45 DNA RECOMBINANTE

PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE.
Resumen.
La tecnología de DNA recombinante es un procedimiento de ingeniería genética
que se viene usando desde hace algunos años y en la actualidad tiene una amplia
variedad de aplicaciones. Esta técnica se basa en la inserción de DNA foráneo al
genoma de una célula hospedadora, para que ésta lo exprese como si fuese suyo.
Este proceso se realiza mediante el uso de enzimas de restricción, vectores de
clonación y hospedadores (procariotas o eucariotas), y consiste en aislar un
fragmento de DNA con genes de interés para el investigador e introducirlo en un
vector, el cual se encarga de llevarlo al hospedero para que ocurra recombinación.
En la actualidad se producen alimentos transgénicos y bio-moléculas con esta
tecnología, la cual también ha abierto nuevas perspectivas en el campo de la
medicina, la genética, la bio-remediación y la industria.
Palabras clave: DNA, recombinación, enzimas, ciclo celular, replicación, virus,
plásmidos.
Introducción.
Uno de los más grandes avances de la ciencia contemporánea ha sido el
desarrollo de la ingeniería genética y la biotecnología. Por medio de estas dos
disciplinas –muy relacionadas entre sí– se ha logrado manipular genéticamente a
los individuos con el fin de propiciarles nuevas características.
La tecnología del DNA recombinante es una técnica que ha permitido introducir
material genético foráneo en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore
dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo (Bohinski 1991,
Greene & Rao 1999). Esta tecnología desarrolló a partir del descubrimiento de las
enzimas de restricción (Griffiths et al. 1998, Klug & Cummings 1999) y su acción
sobre los ácidos nucleicos. Cuando se complementó el estudio de las enzimas de
restricción con la micro-manipulación (conjunto de técnicas que permiten inyectar
y succionar porciones de una célula) se desarrolló esta nueva tecnología, que ha
abierto las puertas a un nuevo y amplio campo de acción a la genética molecular
(Reina 2000).
El principio de la tecnología de DNA recombinante se basa en la inserción de un
fragmento de DNA foráneo (Reina 2000) en un hospedero de clonaje molecular
(Silva 1999) por medio de un vector de clonaje, como ser un virus o un plásmido
(Moreira & Mendes 1998). Una vez que el fragmento de DNA foráneo se ha
introducido en el hospedero, comienza el proceso de clonaje molecular y la
recombinación, dando como resultado la expresión del gen o los genes
introducidos en un organismo diferente (Madigan et al. 1998).
En la actualidad existe una gran cantidad de aplicaciones de la tecnología de DNA
recombinante a todo nivel. Se aplica esta técnica para la producción de vacunas
(Klug & Cummings 1999), para la producción de proteínas, aminoácidos, vitaminas
y ribonucleótidos (Hashimoto & Ozaki 1999) y la producción de curas genéticas
para algunas enfermedades (Griffiths et al. 1998, Klug & Cummings 1999), en el
campo médico.
La ingeniería genética en plantas también ha provisto la mejora de ciertas
especies haciéndolas más resistentes o introduciendo ciertas características de
otros individuos para mejorarlas (Madigan et al. 1998, Klug & Cummings 1999).
Otra aplicación de la tecnología de DNA recombinante bastante reciente, es la
producción de microorganismos transgénicos para procesos de bioremediación de
hidrocarburos (Keasling & Bang 1998, Timmis & Pieper 1999, Pieper & Reineke
2000; Coates & Anderson 2000), metales pesados como el mercurio (Chen &
Wilson 1997, Sayler & Ripp 2000). Las técnicas de bioremediación permiten una
descontaminación de ambientes afectados por medio del uso de microorganismos
capaces de degradar ciertas sustancias, en muchos casos se han empleado
organismos nativos del lugar pero también se ha trabajado con numerosas cepas
modificadas genéticamente para amplificar su acción sobre los contaminantes.
En esta revisión se verán los principios básicos de la tecnología de DNA
recombínate y se analizarán las diferentes aplicaciones actuales y potenciales de
este proceso.
PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE.
Enzimas
de
restricción:
producción
de
fragmentos
de
DNA
para
recombinación.
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas
por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans (Stryer 1995). Estas son
enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces
fosfodiéster de los ácidos nucleicos (Bohinski 1991) y son capaces de cortar
ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie
de fragmentos (Stryer 1995). Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan
(cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos
presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o
citosina del sitio de corte.
La función de las enzimas de restricción es la proteger al organismo de DNA
extraño. Cuando una porción de DNA foráneo ingresa a la célula, las enzimas de
restricción se encargan de degradarlo cortándolo en pequeños fragmentos,
siempre y cuando éste no esté modificado (Smith & Wood 1998).
Actualmente se conocen unas 200 enzimas de restricción (las más conocidas se
muestran en la tabla 1), las cuales se nombran de acuerdo al organismo del cual
se extraen, como por ejemplo EcoRI y EcoRII, que se extraen de E. coli o HaeIII
que se extrae de Haemophilus aegyptius.
Tabla 1: Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su
origen (en base a Griffiths et al. 1998).
Enzima de
restricción
Organismo de donde
se extrae
EcoRI
Escherichia coli
EcoRII
Escherichia coli
HindII
Haemophilus
influenzae
HindII
Haemophilus
influenzae
HaeIII
Haemophilus aegyptius
HpaII
Haemophilus
parainfluenzae
PstI
Providencia stuartii
SmaI
Serratia marcesens
BamI
Bacillus
amyloliquefaciens
BglII
Bacillus globiggi
Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de
bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de
restricción y producen dos tipos de corte: (1) corte con extremos cohesivos y (2)
corte con extremos romos (ver Fig. 1) (Griffiths et al. 1998). Los extremos
cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir,
quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo éstas
complementarias entre sí, mientras que los extremos romos son aquellos en los
que no queda una porción lineal a ninguno de los lados. De acuerdo a la
especificidad de las enzimas de restricción, se conocen dos tipos: las enzimas de
tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una distancia que varía
aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para DNA recombinante. Las de
tipo II reconocen y cortan en la secuencia específica, y son las más empleadas en
este tipo de protocolos por su alta precisión. Las enzimas de restricción de tipo III
son similares a las de tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se
diferencian de éstas en que sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por
ejemplo entre dos adeninas.
Fig. 1: Producción de extremos (a) cohesivos y (b) romos, por medio de enzimas de
restricción en hebras de DNA.
Otro método para producir fragmentos pequeños de DNA para recombinación
consiste en emplear ultrasonidos. Los ultrasonidos son capaces de romper al
DNA cromosomal en pequeños fragmentos. A pesar de ser un procedimiento muy
sencillo, tiene la desventaja de producir fragmentos aleatorios y no permite aislar
genes con gran precisión (Mateos 2000), sin embargo son empleados por su
facilidad de uso.
Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por
medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una
secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una
simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de
corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se
produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En
este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA,
leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto
comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción (Stryer
1995).
Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como
marcadores para la elaboración de mapas de restricción (Mateos 2000). Para
elaborar un mapa de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se
los separa mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de
poliacrilamida) (Smith & Wood 1998, Mateos 2000) y se establecen las distancias
de migración, siendo los resultados muy específicos para cada molécula de DNA
en estudio (Griffiths et al. 1998). Los extremos cohesivos son los más empleados
en la construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal
"pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero,
por complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de
enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal
puede ser usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A
pesar de ser más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos,
mediante la adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de
extremos cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este
procedimiento no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.
Existe otro tipo de enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–
exonucleasas, las cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de
removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y
reconocen secuencias exactas (Bohinski 1991, Stryer 1995) Fraser (1994), plantea
que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener un
papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células
defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos
experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli, Neurospora crassa,
Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila
melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano (Fraser 1994).
Las potenciales aplicaciones en la medicina de estas enzimas podría llevar a curar
varias enfermedades, este aspecto se verá a detalle más adelante.
Vectores de clonación.
Una vez que se han aislado los fragmentos de DNA de interés, por medio de
enzimas, el siguiente paso es unirlos a un vector de clonación. Los vectores de
clonación permiten la unión de los fragmentos de DNA extraño a su propio DNA
por medio de sitios de restricción compatibles, sin afectar su replicación, por medio
de un proceso de recombinación (Madigan et al. 1998, Moreira & Mendes 1998,
Klug & Cummings 1999) El vector es el vehículo que transporta el gen o genes de
interés al hospedero, que normalmente es una bacteria o una célula eucariota
viva. Una vez dentro la célula, el vector se multiplica produciendo varias copias
idénticas del gen que transporta (Moreira & Mendes 1998). Para que un vector sea
utilizable en la tecnología de DNA recombinante, debería ser fácilmente
recuperable de la célula hospedadora, además de no producir daños.
Actualmente, se usan diferentes tipos de vectores para la producción de DNA
recombinante, los principales son los plásmidos, los bacteriófagos, los cósmidos,
vectores transbordadores, células eucariotas y cromosomas artificiales, entre otros
(Madigan et al. 1998, Klug & Cummings 1999).
