Departamento de Biología Aplicada División de Genética Análisis genético y molecular de PEP1, un gen implicado en la morfogénesis del fruto de Arabidopsis thaliana Juan José Ripoll Samper. Sant Joan d’Alacant, 2004 Análisis genético y molecular de PEP1, un gen implicado en la morfogénesis del fruto de Arabidopsis thaliana Trabajo realizado por el Licenciado Juan José Ripoll Samper, en la División de Genética del Departamento de Biología Aplicada de la Universidad Miguel Hernández de Elche, para optar al Grado de Doctor. Sant Joan d’Alacant, 31 de Mayo de 2004. Departamento de Biología Aplicada Universidad Miguel Hernández – Campus de Sant Joan d’Alacant ANTONIO VERA TORNEL, Profesor Titular de Genética de la Universidad Miguel Hernández de Elche, CERTIFICA que el Licenciado D. Juan José Ripoll Samper ha realizado bajo su dirección y supervisión la Tesis Doctoral que con el título Análisis genético y molecular de PEP1, un gen implicado en la morfogénesis del fruto de Arabidopsis thaliana presenta para optar al Grado de Doctor. El trabajo reflejado en la presente memoria se ha desarrollado íntegramente en la División de Genética de la Universidad Miguel Hernández de Elche. Y para que así conste y surta a los efectos oportunos, firmo el presente certificado en Sant Joan d’Alacant a 3 de Junio de 2004 Fdo.: Dr. Antonio Vera Tornel Universidad Miguel Hernández, Campus de Sant Joan, Ctra. Alicante-Valencia Km. 87, 03550 San Juan, Alicante. Spain Tel: 34 96 591 9542 – Fax: 34 96 591 9568 – e-mail: avera@umh.es – URL: http://biolapli.umh.es Departamento de Biología Aplicada Universidad Miguel Hernández – Campus de Elche Prof. Dr. D. José Luis Micol Molina, Catedrático de Universidad y director del Departamento de Biología Aplicada de la Universidad Miguel Hernández de Elche, INFORMA Que la Tesis Doctoral titulada Análisis genético y molecular de PEP1, un gen implicado en la morfogénesis del fruto de Arabidopsis thaliana ha sido realizada por el licenciado D. Juan José Ripoll Samper, bajo la inmediata dirección y supervisión del Prof. D. Antonio Vera Tornel, y que el Departamento de Biología Aplicada ha dado su conformidad para que sea presentada ante la comisión de doctorado. Elche, a 3 de Junio de 2004 Fdo.: José Luis Micol Molina Universidad Miguel Hernández, Campus de Elche, Edificio Vinalopó, Avenida del Ferrocarril s/n, 03202 Elche, Alicante. Spain Tel: 34 96 665 8504 – Fax: 34 96 665 8511 – e-mail: jlmicol@umh.es – URL: http://biolapli.umh.es A mis padres A mis hermanos A Elena Esto no es el final. Ni tampoco es el principio del final. Pero quizás sea, el final del principio. W. Churcill Todas las cosas fingidas caen como flores marchitas, porque ninguna simulación puede durar largo tiempo. Cicerón La ignorancia afirma o niega rotundamente; la ciencia duda. Voltaire La ciencia es la medida de todas las cosas, de lo que es, que es, y de lo que no es, que no es. W. Sellars AGRADECIMIENTOS No siempre se presenta una oportunidad como ésta para dar las gracias a todas las personas que, de una forma u otra, te ayudan a conseguir un determinado objetivo. En primer lugar, quiero agradecerle a Antonio Vera Tornel el permitir mi iniciación, con esta Tesis, en este proceloso mundo de la Ciencia. Le agradezco también su inestimable ayuda, su preocupación, sus consejos, su apoyo, su confianza, que estuviera ahí cuando lo he necesitado y que me creyera capaz de culminar este trabajo. Y cómo no, por aguantar mi carácter. Gracias Antonio (Amunt València !!!). A Antonio Martínez Laborda, por el seguimiento tan de cerca de mi Tesis, por su comprensión y su grandísimo e inestimable apoyo, particularmente en los momentos difíciles, por sus sabios consejos, por su confianza tanto dentro como fuera del laboratorio, por su labor como Tutor durante los cursos de doctorado y por “darme caña” en las discusiones científicas. Tampoco me olvido de esas trufas con las que a veces nos sorprende. A los “Antonios”, globalmente, por su amistad y por preocuparse tanto y tanto por la gente del laboratorio. Por tirar de todos hacia delante, aunque en algunos momentos ha sido difícil. Por esos ratos tan divertidos que hacen olvidar los malos. Son dos de las personas que más mella han dejado en mí. A José Luis Micol, por el gran apoyo y confianza que me ha dado durante todo este tiempo y el interés mostrado sobre nuestro trabajo, por su encomiable labor como director del Departamento, lo que ha facilitado muchas situaciones durante esta travesía. Y desde luego, por la utilización de su equipamiento siempre que ha sido necesario. Quisiera destacar la gran labor previa realizada en su grupo por parte de María Rosa Ponce; Genoveva Berná, José Serrano, Víctor Quesada, Pedro Robles, Héctor Candela y José Manuel Pérez, plasmada en sus respectivas Tesis, y cuya lectura ha supuesto una inestimable ayuda. A Cristina Ferrándiz, por su gran ayuda y valiosos consejos, científicos y personales todo el tiempo que residió en nuestro laboratorio. Deseo agradecerle su confianza, amistad y ánimo en todo momento. A mis compañeros de laboratorio Isabel y Hugo, a los que les tengo mucho aprecio y de los que siempre se aprende alguna cosa. Por ofrecerme su amistad, confianza y sus ánimos durante esta última etapa de escritura. A veces, pienso que paso más tiempo a lo largo del día con ellos que conmigo mismo. A Ade y Asun, por su continua predisposición para preparar cualquier cosa que pudiera necesitar. Por esos momentos tan divertidos que hemos pasado juntos. Gracias por estar ahí tanto dentro como fuera del laboratorio. A María Rosa Ponce, a Héctor Candela, Víctor Quesada y Pedro Robles (los tres veteranos), a Pedro Piqueras, José Manuel Pérez, Santi, José María y Sara por los momentos agradables compartidos cuando residían en este campus y por su ayuda siempre que ha sido necesaria. Tampoco puedo olvidar a Susana Gerber y José Manuel Serrano, que inicialmente me ayudaron con los reactivos, medios de cultivo, placas, etc. Además, quiero agradecerles el interés que han mostrado por saber en todo momento cómo iban las cosas. Dar las gracias a Amparo Albiñana, por librar mil y una guerras con los “papeleos” y encontrar siempre una solución a cualquier problema burocrático surgido en todo este tiempo. A Luis Vicente López Llorca y Jesús Salinas por su interés y apoyo moral, por mediar en la utilización del microscopio electrónico de barrido de la Universidad de Alicante. A Verónica y Andrés, por encontrar siempre un hueco para poder ver las muestras en el microscopio electrónico de barrido. A Joaquín Rueda por permitirnos la utilización de su microtomo. Al laboratorio de Manolo Criado, por ser “un pozo sin fondo” de infinitas enzimas de restricción. Y a Luismi Valor, por ser un buen compañero y vecino, por su interés en la marcha de mi Tesis. Por esas cenas de becarios de risas y cachondeo. A Flavia (por las sesiones de apoyo y “les xarraetes” del pasillo), a Claudia Vieira (por conseguirme cualquier artículo que le pidiera y demás información, por animarme), a Susana Frasés (por allanarme un poco el camino con algunos papeleos), y a la gente de la asociación Joves Investigadors y Precarios. A mis compañeros y amigos Ana y Juan Carlos, Rosana y Luis, Belén, Nuria, Pilar, Edu, Sonia, Nino, Eric, Paco Olaya y M. Carmen, Santi, J. Antonio y Penélope, Marcos y Bea, J. Ángel, Miguel y Pepa, Pepe y Jorge por entender mi “enclaustramiento” durante los últimos tiempos. A la familia Barceló y Payá-Signes, por la ayuda y apoyo prestados en este tiempo. A mis padres, por su cariño y cuidado, por respetar y entender mis decisiones en todo momento, por el gran esfuerzo realizado en procurarme una buena educación. En definitiva, por estar ahí a mi lado. A mis dos hermanos Ros Mary y Rubén, por aguantar mis manías y nervios durante todo este tiempo. A Julia, por sus ánimos. A la familia ilicitana, Amparo y los dos Vicentes, por el cuidado y apoyo moral que en todo momento me han prestado. A Elena, por ser como es y acompañarme durante este largo viaje. Por su cariño y apoyo en los momentos duros, por sus ánimos y comprensión en esta última etapa. Por aguantar como una campeona. Por último, agradecer al Ministerio de Ciencia y Tecnología la concesión de una beca FPI con la que he podido sobrevivir (aunque existan personas que piensen que es un chollo) durante mi periodo de “becario-precario” entre los años 1999 y 2003. ÍNDICE DE MATERIAS Índices I ÍNDICE DE MATERIAS ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS I.- INTRODUCCIÓN 1 I.1.- CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE EL DESARROLLO 2 I.1.1.- Sinopsis, orígenes y evolución de la Biología del desarrollo 2 I.2.- CARACTERÍSTICAS DEL DESARROLLO VEGETAL 4 I.2.1.- Características diferenciales del desarrollo en plantas 4 I.3.- UTILIZACIÓN DE SISTEMAS MODELO EN BIOLOGÍA 6 I.4.- Arabidopsis thaliana COMO SISTEMA MODELO EN EL ESTUDIO DEL DESARROLLO VEGETAL I.4.1.- Características de Arabidopsis thaliana como sistema modelo 6 9 I.4.2.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana 10 I.4.3.- Ciclo de vida de Arabidopsis thaliana 11 I.4.4.- El genoma de Arabidopsis thaliana 13 I.4.5.- Generación, obtención y caracterización de mutantes en Arabidopsis thaliana I.4.5.1.- Mutágenos utilizados en Arabidopsis thaliana 17 17 I.4.5.1.1.- Mutágenos físicos y químicos 17 I.4.5.1.2.- El T-DNA como mutágeno insercional 17 I.5.- DESARROLLO DE Arabidopsis thaliana 20 I.5.1.- Embriogénesis en Arabidopsis thaliana 20 I.5.2.- Desarrollo a partir del meristemo apical del tallo 20 I.5.2.1.- Mantenimiento de la población de células totipotentes en el meristemo 24 Índices II I.5.2.2.- Diferenciación de las células meristemáticas en los primordios de los órganos laterales 27 I.5.3.- Transición de la etapa vegetativa a la reproductiva. Inducción floral 29 I.5.4.- Desarrollo floral 30 I.5.4.1.- El meristemo floral 30 I.5.4.2.- Genes de identidad de los órganos florales. Modelo ABC 32 I.5.4.2.1.- Redefinición del modelo. Genes de la clase E I.5.5.- Desarrollo del fruto en Arabidopsis thaliana 34 35 I.5.5.1.- Estructura del fruto en Arabidopsis thaliana 36 I.5.5.2.- Estadios de desarrollo del gineceo y del fruto de Arabidopsis thaliana 39 I.5.5.3.- Genes implicados en el desarrollo del fruto en Arabidopsis thaliana 41 I.5.5.3.1.- AG, un gen clave en la especificación de los carpelos 41 I.5.5.3.1.1.- Nuevos miembros de la ruta de AG. Genes HUA y HEN 42 I.5.5.3.2.- FRUITFULL, un gen que determina la identidad de la valva 43 I.5.5.3.3.- Los genes SHATTERPROOF1 y SHATTERPROOF2 están implicados en la dehiscencia del fruto 45 I.5.5.3.4.- Papel de INDEHISCENT (IND) y ALCATRAZ (ALC) en el desarrollo del fruto I.5.5.3.5.- REPLUMLESS (RPL) especifica la región del replum 46 47 I.5.5.3.6.- SPATULA (SPT) actúa independientemente de AG en la diferenciación de tejidos del fruto 47 I.5.5.3.7.- La función de CRABS CLAW (CRC) en la diferenciación de los carpelos 48 I.5.5.3.8.- Los genes TOUSLED (TSL), STYLISH1 (STY1) y STYLISH2 (STY2) están implicados en la formación de tejidos apicales del gineceo 49 I.5.5.3.9.- ETTIN (ETT) está relacionado con la regionalización del gineceo 50 I.5.5.3.10.- Los genes CLV y el número de carpelos en el gineceo 51 I.5.5.3.11.- La familia de genes ERECTA (ER) en el desarrollo del gineceo 51 Índices III II.- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS 53 III.- MATERIALES Y MÉTODOS 57 III.1.- ORGANISMOS UTILIZADOS 58 III.1.1.- Estirpes de Arabidopsis thaliana 58 III.1.1.1.- Estirpes silvestres 58 III.1.1.2.- Estirpes mutantes 58 III.1.1.2.1.- Nomenclatura utilizada en la denominación de genes, mutaciones, fenotipos e individuos aislados durante el escrutinio de una colección de mutantes 59 III.1.1.2.2.- Procedencia de los mutantes 60 III.1.2.- Estirpes de Escherichia coli 61 III.1.3.- Estirpes de Agrobacterium tumefaciens 61 III.2.- VECTORES. PLÁSMIDOS Y CONSTRUCCIONES 61 III.3.- OLIGONUCLEÓTIDOS EMPLEADOS COMO CEBADORES 65 III.4.- MEDIOS DE CULTIVO, DISOLUCIONES Y TAMPONES 67 III.4.1.- Medios de cultivo III.4.1.1- Medios de cultivo para Arabidopsis thaliana III.4.1.1.1.- Medios de cultivo líquido (Medio mínimo ATM) III.4.1.1.2.- Medios de cultivo sólido (Medio GM) III.4.1.2.- Medios de cultivo para microorganismos 67 67 67 67 68 III.4.1.2.1.- Medios de cultivo líquido 68 III.4.1.2.2.- Medios de cultivo sólido 68 III.4.1.2.3.- Medios de cultivo con antibióticos 68 III.4.2.- Disoluciones y tampones 69 III.4.2.1.- Disoluciones de uso común 69 III.4.2.2.- Disoluciones para el aislamiento de DNA genómico 69 III.4.2.3.- Disoluciones empleadas en el aislamiento de DNA plasmídico 69 III.4.2.4.- Disoluciones para el aislamiento de RNA 69 III.4.2.4.1.- Disoluciones para el aislamiento de mRNA (poliA+) 69 Índices IV III.4.2.4.2.- Disoluciones para el aislamiento de RNA total 70 III.4.2.5.- Disoluciones utilizadas en electroforesis 70 III.4.2.6.- Disoluciones para el análisis Southern 70 III.4.2.7.- Disoluciones empleadas en la identificación de clones bacterianos mediante hibridación III.4.2.8.- Disoluciones utilizadas en la hibridación in situ de tejidos 70 71 III.4.2.9.- Disolución para infiltración de plantas con Agrobacterium tumefaciens 71 III.4.2.10.- Solución de esterilización de semillas de Arabidopsis thaliana 71 III.4.2.11.- Sustrato para cultivo de Arabidopsis thaliana en maceta 72 III.5.- CONDICIONES Y MÉTODOS DE CULTIVO III.5.1.- Condiciones y métodos de cultivo para Arabidopsis thaliana 72 72 III.5.1.1.- Cultivos en placas de Petri 72 III.5.1.2.- Cultivos en maceta 72 III.5.1.3.- Realización de cruzamientos 73 III.5.2.- Condiciones y métodos de cultivo para Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens 73 III.6.- ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E HISTOLÓGICAS 74 III.6.1.- Fotografía a bajo aumento 74 III.6.2.- Microscopía óptica 74 III.6.2.1.- Inclusión en resina JB4 74 III.6.2.2.- Inclusión en parafina 75 III.6.3.- Microscopía electrónica de barrido (SEM) 76 III.6.4.- Microscopía electrónica de barrido de baja temperatura (LTSEM) 76 III.7.- AISLAMIENTO Y MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 77 III.7.1.- Preparaciones de DNA genómico de Arabidopsis thaliana 77 III.7.2.- Obtención de RNA de Arabidopsis thaliana 77 III.7.2.1.- Obtención de mRNA (poliA+) 77 III.7.2.2.- Obtención de RNA total 78 III.7.3.- Obtención de DNA plasmídico 78 Índices V III.7.4.- Tratamiento de DNA con enzimas de restricción 78 III.7.5.- Reacciones de ligación de DNA 79 III.7.6.- Transformación bacteriana 79 III.7.6.1.- Transformación por choque térmico 79 III.7.6.2.- Electroporación 79 III.7.7.- Técnicas electroforéticas III.7.7.1.- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 79 79 III.7.7.1.1.- Condiciones no desnaturalizantes 79 III.7.7.1.2.- Condiciones desnaturalizantes 80 III.7.7.2.- Electroforesis en geles de agarosa III.7.7.2.1.- Condiciones no desnaturalizantes III.7.8.- Recuperación de DNA a partir de geles de agarosa 80 80 80 III.7.9.- Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 80 III.7.9.1.- PCR convencional 80 III.7.9.2.- PCR de asimetría térmica entrelazada o TAIL-PCR 81 III.7.9.3.- PCR inversa (IPCR) 83 III.7.9.4.- Retrotranscripción y PCR (RT-PCR) 83 III.7.10.- Secuenciación de DNA 84 III.7.11.- Análisis y tratamiento informático de las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas III.8.- TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN MOLECULAR DE ÁCIDOS NUCLEICOS 84 85 III.8.1.- Transferencia de DNA a membranas para análisis por hibridación Southern 85 III.8.1.1.- Obtención de la sonda marcada 85 III.8.1.2.- Transferencia e inmovilización del DNA 85 III.8.1.3.- Tratamiento de prehibridación, hibridación con la sonda y lavado de la membrana III.8.1.4.- Detección quimioluminiscente III.8.2.- Identificación de clones bacterianos mediante hibridación en colonia III.8.2.1.-Obtención de sonda 85 85 86 86 Índices VI III.8.2.2.- Transferencia del DNA a una membrana de nailon 86 III.8.2.3.- Tratamiento de la membrana e hibridación 87 III.8.2.4.- Lavado de la membrana 87 III.8.2.5.- Detección colorimétrica de la señal 87 III.8.3.- RT-PCR semicuantitativa (SQRT-PCR) 87 III.8.4.- Análisis de la expresión mediante hibridación in situ en tejidos vegetales 89 III.8.4.1.- Obtención y marcaje con digoxigenina de la sonda de RNA 88 III.8.4.2.- Cuantificación de la sonda 88 III.8.4.3.- Obtención y procesamiento histológico de las muestras 89 III.8.4.4.- Prehibridación e hibridación de la sonda 89 III.8.4.5.- Lavados e inmunodetección colorimétrica de la señal 90 III.9.- TRANSFORMACIÓN DE Arabidopsis thaliana 90 III.9.1.- Transformación con clones de sobreexpresión 91 III.9.2.- Transformación con clones genómicos 91 III.9.3.- Infiltración con Agrobacterium tumefaciens 91 III.9.4.- Selección de transformantes 92 III.10.- CARTOGRAFÍA GÉNICA MEDIANTE ANÁLISIS DE LIGAMIENTO A MARCADORES SSLP III.11.- GENOTIPADO MOLECULAR DE ESTIRPES DE Arabidopsis thaliana 92 92 III.11.1.- Genotipado molecular de los alelos pep1 92 III.11.2.- Genotipado molecular de otras estirpes mutantes utilizadas 93 III.12.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE χ2 94 IV.- RESULTADOS 95 IV.1.- ESCRUTINIO Y AISLAMIENTO DE MUTANTES DE Arabidopsis thaliana AFECTADOS EN LA MORFOLOGÍA DEL FRUTO 96 IV.1.1.- Escrutinio de una colección de inserciones de T-DNA 96 IV.1.2.- Aislamiento y estudio preliminar de mutantes 97 IV.2.- CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LA LÍNEA SJF20-15. LA MUTACIÓN pepper1-1 100 Índices VII IV.2.1. Análisis macroscópico 100 IV.2.2.- Estudio morfológico de los frutos pep1-1 mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) 105 IV.2.2.1.- Estudio comparativo de la ontogenia de los pistilos silvestres y de pep1-1 108 IV.2.3.- Análisis histológico de las silicuas de pep1-1 110 IV.2.4.- Introgresión de pep1-1 en otros fondos silvestres 112 IV.3.- CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL MUTANTE pep1-1 115 IV.3.1.- Determinación del número de copias de T-DNA en el mutante 115 IV.3.2.- Clonación de las regiones genómicas adyacentes a la inserción 116 IV.3.3.- Ligamiento de pep1-1 a marcadores moleculares de tipo SSLP 119 IV.3.4.- Estudio de la fertilidad en heterocigotos pep1-1 119 IV.3.5.- pep1-1 es una mutación compleja que puede afectar a diversas funciones génicas 120 IV.4.- ESTUDIO DE GENES POTENCIALMENTE AFECTADOS POR LA TRANSLOCACIÓN 121 IV.4.1.- Estudio fenotípico de líneas de inserción correspondientes a genes potencialmente afectados por la translocación de pep1-1. Nuevos alelos de pep1 122 IV.4.2.- Análisis de complementación entre pep1-1 y líneas de inserción procedentes de las colecciones de dominio público IV.5.- ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN At4g26000 (PEP1) 126 127 IV.5.1.- Estructura del gen PEP1 127 IV.5.2.- PEP1 es una proteína con dominios KH 130 IV.6.- LOCALIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN LOS ALELOS DE pep1 IV.6.1.- Expresión de PEP1 en los alelos mutantes 134 134 IV.7.- OBTENCIÓN DE CONSTRUCCIONES Y GENERACIÓN DE PLANTAS TRANGÉNICAS IV.7.1.- Generación de las contrucciones 135 136 IV.7.1.1.- Construcción genómica de PEP1 136 IV.7.1.2.- Construcción de sobreexpresión 35S::PEP1 136 Índices VIII IV.7.2.- Transferencia de transgenes y selección de transformantes 138 IV.7.3.- Fenotipo de las plantas transgénicas 138 IV.7.3.1.- Fenotipo de las plantas transformadas con el clon genómico 138 IV.7.3.2.- Fenotipo de las plantas transformadas con el clon de sobreexpresión 139 IV.8.- ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL GEN PEP1 140 IV.8.1.- Detección del transcrito de PEP1 en distintos órganos de la planta mediante RT-PCR semicuantitativa (SQRT-PCR) 140 IV.8.2.- Localización del mRNA de PEP1 mediante hibridación in situ 141 IV.9.- ANÁLISIS DE LAS INTERACCIONES GENÉTICAS DE PEP1 141 IV.9.1.- Dobles y triples mutantes con hua1, hua2 y hua enhancer2 (hen2) 142 IV.9.2.- Doble mutante con fruitfull (ful) 142 IV.9.3.- Doble mutante con flowering locus k (flk) 143 IV.9.4.- Dobles mutantes con los genes de la ruta de los CLAVATA 146 IV.9.4.1.- Interacciones con clavata3 (clv3) 146 IV.9.4.2.- Interacciones con clavata2 (clv2) 148 IV.9.4.3.- Interacciones con clavata1 (clv1) 150 IV.9.5.- Doble mutante con wuschel (wus) V.- DISCUSIÓN 152 154 V.1.- ESCRUTINIO DE MUTANTES DE Arabidopsis thaliana AFECTADOS EN EL DESARROLLO DEL FRUTO EN UNA COLECCIÓN ESPAÑOLA DE INSERCIONES DE T-DNA 155 V.2.- EL MUTANTE pep1-1 ES PORTADOR DE UNA TRANSLOCACIÓN RECÍPROCA Y PRESENTA ALTERACIONES EN LA MORFOLOGÍA DEL FRUTO 156 V.3.- NUEVOS ALELOS DE pep1 157 V.4.- RESCATE FENOTÍPICO DE pep1 159 V.5.- PAPEL DE LAS PROTEÍNAS CON DOMINIOS KH EN EL DESARROLLO V.6.- INTERACCIONES DE pep1 CON OTROS MUTANTES 161 163 Índices IX V.6.1.- Interacciones con ful, hua1, hua2 y hen2 163 V.6.2.- Interacciones con flk 164 V.6.3.- Interacciones con los genes clv 165 V.7.- PEP1, UN PRESUNTO REGULADOR POSTRANSCRIPCIONAL INVOLUCRADO EN LA ONTOGENIA DEL PISTILO Y EN OTROS PROCESOS DEL DESARROLLO DE Arabidopsis thaliana 166 VI.- CONCLUSIONES 169 VII.- BIBLIOGRAFÍA 172 VIII.- GLOSARIO 196 Índices X ÍNDICE DE FIGURAS Figura I.1.- Distribución geográfica de Arabidopsis thaliana en el mundo 8 Figura I.2.- Número de artículos científicos sobre Arabidopsis thaliana publicados 9 Figura I.3.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana 11 Figura I.4.- Ciclo de vida de Arabidopsis thaliana 12 Figura I.5.- Esquema cronológico de la progresión de los principales eventos durante el desarrollo de Arabidopsis thaliana Figura I.6.- Representación esquemática de los cromosomas de Arabidopsis thaliana 13 14 Figura I.7.- Clasificación funcional de los genes predichos en Arabidopsis thaliana 15 Figura. I.8.- Representación esquemática de la infección por Agrobacterium tumafaciens 18 Figura I.9.- Embrión maduro poco antes de la germinación 20 Figura I.10.- Arquitectura de una dicotiledónea adulta 21 Figura I.11.- Estructura del meristemo apical del tallo en Arabidopsis thaliana 23 Figura I.12.- Fenotipo de los mutantes clv y wus 25 Figura I.13.- Cascada de señalización de la ruta CLAVATA 26 Figura I.14.- Organogénesis desde el meristemo apical 28 Figura I.15.- Meristemos de inflorescencia y floral en Arabidopsis thaliana 30 Figura I.16.- Interacciones génicas en el meristemo floral 31 Figura I.17.- Modelo ABC 33 Figura I.18.- Revisión del Modelo ABC 35 Figura I.19.- Morfología del fruto de Arabidopis thaliana 36 Figura I.20.- Células de la superficie de la valva y del replum en los frutos de Arabidopis thaliana 37 Figura I.21.- Dehiscencia de los frutos 38 Figura I.22.- Sección tranversal de un fruto en antesis 39 Figura I.23.- Estadios de desarrollo del fruto tras la fertilización 41 Índices XI Figura I.24.- Fenotipos de los mutantes involucrados en la ruta de AG 43 Figura I.25.- Fenotipo en el fruto de los mutantes ful-1 44 Figura I.26.- Fenotipo del doble mutante shp1shp2 45 Figura I.27.- Fenotipo en el fruto de los mutantes ind y alc 46 Figura I.28.- Fenotipo en el fruto del mutante rpl 47 Figura I.29.- Fenotipo de los mutantes crc y spt 48 Figura I.30.- Fenotipo de los frutos en los mutantes tsl, sty1 y sty2 49 Figura I.31.- Fenotipo de los frutos en los mutantes ett 50 Figura I.32.- Aparición de valvas extra en los frutos de los mutantes clv 51 Figura I. 33.- Fenotipo en el fruto generado por la mutación er 52 Figura III.1.- Plámidos pGEM-3Zf(+) y pGEM-T 62 Figura III.2.- Esquema de la estructura de los T-DNA que se han empleado en la obtención de las tres colecciones de mutagénesis insercional empleadas en la elaboración de este trabajo 63 Figura III.3.- Vectores para la transformación de Arabidopsis thaliana 64 Figura III.4.- Cuantificación simultánea de distintas ribosondas 89 Figura IV.1- Frutos de individuos aislados durante el escrutinio 97 Figura IV.2.- Fenotipo de pep1-1 101 Figura IV.3.- Recuento del número de valvas en pep1-1 102 Figura IV.4.- Representación del recuento del número de sépalos, pétalos y estambres en individuos pep1-1 y WS-2 103 Figura IV.5.- Flor del silvestre y pep1-1 103 Figura IV.6.- Tallos fasciados y alteraciones en las inflorescencias de pep1-1 104 Figura IV.7. Comparación entre la disposición de órganos en el silvestre y en el mutante pep1-1 104 Figura IV.8.- Rosetas de Ws-2 y pep1 105 Figura IV.9.- Microscopía electrónica de barrido de los frutos de pep1-1 106 Índices XII Figura IV.10.- Asimetría en la disposición de las valvas en pep1-1 107 Figura IV.11.- Observación de las semillas en Ws-2 y pep1-1 107 Figura IV.12.- Distintos estadios en el desarrollo del pistilo en plantas silvestre Ws-2 108 Figura IV.13.- Distintos estadios en el desarrollo del pistilo en plantas pep1-1 109 Figura IV.14.- Histología de frutos de 5 dpa silvestres (Ws-2) y mutantes pep1-1 111 Figura IV.15.- Fruto pep1-1 con dos repla fusionados 112 Figura IV.16.- Introgresión de pep1-1 en Col-0 114 Figura IV.17.- Introgresión de pep1-1 en Ler 115 Figura IV.18.- Detección del T-DNA en pep1-1 mediante hibridación Southern 116 Figura IV.19.- Esquema de la posición relativa, respecto al T-DNA pGKB5, de los cebadores utilizados en TAIL-PCR e IPCR 117 Figura IV.20.- Estructura esquemática de los cromosomas IV y V de Arabidopsis thaliana 118 Figura IV.21.