Tecnología de DNA recombinante

Tecnología de DNA
recombinante
Esther Zoraya Vega, Ph.D.
Certificado en Biotecnología
DNA recombinante
Es la tecnología que permite combinar
DNA de diferentes organismos en una
sola molécula de DNA.
DNA recombinante
Stanley Cohen
Herbert Boyer
DNA recombinante
Enzimas de restricción
Son
endonucleasas,
que pueden
romper enlaces
fosfodíester en el
DNA en secuencias
específicas.
Enzimas de restricción
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción reconocen
secuencias palindromes de 4 a 8
bases.
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción no afectan
el DNA del organismo que lo produce
Mapas de restricción
Mapas específicos que se obtienen por enzimas
de restricción que se puede generar utilizando
cualquier molécula de DNA ó genomas de
cualquier organismo.
Replicación del DNA- in
vitro PCR


Descubierta en
1985 por Kary
Mullis.
Recibío el Premio
Novel en 1993.
PCR



Técnica que permite la amplificación de una
secuencia específica de DNA
millones de veces.
PCR se fundamenta en el fenómeno de la
extensión de un “primer” por la polimerasa
de DNA descubierto en los 60’s.
Ha revolucionado muchas áreas de
investigación como: diagnóstico de
enfermedades, medicina forense y
evolución molecular.
PCR
PCR utiliza la amplificación
enzimática para aumentar el
número de copias de cualquier
fragmento de DNA hasta 6000
pares de bases de largo.
Replicación del DNA

In vitro
PCR
PCR..\Certificado en Biotecnologia\pcrwin.zip
PCR
Reacción se somete a múltiples
ciclos de síntesis que
consisten de:
Desnaturalización
Calentamiento hasta cerca a
94oC, rompiendo los puentes de
hidrógeno entre las bases, y la
doble hebra de DNA se separa.
PCR
Hibridización (annealing)
La disminución de la temperatura
a ~ 65o permite que las sondas
(primers) hibridizen con su
secuencia complementaria en la
hebra sencilla de DNA. La
temperatura óptima depende de la
proporción de AT a GC en la
secuencia de la sonda.
PCR
 Cada
ciclo dura ~ 2 minutos.
 25 ciclos de síntesis produce,
teóricamente, 1,000,000 de
copias de la secuencia blanco.
 25 ciclos toma
aproximadamente 1 hr.
PCR
Detección
Clonaje
 Generación
de múltiples copias de
fragmentos de DNA por amplificación
ó multiplicación de moléculas de DNA
recombinante en un hospedero como
una bacteria.
Replicación del DNAClonaje del DNA
Requisitos de los vectores
de clonaje
 Origen
de replicación
 Marcador dominante – gen que
confiera resistencia a antibíotico
 Lugares únicos de restricción
Vectores de clonajepBR322
 Plasmidios
– se
comportan como
mini-cromosomas
+ y
 pBR322 – tet
amp+;
fragmentos
pequeños ~ 5
kb
pUC18




Se producen en # alto
de copias.
MCS- (polylinker)
lugar de inserción DNA
Resistencia a amp y
lacZ gene
En presencia de IPTG
y X-gal, las colonias
son azules (por la
presencia de la
enzima activa).
Vectores de clonaje

Fagos – derivados de
fago λ (10-15 kb)
 Cíclico lítico es
posible; lisogénico no
 Contiene “cos ends”
del fago (para hacer
λ circular)
 Presencia de placas
en gramas de E. coli
indica la presencia de
moléculas
recombinantes
Vectores de clonaje

Cosmidos- vectores híbridos artificiales
que contienen componentes de y de
fagos, aumentando el tamaño del
fragmento a clonar a 45 Kb (in vivo como
plasmidios; in vitro como fagos)

Luego de empacarse, fagos recombinantes son
utilizados para infectar bacterias donde se
reproducirán como plasmidios
Vectores de clonaje

YACs - hasta 1000
Kb; llevan
centrómeros,
origen de
replicación y
telómeros
Vectores de clonaje

BACs - basado en
7 Kb factor F de E.
coli que actúa
como factor F’
(100-300 Kb)
Vectores de expresión

Vectores de expresión
– permite la expresión
de secuencias
clonadas
fusionándolas con
“transcription and
translation start and
stop sequences”.
Permite la expresión
del DNA clonado en su
respectivo hospedero.