Plásmidos.
Los plásmidos (Fig. 2) son moléculas de DNA bicatenario de carácter
extracromosómico
y
tienen la capacidad de
replicarse
autónomamente.
Además de transportar
los genes de interés
para
el
investigador,
los
plásmidos
transportan
otros
genes que le confieren
propiedades
importantes
al
hospedador, como ser
la resistencia a ciertos
antibióticos
(Madigan
et al. 1998, Klug &
Cummings 1999).
Fig. 2: Plásmido pBR322 con sus diferentes sitios de restricción (tomado de Klug &
Cummings 1999).
Los plásmidos pueden dividirse en dos grupos: plásmidos conjugables y plásmidos
no conjugables. Los primeros promueven la conjugación entre bacterias, pasando
de una célula a otra, y confiriéndola nuevas características codificadas en su
genoma, los otros actúan principalmente en procesos de transformación. Los
plásmidos se clasifican en plásmidos de fertilidad, plásmidos de resistencia,
plásmidos col, plásmidos degradativos y plásmidos virulentos (Moreira & Mendes
1998).
La utilización y el diseño de plásmidos para ingeniería genética ha considerado
que estos vectores contengan un número limitado de sitios de restricción (puesto
que la posición es importante), y además que posean genes de resistencia para
varios antibióticos. El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos usados
para la construcción de DNA recombinante (Klug & Cummings 1999). Según
Madigan et al. (1998), este plásmido presenta nueve características que lo hacen
adecuado como vector de clonación:
1. Es pequeño, sólo tiene 4361 pares de bases.
2. Es estable cuando se encuentra dentro el hospedador.
3. Se pueden producir muchas copias de él, por medio de la inhibición de la
síntesis de proteínas.
4. Es fácil de aislar en su forma súper enrollada.
5. Pueden clonar fragmentos insertos relativamente grandes.
6. Se conoce la secuencia completa de bases del mismo.
7. Existen sitios de restricción únicos para las principales endonucleasas.
8. Posee varios genes de resistencia a antibióticos.
9. Es fácil de introducir a los hospedadores.
Fagos y Bacteriófagos.
Los virus más empleados como vectores para DNA recombinante son los
bacteriófagos lambda y M13, por su facilidad de incorporar genes de otros
individuos a su genoma. La transducción especializada que presentan los
fagos lambda hacen que sean usados como vectores, pero en este caso la
recombinación se da dentro de la célula hospedadora y no en los tubos de
ensayo (Madigan et al. 1998). Esta transducción especial se basa en un
proceso de eliminación del grupo génico central del DNA del fago, por medio
de enzimas de restricción, y la posterior inserción y ligamiento del DNA
exógeno, para luego proceder al empaquetamiento del virus.
Los fagos lambda silvestres no son útiles como vectores, por lo tanto se deben
producir fagos modificados, que contengan el DNA foráneo. El proceso de
incorporación de DNA foráneo se muestra en la Figura 3 (Madigan et al. 1998).
Los pasos que se deben seguir para la clonación del fago lambda son los
siguientes (según Madigan et al. 1998):
1. Aislar el DNA del fago vector y proceder a la digestión por enzimas de
restricción.
2. Ligar los fragmentos esenciales del DNA del vector con el DNA foráneo.
3. Empaquetar el DNA híbrido en extractos celulares que contengan las
proteínas de la cápside y la cola.
4. Producir la infección del hospedero.
Los fagos M13 son filamentosos (Moreira & Mendes 1998) y se caracterizan
por presentar una cadena de DNA simple, la cual se replica dentro el
hospedero formado una doble cadena, denominada forma replicativa. Este
fago es útil porque resulta sencillo añadir una porción de DNA foráneo a su
cadena lineal, mediante el empleo de enzimas de restricción apropiadas. Los
vectores M13 también pueden ser usados para la secuenciación de DNA,
mediante la elaboración de mapas de restricción, que hacen más fácil la
secuenciación del material genético (Madigan et al. 1998, Klug & Cummings
1999), mediante un proceso previo de replicación del material genético a una
estructura de doble hebra, puesto que las enzimas de restricción no son
capaces de cortar cadenas simples.
Fig. 3 Pasos a seguir para la incorporación de DNA foráneo a un virus vector (Madigan
et al. 1998).
Virus
En la actualidad existen muchos virus conocidos, sin embargo solamente se
utilizan dos como vectores para el trasporte de DNA extraño. Esto se debe a que
no todos los virus reúnen las condiciones necesarias que permitan insertar en su
material genético otros genes y transportarlos hasta el hospedero. En la actualidad
se está estudiando a posibilidad de utilizar otros virus como vectores de clonación,
entre ellos están el SV40, algunos adenovirus y algunos baculovirus (Moreira &
Mendes 1998).
Se distinguen dos tipos principales de vectores de clonación en virus: los vectores
de inserción y los vectores de sustitución. Los vectores de inserción son aquellos
en los cuales se elimina una parte de DNA "no esencial" para la inserción de los
genes foráneos, mientras que en los vectores de sustitución se reemplazan
porciones del DNA "esencial" por medio de la acción enzimática sobre varios sitios
de restricción (Moreira & Mendes 1998).
Cósmidos.
Los cósmidos son modernos vectores híbridos que emplean genes específicos del
fago lambda: la secuencia cos. Estos vectores se construyen con la secuencia
cos más la porción de DNA foráneo insertada en el extremo cohesivo de este
fragmento.
La porción
cos se emplea porque es necesaria para el
empaquetamiento del material genético dentro del virión lambda, las secuencias
plasmídicas de replicación y la información necesaria para la resistencia a
antibióticos (Madigan et al. 1998, Moreira & Mendes 1998, Klug & Cummings
1999).
El DNA foráneo se una con la secuencia cos y penetra en la célula como un virus,
pero una vez que está dentro, se comporta como un plásmido. Puesto que la
mayoría del genoma del fago lambda se ha eliminado, la porción de DNA foráneo
que se puede introducir es mucho mayor (puede transportar hasta 50kb de DNA),
lo cual constituye una ventaja frente a los otros vectores que sólo pueden
transportar de 5 a 10kb.
Vectores transbordadores.
Otros vectores híbridos modernos, son los vectores transbordadores. Estos
provienen de diferentes fuentes, como el virus SV40 y otros plásmidos o virus
vegetales y/o animales. Tanto los cósmidos como los vectores transbordadores
permiten clonar una mayor cantidad de DNA con un menor número de clones
(Madigan et al. 1998). Los vectores transbordadores permiten introducir DNA
extraño de hasta 50 kb de tamaño, en contraposición a los virus y plásmidos que
están limitados para transportar de 5 a 10 kb únicamente, puesto que una porción
de mayor tamaño desestabilizaría todo el genoma (Klug & Cummings 1999).
A menudo, los vectores transbordadores son usados para la investigación de la
expresión génica.
Otros vectores.
Además de los vectores vistos anteriormente, existen otros que presentan algunas
modificaciones útiles. Estos son los vectores de expresión y los vectores de
secreción. Los vectores de expresión son aquellos que se emplean para
obtener la síntesis de una proteína codificada por e gen clonado dentro el vector.
Los vectores de secreción hacen una tarea similar y además exportan esta
proteína fuera de la célula, porque contienen una secuencia señal (Madigan et al.
1998, Smith & Wood 1998).
Otros vectores de gran utilidad son los cromosomas bacterianos artificiales, los
cuales son muy útiles para el estudio de cartografía y análisis de genomas
eucarióticos complejos. Estos cromosomas bacterianos artificiales poseen los
genes de replicación, varias copias del factor F y marcadores para la resistencia a
antibióticos, y son capaces de transportar hasta un millón de bases nitrogenadas.
También se han desarrollado vectores a partir de células eucariotas. El más
conocido y empleado consiste en un juego de cromosomas artificiales de
levadura, los cuales son capaces de albergar segmentos muy grandes de DNA.
Estos vectores son capaces de replicarse como si fueran cromosomas normales
de levadura y poseen varios sitos de inserción de genes (Pérez–González et al.
1993).
Hospederos para el clonaje de material genético recombinante.
Una vez introducido el DNA foráneo en el vector, es necesario que éste sea
incorporado a un sistema vivo para expresar los genes adicionados, la mayoría de
las veces. Este hospedero, normalmente es una bacteria o una célula de levadura,
aunque también se han introducido vectores de DNA recombinante en organismos
eucariotas pluricelulares (Silva, 1999). Un hospedero debe presentar las
siguientes características, para que sea considerado apto para la producción de
clones de DNA recombinante:
1. Debe tener un crecimiento rápido, para poder observar varias generaciones
en poco tiempo.
2. Poder crecer en un medio de cultivo económico, pues de lo contrario
representarían costos muy elevados y el número de estudios estaría
limitado por problemas económicos.
3. No ser patógeno, por seguridad del investigador y el personal de
laboratorio.
4. Tener el mismo origen de replicación que el vector, para que así sea
factible la inserción del DNA foráneo que éste transporta.
5. Tener las enzimas adecuadas que permitan la replicación adecuada del
vector.
