TÍTULO DEL PROGRAMA:Programa Nacional de Ciencias Básicas TÍTULO DEL PROYECTO:Relación estructura actividad de un nuevo inhibidor de proteasas hallado en la langosta Panulirus argus. Bases para el desarrollo de nuevos fármacos. ENTIDAD EJECUTORA PRINCIPAL:Centro Medicamentos (CIDEM). Director:Marlene Porto Verdecia de Investigación y Desarrollo de Dirección: Avenida 26 No. 1605 e/ Puentes grandes y Boyeros, Plaza de la Revolución, La Habana Teléfono: 8810818 Fax: 8810830 E-mail:direccion@cidem.sld.cu Firma Director: ENTIDAD EJECUTORA PARTICIPANTE: Teléfono:Fax: Nombre y Firma Director : E-mail: - JEFE DEL PROYECTO: Rolando Perdomo Morales Entidad: Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM) Teléfono: 8811424 Fax: 8810830Email:rolando.perdomo@infomed.sld.cu USUARIOS o CLIENTES: Dirección: Teléfono: km Fax: Nombre y Firma Director DURACIÓN Fecha de inicio: Enero/2014 E-mail: Fecha terminación: Diciembre/2015 AVAL DEL ÓRGANO CIENTÍFICO o TÉCNICO DE LA ENTIDAD Se adjunta RESUMEN En el presente proyecto se propone estudiar la relación estructura-función de un nuevo inhibidor de proteasas hallado en el departamento de Bioquímica del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Se pretende la identificación del sitio activo del inhibidor, así como la modificación de la especificidad inhibitoria mediante técnicas de mutagénesis dirigida con la finalidad de obtener candidatos o moldes para el desarrollo posterior de nuevos fármacos. Casi el 50 % de los fármacos existentes en el mercado ejercen su efecto terapéutico a través de la inhibición de enzimas. Por otra parte, las enzimas continúan siendo el blanco principal para el desarrollo de nuevos fármacos por las principales compañías farmacéuticas y biotecnológicas, por lo que el objetivo de este proyecto es dilucidar la relación estructura-actividad de un novel inhibidor de peptidasas encontrado en la langosta espinosa P. argus. PROBLEMA A RESOLVER. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN En el presente proyecto se propone estudiar la relación estructura-función de un nuevo inhibidor de proteasas hallado en el departamento de Bioquímica del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Se pretende la identificación del sitio activo del inhibidor, así como la modificación de la especificidad inhibitoria mediante técnicas de mutagénesis dirigida con la finalidad de obtener candidatos o moldes para el desarrollo posterior de nuevos fármacos. Casi el 50 % de los fármacos existentes en el mercado ejercen su efecto terapéutico a través de la inhibición de enzimas, lo cual representa más de 96 mil millones de dólares. Por otra parte, las enzimas continúan siendo el blanco principal para el desarrollo de nuevos fármacos por las principales compañías farmacéuticas y biotecnológicas. Por ejemplo, entre el 50 y 75 % de los esfuerzos en la búsqueda de nuevos medicamentos en los Estados Unidos están enfocados en las enzimas como blancos primarios (1). De todas las familias de enzimas, las proteasas, peptidasas o enzimas proteolíticas, constituyen una de las dianas con mayor potencial para el desarrollo de fármacos por las razones quese describen a continuación. Las enzimas proteolíticas representan alrededor del 2% de los genes en seres humanos, organismos infecciosos y otras formas de vida. Su control sobre la síntesis, recambio y activación de proteínas y otras funciones les permite regular procesos fisiológicos tales como la concepción, nacimiento, digestión, crecimiento, diferenciación, señalización/migración celular, respuesta inmune, cicatrización de heridas, envejecimiento y apoptosis. Por otra parte, es conocido que las proteasas son esenciales para la replicación / transmisión de virus, parásitos y bacterias que causan enfermedades infecciosas en mamíferos, y que también están relacionadas con la proliferación de insectos y otras plagas agrícolas que transmiten enfermedades, dañan los cultivos vegetales, y propagan infecciones a través de poblaciones de animales (1). Los inhibidores de proteasas han emergido con prometedoras aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer, infecciones parasitarias, fúngicas y virales (por ejemplo, esquistosomiasis, malaria, C. albicans, VIH, hepatitis, herpes), y en desórdenes inflamatorios, inmunológicos, respiratorios, cardiovasculares y neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer (1). La farmacología moderna se basa en fármacos derivados de fuentes naturales y de los conocimientos biológicos fundamentales extraídos de los estudios de su mecanismo de acción. Sin embargo, ha sido examinada sólo una pequeña fracción de la biodiversidad total