RETROVIRUS. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) N. Cordeiro, R. Taroco, D. Ruchansky Actualizado abril de 2012 por D. Ruchansky, INTRODUCCIÓN E IMPORTANCIA La familia Retroviridae es una de las familias más interesantes y complejas de los virus animales. El término retro significa hacia atrás, y el nombre hace referencia a que estos virus tienen un modo inverso de replicar el ácido nucleico. Los retrovirus son virus con un genoma constituido por ARN, pero se replican por medio de un ADN intermediario usando la enzima transcriptasa inversa (o retrotranscriptasa). Los retrovirus son interesantes por varias razones: • fueron los primeros que se demostró la capacidad que tienen para causar cáncer habiéndose estudiado ampliamente por sus características carcinogénicas; • un grupo de retrovirus, el causante del Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) aunque se conoce solo desde los primeros años de la década de 1980, ha llegado a representar uno de los mayores problemas de salud pública; • el genoma de los retrovirus puede integrarse específicamente en el genoma del hospedador gracias al ADN intermediario. TAXONOMÍA Y CLASIFICACIÓN Los retrovirus son una familia de virus envueltos, con ARN como material genético, que se replican a través de un intermediario de ADN en las células que parasitan. Los vertebrados son su hospedero. Los retrovirus pertenecen a la familia Retroviridae, su estructura taxonómica presenta 2 subfamilias (Orthoretrovirinae y Spumaretrovirinae) que a su vez se subdividen en 7 géneros definidos por su relación evolutiva (Tabla 1). Cinco de estos grupos son retrovirus con potencial oncogénico (antiguamente denominados oncovirus) y los otros dos grupos son los lentivirus y los spumavirus. 1 GENERALIDADES MORFOLÓGICAS DE LOS RETROVIRUS Comprende una gran cantidad de virus que se caracterizan por presentar una morfología común, un genoma constituido por dos moléculas idénticas de ARN de polaridad positiva, y por poseer una transcriptasa reversa. Los virus de la familia Retroviridae se caracterizan por ser partículas envueltas, con un diámetro entre 80 y 120 nm, que contienen nucleocápside enrollada dentro de una cubierta probablemente icosaédrica. La envoltura contiene glicoproteínas víricas (espículas) y es adquirida al brotar por gemación a través de la membrana plasmática de la célula huésped. Existen varias proteínas en la envoltura de los virus y siete proteínas internas típicas, cuatro estructurales y tres enzimáticas. Las proteínas con actividad enzimática (codificadas por el gen pol) que se encuentran dentro de la partícula vírica son, la transcriptasa inversa, una endonucleasa de ADN (integrasa), y una proteasa. El virión también contiene moléculas específicas de ARNt celular que se utiliza en el proceso de replicación. (Fig. 26.1) 2 Figura 26.1: Esquema con las generalidades de los retrovirus, las proteínas estructurales y su función. CARACTERÍSTICAS RETROVIRUS Y REPLICACIÓN DEL GENOMA DE LOS El genoma de los retrovirus contiene dos copias de ARN monocatenario de polaridad positiva (ARN+). El extremo 5´ del ARN presenta cap y el extremo 3´ esta poliadenilado( Fig 26.2), de modo que el ARN es capaz de actuar directamente como ARNm, aunque no es usado como tal. Todos los retrovirus contienen los siguientes genes y en el mismo orden: • gag: codifica proteínas estructurales internas (antígeno específico de grupo). • pol: codifica la transcriptasa inversa, la proteasa y la integrasa. • env: codifica las proteínas de la envoltura. 3 Figura 26.2. Esquema del genoma de los retrovirus PATOGENIA DE LOS RETROVIRUS La mayoría de los retrovirus afectan a un espectro de huéspedes y especies muy limitado. Aunque no todos los retrovirus causan cáncer, son muy comunes los retrovirus tumorales. Algunos conocidos virus tumorales causan sarcomas o leucemia aguda, y poseen un alto potencial oncogénico. La infección con uno de estos virus puede originar transformación celular y la formación de tumores. Se cree que estos retrovirus poseen un gen transformante u oncogén que codifica una proteína responsable de la transformación celular. Este gen codifica una fosfoproteína que posee actividad de proteína quinasa, estas catalizan la fosforilación de proteínas, mecanismo que regula la actividad de las proteínas. En las células normales se han encontrado genes similares, los protooncogenes, lo que sugiere que estos genes son importantes en el crecimiento celular. Los retrovirus son capaces de incorporar esas secuencias normales, que luego se alteran o se expresan de modo anormal. En consecuencia, los retrovirus son agentes mediante los cuales tales genes se transfieren de célula a célula. Un retrovirus importante, el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) causante del SIDA, es un retrovirus no tumoral. 4 VIH-VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA Introducción El Virus de Inmunodeficiencia Humana es el causante de una de las mayores pandemias detectadas a finales del siglo pasado y que persiste en el presente. Produce una infección crónica en la persona infectada que lleva a una progresiva destrucción de su sistema inmune, provocando el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida. En Junio de 1981 se registraron los primeros reportes de pacientes homosexuales, que vivían en USA, afectados por enfermedades que hasta entonces habían sido poco frecuentes, como la neumonía por Pneumocystis carinii (actualmente Pneumocystis jiroveci) y el sarcoma de Kaposi. Pero rápidamente, casos similares fueron reportados en otros grupos que incluían usuarios de drogas inyectables y hemofílicos. Dos años después en el Instituto Pasteur de París, Barré-Sinoussi, Chermann, Montagnier y científicos asociados, detectaron actividad transcriptasa reversa en el sobrenadante del cultivo celular en los linfocitos de nódulo linfático de un paciente que presentaba síndrome de linfoadenopatía persistente, indicando la presencia de un retrovirus, al que denominaron Virus Asociado a Linfoadenopatías (sigla en inglés: LAV). Este primer resultado se publicó en la revista Science en mayo de 1983, y es en rigor el primer trabajo sobre el virus causante del Sida. Los únicos retrovirus humanos conocidos hasta entonces eran los denominados Virus linfotrópicos humanos de células T (HTLV-I y II sigla en inglés), que habían sido recientemente descubiertos por el Dr. Gallo y sus colaboradores. Ente 1983 y 1984 los equipos científicos del profesor Gallo del U.S. National Institutes of Health y del Dr. Jay Levy de la Universidad de California, dan cuenta del aislamiento de retrovirus en células mononucleares periféricas de pacientes con SIDA, denominándolos HTLV-III (en inglés Human T-Lymphotropic Virus Type III)6 y ARV (en inglés AIDS-associated retrovirus), respectivamente. Posteriormente estos tres virus fueron definidos como variantes de un mismo retrovirus, agente etiológico del SIDA y asignado al género Lentivirus. En 1986 el Comité Internacional de Taxonomia Viral, recomendó el nombre de “Virus de Inmunodeficiencia Humana” (VIH). En el mismo año, el equipo de científicos de Luc Montagnier descubrió la circulación de una variante en pacientes de Africa occidental . Fue entonces que el virus original fue designado como VIH-1 y la variante VIH-2, ambos capaces de producir SIDA en seres humanos. 5 EPIDEMIOLOGIA “En junio de 1981 atendimos a un joven varón homosexual que presentaba la inmunodeficiencia más devastadora que habíamos visto hasta entonces. Dijimos: No sabemos qué es, pero esperamos no volver a ver ningún otro caso parecido nunca más”. (Palabras del Dr. Samuel Broder-OMS, 1994) Las palabras del doctor Samuel Broder, describen el impacto de los primeros casos de SIDA en los hospitales de los Estados Unidos, la República Democrática del Congo y a orillas del Lago Victoria, en África oriental. El mundo tardó en reconocer la gravedad de esta nueva crisis de salud y en los años en que el SIDA permaneció fuera de los planes políticos, la infección se afianzó con una fuerza que todavía no ha remitido. Con la creación del Programa Mundial sobre el SIDA en 1987 y el Programa Conjunto de las Naciones Unidas sobre el VIH/SIDA (ONUSIDA) en 1996, las Naciones Unidas pasaron a abordar el SIDA no como un problema de salud aislado, sino como un problema de desarrollo humano tan significativo como cualquiera de los que se le presentan al mundo actualmente. 