6. Ser un organismo del cual se tenga bastante conocimiento, como E. coli,
puesto que mientras más información se tenga será más fácil explicar los
fenómenos ocurridos.
Silva (1999) define una tabla (ver tabla 2) con los hospederos más
usados en ingeniería genética:
La inserción del DNA foráneo, mediante el vector, se realiza generalmente por un
proceso de transformación. Las células receptores crecen luego en una placa de
cultivo, produciendo varias células genéticamente idénticas, llamadas clones, las
cuales tienen incorporado el gen o genes que se desea expresar. En el proceso de
inserción del DNA foráneo mediante el vector, no todos los intentos son exitosos, y
alguna células no reciben el material genético extra, puesto que éstas deben estar
en un estado competente para poder recibir DNA del medio externo, y la cantidad
de célula, tiempo de duración y condiciones del medio para que las células entren
en competencia depende de la célula y son características propias de cada
especie. Estas células deben ser aisladas de las recombinantes por medio del uso
de medios selectivos, puesto que normalmente el vector además contiene ciertos
genes para la resistencia a antibióticos, un medio selectivo con diferentes
antibióticos es una buena alternativa (Klug & Cummings 1999).
Hospederos procariotas.
El primer hospedero empleado para clonación de DNA mediante esta técnica, y el
más usado en la actualidad es E. coli. Esta bacteria, es posiblemente la mejor
conocida por los científicos y se tiene gran cantidad de información sobre su
genoma y sus características fisiológicas (Madigan et al. 1998, Smith & Wood
1998). La cepa K12 de E. coli constituye un hospedero bastante bueno, por
cumplir las condiciones anteriormente mencionadas. Sin embargo, E. coli en su
forma nativa produce una retención de proteínas en el periplasma, haciendo difícil
su aislamiento. Para contrarrestar este problema se han desarrollado cepas
modificadas de esta bacteria, como ser E. coli mutantes para la bioremediación de
ambientes contaminados con mercurio (Chen & Wilson 1997). Otra ventaja de E.
coli es que puede aceptar una amplia gama de vectores, como los plásmidos, los
bacteriófagos y los cósmidos, entre otros (Madigan et al. 1998, Klug & Cummings
1999).
Se ha usado a E. coli para la producción de muchas sustancias de interés médico,
como proteínas y vitaminas, mediante la inserción de los genes que las codifican
(Hashimoto & Ozaki 1999). Un ejemplo de esto, es la producción de grandes
cantidades de insulina en cultivos de E. coli transgénica, cuyos productos están
destinados a los enfermos de diabetes (Bohinski 1991), sin embargo en la
actualidad se discute sobre los problemas que puede acarrear el uso de estas
bacterias modificadas, puesto que los productos obtenidos no son de origen
natural y existe la posibilidad que resulten tóxicos en cierta medida (Käppeli &
Auberson 1998).
La tecnología de DNA recombinante llega aún más allá de la simple producción de
proteínas, se han modificado cepas de E. coli para la bioremediación de
hidrocarburos (Keasling & Bang 1998; Timmis & Pieper 1999; Coates & Anderson
2000) y mercurio (Chen & Wilson 1997), en ambientes altamente contaminados. El
desglose de estas aplicaciones se verá más adelante,
Otro hospedero procariota utilizado en la tecnología de DNA recombinante es
Bacillus subtilis. Esta bacteria normalmente no es patógena, no produce
endotoxinas y secreta proteínas al medio. No existen tantos estudios de cómo
usar esta bacteria como hospedero, como los existentes para E. coli, y muchas
veces se presentan problemas al usarla como hospedador porque no es fácil
adaptarla para la clonación de genes (Madigan et al. 1998), puesto que su
maquinaria biosintética no es tan flexible como la de E. coli.
Hospederos eucariotas.
Si bien E. coli es un buen hospedero para muchos propósitos de ingeniería
genética y DNA recombinante, tiene la desventaja de carecer de núcleo y otros
organelos, y al ser un organismo procariótico, es posible que no exprese
correctamente proteínas introducidas de origen eucariótico, por ello se ha visto la
alternativa de emplear hospederos eucarióticos (Silva 1999).
En la actualidad se vienen usando también células eucariotas como hospederos
para la clonación de DNA. Esto ha permitido que se amplíe notablemente el
conocimiento que se tiene sobre cómo funciona la maquinaria genética de las
células eucariotas. El hospedero eucariota más empleado es la levadura
Saccharomyces cerevisiae, puesto que de ésta se conoce mucho desde el punto
de vista genético (Madigan et al. 1998), y se tiene un "catálogo" completo de
genes y mutaciones, así como la identificación del plásmido 2m , de origen natural,
el cual constituye un excelente vector (Klug & Cummings 1999). Saccharomyces
cerevisiae tiene un genoma de aproximadamente 2*107 pares de bases,
contenidos en 17 cromosomas lineales, el plásmido 2m tiene 6318 pares de bases
y es común encontrar muchas copias de él en cada célula –alrededor de 50
copias–, por lo cual se constituye en un organismo ideal para la clonación de DNA
(Silva 1999).
Tomando como punto de partida la utilización de células de levadura como
hospederos para clonaje molecular, se han desarrollado otros métodos para la
producción de DNA recombinante en eucariotas. Uno de estos métodos es la
construcción de cromosomas artificiales de levadura, los cuales se usan como
vectores (Klug & Cummings 1999).
Aparte de las levaduras, se han usado otros hospederos eucarióticos para la
clonación de DNA foráneo, como ser hongos (Aspergillus sp. y Neurospora crassa
son los más usados) y algas unicelulares como Chlamydomonas reinhardtir.
Además se han hecho algunas pruebas con cultivos de células animales y
vegetales (Silva 1999). Los cultivos de células animales abren un vasto campo de
investigación, muy relacionado con la medicina, ya que al tener células humanas
en cultivo, por ejemplo, sería mucho más fácil estudiar fenómenos como el cáncer.
Sin embargo, el utilizar cultivos de células animales, y en cierta medida cultivos
vegetales, significa un costo muy elevado y menores posibilidades de
manipulación que con un cultivo de bacterias (Madigan et al. 1998, Klug &
Cummings 1999).
Transfección y clonación del DNA.
Una vez que se aislado el fragmento a ser transportado, se lo ha insertado en el
vector y se ha seleccionado un hospedador adecuado, se debe proceder con la
transfección del material genético para que comience el proceso de clonación de
DNA.
La transfección del DNA incluido en el vector se la debe hacer tomando en cuenta
que la célula posee una barrera que la limita y escoge selectivamente qué
sustancias penetrarán dentro de ella, esta barrera es la membrana celular. Para
superar esta barrera, se han diseñado las técnicas de transfección de sustancias,
que se encargan de abrir poros en la membrana o inducir la endocitosis por vías
naturales (Reina 2000). Estos procedimientos se dividen en técnicas de
permeabilización celular, microinyección y técnicas de transfección propiamente
dichas.
Técnicas de permeabilización celular.
Esta técnica consiste en mantener a las células vivas por varias horas en una
solución con condiciones diferentes a las del medio, para que la diferencia de
concentraciones produzca la apertura de poros a todo lo largo de la membrana
celular. Un efecto parecido se obtiene con el uso de detergentes suaves que
disuelven parcialmente la membrana. Este sistema es conveniente y resulta
económico, pero presenta dos grandes inconvenientes: la escasa duración del
ciclo celular viable, y la pérdida incontrolable de componentes celulares (Reina
2000).
Microinyección.
Esta técnica permite la introducción de material ajeno a la célula mediante una
micropipeta (Fig. 4), que se controla bajo un microscopio de alta resolución. Esta
técnica es muy sensible, y requiere de equipo muy sofisticado y costoso, pero se
obtienen buenos resultados, a pesar de no ser recomendable para el tratamiento
de varias células ya que el trabajo se vuelve tedioso (Reina 2000).
Fig. 4: Microinyección de material genético a un cigoto de mamífero (Klug &
Cummings 1999).
Existen además sistemas de microinyección biológicos, como los virus, que
inoculan su material genético dentro de la célula hospedadora, y es por ello que
son muy usados como vectores.
Técnicas de transfección.
Estas técnicas han sido desarrolladas específicamente para la introducción de
ácidos nucleicos dentro de las células, y han permito ampliar los conocimientos
que se tenían sobre replicación, regulación génica y el funcionamiento de las
células a nivel molecular, entre otras, que actualmente se aplican en el campo de
la genética para la producción de plantas y animales transgénicos (Cavener 1992;
Käppeli & Auberson 1998), líneas celulares modificadas, y una de sus principales
aplicaciones es la construcción de DNA recombinante.
La introducción de una cadena de DNA recombinante en las que se ha situado
una secuencia codificante, bajo una secuencia de regulación que se desea
estudiar permite medir con facilidad las tasas de expresión genética en diferentes
situaciones experimentales. Por otro lado, la introducción de un plásmido con
secuencias codificante y reguladora permite la producción de una proteína
deseada, en este caso se emplea a la célula hospedadora como una "fábrica" para
este producto (Reina 2000).