- Esquema hipotético de la estructura de los T-DNA en los cromosomas derivados en pep1-1 118 Figura IV.22.- Localización de los marcadores SSLP utilizados en pep1-1 119 Figura IV.23.- Semiesterilidad en los heterocigotos pep1-1 120 Figura IV.24.- Fenotipo de los alelos pep1-2 y pep1-3 123 Figura IV.25.- Alteraciones en el patrón de filotaxia en los alelos pep1 124 Figura IV.26.- Diferencias en la roseta basal de plantas de 14 días Col-0 y pep1-2 125 Figura IV-27.- Análisis de la expresión, mediante RT-PCR, de At4g26000 (PEP1) y ACT2 en plantas pep1-1 y su ancestro silvestre Ws-2 126 Figura IV.28- Fenotipo de los frutos en los transheterocigotos pep1-1/pep1-2 127 Figura IV.29.- Secuencia y estructura del gen PEP1 128 Figura IV.30.- Estructura esquemática de la proteína PEP1 130 Figura IV.31.- Alineamiento de las secuencias peptídicas de PEP1, FLK y sus respectivos ortólogos en arroz 132 Figura IV.32.- Alineamiento estructural de PEP1, FLK y sus respectivos ortólogos 133 Índices XIII Figura IV.33.- Localización de las inserciones de los alelos pep1 en el gen PEP1 134 Figura IV.34.- Análisis de la expresión en los alelos pep1-2 y pep1-4 135 Figura IV.35.- Esquemas de las construcciones transgénicas 137 Figura IV.36.- Fenotipo de las plantas pep1-2 portadoras de la construcción genómica 139 Figura IV.37.- Selección de transformantes resistentes a la kanamicina (plantas Col-0 portadoras de la construcción para la sobreexpresión de PEP1) 140 Figura IV.38.- Niveles de expresión de PEP1 en distintos órganos del silvestre 140 Figura IV.39.- Localización del mRNA de PEP1 141 Figura IV.40.- Fenotipo del doble mutante pep1-2 ful-1 143 Figura IV.41.- Interacción entre flk y pep1 144 Figura IV.42.- Fenotipo de los frutos en individuos FLK/flk-3 pep1-4 145 Figura IV.43.- Fenotipo de los dobles mutantes clv3-2 pep1-4 146 Figura IV. 44.- Frutos de individuos CLV3/clv3-2 pep1-4 147 Figura IV.45.- Ausencia de la mutación er en plantas clv3-2 148 Figura IV.46.- Interacciones entre clv2-1 y pep1-4 149 Figura IV.47.- Interacciones entre clv1-1 y pep1-4 150 Figura IV.48.- Interacción entre clv1-6 y pep1-2 152 Figura IV.48.- Interacción wus-1 pep1-1 153 Índices XIV ÍNDICE DE TABLAS Tabla I.1.- Rasgos generales de los genes y los tres genomas de Arabidopsis thaliana 15 Tabla I.2.- Estadios de desarrollo floral asociados al desarrollo del gineceo 40 Tabla III.3.- Estirpes mutantes utilizadas 58 Tabla III.4.- Líneas de T-DNA de las colecciones de dominio público 60 Tabla III.3.- Oligonucleótidos empleados durante el desarrollo de esta Tesis 65 Tabla III.4.- Antibióticos utilizados 68 Tabla III.5.- Características y perfiles de las reacciones de TAIL-PCR 82 Tabla III.6.- Genotipado molecular de los alelos pep1 93 Tabla III.7.- Genotipado molecular de estirpes mutantes 93 Tabla III.8.- Valores del estadístico χ2 con distintos grados de libertad (GL) 94 Tabla IV.1.- Estudio de la heredabibilidad del fenotipo y de la resistencia a la kanamicina en los individuos T4 Tabla IV.2.- Segregaciones fenotípicas de la progenie F2 de las líneas estudiadas 98 99 Tabla IV.3.- Análisis de las segregaciones de familias F3 en presencia de kanamicina de los mutantes SJF8-6, SJF9-9 y SJF20-15 99 Tabla IV.4.- Segregación de la resistencia a la kanamicina en la progenie F3 del mutante SJF5-3 100 Tabla IV.5.- Recuento del número de valvas en frutos pep1-1 101 Tabla IV.6.- Número de órganos florales en Ws-2 y pep1-1 102 Tabla IV.7.- Líneas de inserción analizadas y utilizadas en el ensayo de complementación con el mutante pep1-1 Tabla IV.8.- Aparición de las hojas de la roseta en plantas Col-0 y pep1-2 121 124 Índices XV Tabla IV.9.- Proteínas que presentan dominios KH en Arabidopsis thaliana 131 Tabla IV.10.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV3/clv3-2 PEP1 y CLV3/clv3-2 pep1-4 148 Tabla IV.11.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV2/clv2-1 PEP1 y CLV2/clv2-1 pep1-4 150 Tabla IV.12.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV1/clv1-1 PEP1 y CLV1/clv1-1 pep1-4 151 I.- INTRODUCCIÓN Introducción 2 I.- INTRODUCCIÓN I.1.- CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE EL DESARROLLO. El desarrollo en los organismos multicelulares se puede considerar como uno de los grandes éxitos de la evolución. A partir de una célula única, el cigoto, se construye un individuo adulto compuesto por miles o incluso millones de células, que se organizan en el espacio en grupos celulares, dando lugar a niveles de complejidad superiores (tejidos, órganos, aparatos,...). En este proceso intervienen fenómenos de diferenciación (generación de diversidad celular), morfogénesis (organización espacial de las células en tejidos y órganos), crecimiento (aumento del tamaño de las estructuras y del organismo) y reproducción (generación de gametos), siempre bajo un estricto control genético. A todo este conjunto de procesos es a lo que se denomina desarrollo (Wolpert et al., 1998; Atherly et al., 1999; Gilbert, 2000). ¿Cómo se diferencian las células tras las divisiones en el cigoto?, ¿cómo se produce esa organización en distintos tejidos y órganos?, ¿qué elementos subyacen en la formación de los patrones corporales? Estas son algunas de las preguntas a las que intenta dar respuesta la Biología del desarrollo, cuyo objetivo es estudiar los cambios que se producen a lo largo de las etapas que se suceden en la formación del individuo adulto a partir del cigoto, desentrañando los mecanismos y procesos subyacentes (Fosket, 1994; Browder et al., 1997; Mange y Mange, 1999; Gilbert, 2000; Griffith et al., 2002). Además, conocer y comprender cómo se desarrollan los organismos contribuye sin duda al avance del conocimiento básico, pero también se puede explotar en terrenos aplicados, desde el sector agropecuario a las aplicaciones médicas. Este hecho comporta la recopilación y el cotejo de la información obtenida a partir del análisis de un número considerable de especies. I.1.1.- Sinopsis, origen y evolución de la Biología del desarrollo. Ya en la antigua Grecia, Hipócrates (Siglo V A. C.) intentó dar una explicación al desarrollo de los seres vivos basándose en los principios de calor, humedad y solidificación que imperaban en la época. Sin embargo, no fue hasta un siglo después cuando Aristóteles inició los primeros estudios formales acerca de la estructuración de los seres vivos. Estos análisis buscaban entender cómo se forman las distintas partes del Introducción 3 embrión. Propuso la idea de la epigénesis, que postulaba que durante el desarrollo aparecían nuevas estructuras progresivamente. Sus ideas fueron muy influyentes hasta bien entrado el siglo XVII (Wolpert et al., 1998). A partir de este momento, la Biología del desarrollo estuvo inmersa en una etapa meramente descriptiva, basada en estudios anatómicos en diversas especies, que mediante su comparación intentaba dar una explicación al desarrollo. Fue a finales del siglo XIX, cuando la Biología del desarrollo sufrió una catarsis con el nacimiento de la “Mecánica del desarrollo”, lo que hoy conocemos como Embriología experimental. Los experimentos llevados a cabo por los embriólogos Wilhelm Roux y Hans Driesch incluían metodologías quirúrgicas y ensayos químicos, revolucionando la estrategia experimental. A sus experimentos siguieron los realizados por Hans Spemann, refinándose aún más las metodologías (Alberts, 1996; Howell, 1998; Wolpert et al., 1998). Sin duda, la incorporación de la Genética a la Biología del desarrollo cambió su concepción. Descifrar parte del programa genético involucrado en los distintos fenómenos del desarrollo era considerado casi imposible. No obstante, el gran impacto de la Genética en los estudios sobre el desarrollo llevó a que se acuñara por primera vez el término de Genética del desarrollo en 1963, durante la celebración del XI International Congress of Genetics. Posteriormente, la aplicación de estrategias de mutagénesis de saturación permitió la identificación por Nüsslein-Volhard y Wieschaus (1980) de un número considerable de mutantes afectados en el desarrollo de Drosophila melanogaster, lo que dio un espaldarazo definitivo a la Biología del desarrollo. A partir de entonces, los trabajos genéticos para la comprensión del desarrollo se centraron en la búsqueda y estudio de fenotipos aberrantes (Ferguson y Horvitz, 1985; Jürgens et al., 1991; Haffter et al., 1996; Haffter y Nüsslein-Volhard, 1996) que posibilitaran la identificación de los genes afectados, responsables últimos de la elaboración de los distintos programas del desarrollo que finalmente darán lugar al individuo adulto (Wolpert et al., 1998; Davidson, 2001). Sin duda, la concentración de esfuerzos sobre un número limitado de organismos modelo ha contribuido a la rápida progresión de la Biología del desarrollo en los últimos tiempos. Podemos destacar la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster, St. Johnston, 2002), el pez cebra (Danio rerio, Grunwald y Eisen, 2002), el nematodo Caenorhabditis elegans (Jorgensen y Mango, 2002), el anfibio Xenopus laevis (Fukui y Asashima, 1994; Vignali et al., 1994), el ratón (Mus musculus; Justice, 2000), el pollo (Gallus gallus; Brown et al., 2003) o la escrufolariácea Antirrhinum majus (Schwarz-Sommer et al., 2003) y la Introducción 4 crucífera Arabidopsis thaliana (Page y Grossniklaus, 2002) entre los vegetales. Pero además, también reviste una importancia crucial la confluencia con el avance inusitado de las técnicas moleculares, incrementando notablemente el potencial para la identificación de genes involucrados en vías de desarrollo concretas (Howell, 1998). I.2.- CARACTERÍSTICAS DEL DESARROLLO VEGETAL. También la Biología Vegetal atraviesa un período de rápida evolución con el advenimiento de nuevas tecnologías. El estudio de los fenómenos de desarrollo en plantas, un terreno antaño limitado a la descripción de estructuras y a determinadas pruebas bioquímicas (los denominados modelos reconstructivos), incluye hoy día la utilización de herramientas genéticas y moleculares que permiten dilucidar los elementos y procesos subyacentes (Prusinkiewicz, 2004). Históricamente, el análisis del desarrollo vegetal ha recibido menor atención que el desarrollo animal. No obstante, varios de los principios de la Biología del desarrollo moderna han sido establecidos gracias al análisis del desarrollo en las plantas. Podemos citar los conceptos de homología, morfología y equivalencia propuestos por Goethe en 1790, la identificación del núcleo y el protoplasma por Robert Brown en 1835, la teoría celular y el descubrimiento del nucleolo por Schleiden en 1839, la alternancia de generaciones (ciclo digenético) por Hofmeister (1851) o la determinación de las fases de la mitosis en 1884 por Strasburger (citados en Meyerowitz, 1994a; Alberts et al., 1996; Paniagua et al. 1997). Además de un mejor conocimiento de los mecanismos de desarrollo que son propios de las plantas, el estudio de la Biología del desarrollo vegetal puede conducir a un aumento de su producción y calidad, lo que presenta un indudable interés social y económico (Meyerowitz y Pruitt, 1985). I.2.1.- Características diferenciales del desarrollo de las plantas. El análisis genético y molecular de los fenómenos de desarrollo en distintos organismos pone de manifiesto cierto grado de conservación general de estrategias a lo largo de la evolución. Algunas similitudes entre el desarrollo animal y el vegetal han permitido aplicar ciertas teorías con carácter general (Davidson, 1994, Meyerowitz, 2001). Pero existen profundas diferencias entre ambos que, generalmente, no son consideradas en los trabajos centrados en el desarrollo animal. Introducción 5 Las plantas son organismos sésiles, y de ello se deriva su gran capacidad de adaptación al biotopo que les rodea. Esta característica influye en gran medida en su modo de desarrollo, muy dependiente de las condiciones ambientales. Por ejemplo, la temperatura y la duración relativa del día y la noche (fotoperiodo) determinan el momento de la germinación y la floración, mientras que la gravedad y la posición de la fuente de luz dictan la dirección del crecimiento de la planta. Esto se traduce en una gran variabilidad de comportamientos entre las distintas especies (Lyndon, 1990; Fosket, 1994; Howell, 1998). La existencia de cloroplastos en sus células, que las convierte en organismos autótrofos, o de una pared celular rígida que mantiene su estructura, son algunas de las características diferenciales. La presencia de esta pared celular impide que se produzcan los movimientos y migraciones celulares propios del desarrollo animal. Por tanto, la morfogénesis de las plantas queda supeditada a la existencia de diferenciación dependiente de la posición y a un control de la división y la expansión celular (Meyerowitz, 1994a, 1994b; Wolpert et al., 1998; Westhoff et al. 1998). Pero este aislamiento celular debido a la pared no es total. Existe una comunicación intercelular a través de puentes citoplasmáticos denominados plasmodesmos (Robards y Lucas, 1990), que permiten el intercambio de metabolitos y otras moléculas, pudiendo revestir gran importancia en los procesos de desarrollo. Se ha descrito el movimiento de algunos factores de transcripción codificados por los genes LEAFY (LFY, Sessions et al., 2000; Wu et al., 2003), APETALA1 (AP1 Sessions et al., 2000; Wu et al, 2003), SHORTROOT (SHT, Nakajima et al., 2001) en Arabidopsis thaliana, o Knotted1 en el maíz. (Lucas et al., 1995). Las plantas presentan una estructura corporal simple, con alrededor de 40 tipos celulares distintos. Este hecho contrasta, en gran medida, con la compleja organización corporal que presentan los animales, donde podemos diferenciar entre alrededor de 100 tipos celulares distintos (Lyndon, 1990; Howell, 1998). En los animales, muchos de los órganos del adulto se forman durante la embriogénesis, por lo que se dice que el embrión es una copia reducida del individuo adulto. Aquí difieren animales y plantas, ya que durante la embriogénesis vegetal sólo se genera un rudimento del adulto que permitirá, en primera instancia, la subsistencia de la plántula y, en etapas posteriores, se formarán los órganos a partir de los meristemos (del griego merizein, dividir). A partir del meristemo apical o vegetativo (SAM, Shoot Apical Meristem) se generarán las estructuras aéreas del individuo, siendo el meristemo radicular (RAM, Root Apical Meristem) el responsable de la formación del sistema Introducción 6 radicular. Por todo ello se define al desarrollo vegetal como básicamente postembrionario (Lyndon et al., 1990; Fosket, 1994; Evans y Barton, 1997; Howell, 1998; Fletcher, 2002; Bäurle y Laux, 2003; Carles y Fletcher, 2003). Las células indiferenciadas de los meristemos tienen la capacidad de dividirse continuamente para dar lugar a la formación de los distintos tejidos y órganos de la planta adulta. Sin embargo, la totipotencia que caracteriza a estas células meristemáticas puede presentarse en otros linajes celulares. Existe, por consiguiente, la necesidad de mantener el estado diferenciado de la célula, a fin de evitar la desdiferenciación y el retorno a un estado meristemático indeterminado. Esta situación subyace a la enorme plasticidad que presenta el desarrollo vegetal (Taylor, 1997; Laux, 2003). I.3.- UTILIZACIÓN DE SISTEMAS MODELO EN BIOLOGÍA. Los organismos modelo son especies en cuyo estudio experimental convergen un amplio número de equipos de investigación, con el fin de obtener conclusiones que puedan ser generalizables a otras especies (Bolker, 1995). Reúnen características que facilitan su mantenimiento y manipulación en el laboratorio y que, además, permiten la obtención de resultados en un periodo de tiempo razonablemente breve. Estos organismos presentan un ciclo de vida corto, pequeño tamaño, facilidad de propagación y un bajo coste de mantenimiento en el laboratorio. También conviene que tanto su morfología como su genoma sean relativamente simples, lo que facilita la interpretación de los resultados obtenidos durante su estudio (Bolker, 1995). Anteriormente se han citado diversos ejemplos que cumplen con todos o con buena parte de estos requisitos (sección I.1.1). I.4.- Arabidopsis thaliana COMO SISTEMA MODELO EN EL ESTUDIO DEL DESARROLLO VEGETAL. Hasta bien entrado el siglo XX, la mayoría de los estudios en plantas se realizaron con especies de interés económico con el fin de mejorar sus cultivos. Estas especies presentan inconvenientes ya que, en la mayoría de los casos, su genoma es de gran tamaño y presentan un elevado grado de ploidía, lo que dificulta su análisis y manipulación (Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002). Una de las especies mejor estudiadas ha sido el maíz (Zea mays). Pese a ello, se aleja de las características propias Introducción 7 de un organismo modelo. La situación es similar en especies como el clavel (Dianthus caryophyllus), el tomate (Lycopersicon esculentum), el guisante (Pisum sativum) o el tabaco (Nicotiana tabacum). Sólo a partir de mediados de la década de 1980 se generalizó la utilización de una crucífera sin valor económico, Arabidopsis thaliana, en los trabajos de investigación sobre el desarrollo vegetal. Aún reconociendo la importancia de Antirrhinum majus y otras especies de gran tradición en su estudio, en la actualidad Arabidopsis thaliana se ha convertido en la planta modelo por excelencia, considerada por muchos como la “Drosophila vegetal” (Meyerowitz y Pruitt, 1985; Meyerowitz, 1987; Meyerowitz, 1989; Bowman, 1994; Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002). ·· · ·· · · ··· ·· ···· · · · ·· ·· ·· ·· · · · ·· · ·· ·· · · Figura I.1.- Distribución geográfica de Arabidopsis thaliana en el mundo. Las regiones coloreadas corresponden a zonas en las que se han aislado individuos (Rédei, 1970). Los puntos representan los lugares en los que se han aislado los distintos accesos o ecotipos de esta crucífera. Tomado de Alonso-Blanco y Koornneef (2000) con modificaciones. Arabidopsis no difiere del resto de las plantas con flores en los aspectos básicos de su biología, por lo que se espera que las conclusiones de sus estudios sean aplicables al análisis de muchos aspectos estructurales y funcionales de otras especies vegetales (Meyerowitz y Somerville, 1994). Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. es una angiosperma dicotiledónea que pertenece a las Brasicáceas o Crucíferas, familia muy amplia en la que encontramos aproximadamente 340 géneros y más de 3.300 especies (Al-Shehbaz, 1984; citado en Hall et al., 2002). Algunos miembros con interés económico son las diversas Introducción 8 formas de col (Brassica oleracea), el rábano (Raphanus sativus), el nabo (B. napus subsp. rapifera), la colza (B. napus var. arvensis), las mostazas blanca y negra (Sinapis alba y B. nigra, respectivamente) o plantas ornamentales como los alhelíes Erysimum cheiri y Mathiola incana (Strasburger, 1994). Aunque se ha sugerido que es originaria de Asia Central, resulta difícil conocer el origen geográfico exacto de Arabidopsis thaliana, ya que, al igual que otras muchas crucíferas, es una especie cosmopolita que se localiza, mayoritariamente, en regiones de clima moderado (Figura I.1; Meyerowitz, 1989; Strasburger, 1994; Innan et al., 1997). Muchas estirpes aisladas en localizaciones concretas recibieron la denominación de ecotipos. La inadecuación de este término desde un punto de vista adaptativo ha dado paso al de “acceso” (accessions), definido como “un genotipo particular de una especie concreta, recolectado en una localización geográfica específica” (Alonso-Blanco y Koornneef, 2000). No obstante, ambos términos coexisten en el uso corriente de la comunidad científica dedicada a Arabidopsis thaliana. Arabidopsis thaliana, fue descrita en el siglo XVI por Johannes Thal, quien la denominó inicialmente Pilosella siliquosa. Ya en los años cuarenta del pasado siglo, Friedrich Laibach publicó la primera colección de mutantes de Arabidopsis thaliana inducidos por rayos X y constataba la posibilidad de utilizar esta especie en la experimentación de laboratorio (Laibach, 1943; Reinholz, 1947a; Reinholz, 1947b citados en Bowman, 1994; Page y Grossniklaus, 2002; Somerville y Koornneef, 2002). A mediados de la década de los 60, comenzó a organizarse la comunidad científica que trabajaba con esta crucífera, creando el denominado Arabidopsis Information Service (AIS). Poco después (1965) se organizó el primer simposio sobre Arabidopsis thaliana (http://www.arabidopsis.org/ais/1965/contents01S.html). En la década de los 70, decayó su interés, en gran medida como consecuencia del auge de otras especies (maíz, guisante, levaduras, bacterias, Drosophila melanogaster, etc.). Sin embargo, los trabajos realizados por distintos grupos acerca de la respuesta a las auxinas o sobre letalidad embrionaria, así como varias revisiones bibliográficas, despertaron de nuevo el interés en Arabidopsis entre la comunidad científica (Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002), como pone de manifiesto el notable incremento en los últimos años del número de trabajos de investigación publicados sobre Arabidopsis thaliana (Fig. I.2). Número publicaciones por año Introducción 9 Años Figura I.2.- Número de artículos científicos publicados anualmente sobre Arabidopsis thaliana. Tomado, con alguna modificación, de Somerville y Koornneef (2002). I.4.1.- Características de Arabidopsis thaliana como sistema modelo. Arabidopsis thaliana presenta unas características óptimas como organismo modelo en Biología vegetal, entre las que destacan su capacidad de crecimiento bajo condiciones controladas; su pequeño tamaño (unos 30 cm de altura y la posibilidad de cultivar hasta 10.000 plantas /m2). Además, presenta un corto ciclo de vida de alrededor de 6 semanas, permitiendo la obtención de hasta 8 generaciones al año en determinadas condiciones de cultivo (25º C e iluminación continua). Se trata de una especie autógama y muy prolífica, pudiendo conseguir hasta 10.000 semillas por planta sin necesidad de intervención alguna. Las semillas pueden almacenarse varios años a temperatura ambiente, con escasa pérdida de su viabilidad (Bowman 1994; Page y Grossniklaus, 2002). Arabidopsis thaliana se puede mutagenizar con gran facilidad, mediante mutágenos físicos (neutrones rápidos y rayos X), químicos (metanosulfonato de etilo, EMS) o elementos de inserción (transposones y T-DNA de Agrobacterium tumefaciens). En las últimas décadas, se han realizado numerosas mutagénesis sobre Arabidopsis thaliana con el propósito de analizar diferentes procesos biológicos (Rédei, 1970; Rédei, 1975 citados en Meyerowitz, 2001; Estelle y Somerville, 1986; Meyerowitz, 1987; Bowman et al., 1988; Meyerowitz, 1989; Griffing y Scholl, 1991; Koncz et al., 1992; Koornneef y Stam, 1992; Rédei y Koncz, 1992; Berná et al., 1999; Quesada et al., 2000). Cabe destacar la facilidad con la que se puede transformar Arabidopsis thaliana con el T-DNA Introducción 10 de Agrobacterium tumefaciens (Krysan et al., 1999; Brunaud et al., 2002). Esto ha permitido la generación de distintas colecciones de mutantes de inserción (Sessions et al., 2002; Alonso et al., 2003; Jander et al., 2002). El tamaño del genoma de Arabidopsis thaliana, uno de los más pequeños entre las plantas superiores, presenta sólo 125 Mb (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000) con poco DNA repetitivo, lo que facilita los estudios moleculares así como la clonación posicional (Leutwiler et al., 1984; Pruitt y Meyerowitz, 1986; Meinke et al., 1998; Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002). Además, Arabidopsis cuenta con una ingente cantidad de herramientas genéticas (líneas recombinantes endógamas, RI o Recombinant Inbred Lines; marcadores fenotípicos, marcadores moleculares polimórficos, bancos de clones de cDNA, EST, etc.) y bioinformáticas al servicio de la comunidad científica internacional. En la dirección del TAIR (The Arabidopsis Information Resource, http://www.arabidopsis.org; Huala et al., 2001) podemos encontrar actualizaciones periódicas de la información acerca de los recursos de utilidad en el estudio de Arabidopsis (García-Hernández et al., 2002). I.4.2.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana. Arabidopsis thaliana presenta una morfología y anatomía similares a las de otras angiospermas (Fig. I.3). En la base de la planta encontramos la raíz, de la que surgen distintas ramificaciones y la roseta, compuesta de hojas vegetativas a partir de la cual se desarrolla el tallo principal y varios secundarios. Éstos, a su vez, pueden presentar ramificaciones con una hoja caulinar en su base. El espacio comprendido entre un órgano y el siguiente se denomina entrenudo. En los extremos, tanto del tallo principal como de las ramificaciones, se desarrollan inflorescencias con flores con una disposición en racimo. Los órganos en la flor se disponen en cuatro verticilos concéntricos: 4 sépalos, 4 pétalos, 6 estambres (4 externos y dos internos) que alojan al gametófito masculino y dos carpelos fusionados formando el gineceo (Fig. I.3 C y B). El gineceo está formado por el ovario, en cuyo interior se alojan los óvulos, y el estigma situado en la región apical, donde se desarrollan las papilas estigmáticas. Separando a éste del ovario, encontramos el estilo (Fig. I.3 B y I.19; Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999). Introducción 11 A B Estambres Flor Inflorescencia Estigma Carpelos Silicua Pétalos Fitómero Sépalos Entrenudo + Nudo Pedicelo Diagrama floral de Arabidopsis thaliana Ramificación Hoja caulinar C Pétalo Tallo principal Sépalo Hojas de la roseta (vegetativas) Estambre Raíz Carpelo Figura I.3.