6 Desde su aparición hasta la actualidad, la infección por VIH ha dejado de ser una condición fatal para convertirse en una enfermedad crónica que puede tratarse. El desarrollo de la terapia antirretroviral (TARV) ha sido uno de los avances de gran importancia en la historia de la medicina. De acuerdo al informe de ONUSIDA 2011 “a fines de 2010, aproximadamente 34 millones de personas [31,6 millones–35,2 millones] vivían con el VIH en todo el mundo, un 17% más que en 2001. Esto refleja gran número de nuevas infecciones por el VIH y una expansión significativa del acceso al tratamiento antirretrovírico, que ha ayudado a reducir las muertes relacionadas con el sida, especialmente en los últimos años. El número de personas que mueren por causas relacionadas con el sida disminuyó a 1,8 millones [1,6 millones–1,9 millones] en 2010, desde el nivel máximo de 2,2 millones [2,1 millones–2,5 millones] alcanzado a mediados de los años 2000. Desde 1995, se ha 7 evitado un total de 2,5 millones de muertes en países de ingresos bajos y medianos debido al tratamiento antirretrovírico que se introdujo, según los nuevos cálculos de ONUSIDA. Gran parte de ese éxito proviene de los últimos dos años, cuando se produjo una rápida ampliación del acceso al tratamiento; solo en 2010, se evitaron 700.000 muertes relacionadas con el sida. La proporción de mujeres que viven con el VIH se ha mantenido estable al 50% en todo el mundo, aunque este grupo de población es más afectado en África subsahariana (59% de todas las personas que viven con el VIH) y el Caribe (53%). En 2010, hubo 2,7 millones [2,4 millones–2,9 millones] de nuevas infecciones por el VIH, que incluye una cifra estimada de 390.000 [340.000–450.000] niños. Esto representó un 15% menos que en 2001, y un 21% por debajo del número de nuevas infecciones en el nivel máximo de la epidemia en 1997. ” Figura 26.3: Distribución mundial de niños y adultos viviendo con VIH en 2011.Principales vías de transmisión por región. Basado en “Informe de ONUSIDA para el día mundial del SIDA/2011” Distribución mundial de niños y adultos viviendo con VIH Principales vías de transmisión por región. Datos ONUSIDA 2011 Europa occidental y central América del Norte 840 000 1,3 millones Europa oriental y Asia central 1,5 millones UDI HSH, UDI HSex, HSH, UDI Caribe 470 000 200 000 Asia oriental 790 000 África del norte y Oriente Medio HSex, UDI HSex, HSH HSex, UDI, HSH Asia meridional y sudoriental 4 millones América Latina África subsahariana 1,5 millones 22,9 millones HSex, HSH, UDI HSex HSex, UDI Oceanía 54 000 HSH Total: 34 (31,6– 35,2) millones HSex: Heterosexual, HSH: hombres que tienen relaciones sexuales con hombres, UDI: Usuarios de Drogas Inyectables. Se cree que, a nivel mundial, la tasa de incidencia del VIH (el número anual de nuevas infecciones por el VIH como proporción de las personas previamente no infectadas) alcanzó su cota máxima a finales de los años 1990 y que se ha estabilizado desde entonces, a pesar de una incidencia creciente en varios países. En diversos países, las tendencias favorables en la incidencia se relacionan con programas de prevención y cambios de comportamiento. Las modificaciones en la incidencia, junto con la mayor mortalidad por SIDA, han provocado la nivelación de la prevalencia mundial del VIH (la proporción de personas que viven con el VIH). Sin embargo, el número de personas que viven con el VIH ha seguido aumentando a causa del crecimiento de la población y, en fechas más recientes, los efectos de la terapia antirretrovírica sobre la esperanza de vida 8 Figura 26.4 : Nuevas infecciones por el VIH y muertes relacionadas con el SIDA “Informe de ONUSIDA para el día mundial del SIDA/2011”. En África subsahariana, la región con la carga máxima de la epidemia de SIDA, los datos también indican que la tasa de incidencia del VIH ha alcanzado su cenit en la mayoría de los países. No obstante, las epidemias en esta región son muy diversas y especialmente graves en África meridional, donde algunas de ellas todavía siguen expandiéndose. A pesar de los progresos realizados en la ampliación del acceso a la terapia antirretroviral (TARV), actualmente solo llegan a una de cada cinco personas que los necesitan en los países de ingresos bajos y medianos. Los países se hallan en diferentes fases de la respuesta; algunos, como Brasil, ya han alcanzado el 80% de la cobertura del tratamiento, mientras que otros apenas han llegado al 5%, o menos. La principal vía de transmisión de esta pandemia es la heterosexual, involucrando aproximadamente al 85% del total de las infecciones. El consumo de drogas inyectables es el principal factor impulsor de la epidemia en Europa occidental, mientras que en África meridional la epidemia se propaga básicamente por las relaciones heterosexuales no protegidas. Cerca de la mitad de todas las nuevas infecciones se producen en menores de 25 años (incluidos los niños que contraen la infección a través de la madre). La importancia de los comportamientos de riesgo (como el consumo de drogas intravenosas con equipos de inyección no estériles, las relaciones sexuales remuneradas sin protección y las relaciones sexuales sin protección entre varones) resulta especialmente evidente en las epidemias de VIH de Asia, Europa oriental y América Latina 9 En Uruguay el primer caso de SIDA internado en la Clínica de Enfermedades Infecciosas de la Facultad de Medicina, fue identificado en 1983. Se trató de un paciente de 38 años procedente de Nueva York (EEUU). Entre 1983 y 1988 fueron identificados y tratados en la mencionada Clinica veinte casos de SIDA, cuyas edades oscilaban entre los 21 y 54 años. La mayoría de los pacientes se habían infectado en el exterior. El primer caso autóctono en Uruguay se diagnosticó en 1986. La Epidemia de VIH/SIDA en nuestro país tiene carácter endémico y con un patrón de distribución de “tipo concentrada”, es decir baja prevalencia en población general. general (cifras inferiores al 1%) y alta prevalencia de VIH (superior a 5%), en poblaciones específicas. Estas poblaciones son consideradas con mayor vulnerabilidad y dificultades de acceso a los servicios de prevención y atención (en particular personas privadas de libertad, usuarios de drogas, trabajadores/as sexuales masculinos y femenino, hombres que tienen sexo con hombres). A diciembre 2010, aproximadamente 13.978 personas estaban viviendo con el VIH, con una prevalencia en población general del 0.42% (relevamiento del año 2008), esto significa que de cada 10.000 uruguayos existían 42 personas viviendo con VIH en ese año. Del punto de vista geográfico, 9 75% de los casos notificados pertenecen a la ciudad de Montevideo y el 9 25 % restante al resto de los departamentos, donde la prevalencia mayor se detecta en Maldonado, Rivera, Rocha, Artigas, Cerro Largo y Canelones. Observándose que los departamentos más afectados son los fronterizos, de movimiento turístico y con poblaciones móviles. En relación al sexo (casos notificados 1/2005- 7/2010) 9 54.1% población de varones 9 45.9% población de mujeres En relación a la edad: 9 Edad de máxima incidencia entre 25 y 34 años, aunque afecta a todos los grupos etarios En relación a las vías de transmisión( Datos en base a las notificaciones. Informe Epidemiológico VIH/SIDA ITS-VIH/SIDA diciembre 2010): 9 transmisión sexual (64.8%), 9 sanguínea (15.04%), 9 transmisión perinatal (transmisión madre a hijo) (1,5%). 10 Dentro de la transmisión sexual el 70,1% pertenece a población heterosexual. En la transmisión sanguínea hay un predominio neto entre los usuarios de drogas inyectables (UDI) del 98,9%, generalmente involucrados con actividades heterosexuales constituyendo un reservorio importante de transmisión heterosexual TRANSMISION DEL VIH La transmisión del VIH ocurre en situaciones que facilitan el intercambio de fluidos con capacidad infectante (sangre, semen, líquido pre seminal, fluidos vaginales, leche materna). Las principales vías de transmisión son: • Transmisión sexual • Transmisión sanguínea • Transmisión materno-infantil (transmisión vertical) Transmisión Sexual: La transmisión sexual es la principal forma de infección en el mundo, responsable de aproximadamente el 75% de todos los casos. La velocidad de propagación por esta vía es superior a cualquiera de las otras, y es máxima en las parejas femeninas de drogadictos por vía intravenosa, contribuyendo a la “feminización” de esta epidemia. El virus está presente en el semen, libre y dentro de los linfocitos; además se encuentra en las secreciones vaginales y en las células de la mucosa cervical de las mujeres infectadas. Es bien demostrada la transmisión de varón a varón y de varón a mujer, pero es de destacar que el riesgo de transmisión es mayor en el sentido varón a mujer que de mujer a