Para los dos casos vistos anteriormente puede ser importante la selección de las
células que han recibido el material genético incorporado de las que no, para ello
se puede realizar un cultivo en medio selectivo, puesto que normalmente los
plásmidos que se insertan incluyen también genes de resistencia a algunos
antibióticos.
Las técnicas de transfección se pueden dividir en tres grupos:

Métodos químicos: son aquellos en los que se forman complejos para que
la células sean capaces de aceptar o incorporar una cierta molécula a su
citoplasma, por medio del mecanismo normal de endocitosis. Para esta
finalidad se usan el fosfato de calcio, el DEAE dextrano y el método de la
lipofección, los dos primeros se unen al DNA formando complejos
asimilables por la célula, mientras que la lipofección se basa en el
recubrimiento de la molécula de DNA en un complejo de lípidos capaces de
atravesar la membrana.

Métodos físicos: son aquellos en los que se produce una introducción
mecánica del DNA, como la microinyección (que se vio anteriormente) o la
electroporación, que consiste en aplicar una carga eléctrica al medio para
forzar la apertura de poros de membrana por donde penetran las
sustancias.
Clonación de DNA.
Una vez que se ha realizado el proceso de transfección comienza la etapa de la
clonación de DNA dentro de la célula hospedadora. Este proceso es diferente en
procariotas que en eucariotas, y por ello se verán ambos casos por separado.
Clonación en procariotas: En las células procariotas como E. coli el proceso de
clonación de ácidos nucleicos se da una vez que se obtienen los organismos
recombinantes, a partir de los cuales se obtienen clones por simple división. Para
ello se seleccionan las células que si recibieron el DNA foráneo mediante el
vector, y se las aísla en un nuevo medio de cultivo, dándoles condiciones ideales
para que crezcan y se reproduzcan. Esta selección es un proceso que requiere
cuidado y existen varias técnicas para hacerlo. Uno de estos métodos es la
selección rápida, en la que se eliminan a los no mutantes en un medio selectivo
(Smith & Wood 1998), otro método frecuentemente usado es el de rastreo o
cribado (Klug & Cummings 1999), que consiste en separar a los organismos
mutantes de acuerdo a la característica que se ha introducido, este método
fundamentalmente se aplica cuando se usan plásmidos como vectores. El método
de réplica también se usa para este efecto, siendo una variación de la selección
rápida, puesto que consiste en tomar una "réplica" (Fig. 5) de la placa original y
sembrarla en un medio selectivo.
Fig. 5: Técnica de producción de réplicas para aislar mutantes (Klug & Cummings
1999).
Clonación en eucariotas: En algunos eucariotas "inferiores" como la levadura
Saccharomyces cerevisiae se pueden aplicar los mismos métodos que se usan en
la selección de procariotas mutantes, mientras que para hospederos más
"avanzados", como ser tejidos vegetales se usan técnicas de complementación,
usando una cadena de DNA complementario (DNAc), en el cual se da una
selección de los mutantes mediante la aplicación de enzimas de restricción (Smith
& Wood 1998).
La clonación de DNA en células mutantes también puede evidenciarse mediante el
uso de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando
cebadores específicos que van a reaccionar con un tipo específico de secuencia, y
permiten distinguir dos tipos celulares distintos en base a sus características
genéticas (Olmos et al. 1999, Klug & Cummings 1999).
APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE EN LA
ACTUALIDAD.
Las aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante están revolucionando el
mundo moderno, puesto que éstas van desde el diseño de nuevos medicamentos
y curas para enfermedades hasta la producción de plantas mejoradas, pasando
por un amplio espectro de aplicación industrial, además de contribuir a la biología
y a la genética con una mayor comprensión de los mecanismos moleculares que
operan en los sistemas vivos.
Utilidad y aplicabilidad de la tecnología de DNA recombinante en el estudio
genético.
La posibilidad de introducir secuencias foráneas de DNA al genoma de una célula,
para que ésta lo exprese como si fuera suyo ha revolucionado el estudio de la
genética es muchos aspectos, ya que ha permitido entender mejor cómo se dan
los mecanismos de regulación y expresión génica, y por la misma vía se han
mejorado las técnicas de mapeo y cartografía de genes.
La construcción de genes artificiales tanto en procariotas como en eucariotas
(Griffiths et al. 1998) ha sido un punto de partida muy importante para comprender
la dinámica de la información genética en los sistemas vivos, ya que se ha visto
que los diferentes tipos celulares se diferencian en la expresión de un mismo
material genético, lo cual produce un resultado distinto cada vez. Esta técnica
también ha sido el medio para la detección y comprensión de varias enfermedades
genéticas.
Esta técnica se está usando actualmente para la cartografía de genes humanos,
que dado el tamaño y la complejidad de este genoma, es una tarea ardua y
morosa si se la realiza con las técnicas tradicionales de mapeo genético por medio
de frecuencias de recombinación, siendo además este método impreciso por la
influencia de la interferencia.
La detección de enfermedades genéticas y otros problemas relacionados se ha
visto obstaculizada por la imprecisión de las técnicas tradicionales de cartografía,
pero hoy en día es posible efectuar estos análisis con mayor precisión utilizando
como marcadores a los RFLP (polimorfismos de longitud fragmentos de
restricción), los cuales se producen por la acción de diferentes enzimas de
restricción, y estos fragmentos son altamente específicos y cualquier variación da
la posibilidad de detectar mutaciones, ya sean éstas de carácter mendeliano o no.
Incluso esta técnica puede ser empleada para el estudio del ligamiento de genes,
ya que si se construyen familias de RFLP en varias generaciones es posible
incluso detectar genes completamente ligados, lo que a veces no se puede hacer
con las técnicas tradicionales pues no se pueden diferenciar de los genes no
ligados (Klug & Cummings 1999).
Otra ventaja de la tecnología de DNA recombinante es que abre la posibilidad de
realizar mutaciones direccionales (Griffiths et al. 1998), que a diferencia de las
mutaciones naturales, que ocurren de una manera aleatoria, permiten analizar una
característica en particular, sin importar la complejidad o el comportamiento del
organismo a diferentes condiciones.
Además la posibilidad de realizar mutaciones dirigidas reduce al máximo el sesgo
que representan sobre los resultados las mutaciones adicionales no detectables
que se puedan dar en el proceso de inducción de mutagénesis por técnicas físico–
químicas.
La producción de cromosomas artificiales ha abierto las puertas a un campo antes
poco comprendido por los científicos: la regulación de la expresión genética. Hasta
hace algunos años todavía no se tenía claro el proceso o los procesos por los
cuales una sola célula inicial daba lugar a diferentes tipos celulares, y cómo un
mismo genoma podía codificar diferentes proteínas en cada uno de estos tipos
celulares. La introducción de cromosomas artificiales en estos distintos tipos
celulares ha llevado a comprender y evidenciar el mecanismo de regulación de
esta expresión, y estos aplicación ha sido también un importante punto de partida
para verificar la existencia y comprender el funcionamiento de las secuencias de
regulación de genes y los mecanismos por los cuales actúan los interruptores
moleculares (Tjian 1995, Fishel 1998). Estos estudios también han ayudado de
cierta manera a comprender mejor el funcionamiento de varias enzimas
relacionadas con la replicación y reparación de ácidos nucleicos, como las
enzimas de restricción y las polimerasas.
Adicionalmente, la posibilidad de producir grandes cantidades de una proteína por
medio de cultivos bacterianos de células modificadas, ha llevado a reducir
notablemente los costos de enzimas industrializadas, que se usan para la mayoría
de los estudios en esta rama de la biología.
Aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante en el campo de la
medicina y la salud.
La medicina y la salud son quizá los campos de aplicación más beneficiados con
el descubrimiento y la implementación de la tecnología de DNA recombinante,
puesto que ésta ha permitido detectar y buscar alternativas y tratamientos para
numerosas enfermedades, la detección de enfermedades genéticas, la producción
de sustancias y medicamentos revolucionarios, y como complemento a esto se
han desarrollado también terapias genéticas para varios males que aquejan
diariamente a miles de personas.
Producción de sustancias útiles y medicinas.
Esta es una de las primeras aplicaciones que se encontró para la tecnología del
DNA recombinante en el campo de la medicina. La producción de proteínas,
enzimas, vitaminas y ácidos nucleicos por medio de bacterias mutantes
(Hashimoto & Ozaki 1999) ha permitido la obtención de estas sustancias en
grandes cantidades a precios mucho más bajos, haciéndolas más accesibles al
público.
