Laboratorio 8: Familia Enterobacteriaceae Métodos de Identificación

Laboratorio 8: Familia Enterobacteriaceae
Métodos de Identificación Rápida
Biol: 3725L
Objetivos
Conocer
los métodos rápidos para la
identificación de bacterias (API 20E,
Enterotubo II, Biolog y Vitek).
Inocular
un desconocido en varias
pruebas bioquímicas
Tomar datos de las reacciones bioquímicas
después de 24 horas de inoculación.
Características generales de
la familia Enterobacteriaceae
Bacilos (o coco-bacilos)
Gram negativos
Flora normal del intestino de
animales de sangre caliente.
Catalasa positivos
Oxidasa negativos
Causantes de enfermedades
nosocomiales.
Patógenos humanos más
comunes.
No producen esporas
Temperatura óptima entre 32°45.5°C.
Anaerobios facultativos.
Algunos producen cápsula.
Algunos fermentan lactosa.
Pueden ser mótiles (flagelo).
Miembros de la
Familia Enterobacteriaceae
Citrobacter sp.
Enterobacter sp. Salmonella typhimurium
Salmonella enteritidis
Escherichia sp.
Klebsiella sp.
Morganella sp.
Proteus sp.
Shigella dysenteriae
Yersinia pestis
Providencia sp.
Salmonella sp.
Serratia sp.
Shigella sp.
Serratia marcescens
Yersinia sp.
Klebsiella
pneumoniae
Miembros de la
Familia Enterobacteriaceae
Los géneros patogénicos más comunes se clasifican en
tres grupos
Coliformes: bacilo, Gram -, fermentan lactosa a gas y
acido, microbiota normal, pueden ser patógenos
oportunistas.
No coliformes oportunistas: no fermentan lactosa.
Patógenos verdaderos
Enfermedades
Gastrointestinales
Tracto urinario
Meningitis
Septicemia
Pneumonia
Modo de Transmición
Transmición
Alimentos
contaminados
Persona a Persona
Agua contaminada
Contacto con animal
Ruta Oral
Propiedades virulentas de E.coli
Enterohemorrágico
Enterohemorr
ágico
Diarrea en humanos, bovinos, gatos y perros.
Escherichia coli O157:H7
Clasificada de acuerdo a sus antígenos somáticos
(O) y flagelares (H).
Tolerancia acídica (pH bajo)
Tolerante a muchos antibióticos
Escherichia coli O157:H7
Causa principal de colitis hemorrágica o
diarrea con presencia de sangre.
Puede progresar a Síndrome Urémico
Hemolítico.
Afecta riñones
Puede causar Púrpura Trombocitopenia
Trombótica
Moretones
Disminución de plaquetas (trombocitos)
Trombos (coágulos en los vasos sanguíneos
Métodos rápidos de identificación
de la Familia Enterobacteriaceae
Métodos rápidos de identificación
API 20E (Analytical Profile Index)
Provee muchos resultados de una sola inoculación.
20 microtubos con sustratos
deshidratados (rehidratación
con suspensión de bacteria)
Se pueden identificar 127
géneros y 550 spp.
diferentes
Bacterias oxidasa-negativo
Gram-negativo de la familia
Enterobacteriaceae y otros
Gram -
API 20E
Incubar a 35-37ºC
18-24 hrs
API 20E
Provee lectura de 22 pruebas
bioquímicas
Utilización
Se genera anaerobiosis con aceite
mineral estéril en pruebas cuyas siglas
están subrayadas:
Ej.
ADH, LDC, ODC, etc
Las pruebas marcadas con un recuadro
inferior, se deben llenar completamente:
Ej.
CIT
,
VP
, etc.
Procedimiento de API 20E
Preparación de la suspensión
Inocule una colonia (2-3mm diámetro) del cultivo puro
de su bacteria en solución salina 0.85%
Asegúrese que la suspensión sea homogénea.
Procedimiento de API 20E
•Luego de hacer la suspensión
inocular los microtúbulos de
API 20E
•Añadir 5 ml de agua en la
bandeja de incubación para
proveer atmósfera húmeda.
Como llenar los microtúbulos
¿Como se lee el API 20E?
Aminoácidos analizados son (en orden) arginina, lisina y
ornitina.
Decarboxilación: reacción alcalina (cambio de color a
rojo)
Carbohidratos analizados son glucosa, manitol, inositol,
sorbitol, ramanosa, sacarosa, melibiosa, amygdalina y
arabinosa.
Fermentación: reacción ácida (cambio de color a
amarillo)
Producción de H2S e hidrólisis de gelatina (cambio a color
negro en todo el microtubo).
Interpretación del API 20E
Apuntar los resultados en la tabla de tabulación (1, 2, o 4 puntos
para reacciones +, 0 puntos para reacciones -) .
La prueba de oxidasa debe ser negativa.
Tres pruebas son añadidas a la vez para dar un código de 7
dígitos (profile index number), el cual es interpretado en el
manual de códigos.
Ventajas de API 20E
Rápido
Eficaz
Permite realizar numerosas pruebas a la vez
Desventajas de API 20E
Solo para microorganismos no fastidiosos.
Cepas Gram negativas y oxidasa negativa.