varón. Esto se debe principalmente a que el semen queda depositado en la vagina de la mujer teniendo mayor tiempo de exposición, por otro lado hay mayor cantidad de mucosa que queda expuesta al contacto con el semen. Las relaciones sexuales con penetración vaginal o anal sin protección (uso de condón) tanto heterosexuales como homosexuales, pueden trasmitir el VIH. Las relaciones sexuales buco-genitales (boca-pene, boca-vulva) también implican un riesgo de trasmisión. El virus se transmite de dos formas: 1) a través de las células de Langerhans (células dendríticas) de la mucosa y 2) por la inoculación directa en los vasos sanguíneos rotos por traumatismos, Las relaciones sexuales anales son las que tienen mayor riesgo de transmisión ya que la mucosa anal es más frágil que la mucosa vaginal. La coexistencia de otras enfermedades de transmisión sexual, principalmente las asociadas a ulceraciones genitales, favorece la infección. Son de especial importancia la sífilis, el 11 chancro blando y el herpes. En estas enfermedades que cursan con inflamación genital se produce mayor concentración del virus en el semen. Transmisión sanguínea: Por esta vía el virus puede trasmitirse de las siguientes maneras: - Compartiendo jeringas u objetos cortopunzantes contaminados con sangre infectada, por ejemplo en el uso de drogas intravenosas, tatuajes, piercings. - Transfusiones de sangre. El riesgo de que esto ocurra es muy bajo gracias a las medidas de tamizaje que se utilizan: la búsqueda de anticuerpos anti-VIH en sangre y plasma donados, el tratamiento con calor de los concentrados de factores de coagulación, y la detección selectiva de donantes a partir de sus antecedentes. Aun así existe un riesgo muy pequeño de infección a través de sangre “no reactiva” para los anticuerpos anti-VIH , es el caso de donantes que se encuentran dentro del “período ventana”, donde la concentración de anticuerpos es muy baja y no logra ser detectada. Actualmente se aplican metodologías con alta sensibilidad que permiten acotar este riesgo. - Mediante el consumo de drogas que se aspiran o el uso de latas para su consumo. Existe riesgo siempre que se comparta el “canuto” (para aspirar) y haya sangrado por la nariz o la “lata” y haya cortes a nivel de la boca. Transmisión materno-infantil: La transmisión madre-hijo es la causa más importante de SIDA pediátrico. La transmisión puede suceder : - Durante el embarazo: Sucede cuando el virus traspasa la barrera placentaria e infecta al feto. El riesgo de transmisión en esta etapa depende de la carga viral de la mujer y de la etapa de la infección en que se encuentre. - En el momento del parto: En esta instancia los riesgos de transmisión son mayores, debido al contacto estrecho del bebé con secreciones vaginales y con la sangre de la madre. - A través de la lactancia: El riesgo por esta vía aumenta con el tiempo de duración del amamantamiento, la alternativa de alimentación mixta no lo reduce. El riesgo de transmisión vertical se puede disminuir con el estudio serológico de VIH durante los controles del embarazo y con el tratamiento antirretroviral oportuno de las madres. En Uruguay la incidencia de la transmisión vertical del VIH ha descendido de un 28% (1995) a un 1,5% (2006), producto del control y la aplicación de tratamiento antirretroviral a las mujeres embarazadas portadoras de VIH. 12 TAXONOMIA Y CLASIFICACION El VIH pertenecen a la familia Retroviridae, subfamilia Orthoretrovirinae, género Lentivirus. Hasta el momento se han hallado dos tipos de estos virus, el VIH-1 descrito en 1983 y que se ha diseminado por todo el mundo, originando la pandemia antes mencionada y el VIH-2 descubierto en 1986 , que se presenta endémicamente en África occidental y que lentamente se ha ido diseminando a otros países. Estos virus fueron trasmitidos al hombre a partir de diferentes especies de primates, representando por ende infecciones zoonóticas Se ha determinado que la subespecie de chimpancés Pan troglodytes troglodytes es el reservorio del virus de la inmunodeficiencia simia (SIV cpz), que tiene una gran homología con el VIH-1, mientras que el VIH-2 deriva del virus de inmunodeficiencia simia que se encuentra en el mono negro mangabey (Cercocebus atys) (SIV sm). (ver fig 26.4) Figura 26.4: Origen del VIH. Evento zoonotico Una de las principales características que presenta el VIH es su alto grado de diversidad y variabilidad genética asociada a la alta tasa de error producida por la transcriptasa reversa y al fenómeno de recombinación entre genomas heterogéneos co-infectantes de una misma célula. A principios de la década del ’90 se realizaron estudios filogenéticos que permitieron determinar, en base fundamentalmente al análisis del gen env, la existencia de 4 grupos dentro del VIH-1: el grupo M (mayor) que es el prevalente a nivel mundial y el cual incluye actualmente 11 subtipos o sub-subtipos designados de la A a la K, el grupo O 13 (“outlier” o divergente), el grupo N (no M/no O) y el grupo P reportado en 2009. Gracias a los avances tecnológicos que permiten la secuenciación total del genoma viral, se han incorporado en la clasificación las formas recombinantes del VIH-1 que contienen secuencias derivadas de dos o más subtipos, denominadas formas recombinantes circulantes (sigla en inglés CRF) y formas recombinantes únicas (sigla en inglés URF). Actualmente se han identificad más de 47 CRFs y se han descrito más de 30 URFs. De la misma forma que para el VIH-1, se han realizado estudios filogenéticos para el VIH-2, clasificándose en 8 grupos, designados de la A a la H. , siendo los grupos A y B los predominantes, mientras que C-H representan hasta el momento infecciones únicas. (Fig 26.5) Figura 26.5: Diversidad genética del VIH Diferentes aspectos de la epidemia están relacionados con la diversidad genética de este virus. El VIH-1 y el VIH-2 no solo presentan diversidad en su distribución geográfica, sino que poseen diferencias en la secuencia genómica en más de un 55%, diferencias antigénicas e incluso patogénicas, el VIH-2 presenta menor capacidad de transmisión y un período de incubación más largo hasta el desarrollo del SIDA. (ver Fig 26. 6) 14 Fig 26. 6: Distribución geográfica del VIH Distribución Geográfica del VIH Tipos, Subtipos y CRFs A A B,A,C,D, A,C,D,F G A,B A,B A,D,E,O B A A,B, B A,B B,D C,D ,C B/F CRF/URF VIH-1 VIH-2 La variabilidad viral tiene su impacto también en la resistencia a antirretrovirales. Es conocido que tanto el VIH-2 como el grupo O del VIH-1 presentan resistencia natural a los inhibidores no nucleosídicos de la Retrotranscriptasa (INNTs), debido a la sustitución de una base en el gen que la transcribe. La recombinación viral presenta ciertas ventajas frente a las cepas parentales, incluyendo modificación en el tropismo y en la cinética de replicación. Bajo la presión selectiva generada por los antirretrovirales, la recombinación entre cepas de diferente sensibilidad a las drogas, resultan en una nueva variante con múltiple resistencia antiviral. MORFOLOGÍA VIRAL Estos virus se caracteriza por presentar una morfología pleomórfica o esférica (80 a 120 nm de diámetro) recubiertos de una envoltura lipídica proveniente de la membrana citoplasmática de la célula huésped en la que se encuentran aproximadamente 75 espículas formadas por glicoproteinas de superficie y transmembrana, que se proyectan desde la superficie del virus maduro. Presentan una estructura compleja que involucra una cápside centrada, y una matriz proteica. El core se presenta en forma de cono truncado, formado por una proteína que contiene en su interior la información genética viral en 2 monohebras casi idénticas de ácido ácido (ARN) de sentido positivo (igual polaridad del ARN mensajero) que poseen cap en el extremo 5’ y una cadena poliAdenosina en su extremo 3’; un ARN de transferencia (usualmente Lisina) y 3 enzimas requeridas para la replicación viral: retrotranscriptasa, proteasa e integrasa. (Figura 26.7) Figura 26.7. Representación esquemática del virión de VIH. PR: Proteasa, M: matriz, NC: nucleocápside, SU glioproteína de superficie, TM: glicoproteína 15 transmembrana, IN: integrasa, RT: retrotranscriptasa, ARN: monohebra de ARN+, CA: cápside. Extraído y modificado de Principles of Virology. Genoma viral Está constituido por dos moléculas de ARN de cadena simple de 9400 pares de bases, unidas por enlaces no covalentes. Los clásicos genes estructurales gag, pol, y env, codifican proteínas precursoras que serán divididas luego por la proteasa en proteínas maduras (ver figura 26.8). El genoma del VIH contiene además otros genes: tat, rev, vif, nef, vpr