El ejemplo clásico de esto y una de las mayores producciones bacterianas por
DNA recombinante es la producción de insulina en cepas de E. coli modificadas
(Bohinski 1991). La insulina es una hormona de carácter proteico que se sintetiza
en los islotes de Langerhans en el páncreas de los mamíferos (Eckert et al. 1998),
la cual se encarga de regular los niveles de azúcares en el organismo mediante un
complejo sistema de cascadas enzimáticas. La diabetes es una enfermedad que
afecta a millones de personas en el mundo, y produce una deficiencia en la
síntesis de esta proteína, por lo cual a los enfermos de diabetes se les debe
administrar una dosis diaria de insulina. Hasta hace algunos años esta insulina se
extraía de otros mamíferos y su costo era elevado, pero la tecnología de DNA
recombinante permitió introducir el gen que la codifica en el genoma de E. coli, la
cual produce esta proteína como si fuese propia, incluso se ha visto que en
algunos cultivos ésta llega a constituir un 40% de la carga proteica total de la
célula. Entonces, un cultivo celular de reducido costo puede producir una gran
cantidad de insulina, haciéndola más accesible para los enfermos que padecen
diabetes.
Posiblemente el segundo producto de esta naturaleza en la lista de ventas es la
hormona humana del crecimiento (Smith & Wood 1998), la cual se produce en
grandes cantidades por medio de cultivos bacterianos y se usa para el tratamiento
del enanismo. Cuando existe un problema en el suministro de esta hormona por
parte de la hipófisis el organismo sufre un crecimiento reducido y en algunos
casos atrofia de ciertos tejidos. Antiguamente se extraía esta hormona en mínimas
cantidades de cadáveres, pero ésta era insuficiente incluso para pretender hacer
un tratamiento a un solo individuo. Hoy en día esta hormona se produce a escala
industrial en cepas modificadas de E. coli.
La capacidad de hacer que bacterias modificadas produzcan ciertas sustancias en
cantidades ha marcado una revolución en el campo de la medicina farmacéutica,
puesto que hizo factible la producción en masa de medicamentos, a los que se
añaden ciertas vitaminas, factores de crecimiento y/o proteínas de escasa
disponibilidad en la naturaleza. Incluso se han hecho pruebas modificando
bacterias para alterar sus vías metabólicas para que éstas transformen sus
propios productos metabólicos en sustancias específicas (Hashimoto & Ozaki
1999), esto se hace por medio de la adición de enzimas específicas al genoma,
las cuales se encargan de modificar los productos metabólicos, por ejemplo se
pueden producir aminoácidos a partir de intermediarios del ciclo de Krebs
añadiendo genes de transaminasas. Esta tecnología puede aplicarse por dos vías,
la primera es la conversión directa, e la que una enzima específica transforma un
determinado sustrato para dar lugar a un solo producto, la segunda estrategia
consiste en emplear rutas metabólicas completas y alterarlas para este mismo fin.
Klug & Cummings (1999) hacen referencia a la producción de productos
farmacéuticos en huéspedes animales. Esta es una aplicación de la
biotecnología mediante la cual es posible producir ciertas sustancias añadiendo el
o los genes que la(s) codifican en las células de algún animal. Recientemente se
ha podido incorporar con éxito las principales proteínas de la leche materna a la
leche de las vacas, este proceso se ha ido produciendo poco a poco,
introduciendo una proteína por generación, y actualmente se crían vacas en
Estados Unidos, cuya leche contiene cerca de un 80% de las proteínas de la leche
materna humana. Este sin duda, sería un excelente sustituto a las leches
maternas artificiales que se comercializan actualmente.
Detección y tratamiento de enfermedades genéticas.
Las técnicas de clonación selectiva de DNA, entre las que se incluye el DNA
recombinante, permiten el estudio de muchas enfermedades genéticas. El
aislamiento y clonación de un determinado gen responsable de una enfermedad
genética provee información importante para diseñar estrategias de mitigación del
mal o incluso puede dar las luces para la producción de una cura. Dos de las
enfermedades genéticas que se han estudiado mediante la técnica de RFLP son
la neurofibromatosis y el síndrome de Marfan.
La neurofibromatosis afecta a 1 de cada 3000 individuos y produce una variedad
de defectos en el sistema nervioso, que son responsables en gran medida de los
problemas de aprendizaje y de la aparición de tumores benignos en el cerebro.
Esta enfermedad se produce por un alelo autosómico y es de carácter recesivo. La
cartografía de este gen por los métodos tradicionales resulta una tarea
prácticamente imposible, puesto que el estudio de las familias de genes
relacionadas con este mal representaría una cartografía completa de los 22
cromosomas humanos, puesto que tienen una elevada tasa de mutación
espontánea.
Mediante la técnica del RFLP se ha podido establecer una cartografía parcial del
NF1, por medio de la elaboración de un mapa de exclusión (en este tipo de mapa,
se toman posibilidades y se las va descartando de acuerdo a las evidencias
experimentales obtenidas), posteriormente se pudo conseguir la secuencia
completa de aminoácidos y la secuencia genética de este gen, lo cual permitió
identificar a la proteína neurofibromina, responsable de a pérdida de memoria y de
los tumores. Ya una vez que se identificó y caracterizó esta proteína, los
científicos y los médicos han emprendido una nueva investigación en busca de un
medicamento que pueda minimizar sus efectos.
Otro candidato ideal para este estudio es el síndrome de Marfan, que afecta a
varios órganos del cuerpo, produciendo en la mayoría de los casos, una muerte
por ruptura de los principales vasos sanguíneos (Cummings 1995). El gen
responsable de esta enfermedad fue identificado mediante la técnica de los genes
candidatos. Esta técnica es una alternativa de cartografía de genes, que consiste
en analizar proteínas, enzimas u hormonas que se cree son responsables de la
enfermedad, y en base a su secuencia de aminoácidos se eligen genes que se
piensa son los que codifican estas proteínas, estos son los genes candidatos, una
vez que se ha seleccionado un grupo de genes candidatos se va haciendo una
evaluación más profunda y descartando genes, hasta hallar el gen responsable
más probable. El aislamiento y el clonaje de estos genes se lo realiza en base a
los principios detallados en la primera parte. La desventaja de este método es que
se puede aplicar solamente si se tiene información previa del tema, no es útil para
estudios que comienzan desde cero.
Este análisis ha reflejado que los problemas que conlleva el síndrome de Marfan
están relacionados a problemas con la proteína fibrilina, la cual es parte
importante de las membranas oculares, los huesos y los vasos sanguíneos, y es
por eso que los que padecen esta enfermedad tienen problemas de vista, huesos
y arterias débiles y usualmente mueren por un aneurisma al realizar un esfuerzo
muy fuerte.
Los dos ejemplos anteriores muestran la aplicación de las técnicas de DNA
recombinante para el estudio de enfermedades en adultos afectados, pero ¿es
posible detectar estas enfermedades antes del parto?. En respuesta a esta
pregunta
se
han
desarrollado
los
métodos
de
detección
prenatal
de
enfermedades. Existen dos métodos principales para este efecto: a amniocentesis
y la extracción de vellosidades coriónicas. El primero se basa en la extracción de
una muestra del líquido amniótico que protege al feto dentro las membranas
embrionarias, y el segundo e la extracción de una pequeña muestra de tejido del
corion, una de las membranas de protección embrionaria (Klug & Cummings
1999).
Ya sea con la muestra de líquido amniótico o con la de tejido de corion, se
procede a hacer una serie de análisis bioquímicos de las células, que inicialmente
dan información acerca del sexo, tipo de sangre y otra información básica del feto.
Posteriormente, el material genético de estas células puede ser sometido a
enzimas de restricción y mediante tecnología de DNA recombinante se hacen
cultivos con genes de interés (en este caso, la enfermedad a detectar debe ser
conocida y debe ser posible aislar su secuencia), para ver el efecto que produce
en estos, y de esta manera se determina si el feto padece o no una determinada
enfermedad (Fig. 6).
Fig. 6: Técnica de amniocentesis, para detectar enfermedades genéticas y realizar
análisis bioquímicos en el feto (tomado de Klug & Cummings 1999).
Las enfermedades que más comúnmente se detectar prenatalmente son la
talasemia y la anemia de células falciformes, porque de éstas ya se sabe mucho y
se tiene un conocimiento previo de dónde se ubican, y por consiguiente es fácil
aislar los fragmentos de DNA para producir el cultivo en un hospedero y
determinar el comportamiento que tendrá esa sección.
La detección de enfermedades genéticas se ha revolucionado con la
implementación médica de la técnica de nucleótidos específicos y rastreo genético
(Klug & Cummings 1999). Esta técnica, cuya abreviatura es ASO, utiliza en
condiciones adecuadas, una sonda que se denomina oligonucleótido específico de
alelo (de esta frase se deriva la abreviatura ASO, en inglés) el cual hibridará sólo
con su secuencia complementaria y no con otras secuencias, aunque éstas varíen
sólo en un nucleótido. Para rastrear enfermedades como la anemia de células
falciformes, se utiliza esta técnica combinada con análisis de PCR, ya sea este
tradicional o una modificación específica, tal como un PCR de baja temperatura
(Iakobashvili & Lapidot 1999). En este método se produce una extracción de DNA
por lisis en los glóbulos blancos de la sangre, y posteriormente este DNA es
desnaturalizado por calor. Luego se produce una amplificación del gen en cuestión
(para el caso de la anemia falciforme, el gen de la b–globina, por ejemplo)
mediante la técnica de PCR. Se coloca una gota del DNA amplificado en un filtro,
y se hibridiza con un ASO, y luego se lee el resultado en los filtros, de haber
hibridación la molécula resultante es demasiado grande para atravesar los poros
del filtro.