Bacterias de la Fam. Enterobacteriaceae.
De encontrarse Salmonella o Shiguella spp., es necesario llevar
a cabo pruebas serológicas para confirmar la identificación.
API 20E
Resultados para diferentes miembros de la Familia
Enterobacteriaceae
Sistema de Enterotubo II
Identificar miembros de la familia
Enterobacteriaceae, fermentadoras de glucosa y
que son oxidasa negativa. (Salmonella, Yersinia,
Escherichia etc.)
Algunas de las pruebas usadas en este sistema
son: Simmon Citrate, Triple Sugar-iron agar,
ureasa entre otros.
Sistema de Enterotubo II
Tubo con 12 compartimentos, cada uno
con un medio de cultivo sólido
diferente.
15 pruebas estándar preformadas:
Aerobia y anaerobias
Se inocula con una aguja, que se pasa
por el centro de los compartimentos
Incubación: 18 – 24 horas a 37ºC
(oscuridad)
Desventajas
Poco preciso
Riesgos de contaminación de las
pruebas
Se diagnosticaban erróneamente
géneros de bacterias
Sistema Enterotubo II
Lectura
Observar cambios de
color
Identificación:
Estructurar un código de
5 dígitos (Biocode)
Consultar con el manual
ENCISE (Enterobacteriaceae
Numerical Coding and
Identification System for
Enterotube)
Sistemas Computarizados
VITEK
Identificación y/o determinación de reacción antibiótica de
bacterias y levaduras anaerobias (más de 300 especies).
30 pozos con pruebas bioquímicas deshidratadas.
Identificación en 2 a 7 hrs.
La automatización aporta mayor seguridad, suprimiendo las
manipulaciones repetitivas.
Una vez inoculada, queda herméticamente cerrada y por lo
tanto es manipulable sin riesgo de contaminación.
No es necesario añadir ningún reactivo, lo cual evita
cualquier riesgo de olvido o error.
Sistemas Computarizados
Inoculador / Sellador
El cual permite la inoculación de las tarjetas en pocos minutos.
Incubador / Lector
Asegura simultáneamente la incubación y la lectura de las tarjetas
para una capacidad que varía de 32 a 480 tarjetas según el modelo.
Ordenador
Efectúa un control permanente de las operaciones en curso,
memoriza los valores, trata e interpreta los resultados.
Impresora
Sistemas Computarizados
BIOLOG:
Identificación de 1900 bacterias, levaduras y hongos en base a su
capacidad enzimática.
Sistema de microplacas de 96 fosas cada una conteniendo una
fuente única de carbono, nutrientes básicos y un indicador
colorimétrico.
El indicador colorimétrico que utiliza este sistema es una sal de
tetrazolium que en su forma oxidada es incolora.
Cuando el organismo es introducido en la gran variedad de sustratos
de carbono en la microplaca se produce una huella con un patrón
característico.
Los resultados bioquímicos de la muestra son leídos y guardados en
segundos automáticamente, eliminando la subjetividad visual de la
interpretación.
Sistemas Computarizados
BIOLOG:
Posteriormente son comparados con
la extensa base de datos para su
identificación final.
Los resultados se interpretan y se
registran automáticamente.
Especie identificada se exhibe en un
monitor de la pc junto con su patrón de
la reacción.
También una lista de 10 especies con
los patrones relacionados más
cercanos y otra estadística útil.
La tecnología de Biolog es tan
sensible que puede detectar cultivos
mezclados o contaminados.
Práctica
Práctica
De las colonias aisladas de la práctica de la semana anterior, se
inoculará aproximadamente 11 colonias (una en cada columna) y
la primera columna representa el control negativo.
De MacConkey
Gram negative
1- SIM
2- Citrate
3-MacConkey
4- Glucose
5- EMB
6- Urea
7- Colilert
8- Control
De MSA
Gram positive
1- Catalase
2- BEA
3- MSA
4- Glucose
5- Glucose 6.5%NaCl
6- Urea
7- Enterolert
8- Control
Instrucciones
Inocular de la misma colonia, cada fosa de
las columnas de la placa.
Seguir instrucciones del instructor.
Incubar a 37ºC/24hrs.
Observar sus resultados y anotarlos.
Posibles resultados
Medio
Negativo
Positivo
Dextrosa
Rojo
Amarillo
Lactosa
Rojo
Amarillo
Bile Esculine Agar
Marrón claro
Negro
Manitol
Rojo
Amarillo
SIM
Marrón claro
Motilidad
Turbidez difusa
Producción de H2S
Negro
Citrato
Verde
Azul
Urea
Rojo
Rosado “Fuschia”
colilert
Amarillo claro
Amarillo intenso = coliforme total
Fluorescencia = E. coli
Enterolert
No Fluorescencia
Fluorescencia = Enterococcus sp.
MacConkey
Colonias claras (G-)
Colonias fusha = fermentador de
Lactosa
EMB
Colonias oscuras (G-)
Verde metalico = E.coli
Catalase
No burbujas
Burbujas
Fermentación de
carbohidratos
Bile Esculin Agar
MSA
Fermentación
del mannitol.
SIM
Sulfide
Indole
Motility
Simmon’s citrate
negativo
positivo
Urease