Detección de infección por papiloma virus con material celular

VIII Congreso Virtual Hispanoamericano
de Anatomía Patológica — Octubre de 2006
Belen Pérez Mies
Ana Pérez-Campos
Celina Echevarría Iturbe
Isabel García Higuera
Hospital “General Yagüe”
Servicio de Anatomía Patológica.
Correspondencia:
Belen Pérez Mies
Hospital “General Yagüe”
Avda. del Cid, 96
09005 Burgos, España.
Telf: +34 947 28 18 00
Fax: +34 947 28 18 29
E-mail: bepemies@yahoo.com
http://conganat.cs.urjc.es
Ginecopatología
Detección de infección por papiloma virus con material
celular obtenido con torunda seca
INTRODUCCION: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para determinar una infección por virus del papiloma humano (VPH) es una técnica
consolidada. Nuestro objetivo es valorar su rendimiento desde material celular ginecológico obtenido con torunda seca. MATERIAL Y METODOS:
De las 731 determinaciones de VPH de 2004, se han seleccionado las torundas ginecológicas, recogiendo edad, resultado y el motivo de su solicitud. La
muestra se obtiene de cérvix, vagina o vulva, según indicación clínica, con
una torunda seca (cánula Eurotubo), empleando para la detección y tipado
del VPH, un kit comercial (PVH fast 2.0 de Genómica). RESULTADOS: Se
procesaron 597 torundas. Edad media 35,4 años, rango 16-70. 43 % se solicitaron por diagnóstico de ASCUS o AGUS. 25 % casos para seguimiento
de lesión escamosa intraepitelial (SIL) previamente diagnosticada y/o tratada. 22 % tras un primer diagnóstico de SIL (14 % por LSIL y 8 % por
HSIL). En el 7 % no constan antecedentes y el 1 % fue por condilomas vulvares. 63 % fueron negativas y el 36 % positivas. Sólo en el 1 % se inhibe
la reacción. Hubo un 13 % de casos de coinfección de dos o más virus. Los
subtipos más frecuentes fueron 16 (36 %), 53 (15 %) y 58 (7 %), pero existe
representación de casi todos los subtipos. El mayor porcentaje de positivos
fue en menores de 20 años (55 %) disminuyendo el porcentaje un 10 % por
década. Según el motivo de solicitud, el porcentaje más alto de positivos los
SIL, especialmente HSIL (80 %). CONCLUSIONES: Los resultados obtenidos son similares a otras revisiones. Diagnósticos de ASCUS o AGUS son
el motivo más común de solicitud, las mujeres más jóvenes están con más
frecuencia infectadas, el subtipo 16 es el más habitual y las HSIL, tienen el
mayor porcentaje de resultados positivos. Consideramos que la torunda seca
es una forma válida, sencilla y económica para obtener material para PCR.
Palabras clave: HPV; torunda seca; PCR; lesión escamosa intraepitelial;
carcinoma in situ; cervix
INTRODUCCIÓN
La infección por el virus del papiloma humano (VPH)
es la infección viral de transmisión sexual más frecuente. Se estima que hasta un 50 % de la población sexual
activa ha podido estar infectada por el virus (1,2).
Debido al riesgo carcinogénico de algunos subtipos, los
denominados de alto riesgo, se están aplicando diferentes técnicas complementarias a la tradicional citología
cervico-vaginal, que permiten detectar infecciones por
VPH. La detección de ADN viral por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es, hasta el momento, la más
extendida. El material sobre el que se realiza la determinación puede provenir de biopsias, citología líquida o
torundas citológicas entre otros.
Según la Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia (SEGO) las técnicas de detección de infección por
VPH tienen cuatro usos fundamentales: 1) Detección
primaria de la infección, ya sea como técnica única o
junto a la citología para mejorar su sensibilidad; 2) Evaluación de las citologías con ASC-US (Atypical Squamous cells-Undetermined Significance); 3) Evaluación
pronóstica de progresión y seguimiento de las lesiones
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Ginecopatología
intraepiteliales escamosas de bajo grado (LSIL); y 4)
Control de la curación post-tto. (3)
En nuestro centro, la detección de infección VPH en citología cervico-vaginal, con toma citológica con torunda
seca, está establecida desde al año 2002. El objetivo de
este trabajo es valorar el uso que se está dando a la técnica y si nuestros resultados son similares a los de otros
centros.