y vpu, encargados de la regulación de la síntesis y de la organización de las partículas virales infecciosas Figura 26.8: Organización genómica del VIH El gen gag codifica una proteína precursora de 55 kDa (Pr55gag) que es procesada en 16 las proteínas estructurales de la Matríz y Capside del virus (p17 y p24) y en las proteínas estructurales del Core (p15 que posteriormente es procesada a p7 y p9). Los productos del gen pol (gen de la polimerasa) son traducidos a partir del mismo ARNm que las proteínas gag. La poliproteína precursora Pr180 gag-pol se procesa originando la Pr55gag y las proteínas codificadas por el gen pol: PR, RT e IN El gen de envoltura (env) codifica un precursor polipeptídico p85 que luego es glicosilado formando la proteína precursora gp160. Esta es luego procesada por una proteasa celular formando la glicoproteina de superficie gp120 (SU) y la proteína transmembrana gp41 (TM). Tabla 26.1: Proteínas estructurales, reguladoras y accesorias del VIH. Extraído y modificado de “HIV Sequence Compendium 2009” 17 Mecanismos de patogenicidad En las personas infectadas con el VIH es habitual la observación de distintas anormalidades inmunológicas: •severa linfopenia, principalmente de células T CD4+; •reacciones de hipersensibilidad cutánea retardada disminuidas o ausentes, perdida de la función citotóxica de las células natural killer (NK); •función anormal de los monocitos; •hipergammaglobulinemia policlonal. La molécula CD4 sirve como receptor del VIH, es por ello que el virus no solo infecta a los linfocitos T CD4+, sino a otras células que también expresan este receptor, como monocitos de sangre periférica, precursores de células T de la medula ósea y el timo, y macrófagos tisulares. Entre éstos últimos están las células dendríticas foliculares de los ganglios linfáticos y la piel, las células de Langerhans del timo, y las células microgliales en el cerebro. Este virus reduce la capacidad funcional global (disminución de función y de número) de los linfocitos T periféricos y de las células presentadoras de antígeno, e inhibe la producción y maduración de los precursores de la médula. Por tanto, la patogenicidad del VIH se debe a su afinidad por las células CD4+, que lleva a una disminución de la respuesta inmune normal del huésped, luego a la destrucción de la inmunidad, y finalmente a la muerte por infecciones oportunistas. Eventos de la infección La vía sexual implica la entrada del virus a través de las mucosas orofaríngea, genital y anal. La efectividad de la transmisión es mayor si es por vía parenteral. En las superficies mucosas, además de las células epiteliales se encuentran las células de Langerhans; las mismas tienen función de células presentadoras de antígenos (CPA) A nivel de las submucosas también se hallan presentes células de Langerhans y macrófagos. Las partículas virales que viajan en las secreciones vaginales o en el semen, atraviesan la barrera mucosa con mayor facilidad si está lesionada (si bien esto no constituye un factor limitante), y se encuentran en la mucosa o la submucosa con las CPA. Estas células reconocen a la partícula viral como extraña, la incorporan a su superficie o la procesan por medio de fagocitosis, procesando también los antígenos virales para ser presentados a los linfocitos. El macrófago es incapaz de destruir a la partícula viral. Se limita a procesarla, por lo que en el interior de un macrófago es posible encontrar innumerables partículas virales. También a este nivel la partícula viral puede encontrarse además con los linfocitos CD4+. Por lo tanto, el virus una vez atravesada la 18 barrera mucosa puede: a) quedar dentro de un macrófago, b) ser presentado a los linfocitos CD4 por las CPA, o c) adherirse directamente a los linfocitos CD4+ y comenzar a multiplicarse en su interior. Posteriormente, los linfocitos CD4+ y los macrófagos con las partículas virales en su interior, o las partículas virales libres, se dirigen hacia los ganglios linfáticos regionales. En los centros germinales de estos ganglios regionales se encuentran otras células con un papel fundamental en la patogenia del VIH: las células foliculares dendríticas. Estas tienen en su superficie numerosas proyecciones digitiformes con receptores CD4, a los cuales se unirán las partículas virales libres de la circulación, atrapando de esta manera innumerables virus. Éstos son presentados por estas células a todos los linfocitos que, circulando por la linfa o la sangre, pasan por dichos ganglios siendo así infectados. De ese modo, a partir del ganglio regional el virus se disemina a todo el organismo, a todos los tejidos con células que tengan receptores y correceptores que las hagan pasibles de ser infectadas, multiplicando de esta manera la infección. Las partículas virales se diseminan por todo el organismo sembrando varios órganos, particularmente órganos linfoides como nódulos linfoides, bazo, amígdalas y adenoides. Si bien tiene una diseminación sistémica, el blanco fundamental del VIH es el sistema inmune, y dentro de éste los linfocitos CD4+. Una vez en la sangre, se producen los eventos tempranos de la infección por el VIH. En esta etapa temprana se puede detectar gran cantidad de partículas virales a nivel plasmático. Esto se expresa como carga viral, y en esta etapa temprana de la infección puede llegar a 10 millones o más de partículas por mL de plasma (107Copias ARN/mL). Estas partículas tienen una corta vida media libre en el plasma (aproximadamente unos 10-15 minutos). Los linfocitos CD4 + que están produciendo virus tienen una vida media de 1 a 2 días. La partícula viral una vez liberada al plasma tiene que buscar nuevas células con receptores CD4, para poder infectar y continuar su ciclo de replicación viral. En esta fase aguda el número de células CD4+ en la circulación decrece en 20 a 40%, quizás por muerte celular o por dejar la circulación y dirigirse a los órganos linfoides para preparar la respuesta inmune. Dos a cuatro semanas luego de la exposición, cerca del 70% de las personas sufren síntomas similares a una gripe (síndrome retroviral agudo). El sistema inmune enfrenta la infección mediante las células T “killer” y los anticuerpos producidos por los linfocitos B, logrando una reducción dramática de los niveles de virus. En el momento inicial de la infección existen muchas partículas libres en plasma. Pero en un período de dos a tres meses se van generando una serie de respuestas por parte del sistema inmune del huésped, produciéndose de manera espontánea una drástica caída de la carga viral, sin que medie un tratamiento antiviral. Este nivel de carga viral (setpoint) varía de individuo a individuo, y es predictivo de la evolución clínica a largo plazo. Los mismos permanecen bajos (dependiendo del sistema inmune de cada individuo) durante un largo período de tiempo, que puede llegar a 10 años o más. En determinado 19 momento, la carga viral plasmática comienza a aumentar nuevamente, coincidiendo con la etapa clínica de SIDA A esta fase temprana le sigue el período de infección activa inaparente, no obstante lo cual no significa que no haya replicación viral. Si bien la carga viral cae, y no existen síntomas, la replicación viral continúa permanentemente. Se establece un equilibrio, por el cual habría una producción y destrucción de 10 billones de partículas virales por día, así como una producción y destrucción de 2 billones de linfocitos CD4 por día. Este equilibrio se mantiene aproximadamente por 10 años (dependiendo de la carga viral inicial o setpoint, el estado inmunológico de la persona infectada, entre otros). Durante este período la replicación viral no tiene lugar a nivel sanguíneo, la misma se da en los tejidos linfoides profundos: los ganglios linfáticos y el tejido linfoide asociado a las mucosas (gastrointestinal, respiratoria, etc.). En el período de enfermedad clínica existen variaciones. En la etapa de infección sin clínica de enfermedad, distintos factores influyen en la progresión hacia la enfermedad: edad, diferencias genéticas entre los individuos, la virulencia de las diferentes cepas, y la coinfección con otros microorganismos. La existencia de mutaciones en los correceptores puede influir en el curso evolutivo hacia la enfermedad. Por ejemplo una mutación específica en una de las dos copias del gen del correceptor CCR5, tiene como resultado un curso más lento hacia la enfermedad. Tabla 26.2. Enfermedades indicadoras de SIDA. Infecciones oportunistas 20 Varios estudios demuestran que los individuos con alta carga viral circulante (setpoint) desarrollan más rápidamente los síntomas