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana. A) Dibujo de una planta adulta de Arabidopsis thaliana de Somerville y Koornneef (2002) en el que se indican las distintas partes de la planta. B) Fotografía de una flor de Arabidopsis thaliana (de unos 5 mm) en la que se indican los distintos órganos. C) Diagrama floral en Arabidopsis thaliana. Barra de escala en B 1 mm. I.4.3.- Ciclo de vida de Arabidopsis thaliana. Arabidopsis thaliana es una planta anual que presenta dos fases de crecimiento bien diferenciadas, la fase vegetativa y la fase reproductiva (Fig. I.4). Al igual que otras muchas angiospermas, presenta un ciclo de vida típico con alternancia de generaciones haploides y diploides (gametofítica y esporofítica, respectivamente). Los estambres constituyen los órganos reproductivos masculinos de la flor, y se componen del filamento y la antera en la que se encuentran los granos de polen (gametófito masculino, haploide). El gametófito femenino está formado por el óvulo, en el que se aloja la célula huevo y el saco embrionario (Bowman, 1994; Meinke et al., 1998). En el estadio de antesis (momento en el que se abren las flores) los granos de polen de la antera se depositan en el estigma, quedando atrapados en las papilas estigmáticas, y germinan generando el tubo polínico que atraviesa el estilo y la pared del Introducción 12 ovario (septum) hasta alcanzar el óvulo. Se produce la fusión de los gametos dando lugar al cigoto o embrión diploide, que junto con el tejido materno y el endospermo extraembrionario, dará lugar a la semilla (Bowman, 1994; Meinke et al., 1998; Laux et al., 2004). Planta adulta (esporófito) Desarrollo de la semilla Figura I.4.- Ciclo de vida de Arabidopsis thaliana. En esta figura se representan los distintos estadios de desarrollo de esta crucífera. Se anotan algunos de los órganos que presenta la planta. En rojo, se indican cada uno de los procesos que tienen lugar durante el ciclo vital de la planta. Dibujo tomado de Howell (1998) con modificaciones. Al culminar la embriogénesis, se observa en el embrión maduro un plano corporal rudimentario, compuesto por las hojas embrionarias o cotiledones y los meristemos apical y radicular (Laux et al., 2004). Tras la germinación, se produce una plántula compuesta por la radícula, el hipocotilo y los cotiledones. A partir de aquí la planta entra en la fase vegetativa. Ésta se divide en una etapa juvenil (temprana) donde, a partir del meristemo apical, surgen las 4 primeras hojas con filotaxia decusada (pares de hojas enfrentadas), y una etapa adulta (tardía) caracterizada por la producción de hojas que se disponen Introducción 13 siguiendo un patrón filotáctico en espiral con unos entrenudos cortos entre dos hojas sucesivas. A esta transición se asocian cambios morfológicos que reciben el nombre de heteroblastia (Poethig, 1997; Candela et al., 1999; Berardini et al., 2001; Poethig, 2003). Al final del desarrollo vegetativo, y tras la integración de señales exógenas (luz, fotoperiodo, nutrientes, temperatura, etc.) y endógenas (hormonas, regulación génica), se produce la transición floral, lo que marca el inicio de la fase reproductiva. El meristemo apical se transforma en meristemo de inflorescencia, de donde surgen hojas caulinares y meristemos florales siguiendo un patrón de filotaxia helicoidal. Tras la antesis se inicia un nuevo ciclo (Bowman, 1994, Meinke et al., 1998; Boyes et al., 2001; Page y Grossniklaus, 2002). Germinación Producción de hojas vegetativas Crecimiento de la roseta Aparición de la inflorescencia (transición floral) Floración Maduración de la silicua (Fructificación) 0 10 20 30 40 50 50 70 Días Figura I.5.- Esquema cronológico de la progresión de los principales eventos durante el desarrollo de Arabidopsis thaliana. Esquema a partir de Boyes et al. (2001). Las plantas del acceso Col-0 fueron cultivadas en condiciones de 16 h de luz y 8 h de oscuridad (día largo). I.4.4.- El genoma de Arabidopsis thaliana. La práctica totalidad del genoma de Arabidopsis thaliana se encuentra secuenciado salvo alguna región refractaria rica en repeticiones. Presenta un tamaño de 125 Mb estructurado en cinco cromosomas (Fig. I.6) y destaca la baja presencia de DNA repetitivo, cercano al 10% (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Su mapa genético comprende unos 600 cM, con una equivalencia de alrededor de 210 Kb/cM. Por otro lado, encontramos un bajo número de elementos móviles (un 10%) dispersos por todo el genoma (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000; Hall et al., 2002). Este hecho contrasta con lo observado en otras especies como el maíz, donde alcanzan entre un 50 y un 80% del genoma (San Miguel et al., 1996), o un 45% en el caso del genoma humano (The International Human Genome Sequencing Consortium, 2001). Introducción 14 El tamaño del genoma de Arabidopsis thaliana es relativamente pequeño. Se cifra el tamaño del maíz en 2.500 Mb, y el del trigo en 16.000 Mb (Adam, 2000). La diferencia de tamaño con el arroz no es tan notoria ya que su genoma posee 420 Mb (Oryza sativa L. ssp. japonica; Goff et al, 2002) o 466 Mb (Oryza sativa L. ssp. Indica; Yu et al., 2002). I II III IV V MT CLP Figura I.6.- Representación esquemática de los cromosomas de Arabidopsis thaliana. De I a V se indican los cromosomas nucleares. A la derecha el genoma de la mitocondria (MT) y el del cloroplasto (CLP). El círculo rojo indica la posición del centrómero. Al comparar el tamaño del genoma de Arabidopsis thaliana con otros organismos no vegetales, observamos que se asemeja al de otros sistemas modelo, como Drosophila melanogaster (180 Mb; Adams et al., 2000) o el nematodo Caenorhabditis elegans (97 Mb; The Caenorhabditis elegans Sequencing Consortium, 1998). El número de presuntos genes en Arabidopsis thaliana es 25.498, acercándose a las primeras estimaciones de 30.000 genes para la especie humana (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001) y muy superior a los 13.601 predichos para Drosophila melanogaster (Adams et al., 2000) o los 19.099 para Caenorhabditis elegans (The Caenorhabditis elegans Sequencing Consortium, 1998). Estas diferencias deben basarse en reorganizaciones cromosómicas, duplicaciones locales de genes o duplicaciones totales del genoma, acaecidas a lo largo de la evolución. De hecho, la variedad de tipos proteicos es de sólo 11.601, muy similar a lo esperado en Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster, cuyos proteomas oscilan entre 11.000 y 15.000 tipos distintos. Introducción 15 Tabla I.1. Rasgos generales de los genes y los tres genomas de Arabidopsis thaliana. Núcleo Cloroplasto Mitocondria Tamaño del genoma 125 MB 154 Kb 367 Kb Genomas por célula 2 560 26 Regiones duplicadas 60% 17% 10% 25.498 87 58 Variable pero sinténico Conservado Variable 4,5 1,2 6,25 1,9 Kb 900 pb 860 pb Genes con intrones 79% 18,4% 12% Genes/Pseudogenes 1/0,03 1/0 1/0,2-0,5 14% 0 4% Número predicho de genes Ordenamiento génico Densidad génica (Kb/nº de genes) Tamaño medio de la región codificante Transposones (% en el genoma) Del total de genes predichos en el genoma de Arabidopsis thaliana, es posible asignar una función al 69%, basándose en la similitud de secuencia que presentan con respecto a otros genes de otros organismos, de los que un 9% han sido caracterizados experimentalmente. Sin embargo, para un 30% no se ha podido clasificar su función (Fig. I.7). Transcripción Metabolismo Síntesis de DNA, crecimiento y división celular Senescencia, muerte celular y defensa Comunicación celular y transducción de señales Sin clasificar Degradación proteica Transporte intracelular Biogénesis celular Regulación del transporte Energía Síntesis proteica Homeostasis iónica Figura I.7.- Clasificación funcional de los genes predichos en Arabidopsis thaliana. Obsérvese en el diagrama de sectores, el elevado porcentaje de genes cuya función aún no se ha podido determinar. Dibujo tomado de The Arabidopsis Genome Initiative (2000) con modificaciones. Introducción 16 El número de proteínas que son únicas en el genoma de Arabidopsis thaliana se acerca al 35%. Por otro lado, la proporción de éstas que presentan más de 5 miembros es muy superior (37,4%) a lo observado en Drosophila melanogaster (12,1%) o en Caenorhabdidtis elegans (24%). El número de funciones, determinadas en relación a la presencia o no de determinados dominios proteicos, presentan una proporción similar entre Arabidopsis, Caenorhabditis y Drosophila, lo que pone de relieve la similitud en determinados procesos entre los eucariotas, así como la ubicuidad de los tipos proteicos implicados. Sin embargo, se debe tener en cuenta que 150 familias proteicas son únicas (The Arabidopsis Genome inititive, 2000). Otra de las conclusiones que se extrae del análisis del genoma es la abundancia de proteínas implicadas en señalización, y aquéllas que presentan dominios implicados en resistencia a enfermedades y reconocimiento de patógenos. Este resultado sugiere la existencia de un mayor número de rutas de transducción de señales como consecuencia de la respuesta al ambiente y a otros organismos, entre ellos los patógenos (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Cabe destacar el elevado número de factores de transcripción que presenta Arabidopsis thaliana, siendo dos veces mayor que en Drosophila melanogaster y tres que en Caenorhabditis elegans. Estas proteínas muestran entre un 8 y un 23% de similitud con otros factores de transcripción de otros eucariotas, existiendo 29 familias distintas, de las que 16 parecen ser únicas de plantas (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). La existencia de duplicaciones puede ser la causa de cierto grado de redundancia funcional. Por ejemplo, Arabidopsis thaliana cuenta con 80 miembros del grupo de factores de transcripción de tipo MADS. En el caso de la familia de factores SHATTERPROOF o SEPALLATA es necesaria la ausencia de función de todos los miembros de cada familia para la observación de un fenotipo mutante (Liljegren et al., 2000; Pelaz et al., 2000). Arabidopsis thaliana también cuenta con un elevado número de genes que codifican presuntas proteínas implicadas en el metabolismo del RNA (estabilización, procesamiento, eliminación, transporte, ...), siendo mucho mayor que lo determinado para Drosophila melanogaster o Caenorhabditis elegans (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Es verosímil que también aquí desempeñe un importante papel la redundancia funcional. Introducción 17 I.4.5.- Generación, obtención y caracterización de mutantes en Arabidopsis thaliana. I.4.5.1.- Mutágenos utilizados en Arabidopsis thaliana. I.4.5.1.1.- Mutágenos físicos y químicos. Los neutrones rápidos y los rayos X han sido los mutágenos físicos que con más frecuencia se han utilizado en Arabidopsis thaliana (Meyerowitz, 2001). En ambos casos, el tipo de mutaciones que producen son deleciones (alrededor de 1Kb en el caso de los neutrones rápidos) y otro tipo de reorganizaciones cromosómicas (Shirley et al., 1992; Bruggemann et al., 1996). El mutágeno químico más utilizado en Arabidopsis thaliana es el agente alquilante metanosulfonato de etilo (EMS). Éste induce mutaciones puntuales, preferentemente transiciones de G por A (Weigel y Glazebrook, 2002). Debido a la efectividad del EMS, pueden generarse varias mutaciones puntuales en cada individuo. Esto se traduce en una elevada probabilidad de aislamiento de alelos mutantes para un determinado locus durante el escrutinio. Sin embargo, la posible existencia de varias mutaciones acompañantes a la mutación en el locus de interés requiere la eliminación de éstas mediante retrocruzamiento con el ancestro silvestre (Wilhelmi y Preuss, 1996). Generalmente, con estos mutágenos la clonación del gen afectado requiere estrategias basadas en la cartografía y la clonación posicional mediante la utilización de marcadores moleculares polimórficos (Weigel y Glazebrook, 2002). Gracias a la secuenciación del genoma de Arabidopsis thaliana, el número de marcadores moleculares se ha visto aumentado notablemente facilitando las tareas de cartografía (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000; http://www.arabidopsis.org/Cereon). En la actualidad se está desarrollando una colección de mutantes derivados de EMS, dentro del proyecto denominado ATP (Arabidopsis TILLING Project; Colbert et al., 2001; Greene et al., 2003; Till et al., 2003) con el propósito de proporcionar series alélicas de mutaciones puntuales en diversos loci mediante TILLING (Targeting-Induced Local Lesions in Genomes). I.4.5.1.2.- El T-DNA como mutágeno insercional. En Arabidopsis thaliana se han desarrollado, principalmente, dos sistemas insercionales como agentes mutagénicos. Uno de ellos es un sistema heterólogo basado en transposones de maíz (Ralston et al., 1989; Bancroft et al., 1992; Aarts et al., 1993). Tienen una elevada eficacia en Arabidopsis, permitiendo la generación de colecciones de Introducción 18 genes señalizados y su clonación (Bancroft y Dean, 1993; Long et al., 1993; Sundaresan et al., 1995; Kuromori et al., 2004). A pesar de ello, el mutágeno insercional por excelencia en Arabidopsis thaliana es el T-DNA (transfer DNA). Se trata de un pequeño segmento del plásmido inductor de tumores Ti (Tumor inducer) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens que, tras la infección de las plantas, se integra de forma estable en su genoma (Fig. I.8). Tras diversos estudios, no se tiene un modelo completo de cómo el T-DNA finalmente se integra en el genoma de la planta (Zupan et al., 2000; Tax y Vernon, 2001; Valentine, 2003). En la integración, es imprescindible la integridad de dos regiones, cada una en un extremo del T-DNA a integrar, los bordes izquierdo o LB (Left Border) y derecho o RB (Right Border; Bevan y Chilton, 1982; Zambryski et al., 1983; Gelvin, 2000). Plásmido Ti (200 Kb) Agrobacterium tumefaciens Célula huésped infectada T-DNA Región Vir Síntesis del T-DNA por las proteínasVir Intermediario monocatenario del T-DNA Opinas metabolizadas por Agrobacterium La acetosiringona activa a los genes Vir Integración aleatoria del T-DNA en los cromosomas Tranporte del T-DNA al núcleo de la célula Transferencia del T-DNA Síntesis de Síntesis de Síntesis de opinas citoquininas auxinas Aumento en los niveles de auxinas y citoquininas en las células infectadas Las células dañadas producen acetosiringona Molécula de acetosiringona Figura. I.8.- Representación esquemática de la infección por Agrobacterium tumafaciens. Se indican las etapas que tienen lugar durante la transferencia e integración del T-DNA del plásmido Ti en el genoma de la célula huésped. Modificado a partir de Buchanan et al., 2000. En los últimos años, se han generado distintas colecciones de mutantes de TDNA, localizando en cada una de las líneas la posición de la inserción. Este recurso posibilita la rápida obtención de nuevos alelos para un determinado locus, y es de gran Introducción 19 utilidad en estrategias de genética inversa (Sessions et al., 2002; Alonso et al., 2003; Rosso et al., 2003; Strizhov et al., 2003). El T-DNA presenta una serie de ventajas para su utilización como herramienta, no sólo de mutagénesis, sino también en distintos procedimientos generales de Ingeniería Genética (Valentine, 2003), como son la incorporación de marcadores de selección (resistencia a antibióticos o herbicidas) y de genes testigo (Fosket, 1994). Otras aplicaciones con gran interés son el rescate fenotípico de mutantes mediante la inserción de una copia silvestre del gen afectado, o los estudios de sobreexpresión (Enhancer traps, Activation tagging, Topping y Lindsey, 1997; Lindsey et al., 1998; Campisi et al., 1999; Weigel et al., 2000). No obstante, su ventaja fundamental como mutágeno es la posibilidad de aislar e identificar las regiones genómicas adyacentes a los puntos de inserción, pudiendo clonar con relativa facilidad el gen afectado. Sin embargo, y aún teniendo en cuenta estas ventajas, la utilización del T-DNA presenta inconvenientes. El número medio de inserciones por planta mutagenizada es de sólo 1,5. Consecuentemente, se requieren escrutinios de un mayor número de plantas. Por otra parte, la transformación con Agrobacterium puede originar diversas mutaciones cromosómicas, como inversiones (Laufs et al., 1999), duplicaciones, deleciones (Negruk et al., 1996) o translocaciones cromosómicas (Tax y Vernon, 2001). La letalidad embrionaria de muchos mutantes de T-DNA se debe a este tipo de aberraciones cromosómicas (Castle et al., 1993). Los métodos de infiltración con Agrobacterium tumefaciens han progresado notablemente, trivializando procedimientos anteriormente tediosos. El sistema más utilizado actualmente consiste en la inmersión de las inflorescencias de plantas adultas (floral dip) en un cultivo de la bacteria con un surfactante (Bechtold et al., 1993; Clough y Bent, 1998; Bent, 2000; Desfeux et al., 2000). Implica la exposición al mutágeno de individuos que reciben la denominación de T1. Las plantas T2 son descendientes de la autofecundación de los individuos T1. Los posibles efectos fenotípicos de las mutaciones se pueden examinar en homocigosis en la generación T3 y siguientes. Con el propósito de facilitar el escrutinio, las semillas descendientes de varios individuos T2 se reúnen en distintos grupos parentales (pool). Introducción 20 I.5.- DESARROLLO DE Arabidopsis thaliana. I.5.1.- Embriogénesis en Arabidopsis thaliana. La embriogénesis es el proceso por el cual el cigoto sufre transformaciones hasta dar lugar al embrión. En las plantas, durante el desarrollo del embrión se genera un plano corporal simple a lo largo del eje proximo-distal. En Arabidopsis thaliana, una vez formado, podemos distinguir en el embrión el meristemo apical, que se localiza entre las hojas embrionarias o cotiledones, el hipocotilo y la raíz, en cuyo extremo se sitúa el meristemo radicular. Durante la formación de estas estructuras, se produce el desarrollo de la epidermis, el crecimiento de la subepidermis y la formación de un haz vascular principal a lo largo del embrión (Lyndon, 1990; Fosket, 1994; Howell, 1998). Cotiledones Meristemo radicular Meristemo apical Radícula Hipocotilo Figura I.9.- Embrión maduro poco antes de la germinación. Obsérvese ya la formación completa de los cotiledones, la radícula y el meristemo apical. El desarrollo del embrión se encuentra bajo un estricto control genético. Ya en etapas muy tempranas, se activan distintos programas de transcripción relacionados con la formación del patrón del embrión maduro (Lu et al., 1996; Weterings et al., 2001; Friml et al., 2002; Haecker y Laux, 2001) y se han aislado numerosas mutaciones en genes involucrados en este proceso que generan importantes alteraciones estructurales (Jürgens et al., 1994). I.5.2.- Desarrollo a partir del meristemo apical del tallo. En las plantas superiores, el desarrollo postembrionario se caracteriza por la formación reiterativa de primordios de órganos que se desarrollan a partir de los flancos de pequeñas estructuras denominadas meristemos. Los meristemos apical y radicular Introducción 21 definen el eje primario de crecimiento (apical-basal) de la planta. Los nuevos meristemos generan los ejes secundarios de crecimiento de la planta (ramificaciones) en los flancos del meristemo apical o en las axilas de las hojas (Bowman, 1994; Evans y Barton, 1997; Howell, 1998; Carles y Fletcher, 2003; Laux et al., 2003; Fig. I.10). A Meristemo apical del tallo B Meristemos axilares E J E P R I M A R I O Meristemo apical Órgano lateral Nudo Entrenudo Meristemos radiculares laterales Meristemo radicular FITÓMERO Meristemo axilar. Primordio o M. Lateral Figura I.10.- Arquitectura de una dicotiledónea adulta. A) Representación de la estructura de una planta superior indicando el eje primario de crecimiento y la localización de los meristemos. B) Crecimiento modular a partir del meristemo apical (Tomada con modificaciones de Carles y Fletcher, 2003). Cada unidad repetida, recibe el nombre de fitómero (Evans y Grove, 1940, citado en Howell, 1998; Fig. I.10), siendo el plastocrono el intervalo de tiempo que transcurre desde la aparición de un órgano lateral al siguiente. Esta medida puede variar en función de las condiciones de crecimiento (Sharman, 1942, citado en Howell, 1998). Se han descrito mutantes en los que la progresión del desarrollo durante esta etapa se ve alterada (mutantes heterocrónicos). Estas estirpes se caracterizan por un enlentecimiento en la aparición y desarrollo de las hojas (Poethig, 2003). Algunos genes implicados en este proceso son SQUINT (SQN; Berardini et al., 2001), PAUSED (PSD; Hunter et al., 2003; Li y Chen, 2003) y HASTY (HST; Telfer y Poethig, 1998; Bollman et al., 2003) en Introducción 22 Arabidopsis thaliana; PLASTOCHRON1 en arroz (Miyoshi et al., 2004) o TEOPOD2 en maíz (Bassiri et al., 1992). En todos los meristemos, localizamos una población de células indiferenciadas y totipotentes que actúan como reservóreo celular manteniendo su capacidad de división durante todo el ciclo de vida de la planta, lo que permite la formación de los distintos órganos (Fig. I. 10 y 11; Evans y Barton, 1997; Barton, 1998; Lenhard y Laux, 1999; Bowman y Eshed, 2000; Doerner, 2000; Laux, 2003). En Arabidopsis thaliana, el meristemo apical se genera durante la embriogénesis (estadio globular), localizándose entre los primordios de los cotiledones. En la planta adulta consta de alrededor de 60 células que presentan una pared celular fina y un citoplasma muy denso, dispuestas como un montículo protegido por las hojas en desarrollo. Su tamaño aumenta a medida que se desarrolla el primordio del órgano lateral y finaliza el plastocrono (Medford et al., 1992; Fosket, 1994; Evans y Barton, 1997; Howell, 1998; Carles y Fletcher, 2003). Superficialmente, el meristemo apical parece una estructura homogénea, sin embargo presenta una clara organización interna. Inicialmente podemos distinguir una región externa denominada túnica, y otra más interna, el corpus. La túnica se compone de dos capas celulares de distinto origen clonal denominadas L1 (externa) y L2 (interna). El plano de división celular en estas capas es perpendicular a la superficie del meristemo (división anticlinal). Las células L1 pueden permanecer en esta capa o bien diferenciarse a células epidérmicas. Las células de la capa L2 originarán el mesófilo y la línea germinal. El corpus lo compone la capa L3. Las células de esta capa pasarán a formar parte del tallo y la vasculatura de la planta (Fig. I.11 C). No existe un patrón fijo del mantenimiento del linaje celular entre las capas del meristemo apical ya que, ocasionalmente, se producen invasiones de una capa hacia otra sin generar ningún defecto en el desarrollo (Furner y Pumfrey, 1992; Irish y Sussex, 1992; Brand et al., 2001; Fletcher, 2002). Se trata de una muestra más de que la adquisición de destino de una célula vegetal depende de su posición y no del linaje celular del que procede (Poethig, 1989; Irish, 1991). Yuxtapuesta a esta estructuración, existe un segundo nivel de organización que divide al meristemo en tres regiones con distinta función: la zona central (ZC), la región o zona periférica (ZP) y la zona medular (ZM). La zona central se caracteriza por presentar una baja tasa de división. En ella se localizan las células meristemáticas totipotentes que actuarán a modo de reservóreo celular de la región periférica (Fig. I.11 B-D, Barton, 1998; Clark, 2001; Fletcher y Meyerowitz, 2001; Fletcher, 2002; Carles y Fletcher, 2003). Introducción 23 A medida que las células de la zona central se incorporan a la región periférica, se inicia su diferenciación. Estas células pasarán a formar parte de los primordios de los órganos laterales o bien de los entrenudos, encontrando en ambos casos células descendientes de las capas L1, L2 y L3. Estas células serán reemplazadas por células totipotentes de la región central (Fig. I.11 D; Laufs et al., 1998; Brand et al., 2001; Carles y Fletcher, 2002). Los primordios de hojas y flores aparecen alrededor del meristemo apical, generando el denominado patrón de filotaxia a lo largo del eje próximo-distal. En Arabidopsis, se disponen de forma helicoidal con un ángulo de separación de 137,5º (Mitchison, 1977; Steeves y Sussex, 1989, citados en Reinhardt et al., 2003; Micol y Hake, 2003). B A Primordio o meristemo floral Primordio o meristemo floral ZC ZP ZP TÚNICA C ZM CORPUS ML o PR MA ML o PR D ZC ZP ZC ZP ZM ZP ZM Células totipotentes Epidermis ZP L1 L2 L3 Subepidermis Figura I.11.