MATERIAL Y MÉTODOS
De las 731 PCR que se realizaron en nuestro centro a
lo largo del año 2004, se han seleccionado las determinaciones de VPH que corresponden a torundas ginecológicas. En cada caso se ha recogido la edad de la paciente, el resultado de la PCR y el motivo por el que
se ha solicitado el estudio, clasificándolo según los siguientes criterios:1) Solicitud por control de una lesión
escamosa intraepitelial (SIL) previamente diagnosticada, independientemente del grado, anteriormente al año
2004; 2) Solicitud por ASCUS o AGUS en citologías anteriores, independientemente del año, sin que haya sido
diagnosticado en ninguna de estas pacientes un SIL previamente; 3) Solicitud por haberse diagnosticado en ese
año un SIL independientemente del grado; 4) Detección
primaria sin que existan antecedentes de lesión orgánica; 5) Existencia de lesiones clínicamente sugestivas de
condilomas vulvares; 6) Otras.
El método de obtención de la muestra consiste en la toma
de células de la región cervical, vaginal o vulvar, según
indicación clínica, mediante una torunda seca, empleando cánulas Eurotubo que se conservarán a 4 ºC o a ?20ºC
hasta su procesamiento.
Para la detección se ha empleado un kit comercial disponible en el mercado llamado PVH fast 2.0 comercializado por Genómica. Este kit permite detección y tipado
del VPH en distintas muestras (frotis, suspensiones celulares y tejidos fijados en formol e incluidos en parafina)
mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello se amplifica un fragmento de DNA
viral de unos 450 pares de bases (pb), dentro de la región
L1 del virus que presenta escasa variaciones de unos virus a otros. A continuación se efectuó la electroforesis en
gel de agarosa al 2 % para detectar si las muestras contenían o no virus. Posteriormente, en las muestras positivas, se procede a la digestión del producto amplificado
con enzimas de restricción (Rsa I y II) incluidas en el kit
para realizar el tipado de virus. El resultado se visualiza
mediante electroforesis en geles de agarosa Metaphor y
tinción con bromuro de etidio, en un transiluminador de
luz ultravioleta.
RESULTADOS
Se realizaron 597 determinaciones de infección VPH en
torundas ginecológicas, lo que supone un 2 % sobre el
total de citologías cervicovaginales (25801). La media
de edad fue de 35,4 años con un rango que abarca desde
los 16 a los 70 años. El grupo de edad entre 21 y 30 años
es en el que con más frecuencia se solicitan determinaciones con 201 casos (34 %).
De los 597 casos donde se solicitó la determinación,
262 (43 %) fueron peticiones tras un diagnóstico de ASCUS o AGUS ese mismos año o controles de ASCUS
o AGUS diagnosticados en años anteriores. El siguiente
motivo de petición, 151 casos (25 %) fue el seguimiento
de una lesión escamosa intraepitelial (SIL) previamente
diagnosticada. En varios casos la lesión había sido tratada previamente. El 22 % de las peticiones se hicieron tras
un primer diagnóstico de SIL (14 % por LSIL y 8 %por
HSIL). En el 7 % no consta ningún antecedente clínico
o citológico por lo que se ha considerado una indicación
por criterio del ginecólogo y en 1 % de los casos se solicitó por la presencia de condilomas vulvares (Tabla 1).
El 63 % de las determinaciones fueron negativas y el
36 % positivas. En el 1 % de las determinaciones no se
obtuvo resultado por inhibirse la reacción. Hubo 25 casos de coinfección de dos a más virus lo que supone un
13 % de los casos.
De las 193 determinaciones positivas, 25 (13 %) no pudieron tiparse, ya sea por tener una carga viral muy débil
de la que se obtiene escasa señal, insuficiente para el tipado o por ser un tipo de virus desconocido (8 casos). En
las restantes positivas, los virus más frecuentes fueron el
16 (36 %) seguido del 53 (15 %) y del 58 (7 %). Aunque
sean poco frecuentes existe representación de la mayor
parte de los virus conocidos.
El rango de edad donde proporcionalmente fue mayor el
número de resultados positivos fue en las menores de 20
años donde el 55 % de los análisis fueron positivos. A
medida que va aumentando la edad, va disminuyendo la
proporción de resultados positivos del orden de un 10 %
por década (Tabla 2).
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El número de casos positivos según el motivo de solicitud de la PCR queda reflejado en la tabla 3, de forma
que el porcentaje más alto de positivos lo veremos en los
casos diagnosticados ese año de SIL, especialmente de
HSIL donde el porcentaje de positivos alcanza el 80 %
(Tabla 3).