Terapia génica.
El rastreo y caracterización de los genes que producen las enfermedades
genéticas desde un principio tuvo la finalidad de ofrecer un tratamiento a estas
enfermedades, de esto surge el concepto de terapia génica, la cual consiste en
transferir alelos normales a un individuo enfermo para eliminar su problema. Ya se
han hecho varios experimentos en ratones y otros animales, en los cuales se ha
logrado exitosamente restaurar el funcionamiento normal de un alelo por la
inserción de la cadena correcta mediante un vector. El que hayan resultado
exitosos los ensayos realizados en ratones abre la mente a creer que en unos
años más este tipo de terapia pueda ser usada para curar las cientos de
enfermedades genéticas de los humanos (Griffiths et al. 1998, Klug & Cummings
1999).
La terapia génica tiene ya una cierta historia, en un principio se aplicaba en
humanos, inoculando al organismo dosis significativas de la proteína faltante o
defectuosa, por ejemplo, se administraban fuertes dosis de insulina a enfermos de
diabetes, con la finalidad de que una elevada concentración de la proteína
funcional restaure la secuencia genética. Desafortunadamente este tipo de terapia
génica no tuvo éxito, y los estudios derivados a investigar el o los mecanismos
necesarios para el reemplazo de una secuencia defectuosa por una normal,
mediante el uso de vectores y técnicas de DNA recombinante.
Este proceso todavía está en fase experimental y aún no hay datos sobre ensayos
exitosos en humanos, todas las prueba realizadas se han hecho en invertebrados
como Drosophila y en mamíferos pequeños como Mus musculus. Si bien el
proyecto genoma ya ha dado una versión preliminar de la secuencia de los 23
cromosomas humanos, y las técnicas de transferencia de genes están cada día
más avanzadas, todavía resulta difícil aislar genes específicos sanos en humanos,
y más difícil aún el implantarlos en el sitio correcto, en un organismo enfermo. El
tamaño y la complejidad del genoma hacen de ésta una ardua tarea.
Lucha contra el cáncer.
Anualmente millones de personas mueren de cáncer. Esta enfermedad ha sido
extensamente estudiada por los científicos, pero aún no se han podido dar curas
para este mal, pues todavía no se tiene claro cómo se origina exactamente, y
cuáles son los mecanismos que operan para su tratamiento. Hasta ahora se sabe
que el cáncer es producto de una mutación en un sitio importante del genoma, que
ocasiona que las células se reproduzcan sin control generando tumores y
destrucción de tejidos. Se han hecho muchos estudios a nivel molecular y se han
lanzado cientos de hipótesis, pero todavía no se tiene nada concreto que permita
diseñar una cura.
Uno de los estudios más interesantes al respecto se lo ha realizado aislando y
estudiando los factores que determinan la muerte celular, pero investigaciones
recientes han mostrado que la solución puede ser más simple todavía, Fraser
(1994) observó que en algunos organismos existen enzimas denominadas endo–
exonucleasas –aisladas de E. coli–, que se encargan de la reparación del DNA y
la muerte celular. Esta quizá sea la respuesta al cáncer, puesto que esta enzima
bifuncional es capaz de quitar o añadir nucleótidos al DNA para corregir errores, y
si fuera posible introducir el gen que la codifica en las células cancerosas, se abre
la oportunidad de una reparación in vivo de la secuencia mutada, y de esta
manera detener e incluso tal vez, revertir el efecto del cáncer en uno o más
tejidos.
Si bien estas enzimas se han aislado inicialmente en E. coli y han sido
ampliamente estudiadas por medio de la tecnología de DNA recombinante, y otros
métodos como el PCR, se ha encontrado evidencia que existen enzimas parecidas
a estas en Saccharomyces cerevisiae y se ha dejado abierta la posibilidad de que
existan algunas enzimas parecidas a estas en los mamíferos.
Si llegara a concretarse un estudio al respecto y éste revelara la factibilidad de
introducir el gen que codifica las endo–exonucleasas en células humanas,
posiblemente la lucha contra el cáncer habría encontrado un remedio, y la solución
a este problema sería aplicar una terapia génica de inclusión de DNA foráneo para
reparar el material dañado.
Aplicaciones forenses.
La tecnología de DNA recombinante ha pasado a ser un fuerte aliado de la
medicina forense y la investigación criminal. Características genéticas específicas
están siendo usadas como pruebas contundentes en cientos de juicios hoy en día,
puesto que basta una célula de donde se pueda aislar DNA para identificar a una
persona, con menos de un 1% de error. Esta técnica se viene usando desde hace
algunos años para pruebas de paternidad, problemas de inmigración (para
determinar razas) y como una huella molecular para identificar criminales. No
obstante, estos procedimientos han levantado fuertes críticas éticas, ya que en
algunos casos estos resultados llevan a discriminaciones raciales y a problemas
familiares.
Actualmente se usan los minisatélites o VNTR (secuencias muy repetitivas en
tandeo) como huellas moleculares (Smith & Wood 1998, Klug & Cummings 1999)
puesto que al ser éstas altamente variables, la combinación de los distintos
satélites y la posición de cada uno es una característica única de cada persona, la
cual no se puede modificar, ocultar o borrar.
La tecnología de DNA recombinante y las plantas: aplicaciones en la
agricultura.
La aplicación del DNA recombinante en la agricultura ha tenido una gran
aceptación por parte de los grandes productores, puesto que esta revolucionaria
técnica permite obtener especies transformadas a las cuales se les añaden o
acentúan características especiales, como resistencia a herbicidas, mayor
producción de vitaminas, etc.
Actualmente hay una gran cantidad de plantas que se pueden transformar, entre
estas están los cítricos, que son los grupos en los que se han hecho más estudios
y pruebas, muchas de ellas exitosas, todavía se sigue tratando de transformar los
cereales como el trigo y el maíz, pero aún no se ha tenido éxito. Lo cultivos de
papa, soya, rábano y tabaco, sin embargo, son fáciles de transformar y se han
hecho muchas pruebas introduciendo material genético usando como vector a la
bacteria Agrobacterium tumefaciens, que forma asociación naturalmente con estas
plantas (Smith & Wood 1998).
La bacteria Agrobacterium tumefaciens posee un plásmido inductor de tumores
(Ti) que produce un crecimiento tumoroso o callo en las plantas (Smith & Wood
1998). Este callo es un conjunto de células vegetales no diferenciadas, que
producen unas sustancias químicas llamadas opinas, de las cuales se alimenta
esta bacteria. El proceso de DNA recombinante para este caso sigue la siguiente
dinámica: el fragmento de DNA a incluir en la planta es aislado y lo inserta en la
región de homología del plásmido Ti, luego se induce a la formación del callo por
acción de las bacterias y éstas introducen en plásmido con el DNA foráneo en un
cromosoma –de manera aleatoria– en las células del callo. Posteriormente las
plantas se regeneran a partir del callo, expresando el material genético introducido
(Fig. 7).
Este método ha servido para introducir una gran variedad de genes en estas
plantas, uno de los experimentos más conocidos es la planta de Nicotiana
tabacum con genes de luciferasa, la cual brilla en la noche. Esta planta
luminiscente es sin embargo sólo un atractivo visual, puesto que no tiene ninguna
utilidad, y detrás de la polémica que ha levantado la construcción de esta planta,
están muchas otras a las que sí se les ha hecho modificaciones útiles, como frutos
que se pudren más lentamente, plantas que llevan vacunas o plantas resistentes a
plagas y herbicida.
Fig. 7: Técnica de producción de plantas transgénicas por medio de la formación de
callos con Agrobacterium tumefaciens (Klug & Cummings 1999).
Gramíneas resistentes a herbicidas.
Uno de los más grandes problemas que enfrentan los agricultores es la aparición
de malas hierbas en sus campos de cultivo. Usualmente estas hierbas se
combaten
usando
sustancias
químicas
muy
variadas,
denominadas
genéricamente herbicidas. Estos herbicidas, sin embargo, también afectan a las
gramíneas del cultivo y las matan, por lo cual su aplicación es sumamente
riesgosa, puesto que además de matar las hierbas indeseables se matan las
plantas de cultivo.
Mediante la técnica del DNA recombinante se han producido gramíneas
resistentes a algunos herbicidas como el glifosfato. Esto se ha logrado mediante
modificaciones que incrementan la síntesis de la EPSP sintetasa, encargada de
sintetizar aminoácidos, esta enzima se encuentra en los cloroplastos y es la
primera en verse afecta por el glifosfato, pero al aumentar la síntesis de ésta, el
efecto de los herbicidas es mínimo, puesto que se puede continuar con la síntesis
de aminoácidos de una manera prácticamente normal (Klug & Cummings 1999).
Investigaciones similares se han hecho en este campo, para añadir a las plantas
factores de resistencia contra enfermedades virales (como el virus mosaico del
tabaco), contra plagas de insectos e incluso contra sequías prolongadas.