de la Tierra. Por ejemplo, los océanos cubren más del 70% de la superficie de la Tierra y sin embargo se sabe relativamente poco acerca de la biología, la química, e incluso la identidad de sus habitantes. Por tanto, es evidente que los océanos representan una fuente aun poco explorada de moléculas con potencial para el desarrollo de fármacos. Recientemente, nuestro grupo ha hallado y caracterizado parcialmente un nuevo inhibidor de peptidasas en la langosta espinosa Panulirus argus, que hemos nombrado panulirin (Manuscrito en proceso de publicación). Panulirin es un péptido básico de 5 kDa. La falta de homología con otras proteínas sugiere que representa una nueva familia de inhibidores. Para ser efectivo como herramientas biológicas, los inhibidores de proteasa no sólo deben ser muy potentes sino también muy selectivos en la unión a una proteasa particular. Estudios preliminares muestran que panulirin es altamente específico por la tripsina de mamíferosdebido probablemente a propiedades estructurales aún desconocidas. Este hallazgo nos ha estimulado a realizar una mejor caracterización de panulirin centrados en su prometedor potencial como molde para el desarrollo de nuevos fármacos y en fisiopatologías donde se sabe que los inhibidores de proteasas representan los mejores candidatos farmacológicos, como algunas infecciones (ej. hepatitis C y malaria) y en enfermedad pulmonar obstructiva crónica, por solo mencionar un par de ejemplos. A través de la caracterización molecular, se va a identificar el sitio reactivo (P1) ya que la naturaleza de este sitio es responsable, en general, de la especificidad inhibitoria. Este conocimiento será útil para la manipulación biotecnológica de la especificidad del inhibidor contra peptidasas relacionadas con un trastorno fisiopatológico específico, lo cual podría conducir a la obtención de una gran cantidad de candidatos para el desarrollo de fármacos. El proyecto que presentamos pretende ser la contraparte nacional de un proyecto internacional VLIR-UOS convocatoria 2013 con la Universidad de Leuven en Bélgica recién aprobado “Structure-activityanalysis of a novel peptidaseinhibitorfromtheCaribbeanspinylobster, Panulirus argus. A scaffoldfordevelopment of biopharmaceutical leads”, a ejecutarse en los años 2013 hasta 2015. A través de dicho proyecto se va a garantizar la formación de nuestro personal en técnicas novedosas y se va a adquirir equipamientos, accesorios y reactivos necesarios para acometer dicha investigación. 1. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery, by Robert A. Copeland ISBN 0471-68696-4 Copyright © 2005 by John Wiley & Sons, Inc. 2. Leung D, Abbenante G, Fairlie DP.Protease inhibitors: current status and future prospects. J Med Chem.2000 Feb 10;43(3):305-41. 3. Peter Norman. Protease Inhibitors: Innovation Drives Drug Pipeline. Insight Pharma Reports. Febrero 2009. OBJETIVO GENERAL Dilucidar la relación estructura-actividad de un novel inhibidor de peptidasas encontrado en la langosta espinosa P. argus. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Clonar y secuenciar el cDNA de panulirin y determinar su perfil de expresión. 2. Obtener variantes recombinantes de panulirin e identificación del sitio P1 3. Determinación de especificidad inhibitoria frente a peptidasas representativas de las cuatro clases mecanicistas en relación con el residuo de aminoácido que ocupa el sitio P1. METODOLOGÍA A UTILIZAR PARA ENFRENTAR EL PROBLEMA RESULTADOS Y PLANIFICACIÓN DE LAS ACTIVIDADES PRINCIPALES Resultados Planificados Entidad Responsable Actividades Principales Inicio Término Indicadores verificables Determinación del transcripto que codifica para el inhibidor panulirin a partir de cDNA y expresión en tejido Resultados Planificados Estudios in silico de relación estructuraactividad para determinar los mutantes viables para los ensayos de mutagénesis. Clonaje y secuenciación de plásmidos recombinantes con la banda de gen para panulirin y panulirin mutado. Diseño y síntesis de oligos cebadores Obtención de CIDEMmRNA LEUVEN Optimización de la PCR Secuenciación de banda amplificada Actividades Entidad Principales Responsable CIDEMLEUVEN CIDEMLEUVEN Producción y purificación de las versiones de panulirin recombinante CIDEMLEUVEN Determinación y análisis de traducción a proteína Estudio de modelación de la proteína por homologías Determinar los posibles sitios P1 del inhibidor Diseño de oligos para clonación. Insertar banda de interés en el plásmido de recombinación Transformación del vector de expresión Cinética de evaluación de expresión de la proteína. Escalar producción del recombinante. Purificación por cromatografía de intercambio catiónico. 