de SIDA y mueren. Las drogas utilizadas para prevenir o tratar las infecciones asociadas al SIDA han permitido prolongar y mejorar la calidad de vida. Las combinaciones de drogas que incluyen un inhibidor de la proteasa con dos inhibidores de la transcriptasa reversa, reducen la carga viral a niveles muy bajos y retrasan la progresión de la enfermedad por períodos muy prolongados.Se considera afectados de SIDA. a los pacientes infectados por el VIH que presentan alguna de las 26 complicaciones (infecciones o enfermedades diagnosticas de estadio SIDA., entre ellas la tuberculosis y/o candidiasis esofágica), o que tienen un conteo de linfocitos CD4+ inferior a 200/µL. Queda clara entonces la importancia clínica de la cifra de linfocitos CD4+, independientemente de la existencia o no de manifestaciones clínicas. Cuando el paciente alcanza el estadio clínico de SIDA., aparecen infecciones oportunistas características y neoplasias asociados a dicha patología (ver tabla 26.2). Los monocitos y macrófagos infectados por el virus, y relativamente resistentes a la muerte celular, viajan por todo el cuerpo llevando el VIH a varios órganos especialmente a los pulmones y al cerebro; 40 a 50% de las personas infectadas con VIH frecuentemente tienen manifestaciones neurológicas. La célula microglial y el macrófago son las células del cerebro infectadas por el VIH de manera habitual, pero también pueden infectarse las neuronas y las células gliales. La liberación de sustancias neurotóxicas o factores quimiotácticos por los monocitos y las células microgliales, favorecen el desarrollo de respuestas inflamatorias en el cerebro. También es probable que exista un efecto citopático directo del virus sobre las neuronas dando lugar a cuadros como la encefalopatía o complejo de demencia del S.I.D.A. Paradójicamente, aunque el VIH causa inmunodeficiencia, el curso de la enfermedad esta caracterizado por la hiperactivación del sistema inmune con consecuencias negativas. La activación crónica del sistema inmune durante la enfermedad puede resultar en una estimulación masiva de las células B, perdiendo éstas la habilidad de producir anticuerpos contra otros patógenos. Esta activación crónica lleva también a la apoptosis (o muerte celular programada), y al aumento en la producción de citoquinas que no solo estimulan la replicación del VIH, sino que también tiene efectos perjudiciales. Respuesta inmune La misma es iniciada por la inmunidad mediada por células. La respuesta humoral contra las proteínas virales más importantes (gag, pol, env) aparece entre tres semanas y tres meses luego de la exposición viral. Posee dos componentes: 1. Componente celular. – Respuesta de los linfocitos T CD8+ citotóxicos que reconocen en la superficie de la célula infectada, la presencia de partículas virales unidas a moléculas de 21 MHC de tipo I. Estos linfocitos liberan entonces enzimas contenidas en sus gránulos (por ejemplo: perforinas), que determinan la destrucción de la célula por un efecto citolítico directo. – Los linfocitos T CD8+ pueden actuar también por otro mecanismo, liberando mediadores o linfoquinas (quemoquinas), sustancias solubles con función quimiotáctica, que atraen al foco nuevas células defensivas. Estas quemoquinas se unen también a los receptores para quemoquinas presentes en las células pasibles de ser infectadas, bloqueando la fusión de nuevas partículas virales a estas célula. – Los linfocitos T CD4+ reconocen a su vez las partículas virales procesadas por las CPA y presentadas en conjunto a moléculas MHC de tipo II, produciendo así linfoquinas que se unen a sus receptores (de quemoquinas), bloqueando también la unión de nuevos virus a células. Pero sobre todo la función principal del linfocito T helper es potenciar (por medio de sus citoquinas estimuladoras) la respuesta de los linfocitos T CD8+, ya que ellos son el principal efector de la respuesta inmune. 2. Componente humoral. – El mismo está dado por los linfocitos B, los cuales reconocen en las CPA la presencia de sustancias antigénicas y reaccionan activándose, transformándose en plasmocitos y produciendo anticuerpos contra las proteínas de envoltura, de matriz, de nucleocápside viral y frente a las proteínas reguladoras del virus. Si bien el sistema inmune es capaz de generar una respuesta de tipo humoral, se ve abrumado por la rapidez con la que el virus (producto de su variabilidad antigénica) continuamente elabora partículas virales hijas capaces de evadir la neutralización. Esto probablemente se debe a que las partes más expuestas e inmunogénicas de la gp160 en su forma “compacta”, son altamente variables y al mutar ya no son reconocidas por los anticuerpos. Por otro lado, los epítopes más conservados, que interaccionan directamente con el receptor, y que serían los que inducirían anticuerpos neutralizantes de amplio espectro solo son expuestos cuando la proteína se despliega al unirse con el CD4. En este contexto, la eficacia de los anticuerpos neutralizantes es baja dada su restringida accesibilidad .La producción de anticuerpos puede detectarse de dos a ocho semanas después de la infección, luego de la declinación de la viremia inicial. La seroconversión se inicia con la respuesta IgM anti proteína gag; la respuesta IgG se produce entre la primera semana y la semana 41. En tal sentido, los primeros marcadores serológicos en ser evidenciados son IgG anti-p24 e IgG anti-gp120, seguido de IgG anti-gp41. Se ha visto que durante los primeros meses de la infección existe un aumento en el título de anticuerpos anti-p24, en simultáneo a una disminución en el nivel de antígeno p24. Luego de este tiempo el título de tales anticuerpos permanece estable, invirtiéndose esta relación durante la última etapa de la enfermedad (caen los niveles de IgG anti-p24 y suben los de p24) (ver figura 26.6). Como se mencionó anteriormente, luego de 22 la infección aguda por VIH sigue una fase de infección activa inaparente con una duración de entre 1 y 15 años, en la cual los pacientes permanecen asintomáticos pero con una declinación lenta y progresiva de su sistema inmune. Aquellas funciones dependientes de las células T CD4+ son las primeras en verse afectadas. Después de este período el sistema inmune, que hasta ese momento había sido capaz de equilibrar la producción y destrucción de las partículas virales, fracasa y ya no logra contener la replicación viral; se dispara nuevamente la carga viral y comienzan las manifestaciones de la etapa SIDA. Las mismas aparecen cuando los linfocitos disminuyen por debajo de 200 por mm3 (siendo el valor normal: 500-750 por mm3, aproximadamente). La perdida progresiva de linfocitos T CD4+ (calculada entre 60 y 70 linfocitos CD4+ por mm3 por año), puede atribuirse a una variedad de mecanismos. Muerte celular directa. Los virus se multiplican en su interior dando lugar a grandes progenies virales que al liberarse por gemación destruyen la célula. Formación de sincicios. Las células infectadas son capaces de fusionarse con otras células infectadas, y además con células no infectadas, formando de este modo células gigantes denominadas sincicios. Apoptosis. La presencia de material genético y proteínas virales activan el mecanismo apoptótico del linfocito T CD4+. Por otra parte, células no infectadas también pueden sufrir este proceso por señales inapropiadas recibidas a partir de células infectadas. Observadores inocentes. Los linfocitos T CD4+ con partículas virales en su superficie son atacados por los linfocitos T CD8. Anergia. Se ha observado en cultivos celulares que existiría alguna señal del VIH capaz de inhibir a las células T CD4+ impidiendo futuras respuestas a la estimulación inmunitaria. Daño a los precursores celulares. Algunos estudios sugieren que el virus destruye precursores celulares con funciones inmunes especiales, así como también partes de médula ósea y de timo necesarias para el desarrollo de tales células. La presencia de híbridos genómicos virales de ADN/ARN resulta tóxica para el linfocito. 23 CICLO DE REPLICACION DEL VIH Los pasos que sigue el VIH en su proceso de replicación se podrían puntear de la siguiente forma (Fig 26.9): 1. El ciclo de replicación viral del VIH comienza cuando una partícula viral completa se une específicamente por intermedio de sus glicoproteínas de superficie (gp120, gp41) a la célula huésped. Este proceso es mediado por el receptor celular CD4 y sus co-receptores (CCR5 o CXCR4) presentes en las células (linfocitos T CD4+, macrófagos, monocitos, células dendríticas, etc) 2. Posteriormente, se produce la fusión de las membranas vírica y celular, permitiendo la penetración del virus encapsidado. 