Actualmente se trabaja mucho en este campo y próximamente los centros de
abastecimiento, tales como supermercados, ofrecerán a la venta productos
transgénicos como estos.
Plantas y vacunas transgénicas.
Otra de las aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante en las plantas es
la producción de plantas transgénicas con vacunas. Las formas tradicionales de
producción de vacunas son la utilización de capas inactivadas o atenuadas de la
bacteria o virus. La tecnología del DNA recombinante ha permitido el desarrollo de
vacunas genéticas o también llamadas vacunas de subunidad, en las que se
producen grandes cantidades de una proteína de superficie del virus o la bacteria
contra la cual se desea hacer la vacuna, y esta proteína va a generar los
anticuerpos necesarios para hacer frente a la enfermedad.
La aplicación de esta técnica de biotecnología funciona así: se aísla el fragmento
de DNA que codifica la proteína de superficie que irá a constituir la vacuna de
subunidad, se utiliza como vector el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y
se produce una planta recombinante a partir del callo formado (se sigue el mismo
proceso visto anteriormente), una vez desarrolladas las plantas, éstas expresarán
el antígeno contra la enfermedad (Klug & Cummings 1999). De esta manera se
producen grandes cantidades de vacuna a costos reducidos, y la administración
de la misma se hace más fácil, puesto que estos vegetales podrían ser
comercializados para su consumo normal, luego de una certificación previa de los
efectos colaterales que pueda tener el consumo de estas plantas alteradas
genéticamente. Esta técnica se ha aplicado con éxito en la producción de
antígenos para la hepatitis B en plantas de tabaco.
Todavía falta hacer una gran cantidad de estudios en esta área, pero las
perspectivas actuales muestran una interesante potencialidad a la producción de
vacunas de subunidad en plantas transgénicas, ya que esto abriría la posibilidad
de prevención de muchas enfermedades mortales, para las cuales no se conocen
vacunas tradicionales, y además deja abierta la posibilidad de una vacunación por
medio de los alimentos.
¿Cuán seguro es consumir plantas transgénicas?
Si bien todos los ensayos y pruebas que se han hecho con plantas transgénicas
han estado delimitados muy claramente por un límite de seguridad, existen
razones para dudar de que el consumo de productos transgénicos sea totalmente
inocuo y esto deja abierta una pregunta que hacen Käppeli & Auberson (1998):
¿Cuán seguro es "suficientemente seguro" en la ingeniería genética de plantas?.
Estos autores plantean que si bien se tienen todos los cuidados necesarios y se
realizan los procedimientos de DNA recombinante de la manera más profesional y
responsable posible, siempre existen factores naturales de variación que escapan
al control de los investigadores y pueden resultar peligrosos para el consumidor.
Los productos transgénicos pueden resultan potencialmente tóxicos para el
consumidor final, pues nunca se sabe a ciencia cierta el efecto que pueden causar
las mutaciones inducidas al individuo, las cuales pueden derivar en la producción
secundaria de toxinas o incluso pueden llegar a producir enfermedades. Cuando
se aísla un fragmento de DNA para ser incluido en una planta por medio de la
técnica de A. tumefaciens, el investigador controla y predice el efecto primario que
ocurrirá con el campo, es decir, este efecto primario es el fenotipo que se espera
obtener con la modificación, el mismo que ha sido muy bien delineado, con límites
conocidos y cuyo efecto es predecible con un elevado grado de certeza.
Además de este efecto primario, pueden presentarse uno o más efectos
secundarios, los cuales son los fenotipos y reacciones inesperadas. Estos efectos
secundarios se dan por muchas causas en los individuos transgénicos, pero la
principal explicación es que las plantas son sistemas vivos con un genoma flexible
y dinámico, expuesto a otras mutaciones, cambios espontáneos, fenómenos de
recombinación y errores en la replicación del DNA. Cualquiera de estos factores
es capaz de generar un efecto secundario, que produzca un fenotipo diferente al
esperado, potencialmente dañino.
Puesto que estos procesos de variación, responsables de los efectos secundarios,
son impredecibles y no están considerados dentro del estudio inicial, no se sabe
exactamente cuál es su efecto puesto que no se tiene un conocimiento completo
del cambio ocurrido a nivel molecular.
Otra causa de efectos secundarios es un defecto en el proceso de transfección del
DNA foráneo desde el plásmido Ti (vector) hacia las células del callo, como ambos
son sistemas biológicos dinámicos sometidos a constante variación, a veces
ocurre un desplazamiento en el área de transferencia de material genético y se
transfieren otros fragmentos a parte o en lugar del fragmento de interés,
produciendo cambios no deseables.
Todos estos factores hacen de la ingeniería genética en plantas un campo muy
promisorio para el futuro, pero potencialmente peligroso, y la comercialización de
productos transgénicos debería darse una vez realizados estudios profundos de
los impactos a la salud y el ambiente que estos vegetales modificados puedan
causar.
Producción de animales transgénicos mediante DNA recombinante.
Si bien la aplicación de la tecnología de DNA recombinante para la producción de
animales transgénicos se viene realizando desde hace algunos años en los
principales centros de investigación científica del mundo, todavía se levanta
polémica acerca de la ética y la manipulación genética de animales, y más aún de
humanos.
Numerosos estudios realizados en animales transgénicos han permitido entender
mejor la evolución de los sistemas de regulación génica (Cavener 1992), la mayor
parte de estos estudios se han hecho en Drosophila melanogaster y ratones de
laboratorio. Dichos experimentos han sido un importante respaldo para las
investigaciones que trataron y todavía tratan de dilucidar por completo el
funcionamiento de las regiones de control de los genes, y el cómo operan los
promotores y los inhibidores de genes, y el papel que éstos tienen en la
diferenciación celular y la producción diferencial de proteínas de acuerdo a lo que
se denominó un subprograma de vida.
Ya no es un secreto para nadie, que en Estados Unidos se han producido vacas
transgénicas, cuya leche contiene además proteínas humanas, propias de la leche
materna de esta última especie. Un reciente documental del Discovery Channel
mostró a estas vacas pastando como cualquier vaca normal, externamente se ven
idénticas a organismos normales, pero su genoma ha sido alterado para la
producción de proteínas adicionales. Este proyecto tiene miras de buscar
sustitutos "naturales" (si cabe el término) para la leche materna humana, pues se
ha visto que los sustitutos sintéticos que se comercializan actualmente pueden
tener efectos secundarios sobre los lactantes.
Chile es en este momento el segundo mayor productor de salmón del mundo, lo
cual ha obligado a esta industria a buscar nuevas alternativas para asegurar su
producción, protegiendo a los salmones de enfermedades (Bioplanet 2000). En la
actualidad son muchas las enfermedades que atacan a los salmones y producen
grandes pérdidas económicas a los productores de salmón, además del efecto
nocivo que tiene una gran epidemia sobre el equilibrio de los ecosistemas.
Actualmente no se conocen muchos tratamientos o vacuna contra estas
enfermedades, y los estudios realizados son aún insuficientes como para proveer
una solución por este lado.
Por ello, es que el Instituto Tecnológico del Salmón, en Chile, ha planteado otra
solución: la biotecnología. Para este fin, la compañía chilena de biotecnología
Bios, ha desarrollado una serie de vacunas genéticas (Gurunathan et al. 2000)
que permitan a los salmones adquirir resistencia contra estas bacterias, todavía
poco conocidas. Este método es altamente eficiente, puesto que la producción de
anticuerpos es alta desde un principio y condiciona al organismo a estimular y
reforzar su sistema inmunológico. Bajo el lema "es mejor prevenir que curar", se
han desarrollado además vacunas genéticas para enfermedades virales
potenciales, asegurando de esta manera a producción de salmón de la industria
chilena.
Sobre estos métodos de vacuna genética, sin embargo, todavía faltan realizar
estudios de efectos secundarios que puedan resultar potencialmente tóxicos al
consumidor final.
La tecnología de DNA recombinante y el ambiente: bioremediación.
Los problemas de contaminación actualmente están recibiendo gran atención por
parte de las autoridades ambientales en el mundo entero. Si bien los problemas de
contaminación no se pueden revertir, en la actualidad existe otra alternativa: la
bioremediación. Bioremediación se define como el proceso de descontaminación
mediante la inducción de bacterias capaces de degradar las sustancias
contaminantes. Si bien esta técnica tiene apenas 10 años de antigüedad e
investigación, hoy en día son muchas las aplicaciones que se le da. Se emplea
bioremediación para la degradación de petróleo, de metales pesados, de
insecticidas e incluso para combatir radiación.
La bioremediación puede aplicarse usando bacterias silvestres que tengan la
capacidad de degradar el contaminante con el que se está tratando, sin embargo,
en muchos casos se deben construir bacterias –mediante técnicas de DNA
recombinante– para la remediación de un contaminante determinado.