01/14 03/14 Informe parcial e introducción de secuencia en GenBanck Inicio Término Indicadores verificables 04/14 04/15 Informe parcial 04/14 04/15 Informe parcial Publicación en revista de impacto 12/14 12/15 Informe parcial Determinación de la especificidad del inhibidor en relación con las variantes naturales y recombinantes NOMBRE Y APELLIDOS Rolando Perdomo Morales Vivian Montero Alejo Yamile Vega Hurtado Anabel Pacios Michelena Leandro Rodríguez Viera CIDEM Selección de las peptidasas diana Estandarización de ensayo enzimático para cada peptidasa diana Determinación de parámetros cinéticos 01/15 12/15 RECURSOS HUMANOS PRINCIPALES Categoría Marcar si es Grado científica, Jefe de Entidad Científico docente o Resultado tecnológica Investigador x Lic. CIDEM Auxiliar Investigador x Lic. CIDEM Auxiliar Téc. Lic. MSc. Reserva Científica Investigador Agregado Informe final Publicaciones en revista de impacto % de participación 30 20 CIDEM 30 CIDEM 15 CIMUH 15 Experiencia del Jefe del proyecto relacionada con el objetivo principal del proyecto Licenciado en Bioquímica (1994), que se encuentra culminando su doctorado. Actualmente es el jefe del grupo de Bioquímica del CIDEM y es reserva activa de la Subdirección de Investigaciones del Centro. Desde sus comienzos a trabajar en el Centro (1995); ha estado vinculado con investigaciones que persiguen la evaluación y desarrollo de métodos alternativos para la determinación de pirógenos en productos inyectables. En este sentido ha desarrollado procedimientos para la extracción y purificación de patrones moleculares asociados a patógenos o pirógenos exógenos como endotoxinas, ácido lipoteicoico, peptidoglicanos y b-1,3 glucanos. Tiene amplios conocimientos en los métodos existentes para la detección de endotoxinas y otros pirógenos como el LAL y el ensayo de activación de monocitos. Por otra parte, ha profundizado en los mecanismos de respuesta inmune innata de la langosta espinosa P. argus, con lo cual se ha logrado proponer un nuevo producto para la detección de pirógenos empleando componentes de los hemocitos de la langostas y siguiendo una estrategia similar al LAL. Estas investigaciones han permitido colateralmente el hallazgo de una nueva familia de inhibidores de proteasas (panulirin). En este sentido, ha adquirido experiencia en el campo de la enzimología, incluyendo de manera particular las herramientas necesarias para la caracterización cinética de inhibidores de proteasas, y su relación estructura-actividad. Dichas investigaciones han estimulado la búsqueda de nuevos fármacos no solo a partir de inhibidores de proteasas de invertebrados marinos, sino incluyendo péptidos antimicrobianos, ambos con potencial para ser empleados como moldes para el desarrollo de nuevos fármacos. RECURSOS MATERIALES E INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE POR LAS ENTIDADES PARA EJECUTAR EL PROYECTO Debido a investigaciones precedentes desarrolladas y aun en ejecución en el CIDEM, seha logrado una importante experiencia en el estudio del sistema inmune innato de la langosta, lo cual ha permitido el hallazgo de nuevas moléculas de importancia farmacológica como inhibidores de proteasas y péptidos antimicrobianos. Dicha experiencia se ha desarrollado en paralelo con la infraestructura y recursos necesarios para llevar a cabo este tipo de investigaciones. La mayor parte de los reactivos, accesorios y equipamientos necesarios para ejecutar el proyecto están garantizados por un proyecto internacional VLIR-UOS con Bélgica. Además, se debe mencionar que el CIDEM tiene experiencia en la actividad de investigación y desarrollo de medicamentos, incluyendo sus etapas principalestales como farmacología, toxicología, genotoxicidad, tecnología y farmacocinética, lo cual va a contribuir al mejor diseño racional de medicamentos. Presupuesto del Proyecto VALOR EN MN/CUC / AÑO ELEMENTOS DE GASTOS Salario Salario Complementario ( 9.09 - Vac.) SUBTOTAL Seguridad Social (14%) Subcontrataciones Pago del Contravalor Impuesto sobre utilización F.T. (15%) Materiales Dietas y Pasajes Otros Gastos SUBTOTAL TOTAL DE GASTOS DIRECTOS Gastos Indirectos (ST x 1.0045) TOTAL DE GASTOS TOTAL GENERAL DEL PROYECTO I Año MN 13905.10 II Año CUC MN 13905.10 CUC TOTAL MN 27810.20 1263.97 1263.97 2527.94 15169.07 1820.29 15169.07 1820.29 30338.14 3640.58 39309.16 39309.16 78618.32 2275.36 2275.36 4550.72 73.8 40676 24150 73.8 16907 22890 147.6 3300.00 46778.6 3300.00 46778.6 6600.00 93557.2 61947.68 61947.68 123895.36 15237.33 15237.33 30474.67 77185.01 64826.00 77185.01 39797 CUC 57583 47040 154370.02 104623.00 154370.02 104623