3. Continúa una etapa de “desnudamiento parcial”, donde la cápside se desintegra parcialmente liberando las 2 hebras de ARN al citoplasma celular. 4. Se produce la activación de la retrotranscriptasa viral (enzima presente en el virus), generando una copia de ADN doble cadena a partir del ARN viral, 5. El ADN formado es transportado desde el citoplasma al núcleo de la célula huésped. Allí se produce la integración del ADN copia lineal al ADN celular mediado por la 24 enzima viral integrasa, pasando a denominarse ADN proviral. El provirus puede permanecer inactivo por varios años sin producir nuevas copias del VIH o produciendo muy pocas. Esto dependerá de la activación de diferentes citoquinas , entre ellas el factor de necrosis tumora (TNF) y la interleuquina 6 (IL-6) 6. La etapa de transcripción está controlada por una combinación de proteínas víricas y celulares que interactúan con los elementos reguladores del ADN proviral (ej: gen tat ). Es aquí donde la polimerasa celular actúa, produciendo copias del material genómico del VIH (ARN viral) y ARN mensajero (ARNm) que se utilizará para la formación de proteínas estructurales y no estructurales del VIH. 7. Del núcleo salen ARNm que codifican precursores polipeptídicos, que durante la traducción producen largas cadenas de proteínas virales. Estas son procesadas proteolíticamente (clivaje) por la proteasa viral y/o glicosiladas por enzimas celulares hasta obtener las proteínas finales que conformarán las diversas estructuras del nuevo virión. 8. El ensamblaje del nuevo virión sintetizado se produce en el citoplasma donde se genera un complejo formado por las dos moléculas de ARN viral y los productos proteicos codificados por los genes gag y pol. Cuando las proteínas víricas se acumulan en suficiente cantidad, tiene lugar el ensamblaje de la nucleocápside, que luego se desplaza hacia la membrana citoplasmática para la constitución final de las partículas víricas con envoltura. 9. Esta estructura sale de la célula por brotación, adquiriendo la bicapa lipídica (de origen celular) en la cual están insertas las proteínas de superficie y transmembrana (gp120, gp41). En la etapa de liberación viral se produce la maduración del virus, mediado por la acción de la proteasa. Estas partículas maduras son capaces de infectar nuevas células La infección de una célula por una partícula viral puede producir varios miles de partículas virales infecciosas. Figura 26.9: Ciclo replicativo del VIH 25 METODOS DE ESTUDIO VIROLOGICO El diagnóstico de la infección por VIH tiene una gran relevancia terapéutica, permite la captación temprana de personas VIH+, facilitando el acceso oportuno de éstas a los tratamientos antirretrovirales (TARV); es de suma importancia en la mujer embarazada, donde un TARV durante la gestación disminuye sensiblemente la posibilidad de infección en el recién nacido. Además del uso diagnóstico a nivel individual, las pruebas de VIH se usan en el testeo de la sangre donada para ser transfundida, en los productos sanguíneos y en el trasplante de órganos para garantizar su seguridad, así como para la vigilancia epidemiológica. Conceptos importantes a tener en cuenta en el diagnóstico de esta infección: • ventana serológica: es el período que transcurre entre la adquisición de la infección por VIH y la presencia de concentraciones detectables de anticuerpos en sangre. • Sensibilidad: se refiere a la capacidad del test para identificar correctamente una muestra positiva como tal • Especificidad: Mide la capacidad del test para identificar correctamente una muestra negativa como tal. ENSAYOS SEROLÓGICOS El diagnóstico de la infección por VIH normalmente se hace de manera indirecta, es 26 decir, mediante la búsqueda de anticuerpos específicos contra el virus. Se encuentran prácticamente en el 100% de los sujetos infectados por VIH, constituyendo un marcador de la respuesta inmune humoral contra el virus. La presencia de estos anticuerpos es semejante en la infección crónica y en la infección activa por VIH. La prueba de anticuerpos contra VIH requiere que se disponga de al menos dos ensayos diferentes: prueba de tamizaje y prueba de confirmación Pruebas de tamizaje * La mayoría de las pruebas de tamizaje se basan en el principio del inmunoensayo ELISA (Enzyme Linked Immuno sorbent Assay). Estas pruebas son extremadamente sensibles con el fin de minimizar la posibilidad de obtener un resultado falso negativo. Esto significa que tienen la capacidad de detectar los anticuerpos de baja afinidad que se encuentran al inicio de la infección primaria. Detectan anticuerpos dirigidos contra todos los tipos de VIH (VIH-1, VIH-2) y tienden a cubrir todos los grupos y subtipos circulantes. Hay diferentes "formatos" de la prueba de ELISA, todos se basan en el principio de la reacción específica antígeno-anticuerpo. Inicialmente se usaba el antígeno de VIH "virus completo" obtenido de cultivos celulares (pruebas de “primer generación”). Actualmente se usa una mezcla de proteínas de virus recombinante o de péptidos sintéticos con epítopes inmunodominantes representativos (pruebas de la “3ª generación” en adelante). Las pruebas de “4ta generación” combinan la detección de anticuerpos de VIH con la detección del antígeno viral p24, a fin de reducir la "ventana serológica" En nuestro país, están disponibles test de ELISA de “3ª y 4ª generación”, con una duración promedio de la ventana serológica de 25 y 15 días respectivamente. Fig 26.10. Esquema de ELISA de 4º generación y sus características * Pruebas de aglutinación: Se basan en la aglutinación de antígenos de VIH que previamente han sido fijados a partículas capaces de aglutinar en presencia de suero que contenga anticuerpos anti-VIH. Se utilizan partículas de gelatina o de latex, y como 27 antígenos, lisados virales, peptidos sintéticos o proteínas recombinantes. Su sensibilidad es comparable con los test de ELISA, pero su especificidad es mucho menor. * Pruebas de EIA de membrana (Dot-Blot) : es también un ensayo inmunoenzimático, el antígeno, compuesto por proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de VIH, está fijado a tiras de nitrocelulosa. Para su uso no se requiere de equipos automatizados, son de simple realización, análisis e interpretación , la cual es visual. Estos test detectan presencia de anticuerpos anti-VIH. En la mayoría de los casos los resultados están disponibles en 15 a 30 minutos; con frecuencia se usa sangre total o de vasos capilares (obtenida de la punta del dedo o del lóbulo de la oreja). Es de destacar que estas técnicas no sustituyen a las técnicas convencionales inmunoenzimáticas y deben ser realizadas por personal entrenado en las mismas. Los test rápidos facilitan el acceso al diagnóstico cuando se utilizan en los servicios de asistencia sanitaria a nivel de atención primaria. Fig 26.11. Esquema de Pruebas de EIA de membrana Indicaciones para el uso de test rápidos (extraído de “Guías para diagnóstico, monitorizacfión y tratamiento antirretroviral para adultos/as): • En período de pre-parto, parto y puer4perio en mujeres sin antecedentes de control en el último trimestre del embarazo o cuando se carece de dicha 28 información, o al parto en mujeres con factores de riesgo de transmisión de VIH (independientemente del control del embarazo) • Para evaluar rápidamente el caso fuente en los accidentes laborales, así como al personal accidentado de ser necesario (ver Guias de profilaxis Post – exposición) • Para estimular el diagnóstico precoz y captación en poblaciones vulnerables con factores de riesgo para VIH y que difícilmente se acerquen a los sistemas de salud (usuarios de drogas, trabajadores sexuales, hombres que tienen sexo con hombres), en cualquier nivel del sistema de salud. • En personas con sospecha clínica y difícil captación y seguimiento, en cualquier nivel del sistema de salud En todas las eventualidades planteadas, los test rápidos deben ser realizados con conserjería pre y post test y por personal de salud debidamente capacitado, bajo control por un laboratorio de análisis clínicos debidamente registrado en el MSP. Los ensayos de tamizaje pueden presentar reactividad no específica, por lo que se utiliza el término “reactivo” en lugar de “positivo” al referirse al resultado de las pruebas de tamizaje. Prueba de confirmación A todos los resultados reactivos por serología de tamizaje, se les debe hacer una prueba de confirmación, por un procedimiento de alta especificidad, como es la técnica de Western Blot o los inmuno ensayos en línea. Son pruebas donde se determina la reactividad de los anticuerpos presentes en la sangre del paciente con cada una de las proteínas estructurales del VIH. El Western Blot (WB) es una técnica basada en la separación de proteínas virales por su peso molecular mediante electroforesis, que luego son transferidas a una membrana de nitrocelulosa.. Para efectuar la prueba, la membrana se incuba con el suero del paciente. Si el suero contiene anticuerpos contra las diferentes proteínas virales, estas se unirán a la superficie de las tiras a las que se han transferido los antígenos correspondientes. Si la reacción antígeno-anticuerpo tiene lugar, se revela mediante un segundo anticuerpo marcado con una enzima, y con el sustrato correspondiente de la enzima. Esto da lugar a la aparición de "bandas" en la tira de prueba Existen test de confirmación tanto para VIH 1, como para VIH 2. En el Western blot para VIH-1 las bandas se pueden dividir en tres grupos,: las glicoproteínas env o de envoltura (gp41, gp120, gp160), las proteínas gag o del núcleo (p18, p24/25, p55) y las proteínas pol o de endonucleasa-polimerasa (p34, p40, p52, p68).