOCETIN COFACTOR ASSAY
Recogida de las muestras
1. Extraer la sangre venosa mediante venipunción.
2. Añadir inmediatamente nueve partes de sangre a una parte de anticoagulante y mezclar bien
invirtiendo el tubo con el tapón hacia abajo.
3. Centrifugar la muestra a 1500 rpm durante como mínimo 15 minutos
4. Extraer el plasma del tubo antes de 60 minutos utilizando una pipeta de plástico y a
continuación conserver en un tubo de plástico.
5. Analizar la muestra de plasma antes de 4 horas. También se puede conservar la muestra
congelada hasta dos semanas a -20°C o hasta seis meses a -70°C para ser después
descongelada una única vez cuando vaya a ser utilizada
(von Willebrand Factor Assay)
ESPAÑOL
50750
USO PREVISTO
El ensayo Ristocetin Cofactor se utiliza para la cuantificación de la actividad de cofactor de la
ristocetina en plasma.
RESUMEN Y PRINCIPIO
(ver Estándar CLSI H21-A58).
La actividad de cofactor de la ristocetina en plasma puede determinarse a través de la
aglutinación de una suspension estandarizada de plaquetas en presencia del factor von
Willebrand utilizando el antibiótico ristocetina.1 La actividad de cofactor de la ristocetina es la
actividad in vitro del factor von Willebrand, que es el responsable de la aglutinación de las
plaquetas en presencia de la ristocetina. Aunque las plaquetas juegan un papel pasivo en esta
aglutinación, es absolutamente imprescindible que el receptor dependiente de la ristocetina esté
intacto.2 La enfermedad de von Willebrand está asociada a una reducción de la actividad del
factor von Willebrand o del cofactor de la ristocetina y de forma generalizada se acepta que la
actividad de cofactor de la ristocetina es el ensayo in vitro más útil para diagnosticar la
enfermedad de von Willebrand.3,4 Los niveles de actividad del cofactor de la ristocetina se
determinan en función de la capacidad del plasma problema y de la ristocetina para inducir la
agregación en una suspensión estandarizada de plaquetas.5- 7
PROCEDIMIENTO
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Cada unidad de plasma original utilizada en la preparación de este producto ha sido analizada
mediante métodos aprobados por la FDA para comprobar la presencia de anticuerpos frente a
VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) tipo I y tipo II, antígeno de superficie de la Hepatitis B
(HBsAg) y Hepatitis C (HCV), obteniéndose resultados negativos (ausencia de reacción repetida).
Sin embargo, ningún ensayo puede excluir totalmente la transmission de enfermedades
infecciosas por parte de los productos derivados de la sangre humana. Al igual que todos los
materiales de origen humano, este producto debe ser manejado como un material potencialmente
infeccioso. Todos los residuos que contienen material biológico deben ser adecuadamente
etiquetados y conservados y mantenerse separados de los demás residuos. Eliminar los residuos
de acuerdo con las normativas internacionales, nacionales y locales.
Tras su reconstitución, las plaquetas liofilizadas se tratan con ristocetina en presencia de
diluciones de un plasma humano normal estandarizado con una actividad conocida de cofactor de
la ristocetina. Se prepara una curva patrón y a continuación se utiliza un plasma problema como
fuente de actividad del cofactor de la ristocetina en presencia de ristocetina y de plaquetas
reconstituidas, a partir de las cuales se determina un patron de agregación (una pendiente).
Finalmente se interpola la actividad de cofactor de la ristocetina en la curva patrón.
El ensayo debe utilizarse conjuntamente con las observaciones clínicas y con los resultados de
otros ensayos de laboratorio.
Calibración del método
REACTIVO
1. Preparación de la curva patron (preparar para cada conjunto de ensayos).
a. Preparar diluciones del plasma de control normal para construir una curva patrón.
i. Etiquetar tres tubos de ensayo de plástico (12 x 75mm) con la inscripción 100%, 50%
y 25%, respectivamente.
ii. Añadir 0,2ml de TBS a cada tubo.
iii. Añadir 0,2ml de plasma de control, normal, al tubo con la inscripción 100%. Mezclar
bien.
iv. Transferir 0,2ml del tubo con la inscripción 100% al tubo con la inscripción 50%.
Mezclar bien.
b. Preparar una dilución del plasma problema en un tubo de plastic añadiendo 0,1ml de
plasma problema a 0,1ml de TBS. Mezclar bien.
DESCRIPCIÓN DEL REACTIVO
Ristocetin, 1 x 7.5 mg, 50750A
7,5 mg/vial aproximadamene.