- Estructura del meristemo apical del tallo en Arabidopsis thaliana. A) Las diferentes capas celulares del meristemo apical. B) Regiones histológicas en el meristemo apical. C) Superposición de ambas regionalizaciones indicadas en un corte longitudinal del meristemo apical de Arabidopsis thaliana. D) Localización de la población de células totipotentes en el meristemo. (MA: Meristemo apical; ML: Mersitemo lateral; PR: Primordio; ZC: Zona central; ZM: Zona medular; ZP: Zona periférica). Tomado con modificaciones de Howell, 1998 (A); Fletcher y Meyerowitz, 2000 (C y D); Carles y Fletcher, 2003 y Clark, 2001 (D). El intercambio de señales que se produce entre las distintas regiones del meristemo apical, así como entre éste y el órgano lateral en formación, desempeñan un importante papel en el crecimiento modular continuo que se observa en la parte aérea de la planta, así como en la homeostasis celular del meristemo apical, procesos en los que Introducción 24 intervienen un número considerable de genes (Bowman y Eshed, 2000; Brand et al., 2001; Clark, 2001; Fletcher, 2002; Baurle y Laux, 2003; Carles y Fletcher, 2003). I.5.2.1.- Mantenimiento de la población de células totipotentes en el meristemo. La diferenciación de las células totipotentes meristemáticas, así como la delimitación de la región que ocupan éstas en el meristemo, parece estar mediada por la ruta de transducción de señales en la que participan los genes CLAVATA: CLAVATA1 (CLV1), CLAVATA2 (CLV2) y CLAVATA3 (CLV3). Las mutaciones en cualquiera de estos genes provocan la aparición de rasgos fenotípicos muy similares. Los mutantes clv presentan un desequilibrio en la homeostasis celular del meristemo, apareciendo un excedente de células indiferenciadas totipotentes, normales en su morfología y tamaño, en la zona central (Fig. I.13 A-D y G; Clark, 2001; Carles y Fletcher, 2003; Laux et al., 2003). La actividad de los genes CLV no radica en el control de la tasa de división celular, sino en la delimitación de la región de células indiferenciadas (totipotentes) de la zona central del meristemo. La acumulación de células en los mutantes clv se traduce en un aumento notable del meristemo apical. Estos mutantes presentan un incremento en el número de órganos laterales, tallos fasciados y mayor número de órganos florales, típicamente carpelos (Clark et al., 1993; Clark et al., 1995; Kayes y Clark., 1998; Fletcher et al., 1999; Brand et al., 2000; Carles y Fletcher, 2003; Laux et al. 2003). La clonación de los genes CLV ha permitido determinar que se trata de componentes de una ruta de transducción de señales extracelulares. El producto del gen CLV1 codifica un receptor con un dominio kinasa intracelular (RLK, receptor-like kinase) y una región extracelular rica en leucina (LRR; leucine-rich repeat; Clark et al., 1997), al igual que el de CLV2 (Kayes y Clark, 1998). Sin embargo, CLV2 no presenta el dominio kinasa intracelular. Se forman complejos CLV1-CLV1 o CLV1-CLV2 (Jeong et al., 1999). CLV3 codifica un pequeño polipéptido de 96 aa que es secretado al espacio intercelular (Fletcher et al., 1999). El transcrito de CLV3 se localiza en las capas L2 y L3. De otro lado, la expresión de CLV1 se detecta, mayoritariamente, en la capa L3 de la zona central solapando con el dominio de CLV3 (Clark et al., 1997; Fletcher et al., 1999). Se ha propuesto que CLV3 es el interruptor de la ruta. Su unión a CLV1, y en mayor medida al heterodímero CLV1-CLV2 (complejo activo, Fig. I.13 D), activa la ruta de transducción (Trotochaud et al., 2000; De Young y Clark, 2001; Rojo et al., 2002; Lenhard y Laux, 2003). Introducción 25 A B C E G H D F Figura I.12.- Fenotipo de los mutantes clv y wus. Micrografías de barrido (SEM) de meristemos apicales (indicado por la flecha) en individuos silvestre (A), clv1 (C) y wus (E). Secciones longitudinales de meristemos apicales del silvestre (B), clv1 (D) y wus (F). El meristemo apical en los mutantes clv se ve incrementado en tamaño, al contrario que en wus. G) Planta adulta clv3. Se indica con una flecha el tallo fasciado y alteraciones en el patrón de filotaxia. H) Planta adulta de wus, observando su crecimiento característico “stop and go”. fa: flat apex (meristemo plano). Imágenes modificadas a partir de Laux et al. 1996 (H); Clark, 2000 (A); Schoof et al. 2000 (E) y Carles y Fletcher 2003 (B, D y F). La existencia de genes similares a los CLAVATA en otras especies, como el caso de FASCIATED EAR2 en maíz (Taguchi-Shiobara et al., 2001), sugiere la conservación de esta ruta entre las angiospermas. El gen WUSCHEL (WUS) codifica un factor de transcripción con homeodominio y está implicado en la iniciación y localización de la población de células meristemáticas indiferenciadas en el meristemo apical desde etapas embrionarias. Sus mutantes presentan un crecimiento típico denominado stop and go (Fig. I.12 E, F y H) debido a la iniciación del meristemo apical y una degeneración prematura, generando una estructura típica en la planta con la aparición de grupos de hojas y meristemos de forma desorganizada (Laux et al., 1996; Mayer et al., 1998). La expresión de WUS se restringe a la capa L3 en la zona central (Fig. I.11). Se ha propuesto que WUS estaría actuando como un centro organizador (CO), induciendo la totipotencia de las células localizadas por encima de su dominio de expresión (Mayer et al., 1998). Las mutaciones wus son epistáticas sobre las clv, lo que sitúa a WUS aguas arriba de la ruta de transducción de los genes CLAVATA (Laux et al., 1996; Schoof et al, 2000). WUS promueve la división celular ya que la expresión ectópica genera el crecimiento y división celular en zonas Introducción 26 adyacentes a células que expresan WUS. Estas células adquieren características meristemáticas debido a la inducción de la expresión de CLV3 (Gallois et al., 2002; Lenhard y Laux, 2003). D A COMPLEJO INACTIVO COMPLEJO ACTIVO B POL mRNA CLV3 Señal activa CLV Proteína CLV3 Expresión WUS Movimiento CLV3 Solapameinto entre el mRNA de CLV3 y señal activa de CLV Expresión CLV1 ? MAPKs C WUS WUS Figura I.13.- Cascada de señalización de la ruta CLAVATA. A) Se indican aquellas células que expresan CLV1, CLV3 y WUS en el meristemo apical. B) Dominios de expresión de CLV1, CLV3 y WUS así como el movimiento de CLV3 y las zonas donde se localiza el complejo CLV activo. C) Representación esquemática del meristemo de un mutante clv en el que se observa una expansión en el dominio de expresión de WUS. D) Cascada de señalización con los componentes descritos hasta el momento de la ruta CLAVATA. Figura realizada a partir de Clark, 2001 (C); Cock et al., 2002 (D); Carles y Fletcher, 2003 (D); Lenhard y Laux, 2003 (B), con modificaciones. En los mutantes clv, la disminución de la señal de la ruta CLV conlleva una expansión del dominio de expresión de WUS. De otra parte, la sobreexpresión de WUS es Introducción 27 suficiente para generar una fenocopia de alelos clv y la expresión ectópica de CLV3 fenocopia el fenotipo Wus en fondo silvestre (Fig. I.13 C; Brand et al., 2000). Este conjunto de efectos se debe a un intercambio de señales entre las células meristemáticas y el centro organizador que está mediada por CLV3 y WUS a través de un bucle de retroalimentación (Fig. I.13 D). Otros elementos también participan en la ruta de señalización de CLV. KAPP (kinase associated protein phosphatase; Stone et al., 1994, 1998) y una GTPasa de la subfamilia RHO (RAS homology gene family; Li et al., 1998; 2001) interaccionan directamente con el complejo activo del receptor CLV1/CLV2. (Fig. I.13 D; Trotochaud et al., 1999). El mutante shepherd (shd) presenta un fenotipo similar al de los alelos débiles clv (Ishiguro et al., 2002). SHD codifica un ortólogo de la chaperona GRP94 de mamíferos por lo que es posible que esté implicado en la correcta asociación del complejo CLV activo o modulando el plegamiento de las proteínas CLV (Ishiguro et al., 2002). El gen POLTERGEIST (POL), cuyas mutaciones suprimen el fenotipo de los mutantes clv, codifica una subunidad de una fosfatasa de localización nuclear (PP2C; protein phosphatase 2C) de expresión ubicua en la planta (Yu et al., 2003). El análisis genético indica que POL actúa aguas abajo de los genes CLV (Fig. I.13 D) y coopera con WUS, ya que los dobles mutantes wus pol presentan aditividad de fenotipos (Yu et al., 2000). Se han identificado otros elementos que regulan la organización celular del meristemo apical. Dos de estos factores son los genes FASCIATED1 (FAS1) y FASCIATED2 (FAS2), implicados en la regulación de los meristemos apical y radicular (Lesyer y Furner, 1992; Kaya et al., 2000) a través de la remodelación de la cromatina, permitiendo la correcta expresión de WUS, entre otros genes (Kaya et al., 2000). I.5.2.2.- Diferenciación de las células meristemáticas en los primordios de los órganos laterales. Los genes KNOX (KNOTTED-like HOMEOBOX) tienen como función en el meristemo regular la diferenciación de las células. El gen KNOTTED1 (KN1) de maíz, fue el primer factor de transcripción con homeodominio identificado en las plantas. Su sobreexpresión provoca la aparición de zonas con crecimiento indiferenciado en las hojas (Hake y Freeling, 1985; Vollbrecht et al., 1991). Su órtólogo en Arabidopsis thaliana es SHOOTMERISTEMLESS (STM). Sus mutaciones generan fallos en el establecimiento del meristemo apical. Las plántulas stm presentan sólo dos cotiledones sin producción de Introducción 28 órganos laterales (Barton et al., 1993; Endrizzi et al., 1996; Long et al., 1996). Este gen se expresa en todo el meristemo, manteniendo en estado indiferenciado las células y reprimiendo aquellas funciones que promueven la determinación. Su modo de actuación es independiente de CLV y WUS, aunque su actividad, junto con WUS, es necesaria en el mantenimiento de elevados niveles de expresión de CLV3 en el ápice del meristemo (Clark et al., 1996; Gallois et al., 2002; Lenhard et al., 2002). Otros genes de la familia KNOX, KNAT1 (KNOTTED-like from ARABIDOPSIS THALIANA1), KNAT2 y KNAT6, también se expresan en el meristemo apical y actúan de forma redundante con STM, oponiéndose a la diferenciación de las células necesaria para formar parte de los primordios de los órganos laterales (Ori et al., 2000). STM reprime en el meristemo a ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) y ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2), implicados en la diferenciación de los órganos, y restringen su expresión al primordio (Fig. I.15). Por contra, los genes AS1 y AS2 reprimen en el primordio a los genes KNAT, impidiendo el retorno al estado indiferenciado (Byrne et al., 2002). El gen AS1 codifica un factor de transcripción de tipo Myb (Byrne et al., 2000) y AS2 codifica un hipotético factor de transcripción que contiene una cremallera de leucina (Iwakawa et al., 2002; Xu et al., 2002). Meristemo apical PHAB + PNH PHAB + PNH + AS1 YAB + AS1 PHAB + PNH + YAB + AS1 P AS1 YAB STM P P Giberelinas PHAB AS1 KNAT1 KNAT2 YAB Figura I.14.- Organogénesis desde el meristemo apical. Se indican los dominios de expresión en distintos colores señalando las interacciones que tienen lugar en el establecimiento de patrón en las células que conformarán los primordios. P: primordios. AS1: ASYMMETRIC LEAVES 1; KNAT1: KNOTTED-like from ARABIDOPSIS THALIANA1; KNAT2: KNOTTED-like from ARABIDOPSIS THALIANA2; PHAB: PHABULOSA; PNH: PINHEAD; STM: SHOOTMERISTEMLESS; YAB: YABBY. Realizado a partir de Veit (2004). AS2 pertenece a la familia de genes LOB, que codifican factores de transcripción específicos de plantas (LATERAL ORGAN BOUNDARIES; Lin et al., 2003), también implicados en el intercambio de señales entre el meristemo y el primordio de los órganos Introducción 29 (Shuai et al., 2003) junto con PICKEL (PKL, Ogas et al., 1999). Otros elementos importantes son los factores de transcripción con homeodominio y cremallera de leucina de la clase III (HD-Zip III) PHABULOSA (PHB McConnell y Barton, 1998) y PHAVOLUTA (PHV; McConnell et al., 2001) o los genes pertenecientes a las familias YABBY (Kumaran et al., 2002) o KANADI (KAN; Kerstetter et al., 2001). Las fitohormonas giberelinas (Sakamoto et al., 2001; Fig. I.14) y auxinas (Leyser, 2003) también tienen un papel relevante en este proceso. I.5.3.- Transición de la etapa vegetativa a la reproductiva. Inducción floral. Las plantas con flores inician su desarrollo con un periodo de crecimiento vegetativo. En Arabidopsis thaliana, esta fase consiste en la producción, de forma reiterativa, de hojas sin alargamiento de los entrenudos. Cuando las condiciones son favorables, se activan distintos mecanismos que dan lugar a un gran cambio en el modo de desarrollo de la planta. Se inicia la fase de crecimiento reproductivo. A este conjunto de cambios se le denomina transición floral. El meristemo apical varía su morfología y sufre una reprogramación que desencadena su transformación en meristemo de inflorescencia. A partir de éste se desarrollarán los meristemos florales, que finalmente darán lugar a las flores. En plantas como Arabidopsis thaliana, en las que las flores se desarrollan en una inflorescencia, se producen dos transiciones: una que genera la formación del meristemo de inflorescencia seguida de la que induce la producción de flores. En ambas los mecanismos genéticos que subyacen difieren y se pueden distinguir (Lyndon, 1990; Fosket, 1994; Howell, 1998). El análisis genético, molecular y fisiológico de un largo número de mutantes en Arabidopsis thaliana con alteraciones en la transición de la fase vegetativa a la reproductiva, ha permitido la disección de diversas rutas de señalización que responden tanto a factores externos como endógenos de la planta. Se ha podido determinar la existencia de cuatro rutas principales que median la transición hacia la etapa reproductiva. Una de ellas está mediada por la temperatura (vernalización), otra por la luz (fotoperiodo), una tercera por las hormonas vegetales giberelinas y la última la constituye la ruta autónoma (Martínez-Zapater y Somerville 1990; Blázquez et al., 2001; Mouradov et al., 2002; Simpson y Dean, 2002). Existen evidencias de la interconexión entre estas vías, que confluyen finalmente en los denominados “elementos integradores de la floración”, como por ejemplo FLOWERING LOCUS C (FLC), un factor de transcipción de la familia MADS que actúa como represor de la floración (Moon et al., 2003). Los genes de la ruta Introducción 30 autónoma actúan reduciendo la cantidad de transcrito de FLC (Michaels y Amasino, 1999, 2001; Sheldon et al., 2000). Los mutantes en estos genes, presentan un fenotipo de floración tardía. La regulación postranscripcional durante la transición floral adquiere gran relevancia (Cheng y Chen, 2004). Muchos de los productos codificados por los genes implicados en la regulación del tiempo de floración presentan dominios de unión a RNA. FLOWERING LOCUS K (FLK) codifica una proteína con dominios KH (Lim et al., 2004); FY está involucrado en el procesamiento de la región 3’ del mRNA de FCA (Simpson et al., 2003), FPA y FCA codifican proteínas con motivos de reconocimiento de RNA (RRM; Recognition RNA Motifs), ejerciendo este último la autorregulación del procesamiento de sus intrones (MacKnight et al., 1997; Schomburg et al., 2001; Quesada et al., 2003). I.5.4.- Desarrollo floral. I.5.4.1.- El meristemo floral. A partir del meristemo de inflorescencia, se desarrollan los meristemos florales. Ambos son muy similares en estructura pero muestran una diferencia fundamental entre ellos. El meristemo floral es determinado y tras producir un número finito de órganos se detiene su crecimiento. Esto implica el cese de la actividad de las células meristemáticas indiferenciadas y su incorporación a los primordios de los órganos florales (Okamuro et al., 1996; Pouteau et al. 1997; Washburn y Thomas 2000; Zik y Irish, 2003). A B Meristemo de Inflorescencia Meristemo floral Figura I.15.- Meristemos de inflorescencia y floral en Arabidopsis thaliana. A) Microscopía electrónica de barrido de un meristemo de inflorescencia, rodeado por meristemos florales. B) Sección longitudinal de una flor en desarrollo donde se pueden observar los primordios de los órganos florales. Se: sépalos; Pe: pétalos; St: estambres; Ca: carpelos. Figuras tomadas con modificaciones de Lenhard y Laux, 1999 (A), y Carles y Fletcher, 2003 (B). Los meristemos florales se desarrollan alrededor del meristemo de inflorescencia (Fig. I.15 A). En los primeros, los primordios de los órganos florales se disponen de forma Introducción 31 concéntrica a lo largo del eje central del meristemo, en los denominados verticilos, que darán lugar a los órganos florales (sépalos, pétalos, estambres y carpelos; Fig. I.15 B; Steeves y Sussex, 1989; Carpenter et al., 1995; Fletcher, 2003). En Arabidopsis thaliana, la determinación del meristemo floral, así como la especificación de la identidad de ciertos órganos florales, dependen en gran medida de la actividad del gen AGAMOUS (AG), un factor de transcripción de tipo MADS (Bowman et al., 1989; Yanofsky et al., 1990). La existencia de varios ortólogos en otras especies indica la conservación de su función entre las angiospermas (Pnueli et al., 1994; Mena et al., 1996; Yu et al., 1999; Washburn y Thomas, 2000; Kapoor et al., 2002). La actividad de AG parece ser suficiente para conferirle al meristemo floral su naturaleza determinada (Mizukami y Ma, 1997). La expresión de AG se inicia en etapas muy tempranas del desarrollo floral, restringiéndose al ápice del meristemo (Fig. I.16 A y B), en las células que formarán los estambres y los carpelos (Drews et al., 1991). La regulación del patrón de expresión de AG recae sobre WUS y LEAFY (LFY). Conjuntamente, activan la transcripción de AG (Fig. I.16 A) uniéndose de forma independiente a secuencias reguladoras adyacentes (Hempel et al., 1997; Hempel et al., 2000; Lenhard et al., 2001; Lohmann et al., 2001). AG A AP1 +WUS AP1 +WUS AP3 LFY +UFO LFY B AG C D Figura I.16.- Interacciones génicas en el meristemo floral. A) y B) Expresión e interacciones génicas que se producen durante la determinación del meristemo floral. C) y D) Relaciones génicas producidas durante el mantenimiento de la identidad del meristemo floral y la inducción de la formación de los primordios. AG: AGAMOUS; AP1: APETALA1; AP3: APETALA3; LFY: LEAFY; UFO: UNUSUAL FLOWER ORGANS; WUS: WUSCHEL. A partir de Carles y Fletcher, 2003 (A y B) y Zik y Irish, 2003 (B y D). Un vez activada la expresión de AG, éste reprime la expresión de WUS a través de una vía, en parte, independiente de la ruta CLAVATA, lo que limita su expresión a la Introducción 32 región central. Por tanto, la determinación del meristemo depende de una activación progresiva de la expresión de AG que da lugar a la represión de WUS (Fig. I.16 C y D; Busch et al., 1999; Lenhard et al., 2001; Lohmann et al., 2001). Mientras que WUS se expresa tanto en el meristemo vegetativo como en el meristemo floral, LFY es específico del meristemo floral. Su expresión se inicia durante la etapa de transición floral y se mantiene durante todo su desarrollo, induciendo la expresión de genes implicados en la formación de los órganos florales (Fig. I.17; Weigel et al., 1992; Mayer et al., 1998; Wagner et al., 1999; Blázquez y Weigel, 2000; Lohmann et al., 2001). I.5.4.2.- Genes de identidad de los órganos florales. Modelo ABC. Quizás uno de los procesos más estudiados en Arabidopsis thaliana sea el desarrollo floral, por lo que muchas de las actividades génicas que regulan este proceso han sido identificadas (Weigel, 1995). Tal como sucede con los factores de transcripción HOM/Hox, que controlan la identidad de estructuras durante el desarrollo animal (Castelli-Gair, 1998; Verakasa et al., 2000), existe un conjunto de reguladores transcripcionales que determinan la identidad de cada uno de los órganos en los cuatro verticilos de la flor (Wolpert et al., 1998). Las variaciones en los niveles o en los patrones de expresión de estos genes provocan la transformación homeótica de órganos florales. El análisis genético de estos mutantes en Arabidopsis thaliana y Antirrhinum majus permitió elaborar el modelo ABC, considerado hoy en día uno de los dogmas de la Biología del desarrollo vegetal (Carpenter y Coen, 1990; Bowman et al., 1991; Coen y Meyerowitz, 1991; Meyerowitz et al., 1991; Coen, 1992; Weigel y Meyerowitz, 1994). La validez del modelo se pone de relieve debido a que ha podido ser exportado a otras angiospermas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Ambrose et al., 2003; Fornara et al., 2003). El modelo propone que la combinación de tres actividades A, B y C especifica cada uno de los órganos florales de los verticilos (Fig. I.17). La actividad A especifica los sépalos, A + B los pétalos, B + C los estambres y solamente C los carpelos (Fig. I.17 B y C). El modelo propone que las actividades de A y C se excluyen mutuamente. En ausencia de C, la actividad A está presente en toda la flor, y viceversa, no viéndose afectada la función B. En ausencia de la función C, el meristemo floral se transforma en indeterminado generando una repetición continua de órganos con alternancia de sépalos y pétalos (Fig. I.17 D). Introducción 33 AEstambres C Estigma Carpelos Pétalos Sépalos Pedicelo B D E F G H Figura I.17.- Modelo ABC. A) Flor silvestre de Arabidopsis thaliana donde se indican los órganos florales. B) Esquema del modelo ABC. Se indican los verticilos en una sección transversal de una flor silvestre de Arabidopsis thaliana. Las funciones A y C se excluyen mutuamente. C) Representación del modelo ABC en la flor de Arabidopsis thaliana. La función A está implicada en la formación de sépalos (primer verticilo); A + B forman pétalos (segundo verticilo); B + C estambres (tercer verticilo) y sólo C, carpelos (cuarto verticilo). se: sépalos; pe: pétalos; st: estambres; ca: carpelos. Flores de los mutantes ag (D); ap1 (E); ap2 (F); ap3 (G) y pi (H). B y C tomado de http://www.salk.edu/labs/pbio-w/gallery.html y modificado. En Arabidopsis thaliana los genes APETALA1 (AP1) y APETALA2 (AP2) pertenecen a la clase A (Irish y Sussex, 1990; Bowman et al., 1993). El gen AP1 codifica un factor de transcripción de tipo MADS (Mandel et al., 1992) y actúa, junto con AG, WUS y LFY confiriendo identidad al meristemo floral (Fig. I.17 A y C). Inicialmente se expresa en todo el meristemo y en etapas posteriores se restringe su expresión al primer y segundo verticilo (sépalos y pétalos). AP2 también está implicado en la regulación de la identidad del meristemo floral, así como en el desarrollo de la semilla. Codifica una proteína de unión a DNA de tipo EREBP (Ethylene Responsive Element Binding Protein; Riechmann y Meyerowitz, 1998). AP2 regula negativamente a AG, restringiendo su Introducción 34 expresión al tercer y cuarto verticilo, de acuerdo con el modelo. Sin embargo, aún presentando un papel en el primer y segundo verticilo, el transcrito de AP2 se localiza en los cuatro verticilos, lo que supondría una excepción a la regla del modelo. Rrecientemente se ha descrito su regulación postranscripcional mediante microRNA (miRNA). El microRNA miR172 se localiza en el tercer y cuarto verticilo e impide la traducción del transcrito de AP2, apoyando el modelo ABC (Chen, 2004; Jack, 2004). Con AP2 cooperan otros factores que, en su conjunto, regulan negativamente la expresión de AG en los verticilos uno y dos (Klucher et al., 1996; Krizek et al., 2000). Los genes de la clase B en Arabidopsis thaliana, APETALA3 (AP3) y PISTILLATA (PI) especifican identidad de pétalos y estambres en el meristemo floral. Codifican factores de transcripción de tipo MADS que pueden formar heterodímeros entre sí (Jack et al., 1992; Riechmann et al., 1996). El complejo AP3-PI se une a regiones promotoras de AP3 manteniendo sus niveles y patrón de expresión (Hill et al., 1998; Tilly et al., 1998; Honma y Goto, 2000). El gen SUPERMAN (SUP) también presenta un papel en la especificación de función B. Su actividad es necesaria para el mantenimiento de la expresión de AP3. La desregulación de PI y/o AP3 genera la formación de pétalos y estambres en cualquier parte de la flor (Fig. I.17 G y H; Jack et al., 1992; Goto y Meyerowitz, 1994; Krizek y Meyerowitz, 1996). El gen de la clase C, AG en Arabidopsis thaliana, se expresa en el tercer y cuarto verticilo, confiriendo la identidad de carpelo y estambre. La expresión ectópica de AG es suficiente para la formación de carpelos y estambres en el primer y segundo verticilo, (Fig. I.18 D). Algo similar sucede en los mutantes ap2, donde AG se encuentra desreprimido (Mandel et al., 1992; Mizukami y Ma, 1995; Mizukami y Ma, 1997; Jack, 2004). I.5.4.2.1.- Redefinición del modelo. Genes de la clase E. Recientemente, se ha descrito un cuarto grupo de mutantes que son capaces de transformar tejidos florales en tejidos vegetativos. Los genes de tipo MADS box SEPALLATA (SEP1, SEP2 y SEP3; Pelaz et al., 2000; Pelaz et al., 2001a) son redundantes, por lo que sólo el triple mutante muestra un fenotipo claro que consiste, en la formación únicamente de sépalos (Fig. I.18 B). Este rasgo indica que la función de los genes SEP es necesaria en la determinación de la identidad de pétalos, estambres y carpelos. De este resultado se deduce que los genes de las clases B y C necesitan de la actividad de los genes SEP para realizar su función. De otra parte, la sobreexpresión de Introducción 35 estos genes en combinación con genes de la regla ABC genera una transformación de hojas vegetativas en órganos florales (Honma y Goto, 2001; Pelaz et al., 2001b). A Reguladores del meristemo floral B Genes del patrón ABC Formación de complejos multiproteicos Generación de la identidad de los órganos florales Figura I.18.