(Fig 9) 29 Fig 26.12. Diversas modalidades de test confirmatorios. Criterios de positividad. WB: Western Blot, LIA: Inmunoensayo en línea. Existen diversos criterios para la interpretación de los resultados de Western Blot. En Uruguay, para VIH-1 se utiliza el definido por el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC): Positivo: presencia de las bandas p24 con al menos una de las siguientes bandas: gp41 o gp120/160 Indeterminado: Cualquier patrón de bandas específicas que no cumplan con el criterio de positividad Negativo: Ausencia completa de bandas En los casos de sueros indeterminados, el seguimiento debe prolongarse al menos 6 meses para verificar si existe un cambio en el patrón de anticuerpos hacia la positividad o por el contrario, hacia la desaparición. Estos procedimientos tienen una sensibilidad menor que los tests de tamizaje y por tanto el período de ventana serológica para ellos es más prolongado. La reactividad comienza a observarse a partir de los 30 días post infección. Una prueba de tamizaje reactiva no implica la infección por VIH. Sólo un test de tamizaje reactivo con una prueba de confirmación positiva, permite el diagnóstico de la infección por VIH 30 DETECCION DIRECTA DEL VIH Además del diagnóstico indirecto basado en la detección de anticuerpos, también es posible efectuar el diagnóstico directo de la infección por VIH: • Identificación del virus infeccioso (con el uso de cultivos celulares, esto sólo es posible en laboratorios con un nivel de bioseguridad 3), • detección de antígenos virales (ELISA para el antígeno p24) • detección del ácido nucleico viral (genoma viral). * Detección de Antígenos virales: El Ag p24 producto del gen gag, puede detectarse en suero y otros fluidos corporales antes de la aparición de anticuerpos anti-VIH, por lo que es útil en el diagnóstico de la infección aguda y en la progresión de la enfermedad. Sin embargo existen limitaciones en su detección ya que forman inmunocomplejos que hacen difícil muchas veces su determinación. * Aislamiento viral: El aislamiento del VIH se realiza a partir de linfocitos del paciente cocultivados con linfocitos humanos normales, estimulados con fitohemaglutinina o interleucina-2. También se puede aislar partiendo de suero, plasma, semen, secreciones vaginales y otros fluidos corporales. . El aislamiento del virus se comprueba mediante la detección de antígeno viral o de actividad de retrotranscriptasa en el sobrenadante del cultivo. Dada la complejidad del método, su uso está restrigido a laboratorios de alta complejidad y con niveles altos de bioseguridad. * Detección de ácido nucleico viral: Actualmente la prueba más usada en el diagnóstico directo es la determinación de la presencia del genoma viral. Esto es posible mediante el uso de técnicas de biología molecular que permiten la detección de fragmentos del ADN proviral en células mononucleares del paciente (lo cual requiere muestras de sangre total con EDTA). El análisis cualitativo del genoma viral sirve como marcador de la infección. Funciona como complemento o como sustituto de la prueba de anticuerpos para el diagnóstico de la infección por VIH en situaciones particulares como: niños nacidos de madres seropositivas, serología indeterminada (WB indeterminado), diferenciar la infección por VIH-1 de infecciones por VIH-2 con serología no concluyente, hipoglobulinemia, etc. Diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH en adultos, adolescentes y niños mayores de 18 meses El diagnóstico de la infección por VIH en estos grupos etarios, normalmente se hace de manera indirecta, es decir, mediante la búsqueda de anticuerpos específicos contra el VIH-1 y el VIH-2 en suero del paciente, con las pruebas de tamizaje y de confirmación arriba detalladas. Diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH en niños nacidos de madres VIH positivas. 31 En los bebés que nacen de madres infectadas por VIH (niños expuestos), los anticuerpos contra el VIH se transmiten pasivamente de la madre al feto y atraviesan la placenta desde aproximadamente la semana 30 del embarazo en adelante. Los anticuerpos maternos IgG confieren cierta protección inmune fisiológica contra diversas infecciones, pero en el caso del VIH no tienen ninguna eficacia protectora. La circulación de anticuerpos maternos en el niño va disminuyendo progresivamente hasta la eliminación completa entre los 15 y 18 meses de vida. Esto significa que todos los bebes que nazcan de madres VIH positivas (hayan sido infectados o no), inicialmente tendrán resultados “reactivos” en las pruebas serológicas antes descriptas.(ver Fig 26.13) Por lo cual, en los niños expuestos se debe realizar el diagnóstico en los primeros meses de vida con métodos directos que detecten la presencia del virus o alguno de sus componentes. La técnica de elección para este diagnóstico es la investigación de ADN proviral en linfocitos de sangre periférica. Asimismo es conveniente realizar un estudio serológico entre los 18 y 24 meses de edad para establecer el diagnóstico final, correlacionando los datos obtenidos por ambas metodologías (directa e indirecta). Figura 26.13: Dinámica de los Ac. Anti VIH (IgG) en niños nacidos de madres VIH+ Figura 26.14: Algoritmo diagnóstico para niños nacidos de madres VIH+ 32 MONITOREO VIROLÓGICO DEL PACIENTE INFECTADO POR EL VIH Carga viral para VIH: Es la cuantificación del número de copias de ARN viral en plasma de una persona infectada. Cada virión contiene 2 copias de ARNv, por lo cual el número de viriones circulantes en el plasma será el número de copias de ARNv dividido 2. Los resultados se informan en copias/mL o UI/mL (siendo equivalentes ambas expresiones), o en el log10 de esa cifra. Es útil para predecir el grado de progresión en el infectado VIH crónico y realizar el monitoreo terapéutico. Alcanza altos niveles (105-106 copias/ml) en la infección aguda. Resistencia viral a los Antirretrovirales. La replicación del VIH está sujeta a error y se caracteriza por una alta tasa de mutaciones, estas pueden causar la formación de especies virales incompetentes para la replicación. Así también se generan mutaciones por la presión selectiva de los antirretrovirales, causando mutaciones de resistencia, que resultan en la ineficacia de los fármacos. Los métodos que actualmente se emplean en el estudio de resistencia del VIH incluyen: * tests fenotípicos: definen si una cepa de VIH-1 es sensible o resistente a determinado fármaco ARV en función de su capacidad de replicación ante concentraciones decrecientes del fármaco in vitro. El resultado que se obtiene se conoce como concentración inhibitoria 50 o 90%: CI50 – CI90. 