DISCUSIÓN
Debido al conocido riesgo carcinogénico del papiloma
virus, se han desarrollado técnicas para la detección de
ADN viral, que cada vez son más sensibles y específicas
y fáciles de realizar. La detección de ADN viral mediante reacción en cadena de la polimerasa es una de las más
extendidas y puede ser de utilidad en diferentes aspectos
como el cribado primario del carcinoma cervical y sus
lesiones precursoras, el seguimiento de lesiones cervicales ya tratadas o como método de diagnóstico complementario de citologías con anormalidades (2-4).
En nuestro centro, la causa más frecuente de solicitud
de la técnica es el diagnóstico citológico de ASCUS o
AGUS que suponen un 43 % de las peticiones. La técnica permite discriminar fiablemente aquellos casos donde
las anomalías citológicas son de índole reactivo de aquellas donde puede existir una lesión escamosa intraepitelial, sin necesidad de hacer una biopsia, técnica mucho
más agresiva y estresante para la paciente, permitiendo,
en los casos negativos que la paciente vuelva al screening general (5,6). El porcentaje de citologías diagnósticadas de ASCUS o AGUS que fueron positivas fue del
20 % cifra muy similar a otros estudios (7).
La segunda causa de petición de la prueba es el seguimiento de SIL previamente diagnósticado y en muchos
casos tratado (25 %). De esta forma es posible determinar si existen reinfecciones o si persiste el ADN viral. La
Infección se negativiza en las lesiones extirpadas completamente y está presente si la lesión persiste o recurre.
Su negatividad después del tratamiento permite devolver
a la mujer al programa de cribado (3)
La tercera causa es las lesiones escamosas intraepiteliales diagnosticadas por primera vez (22 %). En estos casos, el conocer la presencia del virus permite confirmar
el diagnóstico citológico y determinar qué tratamiento
es el más adecuado en función del riesgo oncogénico
del virus detectado. Aunque a las pacientes se les realice
biopsia y sea posible determinar ADN viral en el tejido,
la extracción de ADN en frotis citológicos es mucho más
sencilla y la parafina en la que se incluyen las biopsias
es un inhibidor para la Taq polimerasa lo que dificulta
la realización de la técnica. Además el uso de formol no
tamponado o la fijación deficiente de la muestra puede
dar lugar a falsos negativos. (8)
Nuestra prevalencia de infección (0,7 %) es mucho menor a la de otras series publicadas (2, 9, 10) y menor que
la general en España que se sitúa entre el 3 y el 6 % (3).
La causa es que no se ha hecho la determinación en todas la población de la zona, sino sólo en un grupo muy
reducido, donde existía indicación clínica. Sin embrago,
las proporciones de casos positivos se mantienen según
los rangos de edad, de forma que el porcentaje de positivos es mucho mayor en las pacientes menores de 30
años donde se solicitó la técnica y especialmente en las
menores de 20 años donde el porcentaje de positivos alcanza el 55 %, al igual que en otra series publicadas (2,
11, 9, 10)
Nuestro porcentaje de VPH 16 alcanza el 36 % cifra
similar a la de otros artículos publicados en España
(2,7,12,13). Los tipos 53 y 58 que son los siguientes en
frecuencia. Así mismo el porcentaje de casos positivos
tanto en los LSIL como en los HSIL está en consonancia
con los resultados de otros autores (2,7,12,13)
Actualmente en muchos centros se está implantando la
citología líquida como alternativa a la tradicional triple
toma. Para algunos autores es controvertido si esta técnica mejora la sensibilidad y la especificidad del screening
(3) pero una ventaja indiscutible es que permite realizar
detecciones de infección HPV con el material obtenido,
de forma que en citologías con diagnóstico de ASCUS
o de SIL se podría hacer directamente la determinación
viral. Sin embrago consideramos que la torunda seca es
una alternativa válida, rápida y económica para la detección de infección, en los centros en los que por motivos
técnicos o económicos no se utilice la citología líquida.
La detección y tipificación del HPV debería añadirse a
los estudios de rutina tanto de material citológico como
histológico. Con esto se reduciría el número de mujeres referidas a tratamiento o los múltiples controles por
citologías anormales (ASCUS) y se podría predecir el
riesgo potencial de la lesión. (12). Algunos autores (8)
proponen controlar los virus de bajo riesgo oncogénico
rutinariamente mientras que la detección de un subtipo
de alto riesgo supone un estrecho seguimiento citopato-
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lógico y clínico con el objetivo de prevenir la aparición
de lesiones de alto grago.
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ICONOGRAFÍA
Tabla 1.- Motivos de Solicitud de Torundas Citológicas para determinación de VPH.
Tabla 2.- Número de casos por grupos de edad y porcentaje de casos positivos.
Tabla 3.- Número de casos según motivo de la solicitud y porcentaje de casos positivos.
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