- Revisión del Modelo ABC. Inclusión de la función de los genes SEP (función E) en el modelo ABC. Inicialmente los genes LFY, UFO y WUS se expresan en dominios específicos del meristemo floral. Esta expresión desencadena la activación de genes implicados en la determinación de la identidad de cada órgano floral. Esto junto con la represión de AP1 por AG, da lugar al patrón ABC en la flor. La función de los genes SEP se restringiría al segundo, tercer y cuarto verticilo, colaborando en la generación de identidad. Se cree que las proteínas SEP forman complejos proteicos con los productos de los genes de identidad B y C. AG: AGAMOUS; AP1: APETALA1; AP3: APETALA3; LFY: LEAFY; PI: PISTILLATA; SEP: SEPALLATA; UFO: UNUSUAL FLORAL ORGANS; WUS: WUSCHEL. Se. Sépalos; Pe: Pétalos; St: Estambres; Ca: Carpelos. El descubrimiento de la importancia de los genes SEP ha provocado la revisión del modelo ABC (Fig. I.18 A), incorporando su participación. Los genes SEP han pasado a denominarse genes de la clase E (Goto et al., 2001; Theissen, 2001; Theissen y Saedler, 2001; Jack, 2004). I.5.5.- Desarrollo del fruto en Arabidopsis thaliana. Durante las últimas dos décadas el estudio del desarrollo floral ha experimentado un gran avance, gracias al análisis genético y molecular de diversos mutantes afectados Introducción 36 en el proceso (Ma, 1994). El conocimiento es mucho menor acerca de los genes implicados en la regulación del crecimiento, diferenciación y forma de estos órganos florales una vez ya formados. Sin embargo, en los últimos años se ha aislado un número considerable de mutantes que está permitiendo comenzar a comprender el desarrollo del gineceo (Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999). I.5.5.1.- Estructura del fruto en Arabidopsis thaliana. Anatómicamente se define a un fruto como un ovario maduro que típicamente incluye, de forma total o parcial, tejidos correspondientes a los carpelos. El fruto es un órgano altamente especializado y complejo desde el punto de vista histológico y funcional, y presenta distintas formas dentro de las angiospermas. Su función final es albergar y proteger a los óvulos y semillas durante su desarrollo, para su posterior dispersión (Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999). A Estigma Estilo Valvas Ovario B Estg Estl O v a r i o Replum Entrenudo Nectarios Figura I.19.- Morfología del fruto de Arabidopis thaliana. A) Microscopía electrónica de barrido de un fruto silvestre (estadio 13) de Arabidopsis thaliana en el que se indican las distintas regiones del fruto que se observan externamente. B) Secciones longitudinales de un fruto polinizado. En la parte inferior de cada sección histológica se representa un dibujo con la localización del eje de corte. (Estg.: estigma; Estl.: estilo). Figuras tomadas de Ferrándiz, 2002 (A) y Bowman et al., 1999 (B) con modificaciones. El fruto de Arabidopsis thaliana, al igual que el de las más de 3.000 especies de Brasicáceas, es una silicua. Su morfología es muy similar a la que presentan los frutos de otras familias como las leguminosas. En Arabidopsis, los frutos se desarrollan a partir de Introducción 37 un gineceo bicarpelar. Tras la polinización, en la etapa de antesis, podemos distinguir el estigma, el estilo, el ovario y el ginóforo o entrenudo (Fig. I.19 A). En el estigma encontramos unas células epidérmicas alargadas que constituyen las papilas estigmáticas. Su función es la adhesión de los granos de polen y promover su germinación para la fecundación de los óvulos (Kandasamany et al., 1994). Este tejido es rico en polisacáridos y guía el crecimiento del tubo polínico (Ferrándiz et al., 1999; Fig. I.19 B ). El estilo se localiza entre el estigma y el ovario. Presenta una simetría radial, y en su interior se distingue una zona central, por la que discurre el tracto transmisor rodeado por el clorénquima. Su superficie la forma una única capa epidérmica con células cuadrangulares entre las que se encuentran estomas (Sessions y Zambrisky, 1995). En el estilo se desarrolla una corona de haces vasculares correspondientes al xilema y al floema (Fig. I.19 B). El ovario de Arabidopsis thaliana está formado por dos carpelos fusionados postgenéticamente, que en el fruto maduro derivan en las valvas y los repla (singular, replum; Bowman et al., 1999). Internamente, el ovario se divide en dos lóculos laterales mediante un falso septum, ya que no se corresponde con las paredes laterales de los carpelos fusionados, sino con extensiones de sus márgenes. A lo largo de la capa interna del septum, discurre el tracto transmisor (Fig. I.22). A B Figura I.20.- Células de la superficie de la valva y del replum en los frutos de Arabidopsis thaliana. A) Vista lateral de un fruto silvestre de Arabidopsis thaliana en el que se pueden observar las diferencias de tamaño y morfología entre las células del replum y de la valva, en la que aparecen estomas. B) Detalle de la aparición de estomas en las valvas. Barras de escala 100 µm. Las células del replum son mucho más compactas y pequeñas; las de la valva son de mayor tamaño y poseen estomas entre ellas (Fig. I.20). Tras la maduración del fruto, la Introducción 38 zona de dehiscencia que se interpone entre ambas regiones se lignifica. Las valvas y el replum se separan dando lugar a la dispersión de las semillas (Fig. I.21; Ferrándiz, 2002). A B valva Figura I.21.- Dehiscencia de los frutos. A) Fruto cerrado. B) Dehiscencia en el fruto. Las flechas indican la dirección de separación de las valvas. Las regiones coloreadas indican lignificación durante el desarrollo final del fruto. ena: endocarpo interno; enb: endocarpo externo. DZ: zona de dehiscencia; LC: capa de células lignificadas en el margen de la valva. SL: Zona de separación. Tomado y modificado de Ferrándiz, 2002. En la valva podemos distinguir 6 capas celulares (Fig. I.22). Desde la más externa a la más interna encontramos la epidermis abaxial o exocarpo, formada por células alargadas, entre las que se localizan estomas. Estas células se encuentran recubiertas por ceras. Por debajo de esta capa encontramos el mesocarpo compuesto por el clorénquima, constituido por tres capas de células isodiamétricas de pequeño tamaño. A través de estas capas, se desarrollan haces vasculares que finalizan en la zona del estilo formando una “corona”. La zona más interna, el endocarpo o epidermis adaxial, la conforman dos capas de células que presentan distinta morfología y disposición. La capa más interna (ena, Fig. I.22) está formada por células isodiamétricas de pared fina y alargadas en el plano lateral. Las células de la subepidermis adaxial (enb; Fig. I.22) son de menor tamaño y están más empaquetadas, alargándose longitudinalmente (Kandasamany et al., 1994; Ferrándiz et al., 1999). En el interior del ovario, los óvulos están dispuestos longitudinalmente en cuatro filas entre la intersección de la valva y el septum. Los funículos son las estructuras encargadas de conectar a los óvulos con el tejido de la placenta. El óvulo presenta una estructura compleja, formada por la nucela, en la cual se encuentra el saco embrionario, Introducción 39 que, a su vez, queda englobada por dos integumentos y el funículo (Bowman, 1994; Bowman et al., 1999). Por último, el ginóforo o entrenudo, es la zona encargada de conectar el gineceo con el receptáculo floral (Fig. I.19 A; Bowman et al., 1999). Figura I.22.- Sección tranversal de un fruto en antesis. Se indican las distintas capas celulares. ex: exocarpo; ms: mesocarpo; enb: capa más externa del endocarpo; ena: capa interna del endocarpo. En cada uno de los dos lóculos (lc) se observan los óvulos (o) en desarrollo. El tracto transmisor (tt) se localiza en la zona media del septum (sp). Se indica la localización de los vasos laterales (lv) en las valvas, y los medios (mv) en el replum (rp). Barra de escala 50 µm. Tomado de Ferrándiz et al., 1999. I.5.5.2.- Estadios de desarrollo del gineceo y del fruto de Arabidopsis thaliana. La morfogénesis floral se divide en distintos estadios atendiendo a las características morfológicas que presenta durante su desarrollo (Fig. I.23; Smyth et al., 1990; Sessions, 1997; Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999; Ferrándiz, 2002). Inicialmente, desde la formación del meristemo floral hasta la antesis, se describen 13 estadios de desarrollo. Posteriormente, tras la fertilización, siguen 7 etapas hasta culminar con la deshiscencia del fruto (Fig. I.23). En la Tabla I.2 se recogen estas etapas haciendo mención a los rasgos más característicos de cada una de ellas. Introducción 40 Tabla I.2.- Estadios de desarrollo floral asociados al desarrollo del gineceo. Estadio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Rasgos morfológicos en la flor Inicio de la formación del meristemo floral. Separación del meristemo floral del tallo y la inflorescencia. Aparición de los primordios de los sépalos. Los sépalos recubren el meristemo floral. Aparición de los primordios de pétalos y estambres. Los sépalos encierran las yemas de los primordios. Crecimiento de los estambres. Aparecen los lóculos en los estambres Los primordios de los pétalos se estrechan en la base. Los pétalos se sitúan por encima de los estambres Las papilas estigmáticas inician su desarrollo. Los estambres se sitúan por encima de los pétalos. Antesis. Rasgos morfológicos en el gineceo Se inicia la formación del gineceo con la aparición de los primordios de los carpelos. Alargamiento del pistilo como un cilindro hueco. Diferenciación de los vasos y del tejido de la placenta. Aparece el primordio del óvulo. Cada carpelo se diferencia en endocarpo, mesocarpo, y exocarpo. El gineceo se cierra por su parte apical. Formación del septum El estilo se diferencia del resto del ovario. El endocarpo se diferencia en dos capas (ena y enb). Desarrollo del funículo en el óvulo. Crecimiento general del fruto. El tracto transmisor se diferencia. Polinización. Etapas tras la fertilización 14 15 16 17 A Las anteras se extienden por el estigma. El estigma crece entre las anteras. Senescencia de pétalos y sépalos. Caída de sépalos, pétalos y estambres. 17 B 18 Crecimiento final de la silicua. Amarilleamiento de la silicua (inicio de la senescencia). 19 20 Separación de las valvas de la silicua. Dispersión de las semillas. Fertilización. Se observa la sutura entre las valvas y el replum (zona de dehiscencia). Lignificación del xilema. Crecimiento general del fruto. Las células de la capa enb se desarrollan en esclerénquima. El exocarpo desarrolla una cutícula. La capa enb inicia su lignificación. La capa ena desaparece. Se completa la lignificación de la capa enb. El mesocarpo se deshidrata. Introducción 41 Figura I.23.- Estadios de desarrollo fruto tras la fertilización. Tomado Ferrándiz et al., 1999. En la base cada fruto se indica el estadio desarrollo que se corresponde con que se describen en la Tabla I.2. del de de de los I.5.5.3.- Genes implicados en el desarrollo del fruto en Arabidopsis thaliana. Muy pocos son los genes cuyas mutaciones afectan sólo al desarrollo del pistilo o del fruto. La inmensa mayoría de los genes están implicados en diferentes vías de desarrollo. Evolutivamente, los frutos derivan de meristemos vegetativos (Lenhard et al., 2001, Lohmann et al., 2001) y de hojas modificadas (Bowman et al., 1999), por lo que es normal que genes implicados en la formación y desarrollo de éstos puedan participar en la morfogénesis del fruto. El grado de redundancia funcional que sugiere el análisis de los distintos genomas secuenciados (Mewes et al., 1997) y, en concreto, el de Arabidopsis thaliana (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), también puede contribuir a esta situación (Bowman et al., 1999). La mayoría de los genes que, directa o indirectamente, ejercen una función durante el desarrollo del fruto, poseen actividades reguladoras de la expresión génica o son elementos de una ruta de transducción de señales (Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999). I.5.5.3.1.- AG: un gen clave en la especificación de los carpelos. La pérdida de función de AG genera la pérdida completa de los carpelos en el fruto (I.5.3.2.), generándose un patrón reiterativo de sépalos y pétalos. Los estudios de sobreexpresión indican que AG es suficiente para la especificación de los carpelos (Mandel et al., 1992). Los sépalos adquieren una morfología carpeloide y los pétalos Introducción 42 presentan rasgos de estambres, una fenocopia de los mutantes ap2 (Mizukami y Ma, 1992). Durante el desarrollo del gineceo, el transcrito de AG se detecta en los estambres y carpelos, consistentemente con el fenotipo observado. Durante el estadio 9 la expresión de AG se hace patente en el óvulo, y a medida que se desarrolla el fruto disminuye en gran medida su expresión en el ovario, el estilo y la placenta, al contrario que en las papilas estigmáticas y el óvulo en desarrollo (Bowman et al., 1991; Ferrándiz et al., 1999). I.5.5.3.1.1.- Nuevos miembros de la ruta de AG. Genes HUA y HEN. Durante el escrutinio de elementos intensificadores del fenotipo de un alelo débil de ag (ag-4), se identificaron nuevos elementos que actúan de forma redundante en la ruta de AG. Las mutaciones en los genes HUA1 y HUA2 provocan un aumento en el fenotipo de las plantas ag-4, como consecuencia de una pérdida de identidad carpelar, siendo similar el fenotipo al de los alelos fuertes (ag-1, Chen y Meyerowitz, 1999). Ambos genes codifican proteínas nucleares. HUA1 codifica una proteína CCCH con dedos de zinc, capaz de unirse a ácidos nucleicos de cadena simple (Liu et al., 2001). Por su parte HUA2 codifica una proteína con un hipotético dominio activador de la transcripción sin ninguna similitud con otras proteínas de las bases de datos (Chen y Meyerowitz, 1999). Los mutantes simples hua1 o hua2 sólo muestran fenotipo cuando les acompaña la mutación ag, (Chen y Meyerowitz, 1999). Los individuos hua1 hua2 presentan una transformación débil de estambre a pétalo y de carpelo a sépalo y sus frutos se engrosan en el ápice. Estas plantas muestran otras alteraciones en el crecimiento general de la planta que indican su participación en el desarrollo vegetativo y que no se restringen al desarrollo floral. De acuerdo con un fenotipo pleiotrópico, los RNA de HUA1 y HUA2 se localizan en distintos órganos (Chen y Meyerowitz, 1999; Liu et al., 2001; Jack, 2002). Sobre un fondo hua1 hua2 se identificaron mutaciones intensificadoras del fenotipo de este doble mutante, produciendo fenotipos similares a ag. En todos los casos, los genes correspondientes a las mutaciones hen1, hen2 y hen4 (hua enhancer 1, 2 y 4) codifican elementos implicados en el metabolismo de RNA. Los mutantes hen2 presentan alteraciones en el patrón de filotaxia y un aumento en el número de flores en la inflorescencia. Teniendo en cuenta las alteraciones fenotípicas que presenta hen2 en combinación con hua1 y hua2, se le asigna a HEN2 una papel en el mantenimiento de las funciones B y C. HEN2 codifica una helicasa de tipo DexH (Western et al., 2002). Introducción 43 La mutación hen1 provoca, en un fondo hua1 hua2, una pérdida de la función C que genera trasformaciones homeóticas similares a las de plantas ag. Las plantas hen1 presentan fenotipos vegetativos, como por ejemplo hojas incurvadas (Chen et al., 2002). El gen HEN1 codifica una proteína que junto con CARPEL FACTORY regula el metabolismo de miRNA implicados en el silenciamiento postranscripcional (Park et al., 2002; Boutet et al., 2003). Se supone que la ausencia de determinados miRNA en hen1 podría ser la causa de la pérdida de especificación de la identidad de órganos florales, como sucede en la regulación del transcrito de AP2 por el miRNA miR172 (Chen, 2004). Los individuos hua1 hua2 hen4 muestran transformaciones de estambres a pétalos. El gen HEN4 codifica una proteína nuclear con dominios KH de unión a RNA (Cheng et al., 2003). La localización conjunta de HEN4, HUA1 y, quizá HEN2, inclina a pensar que actúan regulando el procesamiento del mRNA de AG. Por esta razón, la ausencia de HEN4 y HUA1 genera una disminución del transcrito correctamente procesado y sin intrones de AG, lo que provoca la aparición del fenotipo mutante (Cheng et al., 2003). En la Figura I.24 se muestran los fenotipos de distintas combinaciones mutantes. A E B F C D Figura I.24.- Fenotipos de los mutantes involucrados en la ruta de AG. A) ag-1. B) ag-4. C) ag-4 hua1 hua2. D) hua1 hua2 hen1. E) hua1 hua2 hen2. F) De izquierda a derecha hua1 hua2; hua1-1 hua2-1 hen4-1; hua1-1 hua2-1 hen4-2. En determinadas combinaciones mutantes se ve alterada la morfología del fruto o se producen transformaciones homeóticas. Figuras tomadas de Chen y Meyerowitz, 1999 (B y C); Chen et al., 2002 (D); Western et al., 2002 (E) y Cheng et al. 2004 (F). I.5.5.3.2.- FRUITFULL: un gen que determina la identidad de la valva. El gen FRUITFULL (FUL) fue previamente identificado por su similitud con AG (AGAMOUS-LIKE8, AGL8, Mandel y Yanofsky, 1995). Sus mutaciones de pérdida de Introducción 44 función interfieren con el desarrollo apropiado de las células de la valva (Gu et al., 1999), sin afectar a otras regiones del fruto. Estos fallos en la diferenciación de las células de la valva se pueden detectar ya durante la etapa de desarrollo del pistilo, aunque estas anomalías se acentúan tras la fertilización y el desarrollo posterior. En los mutantes ful, las células de la valva no se alargan tras la fertilización, dando lugar a un fruto pequeño repleto de semillas viables pero de pequeño tamaño. En estos mutantes, tanto el septum como el replum continúan su normal desarrollo, adquiriendo éste un típico crecimiento en zig-zag como consecuencia de la falta de alargamiento del fruto (Gu et al., 1999). La expresión de FUL se localiza en todas las capas celulares de la valva. El mutante ful no presenta una pérdida total de la valva, sino una alteración en la maduración de ésta. Además, la sobreexpresión de FUL no es suficiente para conferir identidad de valva en otros tejidos del fruto, con la excepción del replum. Estos hechos ponen de manifiesto, simultáneamente, el papel de FUL en la identidad de la valva y el requerimiento de otros factores que han de estar presentes para que se pueda llevar a cabo esta transformación (Ferrándiz et al., 2000). A B Figura I.25.- Fenotipo en el fruto de los mutantes ful-1. A) fruto silvestre de Arabidopsis thaliana (estadio 13). B) ful-1 (estadio 17). Barras de escala en A 500 µm y en B 100 µm. El solapamiento en los patrones de expresión de FUL y AG en el cuarto verticilo, la necesidad de AG en la correcta formación del carpelo y la expresión de AG en las estructuras carpeloides derivadas de la sobrexpresión de FUL, sugieren que FUL es un gen situado aguas abajo de AG. Sin embargo, en el mutante AG se detecta expresión de FUL, por lo que deben existir otros factores que regulen la expresión de este último en ausencia de AG (Ferrándiz et al., 1999). Introducción 45 El RNA de FUL también se acumula en los meristemos florales, así como en las hojas caulinares, en la vasculatura del tallo y en el pedicelo floral. De acuerdo con este patrón de expresión, la mutación ful ocasiona hojas caulinares anormales y afecta a la arquitectura global de la planta, poniendo de manifiesto las múltiples funciones que ejecuta este gen durante el desarrollo. (Gu et al., 1999; Ferrándiz et al., 2000a). I.5.5.3.3.- Los genes SHATTERPROOF1 y SHATTERPROOF2 están implicados en la dehiscencia del fruto. Pertenecientes también a la familia de los MADS box, SHATTERPROOF1 (SHP1) y SHATTERPROOF2 (SHP2) se denominaron inicialmente como AGL1 y AGL5, respectivamente por su similitud con AG (Ma et al., 1991). Ambos presentan un patrón de expresión indistinguible el uno del otro. De acuerdo con lo anterior, los mutantes simples shp1 o shp2 no presentan un fenotipo distinto del silvestre. Por otro lado, la similitud de sus secuencias nucleotídicas sugiere la existencia de una duplicación génica reciente (Savidge et al., 1995; Flanagan et al., 1996; Liljegren et al., 2000). El doble mutante shp1shp2 presenta alteraciones en el margen de las valvas. Se produce una pérdida de la zona de dehiscencia y una disminución drástica de la lignificación de esta región, necesaria para la apertura del fruto (Liljegren et al., 2000). A B C D zd Figura I.26.- Fenotipo del doble mutante shp1shp2. A) y C) Frutos silvestre donde se aprecia la zona de dehiscencia, indicada en C como zd. B) y D) Fenotipo del doble mutante donde ha desaparecido la zona de dehiscencia entre la valva y el replum. Barras de escala 100 µm. Tomado con modificaciones de Liljegren et al., 2000. Tanto SHP1 como SHP2 parecen ser dianas de AG. Presentan un solapamiento inicial en su patrón de expresión, quedando luego restringidos a la zona de dehiscencia (Savidge et al., 1995; Flanagan et al., 1996). Introducción 46 La sobreexpresión constitutiva de SHP1 y SHP2 provoca una transformación de valva en margen de valva o zona de dehiscencia, reduciéndose el diámetro de los frutos. Algunas de las características de estos frutos son similares a las que presenta ful (Liljegren et al., 2000). De hecho, se comprobó que FUL actúa regulando negativamente a los genes SHP en las valvas. Por otro lado, la sobreexpresión de FUL presenta fenotipos algo más severos que shp1shp2, lo que sugiere la necesidad de otros factores en este mantenimiento de dominios (Ferrándiz et al., 2000b; Ferrándiz, 2002). Todos estos genes se encuentran bajo la regulación de AG, por lo que, de forma indirecta, AG estaría regulando la formación de estos territorios. I.5.5.3.4.- Papel de INDEHISCENT (IND) y ALCATRAZ (ALC) en el desarrollo del fruto. Al igual que los dobles mutantes shp, tanto indehiscent (ind) como alcatraz (alc) presentan una dehiscencia deficiente. Los genes correspondientes codifican factores de transcripción de tipo básico hélice-bucle-hélice (bHLH, basic helix-loop-helix; Liljegren et al., 2004; Rajan y Sundaresan, 2001). SHP, IND y ALC están encargados de especificar el margen de la valva (Liljegren et al., 2004). F valva valva G valva valva Figura I.27.- Fenotipo en el fruto de los mutantes ind y alc. A) Dehiscencia de una silicua silvestre. Pérdida de la capa de separación (sl) en ind-2 (B) e ind-1 (C), lo que impide la dehiscencia de los frutos. Secciones transversales del silvestre (D) y del mutante ind-2 (E). En F) se muestra la sección transversal de un fruto silvestre en estadio 17 y en G la de un fruto alc en el mismo estadio. NLC: capa de células no lignificadas. sl: capa de separación. v: valva. r: replum. Barras de escala 100 µm. En gran medida, el fenotipo que presentan los mutantes ful se debe a la expresión ectópica de ALC, IND y SHP, y no a la mera pérdida de función de FUL. De hecho, FUL regula negativamente a estos genes, restringiendo su expresión a la región del margen de la valva. Por lo tanto, FUL no se requiere para la especificación de todas las células de la Introducción 47 valva sino para impedir la adopción de identidad de células del margen de valva por parte del resto de células de la valva (Liljegren et al., 2004). I.5.5.3.5.- REPLUMLESS (RPL) especifica la región del replum. La función del gen REPLUMLESS (RPL) es requerida para la correcta formación del replum (Roeder et al., 2003). El gen RPL pertenece a la familia de factores de transcripción con homeodominio BELL1. Se expresa en todos los órganos de la planta y, de acuerdo con este patrón de expresión, presenta otras alteraciones al margen de las descritas en el fruto, como llamativos errores en el patrón de filotaxia (Byrne et al., 2003; Smith y Hake, 2003). En el fruto de los mutantes rpl se reduce drásticamente el tamaño del replum (Fig. I.28). RPL esta implicado en la represión de los genes de identidad de margen de valva (IND y SHP) en el replum (Roeder et al., 2003). Figura I.28.- Fenotipo en el fruto del mutante rpl. A) fruto silvestre Ler. B) Microscopía electrónica de barrido de Ler donde se indican las valvas (v), el replum (r) y el margen de la valva (vm). C) Sección transversal de un fruto silvestre. D) Fruto rpl-1. E) Reducción notable de la región del replum en rpl. F) sección transversal de un fruto rpl donde se aprecia la diferencia de tamaño. Barras de escala 1 mm en A y D; y 20 µm en D, C, E y F. Imágenes tomas y modificadas de Roeder et al., 2003. silvestre rpl-1 I.5.5.3.6.