PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES EN CONEJO Preparación del primer inóculo Adyuvante de Freund completo (Sigma F5881) (FAC) Péptido Salino Sonicador 1. 2. 3. 4. Dejar sedimentar el Mycobacterium en el vial de FAC. Una vez sedimentado, eliminar la mitad superior del volumen usando una aguja y jeringuilla (ej. En vial de 10 ml, reducir el volumen a 5ml). Esto lo llamamos FAC×2. Resuspender la cantidad adecuada de péptido en salino 0.9% NaCl estéril (hospitalario) a 1 mg/ml. Para la 1ª inmunización, usamos 400 µg de péptido por conejo. Mantener en frío. En un tubo ancho (ej. 20 ml), echar 1 volumen de FAC×2 y 1 volumen de péptido en salino (ej. 1 ml de FAC×2 y 1 ml de péptido). Sonicar, 2 ciclos de 30” con 1 min de pausa entre ciclos, manteniendo en un vasito con hielo. Se forma una emulsión pastosa, como mayonesa, muy blanca. Usar para inocular directamente. ¡IMPORTANTE: LIMPIAR EL SONICADOR A FONDO ANTES DE PREPARAR LA EMULSIÓN! 1. 2. 3. 4. 5. Limpiar el vástago con agua y jabón. Aclarar. Limpiar con EtOH 70%. Sonicar EtOH 70%, 3×30” a tope. Lavar con salino. Sonicar salino 2×30” a tope. Preparación de los siguientes inóculos Se hace igual que el primero, con dos salvedades. - Usamos adyuvante de Freund incompleto (FAI) (Sigma F5506) - Ponemos la mitad de péptido (péptido resuspendido a 0.5 mg/ml) Inyección en los conejos Se usan conejos New Zealand, de 2-3 meses (2-3 kg). Primero, se sacan 10 ml de sangre de la oreja para usar como suero preinmune. Preparación del suero preinmune: 1. Dejar la sangre 1h a temperatura ambiente. 2. Pasar la noche a 4ºC. 3. Centrifugar a 2200 rpm durante 10 min, a temperatura ambiente. 4. Separar el suero y mantener a -70ºC. Se les pela el cogote con una peladora, recogiendo el pelo con una aspiradora. Se inoculan 800 µl de mayonesa por vía intradérmica en el cogote con una aguja hipodérmica (g25), formando 5-10 “bolas” de inóculo. Se usan jeringas de 1ml pero con émbolo completo, con lo que se inyecta todo el volumen. Se hacen 2 inmunizaciones intramusculares más usando FAI en vez de FAC y la mitad de péptido (ver arriba). Se saca sangre y se valora el título de anticuerpo, si no han ido bien, se da una 4ª inmunización intradérmica. Se sangran completamente o después de la 3ª o 4ª inmunización, dependiendo de los resultados de la titulación. FICHA DE INMUNIZACIÓN (MANTENER LA CONFIDENCIALIDAD, SI SE COMPARTE ESTE PROTOCOLO FUERA DEL LABORATORIO, BORRAR LOS DATOS) FICHA DE INMUNIZACIÓN ESPECIE: Conejo USUARIO: Miguel Vicente Manzanares Nº DE CUENTA: TELÉFONO LAB.: 91-5202370 CEPA: New Zealand LABORATORIO: IIS-IP / UAM OTROS DATOS: KLH-CONFIDENCIAL TELÉFONO PERSONAL: 677-779-483 Nº DE ANIMALES: CLAVE DE INMUNIZACIÓN: CONFIDENCIAL KLH-peptido EDAD: 2 meses Nº DE CELDA: PAUTA DE INMUNIZACIÓN FECHA ANTÍGENO NATURALEZA 25-1-2012 KLHCONFIDENCIAL KLHCONFIDENCIAL KLHCONFIDENCIAL KLHCONFIDENCIAL 15-2-2012 7-3-2012 28-3-2012 VÍA / ADJUVANTE OTROS P-pep + KLH DOSIS/ CONEJO ug/ml 400/800 ID MULT/ FACx2 d0 P-pep + KLH 200/500 IM / AFI d21 P-pep + KLH 200/500 IM / AFI d42 P-pep + KLH 200/500 IM / AFI d63 NO SE NECESITAN PRECAUCIONES ESPECIALES EN EL MANEJO DE LOS ANIMALES. EXTRACCIONES Nº DE ANIMAL Preinmune 1º 2º 3º FECHA 25-1-2012 VOLUMEN RESULTADOS 10 ml OBSERVACIONES FECHA DE BAJA:....................................1261 y 1262.................................. Sangría completa: OTROS