Si bien se conocen cerca de 70 géneros de bacterias silvestres que pueden ser
usadas para bioremediación, la producción de bacterias modificadas va ganando
terreno e importancia día a día. Numerosos estudios (Keasling & Bang 1998,
Timmis & Pieper 1999, Coates & Anderson 2000, Pieper & Reineke 2000, Sayler &
Ripp
2000)
ha
utilizado
bacterias
modificadas
genéticamente
para
la
descontaminación de ambientes, con un impacto mínimo a largo plazo, puesto que
al ser éstos descontaminadotes agentes biológicos, reducen y controlan su
población luego de cumplir su función, y viven en los ambientes junto con el resto
de la microflora.
En muchos casos, es necesaria la construcción de estas cepas recombinantes,
puesto que todavía no se conocen organismos silvestres capaces de efectuar
algunos tipos de degradación. Coates & Anderson (2000) describen la
construcción de bacterias recombinantes para la degradación anaeróbica de
contaminantes ambientales, proceso aún poco estudiado y poco común en la
naturaleza (la mayoría de los procesos de degradación de contaminantes
requieren de oxígeno). Estudios como el de Katja & Top (1997) sugieren una
transferencia de genes a los microorganismos del suelo para acentuar las
características de biodegradación en cepas nativas de ese medio.
Quizá uno de los casos más llamativos por su importancia, es el propuesto por
Chen & Wilson (1997) para la construcción de cepas de E. coli modificadas
capaces de bioremediar mercurio. Todavía no se han encontrado bacterias
silvestres capaces de remediar contaminación por este metal, pero si bacterias
que pueden hacerlo menos tóxico para el ambiente, cambiándolo de forma a
complejos orgánicos. Sin embargo, la posibilidad de construcción de una cepa
capaz de bioremediar este metal pesado, abre las puertas al tratamiento de áreas
afectadas por la industria, en especial la minería, que vierte grandes cantidades de
residuos con mercurio a suelos y aguas.
Campo de aplicación del DNA recombinante en la industria.
En la actualidad existen muchas aplicaciones industriales para la tecnología de
DNA recombinante. Los productos que se generan a partir de organismos
recombinantes son muchos y tienen diferentes finalidades, que van desde la
industria vitícola hasta la producción de medicamentos.
El microorganismo protagonista en la industria por DNA recombinante es la
levadura Saccharomyces cerevisiae, que al ser un organismo eucariota simple del
cual se tiene ya un gran conocimiento, se facilita la producción de sustancias
mediante su maquinaria biosintética. Actualmente se usan cepas de levadura
modificadas para la producción a gran escala de taumatina y quimosina (Smith &
Wood 1998). La taumatina es una proteína de origen vegetal, unas 200 veces más
dulce que la sacarosa y es usada comercialmente en edulcorantes y como aditivo
para muchos alimentos. La quimosina, también conocida como renina, es una
proteína que se utiliza en grandes cantidades para la producción de queso.
Otra aplicación de levaduras modificadas genéticamente está dada en la industria
de los vinos (Pérez–González et al. 1993). Se han construido cepas de levadura
recombinante que expresen el gen de la b –(1,4)–Endoglucanasa, una enzima que
reacciona con los azúcares del mosto, dándole al vino un aroma a frutas más
intenso y agradable. Esta modificación de la levadura del vino, favorece al proceso
de micro vinificación, induciendo una fermentación más rápida del mosto, sin
alterar la calidad y el sabor del vino. El proceso de modificación de esta cepa de
levadura es complejo y requiere de equipo sofisticado (ver Pérez–González et al.
1993 para mayor información), puesto que se debe asegurar el correcto
funcionamiento de la cepa ya que su aplicación es de gran escala, y un error en la
construcción de la cepa puede representar pérdidas millonarias para la industria,
pero su correcta aplicación también genera un movimiento económico significativo.
Como ya se vio en la parte de aplicaciones médicas, las bacterias recombinantes
se usan ampliamente para la producción de ciertos medicamentos y enzimas a
gran escala. Este método de producción también ha revolucionado la industria
farmacéutica, puesto que desde hace algunos años que este método ha
reemplazado la producción tradicional de insulina, enzimas, hormonas y otros, lo
cual ha llevado a una masificación de su uso y una considerable reducción de
costos. Si se compara el costo y rendimiento de la extracción de microlitros de
hormona de crecimiento de cadáveres, con los volúmenes diarios que puede
proveer un cultivo de E. coli recombinante ya diferencia es abismal: gracias a la
industrialización mediante tecnología de DNA recombinante, millones de personas
en el mundo pueden acceder ahora a tratamientos médicos con este tipo de
proteínas.
El campo de la investigación genética y la biología en general, también se han
visto favorecidas con la producción de gran escala y menor costo de proteínas y
enzimas necesarias para las investigaciones que se realizan en los diferentes
campos de estas ciencias.
Discusiones y conclusiones.
La tecnología de DNA recombinante es una técnica de reciente aplicación, que a
tenido un gran impacto en la ciencia y diversos aspectos de la vida cotidiana.
Los principios de esta metodología se han ido perfeccionando con el tiempo, los
estudios que se han ido realizando sobre vectores y hospederos han abierto las
puertas al uso de nuevos métodos de aplicación de este principio, tales como el
desarrollo de cromosomas artificiales, los mismos que han permitido entender
mejor los sistemas de regulación génica y la expresión.
La genética se ha visto especialmente beneficiada por el desarrollo de esta
tecnología, ya que ha permitido el estudio de mecanismos y procesos complejos,
que de otra manera habrían tomado décadas en ser dilucidados. La genética y la
biotecnología son dos ramas muy relacionadas que se benefician mutuamente, el
beneficio que da la biotecnología a la genética se lo acaba de explicar, y a su vez
la genética beneficia a la biotecnología, al propiciar el desarrollo de nuevas técnica
y procedimientos en respuesta a las necesidades de los investigadores.
La capacidad de aislar fragmentos específicos de DNA e insertarlos dentro de otro
organismo para su expresión y su clonación, ha permitido y permitirá la
investigación en genes. En la actualidad esta técnica permite la detección de
enfermedades genéticas tanto en individuos adultos como en individuos
prenatales, mediante una combinación de la tecnología de DNA recombinante con
la técnica de PCR.
Este cambio dinámico en la tecnología de DNA recombinante ha propiciado su
aplicación en un conjunto heterogéneo de campos, como ser la industria, la
agricultura y la bioremediación. La posibilidad de crear organismos recombinantes
que expresen genes ajenos a su genoma hace que se puedan masificar procesos
industriales a costos más bajos, que se puedan crear plantas transgénicas que
lleven vacunas, vitaminas o que tengan una mayor resistencia a la putrefacción,
aunque la seguridad de consumir alimentos transgénicos está todavía en tela de
juicio. De la misma manera, hoy en día se producen animales transgénicos en los
que se experimentan terapias génicas, también se producen animales con gran
resistencia a enfermedades o que puedan producir proteínas humanas en su
leche.
La medicina actual ha experimentado un gran desarrollo desde que se pueden
producir proteínas y otras sustancias útiles en gran cantidad y a bajos costos por
medio de cultivos bacterianos. Se han planteado terapias génicas que permitan
sustituir los alelos defectuosos que producen las más de 500 enfermedades
hereditarias conocidas, por alelos normales para combatir estos males que
acechan a millones de personas en el mundo.
Esta tecnología de DNA recombinante ha abierto las puertas a la aplicación
masiva de la bioremediación, puesto que al poder crear organismos transgénicos
capaces de degradar contaminantes, con un efecto ambiental colateral mínimo, se
puede hacer frente de una manera más efectiva a los problemas ambientales de
contaminación, ya sea esta por hidrocarburos, metales pesados o radiación.
Si bien la aplicabilidad de la tecnología de DNA recombinante ha llegado a
diversos campos y ha dado grandes resultados, todavía se discute cuán seguro es
el utilizar estos productos alterados genéticamente, porque el investigador controla
y determina los efectos primarios que se vayan a producir, pero escapan de su
control los efectos secundarios que se puedan producir por los procesos naturales
de variación propios de los seres vivos, y una alteración significativa –de carácter
aleatorio– en los organismos transgénicos de uso común (alimentos, cepas
industriales, etc.) representaría un daño económico y humano muy grande si no se
toman las previsiones del caso.
También se discute mucho acerca de la ética de experimentar con humanos,
puesto que el factor intrínseco de variación puede dar resultados inesperados, sin
embargo esta experimentación también puede conllevar aspectos positivos como
la posibilidad de encontrar una cura para el cáncer.
En síntesis, la tecnología de DNA recombinante es una de las principales
herramientas de biotecnología con la que cuenta el mundo actual, que al tener una
variedad tan amplia de aplicaciones, que van junto con un cambio y mejoramiento
dinámico constante, hacen que sea posible extender los horizontes de la cultura
humana más allá de los límites que se tenían hace algunos años, y por
consiguiente ha llevado a mejorar la calidad de vida de millones de personas que
se han visto beneficiadas con estas aplicaciones. Sin embargo, se debe tener muy
en cuenta que la utilización de ésta y otras técnicas de biotecnología conllevan
riesgos potenciales y problemas éticos que no pueden ni deben pasar
desapercibidos.
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