- SPATULA (SPT) actúa independientemente de AG en la diferenciación de tejidos del fruto. Las mutaciones en el gen SPATULA (SPT) provocan alteraciones fenotípicas que se restringen únicamente al gineceo. spt presenta fallos en la fusión apical de los carpelos, con una disminución en la cantidad de tejido estigmático y la desaparición del tracto transmisor, lo que en su conjunto provoca una reducción de la fertilidad (Fig. I.29 B; Introducción 48 Álvarez y Smyth, 1999). EL gen SPT codifica un factor de transcripción de tipo bHLH (Heisler et al., 2001). El análisis genético ha evidenciado que la ausencia de la función SPT provoca una reducción de los rasgos carpeloides que adoptan las estructuras florales como consecuencia de la expresión ectópica de AG. Por otro lado, la expresión ectópica de SPT genera la adquisición de rasgos carpeloides en otras estructuras de la flor, independientemente de la función de AG. Por tanto, resulta verosímil que SPT actúe paralelamente a AG en la generación de la identidad carpelar (Álvarez y Smyth, 1998). Se ha demostrado que los tratamientos con inhibidores de auxinas rescatan el fenotipo silvestre en los frutos spt, lo que indica un papel importante de estas hormonas en esta ruta (Nemhauser et al., 2000). A B C Figura I.29.- Fenotipo de los mutantes crc y spt. Obsérvese la falta de fusión en la región apical del fruto en los mutantes spt (A) y crc (B). En C) fenotipo del doble mutante crc spt. A y B tomadas de Ferrándiz et al., 1999. C de Álvarez y Smyth, 1999. Barras de escala 500 µm. I.5.5.3.7.- La función de CRABS CLAW (CRC) en la diferenciación de los carpelos. Los frutos de los mutantes crc son de pequeño tamaño y de fertilidad reducida (Fig. I.29 A). Presentan una reducción del tejido del estilo y deficiencias en la fusión apical de los frutos. La diferenciación de las células de la valva es anormal (Bowman y Smyth, 1999). El gen CRC codifica un miembro de la familia YABBY de factores de transcripción específicos de plantas, implicados en la generación de polaridad abaxial-adaxial en los órganos laterales (Sawa et al., 1999; Seigfried et al., 1999). Junto con AG y SPT, CRC es un gen necesario en la determinación de los carpelos, así como de otras estructuras como los nectarios (Álvarez y Smyth, 1999). Una Introducción 49 importante función de CRC es la determinación de la polaridad abaxial en las valvas y el replum (Eshed et al., 1999; Kerstetter et al., 2001). I.5.5.3.8.- Los genes TOUSLED (TSL), STYLISH1 (STY1) y STYLISH2 (STY2) están implicados en la formación de tejidos apicales del gineceo. Los genes STYLISH1 (STY1) y STYLISH2 (STY2) actuan junto con SPT y CRC en la formación de los tejidos de la región apical del gineceo (Kuusk et al., 2002). Stg Stl Val Figura I.30.- Fenotipo de los frutos en los mutantes tsl, sty1 y sty2. A la izquierda un fruto en estadio 17 del mutante tsl en el que se observa la pérdida de tejidos apicales. El panel de la derecha muestra las diferencias existentes en la región apical de los frutos sty1 y del doble mutante sty1 sty2 respecto de su ancestro silvestre (puntas de flecha). La imagen de la izquierda tomada de Ferrándiz et al., 1999. El panel de la derecha de Kuusk et al., 2002. En la imagen de la izquierda la barra de escala indica 500 µm, y en el panel de la derecha 100 µm. El estudio de los mutantes simples sty1 y sty2, y del doble mutante sty1 sty2, pone de manifiesto que STY1 y STY2 presentan funciones parcialmente redundantes en la especificación del estilo, ya que el fenotipo de los dobles mutantes es más severo que el de los mutantes simples. La expresión ectópica de estos genes genera una transformación del tejido de la valva en estilo, lo que apoya la idea de que ambos genes regulan la identidad de los tejidos del estilo. Las proteínas STY1 y STY2 presentan un dominio de localización nuclear y un motivo de interacción con otras proteínas C3HC4 RING con dedos de zinc (zinc binding C3HC4 RING finger motif). El gen TOUSLED (TSL) codifica una kinasa de Ser/Tre (Roe et al. 1993) perteneciente a una familia conservada entre plantas y animales (Yamakawa et al., 1997; Introducción 50 Shalom et al., 1999; Sillje et al., 1999; Li et al., 2001; Zhang y Liu, 2001). Los individuos tsl presentan una reducción en los tejidos de la región apical del gineceo, desapareciendo la zona de fusión del septum y el estilo, donde se localiza su expresión. Mediante el análisis de interacciones génicas, se ha visto que su modo de actuación en el gineceo es independiente de AG y AP2, aunque su función se requiere para la formación de tejidos carpeloides ectópicos (Roe et al., 1997). I.5.5.3.9.- El gen ETTIN (ETT) está relacionado con la regionalización del gineceo. En los mutantes ettin (ett) (Fig. I.31) se reduce enormemente el tejido correspondiente a las valvas, desarrollándose mucho más que en el silvestre la región correspondiente al tejido estigmático. Las anomalías se hacen evidentes en etapas muy tempranas del desarrollo del gineceo, lo que se corresponde con su temprana expresión en los primordios florales (Sessions y Zambryski, 1995; Sessions, 1997). Figura I.31.- Fenotipo de los frutos en los mutantes ett. Se observan distintas alteraciones en la distribución de tejidos y en la diposición de los órganos en los gineceos ett. A) Fruto silvestre. B) ett-2. C) ett-3. D) ett-1. Tomado de Sessions y Zambryski, 1995. La barra de escala en A corresponde a 153 µm; en B 109 µm; en C 295 µm y en D 132 µm. El gen ETT codifica un factor de transcripción de respuesta a auxinas (ARF3, Auxin Response Transcription Factor 3). El tratamiento de alelos débiles de ett (ett-2) con inhibidores del transporte polar de esta hormona, genera la aparición de fenotipos similares al de los alelos fuertes. Por lo tanto, a ETT se le asigna la función de interpretar las señales generadas por las auxinas en la regionalización del gineceo. Introducción 51 I.5.5.3.11.- Los genes CLV y el número de carpelos en el gineceo. Como hemos mencionado en apartados anteriores, las mutaciones en los genes CLV, impiden el mantenimiento de un equilibrio entre la actividad mitótica del meristemo y la incorporación de las células a los primordios de los órganos. Esto genera una acumulación de células indiferenciadas en el meristemo que altera su homeostasis celular (Clark, 2001). Como consecuencia, los mutantes clv, entre otras alteraciones, desarrollan un mayor número de valvas en el fruto (Clark et al., 1993; Clark et al., 1995; Kayes y Clark., 1998; Brand et al., 2000). Estas anomalías de los mutantes clv se detectan ya en etapas muy tempranas, con el desarrollo de varios carpelos rodeando la región meristemática a modo de anillo (Clark et al., 1993). En ocasiones, esta región meristemática genera un quinto verticilo que presenta proliferación de células indiferenciadas (Clark et al., 1995). A B C Figura I.32.- Aparición de valvas extra en los frutos de los mutantes clv. A) clv1. B) clv2. C) clv3. Frutos en estadio 17. Barras de escala 1 mm. I.5.5.3.12.- La familia de genes ERECTA (ER) en el desarrollo del gineceo. El gen ER codifica un receptor de membrana con dominio kinasa relacionado con CLV1 (Torii et al., 1996). Los mutantes er presentan una reducción en el número de células, lo que genera entre otros defectos, el desarrollo de inflorescencias compactas y silicuas de una longitud inferiores a las del silvestre. En estos frutos se reduce la longitud de la región del estilo (Fig. I.33) Este hecho implica a ER en la promoción de la proliferación celular en el crecimiento de todos los órganos (Torii et al., 1996). Introducción 52 Las mutaciones en dos parálogos funcionales ERL1 y ERL2 (ERECTA-LIKE KINASE) intensifican el fenotipo del mutante simple er, reduciendo aún más la longitud de las silicuas, indicando la redundancia funcional existente entre estas kinasas (Shpak et al., 2004). A B Figura I. 33.- Fenotipo en el fruto generado por la mutación er. A) fruto silvestre. B) Región apical de un fruto de una planta er. Frutos en el estadio 15. Barras de escala 1 mm. II.- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Antecedentes y Objetivos 54 II.- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Desde siempre, numerosos investigadores se han visto interesados por el estudio de los procesos biológicos que tienen lugar en las plantas. En los últimos tiempos, la Biología Vegetal ha experimentado un avance vertiginoso, que ha conducido a una visión mucho más detallada de los distintos procesos analizados. En la actualidad, además de las metodologías clásicas (pruebas bioquímicas, descripciones morfológicas,...), se han incorporado definitivamente las herramientas genéticas y moleculares. Los fenómenos de división, expansión, y diferenciación celular, o el establecimiento de patrones que se producen durante el desarrollo, se encuentran bajo un estricto control genético. Por tanto es fundamental identificar, mediante el aislamiento y caracterización de sus mutaciones, los genes que rigen estos procesos (Wolpert et al., 1998; Gilbert, 2000). La planta modelo Arabidopsis thaliana posee propiedades que hacen de ella un organismo ideal para la disección genética y molecular de procesos biológicos complejos, como la formación de tejidos y órganos (Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002). El fruto es un órgano que suscita un gran interés, tanto básico como aplicado. El fruto de Arabidopsis thaliana es una silicua, y ya desde los momentos más tempranos de su desarrollo, inmediatamente después de la fertilización, se distingue del pistilo por la aparición de estomas en la superficie del ovario (Bowman, 1994), presentando características morfológicas y fisiológicas comparables a las de muchos frutos (Barendse et al., 1986). Existen indicios de que hay una etapa inicial de divisiones celulares (Martínez et al., 1992) y que la mayor contribución al tamaño final corresponde al crecimiento longitudinal de las células (Bowman, 1994; Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999). Cabe esperar que las características que muestran a la silicua de Arabidopsis como un fruto típico, junto a las que hacen de esta planta un organismo ideal para la disección genética y molecular de fenómenos biológicos, permita la elaboración de modelos aplicables a otros vegetales que expliquen, mediante la expresión de sus genes y la función de sus productos, de qué manera se regulan los procesos morfogenéticos que dan lugar a la formación del pistilo y del fruto. Antecedentes y Objetivos 55 Una vía para comprender cómo se forma el fruto de Arabidopsis es la obtención de mutantes sin frutos o con su morfología alterada para, a continuación, clonar los genes responsables. De esta manera, se han caracterizado una serie de genes "maestros" en la jerarquía de la formación del fruto, como los factores de transcripción AP2 (Drews et al., 1991; Jofuku et al., 1994), AG (Yanofsky et al., 1990), FUL (Gu et al., 1999), LUG (Chen et al., 2000; Conner y Liu, 2000), ANT (Liu et al., 2000; Nole-Wilson y Krizek, 2000) RPL (Roeder et al., 2003), SHP1 y SHP2 (Liljegren et al., 2000), SPT (Heisler et al., 2001) o CRC (Bowman y Álvarez, 1999; Álvarez y Smyth, 1999) entre otros, y quinasas que participan en las rutas de señalización entre los que podemos destacar a los genes CLV1 y CLV2 (Kayes y Clark, 1998; Stone et al.,1998; Jeong et al., 1999; Clark, 2001), PID (Benjamins et al., 2001), TSL (Roe et al., 1993; Roe et al., 1997) o ER (Torii et al., 1996). Recientemente, se han sumado a esta lista una serie de actividades génicas con un papel en la regulación postranscripcional de algunos de lo genes anteriormente mencionados, como HUA1 (Liu et al., 2001), HUA2 (Chen y Meyerowitz, 1999), HEN1 (Chen et al., 2002), HEN2 (Western et al., 2002), HEN4 (Cheng et al., 2003) o CARPEL FACTORY/DICER LIKE (CAF/DCL; Jacobsen et al., 1999). A pesar de los progresos realizados, aún quedan por identificar numerosos genes implicados en los procesos de morfogénesis del pistilo y fructificación. El escrutinio y análisis de nuevos mutantes con frutos anormales permitirá identificar estas nuevas funciones y contribuirá a la elaboración de un modelo sobre la construcción de este órgano. Con estos antecedentes, nos planteamos una serie de objetivos a realizar en la presente Tesis. Un primer objetivo lo constituyó el análisis y evaluación de una colección española de T-DNA de reciente creación en el momento del inicio de este trabajo. Se planteó la obtención de nuevos mutantes afectados en la morfología del fruto, junto con la caracterización fenotípica y genética de los mutantes obtenidos. Un aspecto importante de este objetivo es la determinación del ligamiento de la mutación al hecho de inserción de TDNA. Dada la supuesta sencillez de la clonación de genes señalizados mediante inserciones de secuencia conocida, una finalidad obvia de esta Tesis consistía en la identificación de las actividades génicas afectadas por las mutaciones. Nuestro tercer objetivo era la confirmación de la identidad de los genes definidos por las distintas mutaciones mediante complementación funcional. Antecedentes y Objetivos 56 Con el propósito de obtener una información inicial sobre el papel que pudieran desempeñar estos genes en la morfogénesis de la planta, se planteó el estudio del patrón espacio-temporal de expresión de los genes caracterizados. Nuestro último objetivo consistía en llevar a cabo un análisis de las interacciones de nuestros mutantes con otros previamente caracterizados, lo que permitiría obtener información sobre las rutas o procesos de desarrollo en los que participan los genes identificados durante este trabajo. Toda esta información, en su conjunto, debería contribuir a un mejor entendimiento de los procesos y mecanismos que tienen lugar durante la morfogénesis del fruto. III.- MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos 58 III.- MATERIALES Y MÉTODOS III.1.- ORGANISMOS UTILIZADOS. III.1.1.- Estirpes de Arabidopsis thaliana. El NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Center, Norwich, Reino Unido) y el ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State University, Estados Unidos) tienen como misión el mantenimiento y la distribución de semillas y clones de DNA de Arabidopsis thaliana. Las distintas estirpes reciben un código de identificación, que en el caso del NASC se inicia con una N y un número, o CS y ese mismo número, en el caso del ABRC. Así por ejemplo, la estirpe mutante ap1-1 se identificaría como N28 a través del NASC y CS28 a través del ABRC. III.1.1.1.- Estirpes silvestres. Las estirpes silvestres utilizadas en esta Tesis son Landsberg erecta (Ler, NW20 o CS20), Columbia-0 (Col-0, N1092 o CS1092) y Wassilewskija-2, (Ws-2, N1601 o CS1601). III.1.1.2.- Estirpes mutantes. III.1.1.2.1.- Nomenclatura utilizada en la denominación de genes, mutaciones, fenotipos e individuos aislados durante el escrutinio de colecciones de mutantes. Durante la realización del presente trabajo se han seguido las directrices propuestas por Meinke y Koornneef (1997) para Arabidopsis thaliana respecto a la denominación de genes, mutantes y fenotipos. De forma continua, podemos encontrar actualizaciones de esta normativa en la dirección de Internet http://mutant.Lse.okstate.edu/genepage/namerule.html. Los alelos de un gen se indican mediante una abreviatura de su nombre formada por tres letras en cursiva, con mayúsculas en el caso del alelo silvestre, y minúsculas si se trata de un alelo mutante. Los distintos alelos mutantes de un gen se denotan utilizando números separados por un guión que habitualmente indican el orden de aislamiento. En el caso de que alguno de estos alelos mutantes sea dominante respecto del silvestre, se añade una D en cursiva (D). Por ejemplo, phb-1D es un alelo mutante y dominante del gen PHABULOSA. Materiales y Métodos 59 La proteína codificada por el gen se indica mediante la misma abreviatura con letras mayúsculas y en tipografía normal. Para referirnos a un fenotipo mutante, se escribe la abreviatura del gen en tipografía normal y con la letra inicial en mayúscula. - PEP1: Gen. - pep1-1: alelo mutante del gen PEP1. - PEP1: proteína codificada por el gen PEP1. - Pep1: fenotipo de los mutantes pep1. Los mutantes aislados en nuestro laboratorio han recibido, inicialmente, el nombre de SJF (San Juan Fruto) seguido de dos números, correspondiendo el primero de ellos al grupo parental al que pertenece la planta aislada, y el segundo al orden de aislamiento. Por ejemplo, SJF25-2 hace referencia al grupo parental 25 y al aislado número 2. Esta denominación es transitoria hasta la aplicación de las directrices anteriormente mencionadas. La anotación de los genes en el genoma de Arabidopsis thaliana se ajusta a la nomenclatura determinada por el AGI (Arabidopsis Genome Initiative). Por ejemplo, At4g26000 hace referencia al gen numerado como 26.000 en el cromosoma IV de Arabidopsis thaliana. Versiones actualizadas de las anotaciones se pueden encontrar en http://www.arabidopsis.org/info/guidelines.jsp#alia. III.1.1.2.2.- Procedencia de los mutantes. Las estirpes mutantes que se han utilizado en este trabajo pueden dividirse en tres grandes grupos teniendo en cuenta su origen. Al primer grupo pertenecen aquellos mutantes aislados durante el presente estudio a partir del escrutinio de una colección española de mutantes obtenida mediante mutagénesis insercional de T-DNA (Dr. J. Paz Ares, C.N.B., Madrid). El segundo de ellos englobaría a las estirpes mutantes ya aisladas y caracterizadas por autores anteriores (Tabla III.1). El tercer grupo lo constituyen líneas de T-DNA donde se ha determinado previamente qué genes se hallan afectados por el hecho insercional. Tabla III.1.- Estirpes mutantes utilizadas. Acceso Ler Gen afectado CLAVATA1 Alelo clv1-1 Ler CLAVATA1 clv1-6 Fenotipo Aparición de órganos supernumerarios Aparición de órganos supernumerarios Referencia Clark et al, 1993 Dievart et al., 2003 Materiales y Métodos 60 Tabla III.1.- Estirpes mutantes utilizadas. Continuación. Acceso Ler Gen afectado CLAVATA2 Alelo clv2-1 Ler CLAVATA3 clv3-1 Ler CLAVATA3 clv3-2 Ler Ler HUA1 HUA2 hua1-1 hua2-1 Fenotipo Aparición de órganos supernumerarios Aparición de órganos supernumerarios Aparición de órganos supernumerarios Alteraciones florales Alteraciones florales Ler HUA ENHANCER2 FRUITFULL WUSCHEL hen2-1 Alteraciones florales Ler Ler ful-1 wus-1 Referencia Kayes et al., 1998 Clark et al., 1995 Clark et al., 1995 Liu et al., 2001 Chen y Meyerowitz, 1999 Western et al., 2002 Valvas y replum del fruto alterados. Gu et al., 1999 El meristemo apical es Laux et al., 1996 rudimentario. En ocasiones se desarrollan inflorescencias donde aparece una flor terminal con sólo un estambre. En esta Tesis se han analizado líneas de las colecciones de semillas de dominio público procedentes del Salk Institute for Genomic Analysis Laboratory (SIGnAL), popularmente conocidas como líneas SALK y así referidas en este trabajo, y de la compañía Syngenta, o líneas SAIL (Syngenta Arabidopsis Insertion Library). Todas las líneas de estas colecciones se han generado utilizando como fondo genético el acceso Columbia-0. En la Tabla III.2 se muestran las líneas utilizadas. Tabla III.2.- Líneas de T-DNA de las colecciones de dominio público. Línea Colección Gen afectado Alelo SJF20-15 Españolaa At4g26000 (PEP1) pep1-1 F09_517 SAILb At4g26000 (PEP1) pep1-2 pep1-3 G12_1249 SAIL At4g26000 (PEP1) SALKc At4g26000 (PEP1) pep1-4 SALK_055265 SALK_036321 SALK At5g65390 (AGP7d) SALK_036324 SALK At5g65390 (AGP7) SALK_099106 SALK At5g65390 (AGP7) SALK_039285 SALK At5g65390 (AGP7) SALK_058288 SALK At4g26010 (PXDe) SALK_058547 SALK At4g26010 (PXD) SALK_048558 SALK At4g24190 (SHDf) SALK_076031 SALK At4g24190 (SHD) SALK_076127 SALK At4g24190 (SHD) SALK At3g04610 (FLKg) SALK_001523 a Esta Tesis. bSessions et al., 2002. cAlonso et al., 2003. d Majewska-Sawka y Nothnagel (2000). ePresunta peroxidasa. f Ishiguro et al., 2002. g Lim et al., 2004. Materiales y Métodos 61 III.1.2.- Estirpes de Escherichia coli. Se utilizaron las estirpes DH10β (Choi et al., 1995) y DH5α (Hanahan et al., 1983) de E. coli. Ambas permiten la selección blancas/azules (Φ80dlacZ∆M15) y son incapaces de recombinar (recA-). Los experimentos de transformación se llevaron a cabo mediante choque térmico (DH5α) o electroporación (DH10β). La estirpe DH10β es portadora de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosome, Shizuya et al., 1992) procedentes de la genoteca IGF (Institut für Genbiologische Forschung, Berlin GMBH), depositadas en el ABRC. Los clones F20B18 y MNA5, se generaron utilizando el vector pBeloBAC-Kan (Mozo et al., 1998) que confiere resistencia al antibiótico kanamicina. III.1.3.- Estirpes de Agrobacterium tumefaciens. Se han utilizado en este trabajo dos estirpes de Agrobacterium tumefaciens: C58C1 (Zambrisky et al., 1983; Koncz et al., 1986) y LBA4404 (Hoekeman et al., 1983). La primera carece de plásmido Ti, mientras que la segunda presenta modificaciones respecto a la estructura original del mismo. Dado que ambas estirpes tienen resistencia cromosómica a la rifampicina, siempre se cultivaron en presencia de este antibiótico, impidiendo así la proliferación de otro tipo de microorganismos. Se generaron células competentes de ambas estirpes para someterlas a transferencia de DNA mediante electroporación (Calvin y Hanawalt, 1988). La estirpe C58C1 se utilizó en la transferencia de construcciones de sobreexpresión génica. La estirpe LBA4404, en cambio, se utilizó en experimentos de transformación con clones genómicos. III.2.- VECTORES. PLÁSMIDOS Y CONSTRUCCIONES. En este apartado se incluyen los vectores utilizados en los trabajos rutinarios de clonación y los empleados en experimentos de transformación de plantas, tanto en la creación de las distintas colecciones de mutantes por mutagénesis insercional de T-DNA (generadas en otros laboratorios) como en los experimentos llevados a cabo durante esta Tesis. En todos los experimentos de subclonación o transcripción in vitro se han empleado los plásmidos pGEM-3Zf(+) y pGEM-T (Promega, U.S.A., Fig. III.1). Materiales y Métodos 62 B A pGEM-3Zf(+) (3.197 pb) pGEM-T (3.000 pb) Figura III.1.- Plámidos pGEM-3Zf(+) y pGEM-T. A) pGEM-3Zf(+). Derivado del plásmido pGEM-3Z. B) pGEM-T. Generado a partir del plásmido pGEM-5Zf(+) tras linearizar con EcoRV y añadir un nucleótido de timina (T) en los extremos 3’. Esto permite la clonación directa de productos de PCR utilizando polimerasas de DNA termoestables que generan extremos compatibles colocando un nucleótido de adenina (A) en posición 3’ terminal, lo que incrementa la eficacia en la ligación entre inserto y vector y evita la recircularización. Ambos r plásmidos confieren resistencia a la ampicilina (Amp ), presentan un sitio de clonación múltiple dentro del gen de la β-galactosidasa (LacZ) y poseen promotores para las polimerasas de RNA de los bacteriófagos T7 y SP6. El origen de replicación en ambos se indica como ori. El plásmido pGKB5 (Bouchez et al., 1993) fue empleado en la mutagénesis insercional para la elaboración de la colección española de semillas mutagenizadas mediante T-DNA (Dr. J. Paz Ares). Este T-DNA presenta genes de resistencia al antibiótico kanamicina (neomicina fosfotranferasa II, nptII) y al herbicida Basta (glufosinato amónico, Bastar). También contiene el gen testigo que codifica la enzima β-glucuronidasa (GUS), cuya expresión puede estar dirigida ocasionalmente por regiones reguladoras del gen en el cual se encuentra insertado este elemento. El plásmido pROK2 (Baulcombe et al., 1986) fue la herramienta elegida en la obtención de la colección de inserciones SALK (Alonso et al., 2003). Confiere a las plantas portadoras resistencia a la kanamicina, propiciada por el gen nptII. Para la elaboración de la colección SAIL (Sessions et al., 2002) se utilizó el T-DNA presente en el plásmido pDAP101 que confiere resistencia al herbicida Basta a las plantas portadoras. En la Figura III.3 se presentan los vectores utilizados en los experimentos de transformación de plantas mediante infiltración con Agrobacterium tumefaciens. Dentro de este grupo se encuentran el sistema binario denominado pGreen, formado por los plásmidos pSoup y pGreenII0179 (Fig. III.3 A y B, Hellens et al., 2000a y 2000b). El plásmido pSoup Materiales y Métodos 63 contiene todas las funciones trans necesarias para la integración del T-DNA que porta el plásmido pGreenII0179. El plásmido pBIN-JIT (Fig. III.3 C, Van Engelen et al. 1995) contiene tanto las funciones para la integración como el T-DNA. Este último presenta dos copias del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S CaMV), apropiado para experimentos de sobreexpresión génica en plantas. pGKB5 KanR A GUS BastaR RB LB uidA 1 XbaI BamHI 2 3 EcoRV EcoRV bar nptII P nos P 35S nos 3’ ocs 3’ 4 5 6 EcoRI 3’g7 7 Kb EcoRV KpnI KpnI HindIII pROK2 KanR B RB LB nos 3’ P 35S 1 BglII EcoRI XbaI SacI KpnI SmaI BamHI C nos 3’ nptII 2 P nos 3 4 Kb BglII HindIII pDAP101 Basta R RB LB bar nos 3’ P 35S 1 pBluescriptII 2 HindIII EcoRV BglII XbaI SbfI PstII 3 4 Kb ScaI NcoI NsiI Psu 10I Figura III.2.- Esquema de la estructura de los T-DNA que se han empleado en la obtención de las tres colecciones de mutagénesis insercional empleadas en la elaboración de este trabajo. A) pGKB5, empleado en la obtención de la colección española. B) pROK2, utilizado en la obtención de la colección SALK. C) pDAP101, empleado en la obtención de la colección SAIL. Materiales y Métodos 64 A B Sitio de clonación múltiple C pGreenII 0179 (5.139 pb) pBIN-JIT (13 Kb) Figura III.3.