Lyophilized Human Platelets, 1 x 6 ml, 50750B
6ml.
von Willebrand Reference Plasma, Normal, 1 x 1.0 ml, 50750C
Plasma humano estandarizado para la actividad de cofactor de la ristocetina, seco.
von Willebrand Reference Plasma, Deficient, 1 x 0.5 ml, 50750D
Derivado de FVIII plasma inmunodeficiente y contiene menos del 30% de actividad normal de
cofactor de ristocetina, liofilizado.
Tris Buffered Saline (TBS), 1 x 12 ml, 50750E
Contiene azida sódica al 0,1%.
2. Preparación del blanco.
a. Añadir 0,25ml de TBS y 0,25ml de plaquetas reconstituidas a la cubeta del agregómetro.
Mezclar bien.
b. El blanco se utiliza para establecer la línea de base al 100% para cada cubeta de la
muestra.
PREPARACIÓN DEL REACTIVO
Ristocetina
Reconstituir con 0,75ml de agua calidad reactivo hasta obtener una concentración final de
aproximadamente 10 mg/ml. Dejar reposar durante 10-15 minutos a temperatura ambiente (1825°C) agitando de vez en cuando. Comprobar que se han disuelto bien todas las partículas.
Plaquetas humanas liofilizadas
Reconstituir un vial de plaquetas humanas liofilizadas con la cantidad de solución salina
tamponada con Tris que figura en la etiqueta del vial. Antes de utilizar, dejar reposar al menos
durante 10 minutos. Antes de cada uso, mezclar el contenido del vial invirtiéndolo suavemente.
Plasma de control von Willebrand, normal
Reconstituir con 1,0ml de agua calida reactivo. Dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente
18-25°C) agitando de vez en cuando. Comprobar que se han disuelto bien todas las partículas.
Plasma de control von Willebrand, deficiente
Reconstituir con 0,5ml de agua calidad reactivo. Dejar reposar 10 minutos a temperatura
ambiente 18-25°C) agitando de vez en cuando. Comprobar que se han disuelto bien todas las
partículas.
Solución salina tamponada con Tris (TBS)
Utilizar para reconstituir las plaquetas liofilizadas.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
1. Añadir 0,4ml de plaquetas reconstituidas a una cubeta del agregómetro.
2. Añadir 0,05ml de ristocetina a la cubeta de la muestra. Mezclar bien. Introducir una varilla de
agitar en la cubeta.
3. Colocar la cubeta en el agregómetro.
4. Establecer las líneas de base al 0% y al 100% de acuerdo con las instrucciones del fabricante
del instrumento. Por lo general, el blanco (preparado en la Calibración del método sección) se
utiliza para la línea de base al 100% y el TBS sólo como línea de base al 0%.
5. Iniciar la agregación añadiendo 0,05ml del plasma de control normal al 100% a la cubeta de la
muestra que contiene la mezcla plaquetasristocetina. Observar y registrar el patrón de
agregación hasta que se haya completado.
6. Repetir los pasos 1-5 para las diluciones al 50% y al 25% del plasma de control normal.
7. Repetir los pasos 1-5 para el plasma problema (dilución 1:2 preparada previamente).
CONTROL DE CALIDAD
En el kit de ensayo se incluye el plasma de control von Willebrand deficiente para su uso como
control patológico. El valor del cofactor de la ristocetina de este control es inferior al 30% y
cuando se utiliza en lugar del plasma problema da lugar a una reducción de la agregación y de la
pendiente y a un valor interpolado inferior al 30% del cofactor de la ristocetina.
MATERIALES ADICIONALES NECESARIOS
Método para medir la agregación plaquetaria con registrador gráfico
Cubetas para el agregómetro
Varillas para agitar
Pipeteadores de precisión para 4ml, 1ml, 0,5ml, 0,4ml y 0,05ml
Pipetas de transferencia de plastico
Si el plasma de control von Willebrand deficiente no da un valor inferior al 30%, repetir la curva
patrón y el control. Si el control patológico vuelve a no dar este valor, cabe sospechar un deterioro
del reactivo o un error técnico. Póngase en contacto con el Servicio Técnico de Tcoag.
ALMACENAJE Y ESTABILIDAD
RESULTADOS
Ristocetina
Conservar a temperaturas entre 2°C y 8°C. Tras su reconstitución las fracciones no utilizadas
pueden conservarse si se congelan a temperaturas de –20°C o inferiores.
Plaquetas humanas liofilizadas
Conservar a temperaturas entre 2°C y 8°C. Tras su reconstitución pueden conservarse a
temperaturas entre 2°C y 8°C hasta 30 días o en estado congelado hasta 30 días.