33 * tests genotípicos, Se basa en la amplificación genética de regiones del genoma del VIH-1 implicadas en el desarrollo de resistencias, como el gen de la transcriptasa inversa y de la proteasa, El análisis de las secuencias nucleotídicas permite la identificación de mutaciones que han sido relacionadas con resistencia y/o resistencia cruzadas en estudios previos. Los estudios fenotípicos resultan más fáciles de interpretar, pero no detectan cambios pequeños en la sensibilidad del virus, son más laboriosos y costosos. Los estudios genotípicos poseen capacidad de detectar pequeños cambios en la sensibilidad, son más sencillos de realizar, los resultados se emiten en un menor tiempo y con un menor costo. La mayor limitación de los tests genotípicos es su interpretación, debido al elevado número de mutaciones de resistencia que actualmente se conocen y la interacción que existen entre ellas. * fenotipo virtual : La compañía Virco ha desarrollado este estudio (que se realiza en muy pocos países y a un costo muy elevado) que combina las características de la genotipificación y fenotipificación, compara la información del genotipo viral del paciente con los genotipos y fenotipos incluidos en una gran base de datos y busca identificar patrones de mutaciones idénticos o similares. PREVENCIÓN Y CONTROL Uno de los mayores obstáculos en la producción de vacunas contra el VIH, está vinculado con la rápida capacidad de mutación del virus, permitiéndole escapar a las respuestas inmunes que podrían ser protectoras. A 2012 se han evaluado más de 30 vacunas candidatas. La primera generación de vacunas se basó en el concepto de que los anticuerpos neutralizantes eran suficientes para conferir protección contra la infección por el VIH. En el 2003, estas investigaciones basadas en la glicoproteina gp120 (de la envoltura) demostraron no conferir protección. La segunda generación de vacunas comenzó a mediados del ’90, reconociéndose la importancia de la inmunidad celular en el control de la infección. Se diseñaron con este fin varias vacunas experimentales que incluyeron vectores basados en Adenovirus 5 (Ad5) y vectores basados en Canaripox. En setiembre del 2007, los resultados de una prueba fase IIB de la vacuna que utilizó Ad5 como vector, indicaron que la misma no fue capaz de prevenir infecciones por el VIH, o de disminuir la carga viral en personas vacunadas que subsecuentemente se infectaron por el virus. Una vacuna eficaz contra el VIH no sustituirá los esfuerzos de prevención. La mejor manera de combatir la pandemia es utilizar diversas intervenciones a varios niveles y el poder protector de una vacuna podrá ser un beneficio en la prevención del VIH.De momento no existe vacuna disponible para la inmunización activa, y en la actualidad la posibilidad real de obtener una vacuna efectiva parece todavía bastante alejada. Por tanto la herramienta más eficaz que se tiene es la prevención. 34 Es fundamental la educación acerca de las vías de transmisión, el uso de preservativos en las relaciones sexuales, el análisis sistemático de sangre a ser transfundida, el no compartir agujas, jeringas, ni objetos cortopunzantes. Así mismo, en el caso de la transmisión vertical, es de relevancia el control del embarazo, la detección de otras infecciones de transmisión sexual (ITS), y en caso de madres seropositivas evitar el amamantamiento Terapia antirretroviral (TARV) La finalidad del Tratamiento Antiretroviral (TARV) es reducir al máximo y durante el mayor tiempo la replicación viral, lo que se objetiva en el descenso de la carga viral/VIH plasmática. El otro objetivo es preservar o restaurar el sistema inmune de la persona infectada. Su aplicación, de acuerdo a las buenas prácticas clínicas ha disminuído la morbimortalidad y ha logrado una sustancial mejoría en la calidad de vida y años de sobrevida de los pacientes.. Actualmente las principales de drogas aplicables durante las diferentes fases del ciclo del VIH son las siguientes: Inhibidores de fusión: Estos fármacos se adhieren a la glicoproteína de superficie bloqueando la unión de ésta con los receptores CD4 . De esta forma se evita la fase de adsorción viral sin afectar el funcionamiento normal de la célula.. Inhibidores de trancriptasa inversa análogos de los nucleósidos: Estos impiden que el virus haga copias de sus propios genes. Los nucleósidos son los componentes básicos de los genes. La droga interrumpe el proceso de replicación proporcionando versiones defectuosas de estos componentes. Inhibidores de transcriptasa inversa no análogos: Estos también afectan el proceso de replicación. Actuán directamente sobre la enzima Transcriptasa inversa, impidiendo que ésta funcione correctamente. Inhibidores de proteasa: Actúan sobre la enzima proteasa, Al inhibirse esta enzima, se afecta la producción de nuevas proteinas virales, liberando partículas virales estructuralmente desorganizadas y no infecciosas Inhibidores de la integrasa: Estos fármacos interfieren con la enzima integrasa del VIH. Evitan que el ADNproviral se inserte en el genoma de las células huésped,. Inhibidores de co-receptores: Son fármacos diseñados para evitar el acoplamiento del VIH a los receptores quimoquinos (CCR5) de las células huéspedes. En la selección del régimen de TARV inicial se consideran eficacia, reacciones adversas, simplicidad y toxicidad. Algunas condiciones del paciente pueden afectar las características mecionadas, como el recuento de CD4, la presencia de comorbilidades, 35 coinfecciones y la concomitancia de otros tratamientos farmacológicos. Otros factores a tener en cuenta con las posibilidades de adherencia, la edad y sexo, fertilidad en la mujer, etc. Recientemente el MSP a través de su programa ITS/SIDA, ha editado una “Guía para diagnóstico, monitorización y tratamiento antirretroviral (para adultos/as). En la misma se presentan las recomendaciones tanto para el diagnostico como para el tratamiento a las personas viviendo con VIH: Iniciar TARV en: Sintomàtico B o C Embarazo CD4<350/mm3 Nefropatia asociada al VIH Coinfecciòn con VHB cuando es necesario tratar el VHB Considerar inicio en: CD4 entre 350/mm3 y 500/ mm3 Considerar la presencia de uno o màs de los siguientes factores para la indicación: Edad >50 años Descenso de CD4 > 100/ mm3 en un año CV >100.000 Copias/mL Comorbilidad asociada que empeore el pronòstico (hepática, renal, cardiovascular, neoplasia no-SIDA) Pareja serodiscordante Coinfeccion con VHC Diferir inicio en: CD4 > 500/ mm3 Profilaxis postexposición Para el caso concreto del personal sanitario, el riesgo de infección es del 0,2-0,5% en caso de pinchazo o herida accidental con una aguja u otro objeto contaminado con sangre, y prácticamente nulo si sólo ha existido un contacto accidental de sangre u otras secreciones contaminadas con la piel y las mucosas intactas. No obstante, y dado que las consecuencias físicas, morales, sociales y económicas de adquirir una infección por VIH-1 a través de un accidente laboral pueden ser irreparables, debe recomendarse el tratamiento antiretroviral tras la exposición percutánea (pinchazo) o mucosa con sangre contaminada. El tratamiento debe instaurarse lo antes posible (menos de cuatro horas) y debe administrarse durante al menos cuatro semanas. Precauciones universales Es obligatorio la aplicación de precauciones universales (aplicables a todos los pacientes) cuando se manipula sangre o determinados productos biológicos considerados peligrosos (líquido pericárdico, pleural, peritoneal, articular y 36 cefalorraquídeo, además del semen y las secreciones vaginales), y al efectuar cualquier maniobra invasiva. Por tanto, el personal sanitario deberá utilizar métodos de barrera (guantes y si es necesario mascarilla, protectores oculares y batas), y adoptar precauciones para evitar la producción de heridas por agujas, bisturíes u otros instrumentos punzantes en el transcurso de su empleo o limpieza. El descarte de tales elementos debe realizarse en recipientes de paredes rígidas a fin de evitar cortes y pinchaduras. Esterilización del instrumental sanitario Los métodos habituales de esterilización (por ejemplo autoclave, óxido nitroso) y desinfección (por ejemplo germicidas, lejía, jabones) son adecuados para esterilizar el instrumental sanitario o efectuar una desinfección ambiental. Estos virus son rápidamente inactivados por detergentes y desinfectantes efectivos contra otros virus envueltos. Se recomienda el uso de hipoclorito de sodio en una concentración de 5.000 ppm para superficies contaminadas, pudiéndose emplear concentraciones más elevadas (10.000 ppm) cuando se trabaje con preparados y/o cultivos virales. BIBLIOGRAFÍA • Abbas A K, Lichtman A H, Pober J S. Congenital and Acquired Immunodeficiencies. Cellular and Molecular Immunology. 3rd ed. 1997 MCGRAW-HILL. • Dezzutti C S, Lal R B. Human T-Cell Lymphotropic Virus Types I and II. In: Murray P, Baron J E, Pfaller M A, Tenover F C, Yolken R H. Manual of clinical microbiology. 7th ed. 1999. Washington: American Society for Microbiology • Gayle H D, Hill G L. Global Impact of Human Immunodeficiency Virus and AIDS. Clinical Microbiology Reviews 2001; 14: 327-335. • Gutierrez S. Infección por VIH y S.I.D.A. en Pediatría. Monografías del Instituto de Higiene. Nº 2. Virus y Virología Médica en Uruguay. 2002. • Haynes B F, Palker T J. Retrovirus Humanos. En: Joklik W K, Willet H P, Amos D B, Wilfert C M, Zinsser. 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