- Vectores para la transformación de Arabidopsis thaliana. A) pSoup. En rojo se indica el gen de r resistencia a la tetraciclina (Tet ) y en amarillo los orígenes de replicación para Agrobacterium y E.coli. B) pGreenII 0179. En amarillo y violeta se indican los orígenes de replicación. En el T-DNA se encuentra el gen LacZ, interrumpido por el sitio de clonación múltiple, lo que permite realizar una selección azul-blanco de r colonias. El gen Hyg (en rojo), bajo el control del promotor 35S, confiere a los individuos transformantes resistencia a la higromicina. C) pBIN-JIT. Vector de 13 Kb derivado del pBIN19. Incorpora un T-DNA modificado que presenta dos copias del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35SCaMV) y el terminador del gen de la nopalina sintetasa (nosT) flanqueando el sitio clonación (recuadro rojo). El gen nptII (neomicina fosfotransferasa II) confiere resistencia a la kanamicina. En B) y C) se indican como RB y LB los bordes derecho e izquierdo del T-DNA, respectivamente. Materiales y Métodos 65 III.3.- OLIGONUCLEÓTIDOS EMPLEADOS COMO CEBADORES. Todos los oligonucléotidos empleados en esta Tesis han sido sintetizados en la empresa TIB-MOL-BIOL (Alemania) en la escala 0,01 µM, con grado de purificación máximo (HPR3). Tabla III.3.- Oligonucleótidos empleados durante el desarrollo de esta Tesis. Nombre ACT2-f ACT2-r d AD1 d AD2 d AD3 AT1 AT2 AT3 AT4 AT5 AT6 AT7 AT8 AT9 AT10 AT11 AT12 AT13 AT14 AT15 AT16 AT17 CIW7-f CIW7-r ERA1 ERA2 FUP1-1 FUP1-2 FUP1-3 FUP1-4 FUP1-5 FUP1-6 FUP1-7 FUP1-8 FUP1-9 FUP1-10 FUP1-11 FUP1-12 FUP1-13 FUP1-14 Secuencia (5’ 3’) Clon (plásmido o BAC) a CTCTTAACCGTAAAGCTAACAG (f) b AGTGAGAATCTTCATGAGTGAG (r) NTCGASTWTSGWGTT NGTCGASWGANAWGAA WGTGNAGWANCANAGA CGGACTCCAGGGCGTGTGCC (f) CGGAATAGTTTTGGCCAGACC (r) CAGACGCGTGGTTACAGTC (r) CCGCATCGAAACGCAGCAC (r) GTCTGGATCGCGAAAACTGTG (f) ACCACCTGTTGATCCGCATCACG (r) CATACGCGTCTAGGATCCGATGG TGTATTCCACCCACCGAC CTGTTGCCGGTCTTGCGATG TCATGCGATCATAGGCGTCTCG TCAAAAGTCGCCTAAGGTCAC TCGGCAGAGGCATCTTGAACG AGGCTGTAGCCGACGATGGTGC TGAGACTCTAATTGGATACCGAG TGGCACACGCCCTGGAGTCCG (r) TCTGCACCATCGTCAACCAC ACGCTCTTGAAGCCCTGTGC AATTTGGAGATTAGCTGGAAT (f) CCATGTTGATGATAAGCACAA (r) CTAATGTAGTGATCTGCGAGGTAA-TC (f) GAGTTTATTCTGTGCCAAGTCCCT-G (r) TAACTCTGACAGCTATCTCC (r) CTTAAGAAAGATAGAGAGTGAAGC (f) ACCTAATACATGCTATATGGAC CACCAGAGTTCTCTATAGAC (r) TGTTGCTAGTAACAAGAG (f) TTTCGTATGATCGTTCCGGTG (f) ATGCCGGTGACATGTAGGCCTC (r) GAGATAGAGATACTAACGATGCGA-TCG (r) ACGCACCGGAACGATCATACG (r) CTGGCAATTTTGACTGCAGCCGAA-GC (r) TCATCCTCTAGGAATCCCACACTG (r) TGTAGGTATAGTGTATAATCGTC (r) TAGAGCTCACGTGGTGTTTTCCTT-TACACTAG (f) TAGTCGACTCAACGGAATCTGCGA-CGGC (r) Posición BAC MYH9 BAC MYH9 (nucleótidos) 5.997-6.019 6.319-6.340 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 pGKB5 BAC F17L22 (IV) BAC F17L22 (IV) 6.875-6.895 6.704-6.724 1.223-1.241 891-908 702-722 1.286-1.308 6.484-6.497 7.183-7.201 2.548-2.568 3.450-3.571 4.575-4.595 5.686-5.705 2.465-2.486 4.495-4.518 6.875-6.895 5.992-6.011 6.277-6.294 56.159-56180 56.268-56.289 BAC T1D16 (II) 7.205-7.231 BAC T1D16 (II) BAC MNA5 (V) BAC MNA5 (V) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC MNA5 (V) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) 7.685-7.710 42.145-42.164 41.204-41.227 34.858-34.882 35.857-35.880 42.121-42.142 35.283-35.303 35.678-35.700 BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) 35.413-35.434 35.286-35.306 BAC MNA5 (V) BAC MNA5 (V) BAC MNA5 (V) 42.757-42.783 42.639-42.663 42.398-42.420 BAC F20B18 (IV) 32.401-32.425 BAC F20B18 (IV) 35.064-35.084 Enzimac SacI SalI Materiales y Métodos 66 Tabla III.3.- Oligonucleótidos empleados durante el desarrollo de esta Tesis. Continuación Nombre FUP1-16 Secuencia (5’ 3’) Clon (plásmido o BAC) FUP1-33 FUP1-34 FUP1-35 FUP1-36 TACCCGGGTCAAAGATTATAACTG-CTGTAGCCACC (r) TGTACTGCACCGGCTCTGTG (r) GCTAATATAGCCTATATCCGTCG (f) ATAGGAAATGACTGG (r) TATCGATATGAATACG (f) TTAGATTGATGCTCC (r) AAATGTATTGGAGTG (f) TCGTATTGAATGAGTC (r) TCGTACGTATACACG (f) ACTCAATCATATGTGG (r) CTGTGGATATCCATCG (f) ATGTCGACCTTTAGCTATCTTTTTTG-TGTTACC (f) ATCCCGGGTGACCAGAAACGTAGT-GTGAC (r) TTTATTAGTTGCTTCAACGCAG (f) CACCGTTTTATGCTGCACAG (r) TCCTGGCGAGTTTGAGAGAC (f) ATCATTATCAGGCAACCCTG (r) R11187 pda04780 BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) RAFL08-13-K20 (pda04780) RAFL08-13-K20 (pda04780) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) FUP1-37 TCTGCTTTTGTGACACAGGTATCT (f) BAC F20B18 (IV) FUP1-38 CCTTGTGATTGATGATGAACTCTTG………………………………………….-A (r) TCCTCCGTCTTCAGCTCCTT (r) BAC F20B18 (IV) FUP1-17 FUP1-18 FUP1-19 FUP1-20 FUP1-21 FUP1-22 FUP1-23 FUP1-24 FUP1-25 FUP1-26 FUP1-27 FUP1-31 FUPS351 K3-1 K3-2 LBTM1 CTGATCTTCAGCTTCAGCCAT (r) TGGTTCAAGAGTCGGATCTG (F) GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGC-CTTGCTTCC (r) LBTM3 TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCT-CGATACAC (r) M13F GTAAAACGACGGCCAGTG (f) M13R GGAAACAGCTATGACCATG (r) MBK21p28 CATGTAAGCCTAGACAATG (f) MBK21p28 GCAGCATAAAAAACTCAGCT (r) MKD15p31 TAAGGTCTGTTCCATTCTG (f) MKD15p7-2 TGCTCCTTTGTCTTATTCTCA (r) MNA5-1 TACGAGGAAAACATCTAACAGTC (f) MNA5-2 AAAAGTCCCAACTCCAAATACC (r) OCF1 GTCGACCGGTTCAAATGGC (f) OCF2 CACCTAAAACATAACATTGAGC (r) OCF3 GCTCAATGTTATGTTTTAGGTGCAT-CGGGAGTATTAAC (r) OCF4 GGATCCGTCGCAGATTCCGTT (f) OCF10 CTAGACCGCTATTGAACGGGCTTT-G (f) GTCGACGGAGAGTGAGAGAAAGAGOCF11 -AGTC (f) OCF12 CTAGACTTATTTGACCAGAAACGT-AGTG (r) OCF13 CTTGAGTTGTGATCAT (f) OCF14 GCTGCACAGGATGAGA (f) OCF15 CTGTCTGCCAGACACT (f) OCF16 GCGACGTGGCATTGTA (f) Posición Enzimac (nucleótidos) 1.494-1.521 SmaI 37.173-37.192 36.770-36.790 33.119-33.134 33.011-33.027 33.607-33.622 33.563-33-577 34.158-34.173 34.094-34.109 34.634-34.649 34.561-34.575 2-26 SalI 1.751-1.771 SmaI BAC MNA5 (V) 35.798-35.820 36.070-36.089 36.306-36.326 35.734-35.753 36.535-36.552 y 36.711-36.717 36.898-36.902 y 37.042-37.063 40.966-40.986 BAC F7O18 BAC F7O18 pDAP101 32.615-32.636 32.440-32.460 - pDAP101 Universal Universal BAC T2E22 (III) BAC T2E22 (III) BAC MYJ24 (V) BAC MYJ24 (V) BAC MNA5 (V) BAC MNA5 (V) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) 2.717-2.736 3.797-3.817 57.425-57.444 54.754-57.775 35.043-35.062 35.633-35.654 BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) 35.396-35.412 35.065-35.080 BAC MNA5 (V) 40.004-40.022 BAC F20B18 (IV) 32.799-32.821 BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) BAC F20B18 (IV) 37.496-37.518 35.527-35.542 36.081-36.096 36.496-36.502 36.945-36.960 XbaI SalI XbaI Materiales y Métodos 67 Nombre Secuencia (5’ 3’) Clon (plásmido o BAC) Posición Enzimac (nucleótidos) GGATCCAATTCAAAGATTATAACT (r) BAC F20B18 (IV) 37.303-37.326 CTCCGCTTCTTGCACG (r) BAC F20B18 (IV) 36.789-36.803 CTTGCTTTCAGCTAAG (r) BAC F20B18 (IV) 36.331-36.348 TGAAGAGAAGACACTTC (r) BAC F20B18 (IV) 35.775-35.792 e CGGCAACAGGATTCAATC (r) pBINJIT TGTTTCACTAGTGGGCCATCG (r) pBIN-ROK 416-437 AACCAGCGTGGACCGCTTGCTG (r) pBIN-ROK 222-243 GCTCGTCCTTTCCACGACGTCCABAC T4E14 (II) 86.198-86.223 -GC (f) T4E14p50 GCGTCCATCATTCTGGTCTTCTTC-CTGTC (r) BAC T4E14 (II) 86.770-86.598 a, b c Se indica con (f) la orientación sentido y con (r) la antisentido de la secuencia de los oligonucleótidos. A d algunos cebadores se les ha añadido la diana para alguna endonucleasa de restricción. A los cebadores degenerados AD1, AD2 y AD3 no se les asigna ninguna posición (N denota cualquier base; S es G o C, e mientras que W indica A o T. Tampoco se les asigna posición a aquellos cebadores situados en los plásmidos de los que no se dispone de su secuencia. OCF17 OCF18 OCF19 OCF20 OCF21 SALKLBa1 SALKLBb1 T4E14p50 III.4.- MEDIOS DE CULTIVO, DISOLUCIONES Y TAMPONES. Para la preparación de las distintas soluciones se ha empleado en todo momento agua desionizada, obtenida con una resistividad de 15 MΩ mediante un purificador Millipore (MilliRX). Para la esterilización se ha utilizado un autoclave Presoclave 75 (Selecta) sometiendo las soluciones a una presión de 1 atmósfera y 121ºC durante 20 min. Para la esterilización de las soluciones termolábiles se empleó filtración mediante filtros Millipore de 0,45 µm, 0,22 µm y 0,025 µm. III.4.1.- Medios de cultivo III.4.1.1- Medios de cultivo en Arabidopsis thaliana. III.4.1.1.1.- Medio de cultivo líquido (Medio mínimo ATM). Los cultivos en maceta se irrigaron con medio mínimo ATM, cuya composición es la siguiente: KNO3 5mM; KH2PO4 2,5 mM; MgSO4 2 mM; Ca(NO3)2 2 mM; FeNaEDTA 51 mM; H3BO3 70 mM; MnCl2 14 mM; CuSO4 0,5 mM; ZnSO4 1 mM; NaMoO4 0,2 mM; NaCl 10 mM; CoCl2 0,01 mM (Kanz y Kirchheim, 1987). III.4.1.1.2.- Medio de cultivo sólido (Medio GM). Para la preparación de medio de cultivo sólido, se añadió agar bacteriológico europeo (Scharlau, concentración final de 0,8% m/v) al resto de los componentes. Tras su Materiales y Métodos 68 esterilización en autoclave, se dejó atemperar el medio a 55ºC, se agregaron los antibióticos en aquellos casos en los que fue necesario, y se realizó el vertido en placas de Petri. Las placas se almacenaron precintadas a 4ºC. Medio GM: NH4NO3 10,3 mM; H3BO3 50,1 mM; CaCl2 1,5 mM; CoCl2·6H2O 50 nM; Na2EDTA 55,4 µM; MgSO4 0,75 mM; MnSO4·H2O 50 µM; NaMoO4·2H2O 0,5 µM; KNO3 9,4 mM; KH2PO4 0,62 mM; ZnSO4·7H2O 15 µM; sacarosa 29,2 mM; MES [ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico] 2,3 m; pH 5,7; agar 0,8% m/v. III.4.1.2.- Medios de cultivo para microorganismos. III.4.1.2.1.- Medios de cultivo líquido. LB (Luria-Bertani): 1% NaCl (m/v), 0,5% extracto de levadura (m/v, Scharlau), 1% bacto-triptona (m/v, Scharlau), pH 7,5. Para el cultivo de Agrobacterium tumefaciens, se enriqueció el medio con glucosa (0,5% m/v). III.4.1.2.2.- Medios de cultivo sólido. Para la elaboración de medios de cultivo sólido se agregó agar bacteriológico europeo (Scharlau) a una concentración final del 1,5% (m/v). Las placas se almacenaron precintadas a 4ºC. III.4.1.2.3.- Medios de cultivo con antibióticos. En determinadas ocasiones, se añadió antibiótico (Tabla III.4) a los medios de cultivo. Ls antibióticos que se han utilizado en esta Tesis se muestran en la Tabla III.4. Tabla III.4.- Antibióticos utilizados. a Antibiótico Solvente Ampicilina Carbenicilina Kanamicina Tetraciclina Cloranfenicol Rifampicina Higromicina H2O H2O H2O H2O Etanol DMSOa H2O Dimetil Sulfóxido Concentración de la solución madre (mg/ml) 100 50 50 12,5 150 50 20 Concentración final (µg/ml) 100 50 50 12,5 150 50 20 Temperatura de almacenamiento (ºC) -20 -20 -20 -20 -20 -20 4 Materiales y Métodos 69 III.4.2.- Disoluciones y tampones. III.4.2.1.- Disoluciones de uso común. SDS 20% 20X SSC: NaCl 3 M, 0,3 M citrato sódico, pH 7,0. TE pH 8: Tris-HCl 10 mM pH 8, Na2EDTA 1 mM pH 8. III.4.2.2.- Disoluciones para el aislamiento de DNA genómico. 10X tampón de lisis: 3,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM Na2EDTA pH 8. Tampón de extracción: Tampón de lisis 1X, Na2EDTA 50 mM pH 8, urea 7 M, 2 % sarkosyl (N-dodecanoil-N-metilglicina, sal sódica). Se prepara inmediantamente antes de su uso. III.4.2.3.- Disoluciones empleadas en el aislamiento de DNA plasmídico. STE: NaCl 0,1 M, Tris-HCl 10 mM (pH 8) y Na2EDTA 1 mM (pH 8). Solución I o de resuspensión: glucosa 50 mM; Tris-HCl 25 mM, Na2EDTA 10 mM. Solución II o de lisis: Preparada en el momento de su utilización. SDS 1% (v/v); NaOH 0,2 M. Solución III o de neutralización: acetato potásico 3 M, ácido acético 11,5 % (v/v). III.4.2.4.- Disoluciones para el aislamiento de RNA. III.4.2.4.1.- Disoluciones para el aislamiento de mRNA (poliA+). Para la preparación de estas soluciones se utilizó agua tratada con dietil pirocarbonato (DEPC, Sigma-Aldrich). Tampón de lisis y unión: Tris-HCl, LiCl 0,5 M, Na2EDTA 15 mM, 1,4-ditiotreítol (DTT) 2,5 mM y sal de litio lauril sulfato (LiDS, Sigma-Aldrich) 0,1 % (m/v). pH 7,5. Tampón de lavado A: Tris-HCl 10 mM, LiCl 150 mM, Na2EDTA 1 mM y LiDS 0,1% (m/v). Tampón de lavado B: Tris-HCl 10 mM, LiCl 150 mM, Na2EDTA 1 mM, pH 7,5. Tampón de elución: Tris-HCl 10 mM pH 7,5. Tampón de reacondicionamiento de las esferas magnéticas: NaOH 100 mM. Tampón de almacenamiento de las esferas magnéticas: Tris-HCl 250 mM, Na2EDTA 20 mM, Tween-20 0,1% (v/v), azida sódica 0,02% (m/v) pH 7,5. Materiales y Métodos 70 III.4.2.4.2.- Disoluciones para el aislamiento de RNA total. Todas la soluciones utilizadas se comercializan junto con el kit utilizado de aislamiento de RNA total denominado RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc). III.4.2.5.- Disoluciones utilizadas en electroforesis. 50X TAE: Tris-HCl 2 M; ácido acético 5,71%, EDTA 50 mM, pH 8,0. 10X TBE: Tris-HCl 0,89 M, BO3H3 0,89 M, Na2EDTA 20 mM, pH 8,0. Tampón de carga para electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes: glicerol al 30% (v/v); azul de bromofenol 0,25% (m/v), xilene de cianol 0,25% (m/v), formamida desionizada 50% (v/v). Tampón de carga para electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes: glicerol al 30% (v/v); azul de bromofenol 0,25% (m/v), xilene de cianol 0,25% (m/v). III.4.2.6.- Disoluciones para el análisis Southern. HCl 250 mM. Solución de desnaturalización: NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M. Solución de neutralización: NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5. Solución de prehibridación: Na2HPO4 250 mM, SDS 7%, EDTA 1 mM, “agente bloqueante” 0,5% (m/v, Roche Diagnostics), pH 7,2. Solución de hibridación: Idéntica a la anterior junto a la sonda de DNA a una concentración 40 ng/ml. Tampón maleico: ácido maleico 150 mM; NaCl 125 mM, Tween 20 (v/v, SigmaAldrich) 0,3%, pH 8. Solución bloqueante: “agente bloqueante” 0,5% (m/v, Roche Diagnostics) en tampón maleico. Tampón para la detección quimioluminiscente y colorimétrica: Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCl2 50 mM, pH 9,5. III.4.2.7.- Disoluciones empleadas en la identificación de clones bacterianos mediante hibridación. Solución de lavado: 2X SSC, 0,1% SDS. Solución de desnaturalización: NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M. Solución de neutralización: NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5. Materiales y Métodos 71 Solución de prehibridación: Se utilizó la misma solución que la empleada en el análisis de tipo Southern. Solución de hibridación: solución de prehibridación junto a una sonda de DNA a una concentración de 20 ng/ml. Tampón maleico: idéntico al descrito en el apartado III.4.2.6. Solución bloqueante: idéntica a la descrita en III.4.2.6. Tampón de detección colorimétrica: idéntico al descrito en el apartado III.4.2.6. III.4.2.8.- Disoluciones utilizadas en la hibridación in situ de tejidos. 20X SSC. Solución para el anticuerpo y los lavados: 1X TBS, BSA 5% (m/v), Tritón X-100 0,3% (v/v). Solución de prehibridación: 6X SSC, SDS 1,5% (m/v), formamida 50% (v/v), tRNA de levadura (100 µg/ml). Solución de hibridación: Solución de prehibridación junto a una ribosonda a una concentración particular. 20X PBS: NaCl 2,75 M, KCl 50 mM, Na2HPO4 200 mM y KH2PO4 35 mM (pH 7,4). Tampón para proteinasa K (5X): Tris-HCl 0,5 M, Na2EDTA 250 mM, pH 8,0. 10X TBS: Tris-HCl 1 M, NaCl 4 M, pH 7,5. Solución bloqueante con TBS: 1X TBS y “agente bloqueante” 0,5% (m/v, Roche Diagnostics). Tampón de detección A 10X: Tris-HCl 1 M, NaCl 1M, pH 9,5. Tampón de detección B 10X: MgCl2 0,5 M. Tampón de detección: 1X tampón A + 1X tampón B. III.4.2.9.- Disolución para infiltración de plantas con Agrobacterium tumefaciens. Se resuspendieron los cultivos bacterianos en sacarosa 5% (m/v, preparada inmediatamente antes de su uso) hasta alcanzar una A600 de 0,8 y se añadió el detergente Silwet-L77 0,035% (v/v, Lehle Seeds). III.4.2.10.- Solución de esterilización de semillas de Arabidopsis thaliana. NaClO 5% (v/v, a partir de lejía comercial), Tritón X-100 0,003% (v/v). Materiales y Métodos 72 III.4.2.11.- Sustrato para cultivo de Arabidopsis thaliana en maceta. Perlita (granulometría de 1 a 3 mm; 105-125 kg/m3; Asfaltex S.A.), vermiculita (granulometría de 0 a 3 mm; 80-100 kg/m3; Asfaltex S.A.), y turba no fertilizada (turba rubia de musgo Sphagnum de estructura gruesa; Kekkilä OY, Tuusula, Finlandia) en proporción 2:2:1. La mezcla se esterilizó en el autoclave. III.5.- CONDICIONES Y MÉTODOS DE CULTIVO. III.5.1.- Condiciones y métodos de cultivo para Arabidopsis thaliana. III.5.1.1.- Cultivos en placas de Petri. Tras esterilizar las semillas (8 min en la solución de esterilización reseñada en el apartado III.3.2.11 y tres enjuagues con agua estéril), éstas se dispusieron regularmente en placas de Petri de 150 mm con medio sólido GM estéril. Las semillas se estratificaron a 4ºC durante 24 h y se trasladaron a incubadores Sanyo MLR-350H, en unas condiciones de 20±1ºC, 60-70% de humedad relativa y con iluminación continua de 7.000 lux (tubos fluorescentes Toshiba FL40SS·W/37). Después de un periodo de entre 15 y 22 días, las plantas se trasplantaron a macetas o bandejas completando su ciclo de vida en la cámara climática. III.5.1.2.- Cultivos en maceta. Se utilizaron bandejas de plástico de 28 x 50 cm con 42 alveolos de 5 x 5 cm (altura x diámetro) con un orificio en la parte inferior, o macetas cuadradas de 12 x 12 x 5 cm con pequeños orificios, dispuestas en el interior de cubetas de plástico. En los alveolos se colocaron cestillos de plástico con rejilla rellenos de la mezcla de sustrato. En las macetas cuadradas, el sustrato se dispuso directamente en su interior. Como solución nutritiva se utilizó ATM (III.4.1.1.1) mediante subirrigación. Se trasplantó a cada cestillo una sola planta procedente de las placas de Petri. En el caso de las macetas, se trasplantaron entre 25 y 40 plantas por maceta. En ocasiones, se sembraron semillas directamente sobre el sustrato sin necesidad de esterilización. En ambos casos, se taparon las cubetas con plástico transparente de uso alimentario agujereado en varios puntos con el fin de evitar la vitrificación de las plantas por un exceso de humedad. El plástico se eliminó a los 3 días tras el trasplante o bien a los 10 días tras la siembra directa en el sustrato. En el caso de la siembra en cestillo, tras eliminar el plástico se colocaron soportes y cilindros de plástico del sistema aracon (Arabidopsis condom, Beta Materiales y Métodos 73 Tech, Bélgica), que separan unos individuos de otros. En el caso de la siembra directa en maceta, las semillas se incubaron a 4ºC durante las 48 h iniciales. Las plantas se mantuvieron en la cámara climática a una temperatura de 20ºC±1ºC, 60-70% de humedad relativa y 7.000 lux de iluminación continua generada por tubos fluorescentes Philips F72T12/D/VHO 160 W 1500 SF (luz blanca fría), y bombillas incandescentes de filamento de tungsteno de 60 W (luz roja). Durante las dos primeras semanas de crecimiento en la cámara climática, se regaron las plantas con solución nutritiva ATM, y posteriormente con agua potable de la red. III.5.1.3.- Realización de cruzamientos. En la realización de cruzamientos entre distintas estirpes de Arabidopsis thaliana, inmediatamente antes del estadio de antesis, a las flores de plantas que actuaron como parental femenino se les retiraron sépalos, pétalos y estambres con ayuda de pinzas de cirugía y una lupa de 2,5 aumentos con iluminación, o bien una lupa binocular (Leica Zoom 2000). Posteriormente, se pusieron en contacto las anteras maduras del donante de polen (parental masculino) con el pistilo de la planta aceptora. Las semillas resultantes se almacenaron a 4ºC. III.5.2.- Condiciones y métodos de cultivo para Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens. Los cultivos se efectuaron a 28ºC en el caso de Agrobacterium tumefaciens, o a 37ºC para el crecimiento de Escherichia coli y se mantuvieron en agitación continua (E. coli a 225 rpm; Agrobacterium tumefaciens a 270 rpm) en un incubador con agitación orbital Sanyo MIR222-RL. Para la realización de microcultivos (de 200 µl a 1 ml de cultivo) se utilizó un agitador para tubos eppendorf con control de temperatura (Thermomixer Compact, Eppendorf, Alemania). El cultivo en presencia de antibióticos se realizó con las concentraciones reflejadas en la Tabla III.4. Para la conservación de estirpes bacterianas, a 1 ml de cultivo en medio líquido con LB (y el correspondiente antibiótico, en caso de ser necesario) se le añadieron 500 µl de glicerol al 80% (v/v) y se almacenó a –80ºC. Materiales y Métodos 74 III.6.- ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E HISTOLÓGICAS. En este apartado se describen las técnicas utilizadas en la realización de los estudios fenotípicos, tanto macro- como microscópicos, de las plantas de Arabidopsis thaliana analizadas. III.6.1.- Fotografía a bajo aumento. Para obtener imágenes a bajo aumento de los distintos rasgos fenotípicos se han utilizado las cámaras digitales Mavica FD-877 (Sony) y CoolPix 5400 (Nikon). En los exámenes preliminares de las características fenotípicas, se utilizó una lupa binocular Leica Zoom 2000. Para los análisis pormenorizados de características fenotípicas resaltables, nos servimos de las lupas binoculares Nikon SMZ 800 y Nikon SMZ 1500, provistas de una unidad de iluminación externa de luz blanca fría (Volpi Intralux 5000-1) y conectadas a una cámara digital DXM1200F (Nikon) para la captura de imágenes. III.6.2.- Microscopia óptica. III.6.2.1.- Inclusión en resina JB4. Para la inclusión en resina se ha utilizado el sistema denominado JB-4 (Polyscience), compuesto de tres elementos: A, la resina; B, un agente polimerizador y C, el catalizador. La resina es miscible en agua lo que permite el procesado completo de la muestra sin su total deshidratación. Las muestras se trataron con el fijador FAA/Tritón-X100 (ácido acético glacial 5%, formalina 1,75%, etanol 50%, Tritón-X100 1%) y se sometieron a vacío (500 mb, 45 min). Se reemplazó el fijador por otro recién preparado y se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. Para la deshidratación se eliminó el fijador y se trató con etanol 70% durante toda la noche a 4ºC. Se prosiguió el tratamiento sometiendo las muestras a series de 2 h en etanol en concentraciones crecientes (80%, 90% y 95%). Para la tinción, se añadió safranina (0,5% m/v, Sigma-Aldrich) en etanol al 95%, dejando de nuevo a 4ºC durante toda la noche. Para eliminar la sobretinción, se lavaron las muestras con etanol 95% durante 2 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se preparó la solución de la resina activa disolviendo 1,25 g del catalizador C (peróxido de benzoilo, Polyscience) en 100 ml de la solución de la resina (A), con agitación. A continuación se elaboró una mezcla 1:1 de etanol 95% y solución de resina, añadiéndola a las muestras tras eliminar el etanol 95%. Se incubó a temperatura ambiente durante 3 h, se sustituyó esta mezcla por solución de resina activa y se mantuvo de nuevo a temperatura ambiente durante 3 h. Se mezclaron 25 ml de resina activa con 1 ml de solución Materiales y Métodos 75 de polimerización (B) en un tubo falcon de 50 ml, y se añadió a los moldes (Polyscience) en los que se encontraba la muestra tras ser incubada con la resina activa. Los moldes se incubaron a 55ºC envueltos en plástico transparente de uso alimentario en un horno de hibridación, favoreciendo así la polimerización. Los moldes se pegaron en la orientación adecuada en cilindros de aluminio con un adhesivo instantáneo (Loctite, Henkel). Las secciones histológicas obtenidas en el microtomo (2050 Supercut, Reichert-Jung, Cambridge Instruments Gmbh) se tiñeron con azul de toluidina (Sigma-Aldrich) al 1% y ácido bórico al 0,6%. Para la visualización se utilizó un microscopio Nikon Eclipse E-800, realizando el montaje con una gota de Eukitt (O.Kindler GMBH & Co.). Las imágenes correspondientes se obtuvieron con una cámara digital DXM1200F (Nikon) acoplada al microscopio. III.6.2.2.- Inclusión en parafina. Tras la fijación inicial de las muestras (sometidas a vacío a 100 mb durante 10 min en etanol 50%, ácido acético glacial 5%, formaldehído 3,7%), se reemplazó la solución de fijación por otra recién preparada y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. Se deshidrataron las muestras (etanol 70% 30 min, etanol 95% 30 min) y se efectuó la tinción con Eosina Y 0,2% (m/v, Sigma-Aldrich) en etanol 95% durante 2 h a temperatura ambiente, y a continuación toda la noche a 4ºC. La aclaración o diafanización del tejido (imbibición del tejido en una sustancia miscible en parafina para facilitar su inclusión) se llevó a cabo con Histoclear (National Diagnostics) que, esencialmente, se compone de limoneno. Durante la diafanización se incubaron a temperatura ambiente las muestras en las siguientes soluciones durante 2 h: 1) Etanol 100% de gran pureza (dos incubaciones sucesivas). 2) Histoclear 25% y etanol 75%. 3) Histoclear 50% y etanol 50%. 4) Histoclear 75% y etanol 25%. 