Plasma de control von Willebrand, normal
Tras su reconstitución puede conservarse durante 4 horas a temperaturas entre 2°C y 8°C o si se
congela a -20°C hasta 30 días.
Plasma de control von Willebrand, deficiente
Tras su reconstitución puede conservarse durante 4 horas a temperaturas entre 2°C y 8°C o si se
congela a -20°C hasta 30 días.
Determinación de la pendiente
1. La mayoría de los agregómetros comerciales permiten una lectura directa de la pendiente (ver
las instrucciones del fabricante del instrumento).
Preparación de una curva patron con los valores de la pendiente
1. Utilizando papel de gráfica log-log, representar el % de cofactor de la ristocetina en la dilución
del plasma de control normal (100%, 50% y 25%) en el eje indicado frente a los
correspondientes valores de pendiente en el otro eje.
2. Trazar la recta de máximo ajuste entre los 3 puntos.
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Determinar el valor de cofactor ristocetina en el plasma problema
1. Desde el valor de la pendiente del plasma problema, cortar la recta de máximo ajuste
prolongando la recta hasta el eje del cofactor de la ristocetina e interpolando el nivel de
actividad de cofactor de la ristocetina en la muestra problema.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
1. Al plasma de referencia se le asigna un valor de actividad de ristocetina. El valor interpolado
obtenido del gráfico, para el nivel de actividad del cofactor de ristocetina en la muestra de
prueba, asume que el plasma de referencia presenta una actividad del 100%. La actividad del
cofactor de ristocetina en la muestra de prueba debe corregirse para tener en cuenta el valor
de ristocetina asignado al plasma de referencia. El factor de corrección empleado es el valor
asignado al plasma de referencia.
2. Cálculo
Actividad del cofactor de ristocetina (%) = valor interpolado para la actividad del cofactor de
ristocetina del plasma de referencia.
Ejemplo
Actividad del cofactor de ristocetina
Prueba
Plasma de referencia
- 101%
- 90%
Actividad del cofactor de ristocetina =
101 x (90)
100
Actividad del cofactor de ristocetina =
90.9%
RESULTADOS ESPERADOS
Los resultados inferiores a un 40% del cofactor ristocetina (factor von Willebrand) se consideran,
por lo general, como anómalos y son indicativos de la enfermedad de von Willebrand.1- 4 Cada
laboratorio deberá establecer su propio intervalo normal utilizando su combinación habitual de
reactive e instrumento.
LIMITACIONES
Muchos investigadores consideran el ensayo del cofactor de la ristocetina como el más fiable para
la enfermedad de von Willebrand. Sin embargo, el diagnóstico completo y la determinación de las
variantes de esta coagulopatía requieren la evaluación de otros factores tales como el factor VIIIRag, la actividad del factor VIII-C, el tiempo de coagulación y la historia familiar.
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Kit
REFERENCIAS
Weiss, H.J., Hoyer, L.W., Rickels, F.R., Varma, A., and Rogers, J., J. Clin. Invest. 52: 2708,
1973.
Morisato, D.K., and Gralnick, H.R., Blood 55: 9, 1980.
Olson, J.D., Brockway, W.J., Fass, D.N., Magnuson, M.A., and Bowie, E.J.W., Am. J. Clin.
Path. 63: 210, 1975.
George, J.N., Nurden, A.T., and Phillips, D.R., N. Eng. J. Med., 311: 1084, 1984.
Allain, J.P., Cooper, H.A., Wagner, R.H., et al., J. Lab. Clin. Med. 85: 318, 1975.
Brinkhous, K.M., Graham, J.C., Cooper, H.A., Allain, J.P., and Wagner, R.H., Thromb. Res.
6: 267, 1975.
Ramsey, R., and Evatt, B.L., Am. J. Clin. Path. 72: 996, 1979.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Collection, Transport, and Processing of
Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays and Molecular
Hemostasis Assays; Approved Guideline - Fifth Edition. CLSI document H21-A5 Vol. 28,
No. 5, 2008.
INFORMACIÓN SOBRE EL PEDIDO
Ristocetin Co-factor Assay
Catalogue No.
Additional Reagents Available
50705
8851
50704
50710
50750
Ristocetin 7.5mg/vial
Collagen
ADP
Platelets
Tcoag Ireland Limited,
IDA Business Park,
Southern Cross Road,
Bray, Co. Wicklow,
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Fax + 353 1 2746678
www.tcoag.com
info@tcoag.com
10 x 0.5 ml
3 x 1 ml
3 x 0.5 ml
3 x 6 ml
50750-29 Rev B
06/2011
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