5) Histoclear 100% (dos incubaciones sucesivas). Una vez realizados estos pasos, se vaciaron a la mitad los recipientes con las muestras y se añadió parafina Paraplast-Plus (Sherwood Medical) fundida a 60ºC, dejando toda la noche a dicha temperatura. Se realizaron varios cambios de parafina para permitir su penetración en el tejido y la eliminación del Histoclear. Materiales y Métodos 76 Se confeccionaron bloques de parafina con las muestras. En una placa calefactora (Plactronic, Selecta) a 55ºC, se realizó el montaje empleando moldes metálicos con una zona cóncava (Selecta) rellena de parafina fundida, en la que se depositaron las muestras en la orientación deseada. Tras enfriarse la parafina, se desmontaron los bloques. Se efectuaron los cortes en el microtomo y se dispusieron en un baño a 42ºC. Las secciones se desparafinaron con Histoclear y se montaron añadiendo una gota de Eukitt. Se utilizó el microscopio Nikon Eclipse E-800 con iluminación de campo claro, con una cámara digital acoplada DXM1200F (Nikon) para la obtención de imágenes. III.6.3.- Microscopía electrónica de barrido (SEM). Las muestras se trataron con la solución fijadora FAA/Tritón X-100, sometiéndolas a vacío (90 min, 500 mb). Se sustituyó el fijador por otro fresco incubando a temperatura ambiente durante 1 h. Tras decantar el fijador se incubó en etanol 70% toda la noche a 4ºC. Se deshidrataron las muestras en series crecientes de etanol (80%, 90%, 95% y 100%) durante 2 h en cada una. Tras la deshidratación se realizó el punto crítico (critical point drying), consistente en la desecación completa de la muestra sustituyendo el etanol por CO2 con un aparato EM5850 (Electron Microscopy Sciences). Para la colocación de las muestras en los pedestales metálicos, se utilizó cinta de carbono adhesiva por ambas caras (Electron Microscopy Sciences). Posteriormente, las muestras se recubrieron con oro utilizando un recubridor Sputter Coater SCDOO4 (Balzers). Las muestras se observaron y fueron fotografiadas en un microscopio electrónico de barrido JEOL modelo JSM-840 conectado a un ordenador para el almacenamiento de la captura de las imágenes. III.6.4.- Microscopía electrónica de barrido de baja temperatura (LTSEM). Basado en el principio de microscopia electrónica de barrido, este método permite obtener imágenes de muestras en fresco sin necesidad de ser fijadas. Se puede aplicar en aquellas situaciones en las que la muestra presente un elevado grado de fragilidad, o en los casos en los que la fijación resulta demasiado agresiva para su estructura. Para su preparación, se adhirió el espécimen a una cinta adhesiva de cobre y se transfirió rápidamente en fresco a la precámara del microscopio, donde se congeló con nitrógeno líquido y se transfiere a una cámara donde un haz de electrones bombardea la muestra y se genera una imagen tridimensional que puede ser captada utilizando un sistema de análisis de imagen. Se utilizó un microscopio Hitachi S-9000. Materiales y Métodos 77 III.7.- AISLAMIENTO Y MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. III.7.1.- Preparaciones de DNA genómico de Arabidopsis thaliana. Hemos seguido el método de obtención de DNA genómico de Arabidopsis thaliana desarrollado por Dean et al. (1992) y modificado por Li et al. (1999). El material vegetal se congeló con nitrógeno líquido y se homogeneizó en presencia de tampón de extracción (apartado III.4.2.2). Se incubó durante 10 min a 37ºC y 225 rpm. A continuación, se añadió 1/2 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:25:1) y, de nuevo, se incubó 10 min a 37ºC y 225 rpm, tras lo cual se centrifugó durante 10 min a 13.000 rpm. A la fase acuosa se le añadió aproximadamente un volumen de isopropanol y 1/10 de volumen de NaOAc 3M. Tras precipitar unos minutos en hielo, se centrifugó la muestra durante 15 min a 13.000 rpm. El precipitado se lavó con etanol absoluto y se resuspendió en agua estéril. A continuación, se dializaron las muestras durante 15 min utilizando un filtro de nitrocelulosa (Millipore) de 0,025 µm de diámetro de poro, sobre el que se depositaron las muestras. Tras la diálisis se cuantificó el DNA en un espectrofotómetro Biophotometer (Eppendorf, Alemania), midiendo una dilución 1:50 de cada preparación. III.7.2.- Obtención de RNA Arabidopsis thaliana. Durante el desarrollo de los experimentos con RNA se han seguido las precauciones convencionales para conseguir un ambiente libre de ribonucleasas (Blumberg, 1987). III.7.2.1.- Obtención de mRNA (poliA+). Para el aislamiento del RNA poliadenilado o RNA-poliA, se utilizó el kit Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Biotech). Con este kit se lleva a cabo un aislamiento rápido a partir de una pequeña cantidad de material, sin necesidad de un aislamiento previo de RNA total u otro tipo de purificaciones. La extensión poli-A+ de muchos de los RNA mensajeros se une al oligo-(dT)25 que se encuentra adherido a la superficie de las esferas magnéticas que caracterizan a este kit. Una ventaja de este sistema es la posibilidad de poder utilizar el mRNA unido a las esferas magnéticas en reacciones de RT-PCR, sin necesidad de elución previa. Se siguieron las instrucciones del proveedor partiendo de 100 mg de material vegetal. Las extracciones se almacenaron a –80ºC. El rendimiento de ácidos nucleicos se midió como en el apartado II.7.1. Materiales y Métodos 78 III.7.2.2.- Obtención de RNA total. Para el aislamiento del RNA total, hemos utilizado el sistema RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit está basado en la capacidad selectiva de unión a RNA que presentan las membranas de las columnas de purificación. Tras la elución, se añadió a cada una de las muestras 1 µl (10 U) de DNasa (Roche Diagnostics), junto con 20 U (0,5µl) de inhibidor de Rnasas (RNasin, Roche Diagnostics) con el fin de eliminar las trazas de DNA. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 45 min. Se realizaron dos extracciones con cloroformo, centrifugando 5 min a 13.000 rpm, y se precipitó con etanol y NaOAc 3M. Tras resuspender, se cuantificó el rendimiento de las muestras de igual forma que en el apartado III.7.1. III.7.3.- Obtención de DNA plasmídico. Para la obtención de preparaciones a pequeña escala (minipreps) de DNA plasmídico de pequeño tamaño, se partió de cultivos bacterianos de 3-10 ml de medio líquido LB. Empleamos el kit Concert Rapid Plasmid Miniprep System (Gibco BRL), basado en el método clásico de la lisis alcalina, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se verificó el rendimiento de la extracción mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. El rendimiento de ácidos nucleicos se midió como en el apartado III.7.1. En los aislamientos de DNA plásmídico a mayor escala y en la obtención de BAC de estirpes de Escherichia coli, se empleó el método de lisis alcalina, realizando la precipitación con polietilénglicol y NaCl de acuerdo con Sambrook y Russell (2001). Finalmente, se resuspendió el precipitado en 100 µl de TE pH pH 7,6 o en agua y se realizó una cuantificación espectrofotométrica como en el apartado III.7.1. La integridad de los BAC se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Las preparaciones obtenidas se almacenaron a –20ºC. III.7.4.- Tratamiento de DNA con enzimas de restricción. Se procuró utilizar una relación de 1 U de enzima por cada µg de DNA a digerir, durante un tiempo que varió de 2 h a toda la noche. Las enzimas se inactivaron por incubación a 70ºC durante 15 min y se verificó el resultado de la digestión mediante electroforesis en gel de agarosa. Materiales y Métodos 79 III.7.5.- Reacciones de ligación de DNA. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen de 10 a 15 µl, en el caso de tratarse de ligaciones intermoleculares, o 250 µl para reacciones intramoleculares, usando de 1 a 2,5 U de enzima ligasa del bacteriófago T4 (Fermentas). En los ensayos de clonación de un inserto en un plásmido se utilizó un relación molar vector:inserto de entre 1:3 a 1:6. Los tubos de reacción se incubaron 3 h a temperatura ambiente o toda la noche a 16ºC. III.7.6.- Transformación bacteriana. III.7.6.1.- Transformación por choque térmico. Para la obtención de células competentes partimos de la estirpe DH5α de E. coli y se siguió el protocolo descrito en Sambrook y Russell (2001). Las cantidades de DNA empleadas para transformar oscilaron entre 1 y 10 ng. III.7.6.2.- Electroporación. Se utilizó esta técnica en aquellos casos donde se requería un elevado número de transformantes o en el caso de Agrobacterium tumefaciens, donde fue el método rutinario de transferencia. Las cepas bacterianas utilizadas con este procedimiento fueron DH10β (E. coli), y LBA4404 y C58C51 (Agrobacterium tumefaciens). Las muestras de DNA se dializaron con membranas de nitrocelulosa de 0,025 µm de diámetro de poro durante 15 min. Utilizamos un electroprador modelo Electroporator 2510 (Eppendorf, Alemania). Se utilizaron cubetas Eppendorf de 2 mm de paso con los siguientes parámetros: 2.500 V de descarga, 10 µF y 330 Ω de resistividad. III.7.7.- Técnicas electroforéticas. III.7.7.1.- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). III.7.7.1.1.- Condiciones no desnaturalizantes. Empleamos esta técnica para el análisis de moléculas de DNA de muy pequeño tamaño en geles de entre el 6 y el 8% de acrilamida (Pronadisa, acrilamida:bisacrilamida 29:1) con tampón 1X TAE. Las bandas de ácidos nucleicos se observaron mediante tinción convencional con bromuro de etidio e iluminación con luz ultravioleta (312 nm). Para la visualización se utilizó una lámpara ultravioleta acoplada a un documentador de geles GeneDOC con cámara digital (Vilmer Lourmat). Materiales y Métodos 80 III.7.7.1.2.- Condiciones desnaturalizantes. Este tipo de electroforesis se utilizó en el análisis de las reacciones de transcripción in vitro para la obtención de ribosondas. Se emplearon geles del 6% de acrilamida (acrilamida:bisacrilamida, 29:1) en presencia de 0,5X TBE y urea 8 M. Para la visualización de las bandas se procedió como en el apartado anterior. III.7.7.2.- Electroforesis en geles de agarosa. III.7.7.2.1.- Condiciones no desnaturalizantes. Se prepararon geles con agarosa de punto medio de electroendósmosis (Ecogen) y un rango de concentración comprendido entre 0,8% y 2,5% (m/v), empleando como electrolito 1X TAE. Los geles contenían bromuro de etidio (0,5 µg/ml) lo que permitió, la visualización inmediata de los ácidos nucleicos con iluminación con luz ultravioleta. III.7.8.- Recuperación de DNA a partir de geles de agarosa. Para este fin se siguió un procedimiento basado en la fusión de la agarosa, cromatografía en una matriz de sílice y posterior elución siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (GENE-CLEAN, BIO-101). Se verificó el éxito del procedimiento mediante electroforesis en gel de agarosa (apartado III.7.7.2.1). Se diluyeron las muestras (1:50) y se cuantificaron espectrofotométricamente. III.7.9.- Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). III.7.9.1.- PCR convencional. Las amplificaciones mediante PCR (Mullis et al., 1986) se llevaron acabo partiendo de una cantidad de DNA molde comprendida entre 5 ng y 40 ng, en presencia de 0,3 µM de cada uno de los oligonucleótidos y 0,8 mM de una mezcla equimolar de cada desoxirribonucleótido (dNTP; 0,2 mM de cada uno de ellos). Se añadió 1 U/µl de reacción de Taq polimerasa (EcoGen). En aquellas situaciones en las que se requería una elevada fidelidad de copia se utilizó una mezcla de polimerasas con actividad correctora de prueba (High Fidelity, Roche Diagnostics). En cada uno de los casos se siguieron las condiciones indicadas por el proveedor. Se usaron tubos eppendorf de pared fina (0,2 ml y 0,5 ml). Los perfiles de reacción se programaron en termocicladores Eppendorf Mastercycler y Eppendorf Mastercycler Personal. Materiales y Métodos 81 Las muestras se sometieron a 2 min de desnaturalización inicial a 93-95ºC, 20-35 ciclos de 20-45 s de desnaturalización a 93-95ºC, 20-30 s de apareamiento a 45-70ºC y un periodo de extensión a 72ºC de 20 s a varios minutos. La temperatura de hibridación (Tm, melting temperature o annealing temperature) utilizada fue siempre 5-10ºC inferior a la resultante de aplicar la siguiente fórmula con cada oligonucleótido empleado: Tm = 69,3 + 0,41·[%(G + C) del cebador] – (650/L) L= longitud del cebador en pb En aquellos casos en los que se añadió una diana para endonucleasa de restricción en el extremo 5’ del cebador, la secuencia correspondiente no computó en el cálculo de la Tm. Las reacciones se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida no desnaturalizantes. III.7.9.2.- PCR de asimetría térmica entrelazada o TAIL-PCR. La TAIL-PCR (Thermal Asymetric Interlaced PCR) permite la obtención de secuencias desconocidas adyacentes a una región de secuencia conocida. Por este motivo constituye una metodología de gran utilidad en la caracterización de las secuencias genómicas que flanquean al T-DNA (Liu et al., 1995; Singer et al., 2003). Consiste en la utilización de tres oligonucleótidos imbricados consecutivos de secuencia conocida (oligonucleótidos específicos, OE) y correspondientes a la secuencia conocida (el T-DNA en nuestro caso), con temperaturas de hibridación decrecientes desde el situado más en 5’ al situado más hacia 3’ (el primer oligonucleótido tiene mayor temperatura de hibridación que el segundo y éste que el tercero). Estos cebadores se enfrentan de manera secuencial a un oligonucleótido de pequeño tamaño y arbitrariamente degenerado (AD) en tres series consecutivas de reacciones de PCR con ciclos complejos (ver Tabla III.5), estando la eficacia de amplificación de los productos, tanto específicos como no específicos, controlada por la temperatura (Liu et al., 1995). En el proceso, el primero de los oligonucleótidos específicos (OE) se enfrenta a tres cebadores degenerados (AD1, AD2 y AD3) en distintas reacciones en paralelo de 20 µl. Se tomó 1 µl de una dilución 1:50 (v/v) de las primeras reacciones como molde en la siguiente tanda de reacciones (20 µl). Los mismos oligonucleótidos degenerados se enfrentaron al segundo OE. Materiales y Métodos 82 Estas nuevas reacciones de PCR se diluyeron de igual modo y constituyeron los moldes para la tercera ronda de amplificación entre el tercero de los OE y los oligonucleótidos degenerados inespecíficos. En esta última amplificación el volumen de reacción fue de 100 µl. Tanto las primeras como las segundas rondas de amplificación se realizaron bajo unas condiciones de reacción muy restrictivas, siendo en la tercera fase donde se reduce el rigor de las mismas (ver Tabla III.5). En cada una de las rondas de amplificación se utilizaron concentraciones de cebadores diferentes. Tabla III.5.- Características y perfiles de las reacciones de TAIL-PCR. Reacción primaria Reacción secundaria Reacción terciaria Condiciones de cebadores AD1= 1,5 µM AD2 y AD3= 2 µM OE-1a= 0,2 µM Condiciones de cebadores AD1= 1,5 µM AD2 y AD3= 1,5 µM OE-2= 0,2 µM Condiciones de cebadores AD1= 1,5 µM AD2 y AD3= 1,5 µM OE-3= 0,2 µM Perfil Perfil 1º) 93ºC ------ 1 min 1º) 94ºC ------ 10 s 2º) 95ºC ------ 1 min 2º) 64ºC ------ 1 min 3º) 94ºC ------ 30 s 3º) 72ºC ------ 2 min 30 s 4º) 62ºC ------ 1 min 4º) 94ºC ------ 10 s 5º) 72ºC ------ 2 min 30 s 5º) 64ºC ------ 1 min 6º) 94ºC ------ 30 s 6º) 72ºC ------ 2 min 30 s 5 ciclos del paso 5º) al 3º). 7º) 94ºC ------ 10 s 8º) 44ºC ------ 1 min 7º) 25ºC ------ 3 min 9º) 72ºC ------ 2 min 30 s. Se incrementa de forma 12 ciclos desde el paso 9º paulatina la temperatura al 1º. desde 25ºC hasta 72ºC en un intervalo 10º) 72ºC ------ 7 min de 3 min (15ºC/min). 11º) 4ºC ------ ∞ 8º) 72ºC ------ 2 min 30 s 9º) 94ºC ------ 10 s 10º) 68ºC ------ 1 min 11º) 72ºC ------ 2 min 30 s 12º) 94ºC ------ 10 s 13º) 68ºC ------ 1 min 14º) 72ºC ------ 2 min 30 s 15º) 94ºC ------ 10 s 16º) 44ºC ------ 1 min 17º) 72ºC ------ 2 min 30 s Se repite 15 veces desde el paso 17º al 10º. 18º) 72ºC ------ 7 min 19º) 4ºC ------ ∞ a Cebador específico de cada reacción. Perfil 1º) 94ºC ------ 2 min 2º) 94ºC ------ 15 s 3º) 44ºC ------ 1 min 4º) 72ºC ------ 2 min 30 s 25 ciclos desde el paso 4º al 2º. 5º) 72ºC ------ 7 min 6º) 4ºC ------ ∞ Materiales y Métodos 83 El resto de los componentes de la reacción se mantuvieron en las mismas condiciones establecidas en el apartado III.7.9.1. Se examinó 1/10 de cada una de las reacciones mediante electroforesis en gel de agarosa. III.7.9.3.- PCR inversa (IPCR). La técnica de PCR inversa también permite el aislamiento de secuencias desconocidas adyacentes a una región ya caracterizada (Ochman et al., 1988; Triglia et al. 1988; Hartl et al., 1996). Se digiere completamente una muestra de DNA con una sola endonucleasa de restricción. El conjunto de moléculas resultante es sometido a una ligación intramolecular para su circularización, utilizándose una alícuota de esta ligación como molde en una reacción de PCR que utiliza dos cebadores adyacentes y divergentes en el territorio de secuencia conocida. En nuestro laboratorio, la técnica de IPCR ha sido empleada en el estudio de las secuencias adyacentes a los bordes derecho (RB) e izquierdo (LB) de las inserciones de TDNA pGKB5 (ver Figura III.2). Se realizaron los siguientes pasos: 1) Digestión en un volumen de reacción de 50 µl utilizando, en este caso, 2 µg de DNA genómico y 30 unidades de la restrictasa correspondiente (EcoRI, NdeI, HindIII, ApaI, BglII y SalI, Roche-Diagnostics), y comprobación mediante electroforesis en geles de agarosa. 2) Ligación de los productos de restricción durante toda la noche a 16ºC, utilizando 10 unidades de la ligasa del fago T4 (Fermentas) y 25 µl de cada restricción en un volumen final de reacción de 250 µl. 3) Extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y precipitación con etanol absoluto en presencia de acetato sódico 0,3 M para, finalmente, resuspender en 10 µl de agua destilada o TE. 4) Reacción de PCR en un volumen final de reacción de 50 µl utilizando como molde 1 µl de la resuspensión anterior. 5) Electroforesis en gel de agarosa y extracción de las bandas para su secuenciación. III.7.9.4.- Retrotranscripción y PCR (RT-PCR). La primera hebra de cDNA se obtuvo partiendo de 1 µg de RNA poliadenilado (apartado III.7.2.1) o 5 µg de RNA total (apartado III.7.2.2), 40 U mA260 de oligo(dT)15 como cebador (Roche Diagnostics) y 1 mM de cada uno de los dNTPs. La mezcla de reacción se Materiales y Métodos 84 incubó durante 5 min a 70ºC y, posteriormente, se añadieron 40 U de retrotranscriptasa (MMuLV, Roche Diagnostics) y 30 U de inhibidor de RNasa (Roche Diagnostics), incubándose a 37ºC durante 1 h. El volumen empleado en cada reacción fue de 20 µl. En la siguiente etapa se utilizaron 5 µl de la retrotranscripción como molde en reacciones de PCR de 25 µl. Se comprobó el resultado mediante el examen de 2,5 µl de la reacción por electroforesis en gel de agarosa. III.7.10.- Secuenciación de DNA. Las reacciones de secuenciación se efectuaron en un termociclador Eppendorf MasterCycler aplicando las condiciones propuestas en el kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction (Perkin Elmer). Las electroforesis de los productos de reacción se realizaron en un secuenciador automático ABI PRISM 377 (Perkin Elmer). III.7.11.- Análisis y tratamiento informático de las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas. El análisis de las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas se realizó, de forma interactiva a través de Internet, en los distintos bancos de datos internacionales utilizando los programas BLAST (Altschul et al., 1997; Tatusova y Madden, 1999) de las siguientes direcciones http://www.ebi,ac.uk/blast2/index.html (EBI, European Bioinformatic Institute del European Molecular Biology Laboratory, http://www.arabidopsis.org/wublast/index2.jsp EMBL; (TAIR, The Rodríguez-Tome, Arabidopis 2001), Resource) y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ (NCBI, National Center for Biotechnology Information, Benson et al., 2002). También se usó el programa FASTA (Pearson, 1994) a través de la dirección http://www.ebi.ac.uk/fasta/index.html (EBI). Para los alineamientos de secuencia se utilizó el programa CLUSTAL-W (Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996) a través del servidor del EMBL. Para el alineaminto de secuencias de aminoácidos se usó el programa CLUSTAL X 1.5b (Thompson et al., 1997). El análisis de posibles dominios o secuencias específicas, así como la búsqueda de determinadas familias proteicas se realizó a través de la dirección http://au.expasy.org/prosite/ donde se encuentra alojada la base de datos PROSITE (Bairoch, 1991; Hulo et al., 2004). Materiales y Métodos 85 III.8.- TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN MOLECULAR DE ÁCIDOS NUCLEICOS. III.8.1.- Transferencia de DNA a membranas para análisis por hibridación Southern. III.8.1.1.- Obtención de la sonda marcada. En todos los casos se utilizaron sondas de DNA generadas por PCR. Como molécula trazadora se utilizó digoxigenina en forma de digoxigenina-11-dUTP presente en la mezcla de didesoxi-nucleótidos trifosfato (7 TTP : 1 DIG 11-UTP). Una vez comprobada la reacción, se precipitó en presencia de etanol y cloruro de litio 0,4 M. Se centrifugó y se resuspendió la muestra en el volumen deseado. III.8.1.2.- Transferencia e inmovilización del DNA. Tras la separación electroforética del DNA en gel de agarosa, se fotografió éste tomando las referencias pertinentes. Se depurinó el DNA con HCl (250mM) durante 15 min. Seguidamente, se realizaron dos lavados consecutivos con la solución de desnaturalización (apartado III.3.2.6), se enjuagó el gel con agua bidestilada estéril y se efectuaron dos lavados consecutivos con la solución de neutralización. Tras lavar con agua, se procedió a transferir el DNA a una membrana de nailon (Hybond-N, Amersham Biosciences) en presencia del tampón de transferencia 20X SSC durante, como mínimo, 12 h. La membrana se enjuagó con una solución 2X SSC, se dejó secar a temperatura ambiente, y se irradió con luz UV (crosslinker, UniEquip Research, 120mJ/cm2). III.8.1.3.- Tratamientos de prehibridación, hibridación con la sonda y lavado de la membrana. La prehibridación tuvo lugar con la membrana sumergida en solución de prehibridación (apartado III.3.2.6) durante 2 h a 65ºC. Se sustituyó la solución de prehibridación por otro volumen de la misma conteniendo la sonda (previamente desnaturalizada por calentamiento a 90ºC durante 10 min). La concentración de sonda fue de 40 ng/ml. La hibridación tuvo lugar durante un mínimo de 12 h a 65ºC. Tras la hibridación, para eliminar el exceso de sonda, la membrana se lavó dos veces con 2X SSC y 0,1% SDS a temperatura ambiente seguidos de otros dos con una solución 0,1X SSC y 0,1% SDS a 65ºC. III.8.1.4.- Detección quimioluminiscente. Empleamos un anticuerpo contra la digoxigenina conjugado a una fosfatasa alcalina (anti-DIG, Roche Diagnostics). Ésta desfosforila al sustrato CSPD, nombre comercial del 3- Materiales y Métodos 86 (4-metoxiespiro{1, 2-dioxietano-3, 2’-(5’-cloro)triciclo[3.3.1.13.7] decan}-4-il) fenil fosfato disódico. La desfosforilación genera un compuesto inestable que se descompone emitiendo luz (λ 466 nm) que puede detectarse con una película fotográfica. Para la detección se siguieron los pasos que a continuación se detallan: 1) Equilibrado de la membrana con tampón maleico (III.4.2.6) durante 5 min. 2) Tratamiento de la membrana con la solución bloqueante (III.4.2.6) durante 1 h. 3) Incubación de la membrana con una dilución 1:5000 (150 mU/ml) del anticuerpo en tampón maleico durante 45 min. 4) Tres lavados de 20 min con tampón maleico para eliminar el exceso de anticuerpo. 5) Equilibrado de la membrana con la solución para detección quimioluminiscente (III.4.2.6) durante 5 min, e incubación con esta misma solución y el sustrato (dilución 1:200 v/v) durante 10 min a 37ºC. 6) Exposición con la película fotográfica (Hyperfilm MP, Amersham Biosciences) durante al menos 1 h. Para el revelado y fijado de la película se utilizó una dilución 1:50 del revelador RODINOL (AGFA) y 1:8 del fijador AGFA-FIX (AGFA). III.8.2.- Identificación de clones bacterianos mediante hibridación en colonia. Debido a la semejanza del procedimiento con el desarrollado en la técnica de Southern, sólo se describen en detalle los apartados en los que difieren. III.8.2.1.-Obtención de sonda. Se procedió del mismo modo que se detalla en el apartado III.8.1.1. III.8.2.2.- Transferencia del DNA a una membrana de nailon. Las colonias a estudiar se replicaron de forma uniforme en placas de Petri de 90 mm, utilizando una plantilla patrón a fin de colocar al menos 60 clones por placa, y se dejaron crecer durante 12 h. Tras poner en contacto la superficie de la placa con una membrana de nailon, ésta quedó impregnada con las colonías. Las membranas se incubaron 5 min sobre varias capas de papel GB002 saturadas en solución de desnaturalización (III.4.2.7) durante 5 min, a continuación en varias capas saturadas en solución de neutralización otros 5 min y, por último, en capas de papel saturadas en 20X SSC 5 min. A continuación se inmovilizó el DNA (III.8.1.2.) y se eliminaron los residuos bacterianos incubando la membrana en una solución 2X SSC y 0,1% de SDS a temperatura ambiente. Materiales y Métodos 87 III.8.2.3.- Tratamiento de la membrana e hibridación: Se siguieron los mismos pasos que se describen en el apartado III.8.1.3., salvo que en este caso el tiempo de hibridación osciló entre 6 y 8 h. III.8.2.4.- Lavado de membrana. De forma idéntica a la descrita en III.8.1.4. III.8.2.5.- Detección colorimétrica de la señal. La fosfatasa alcalina, conjugada al anticuerpo anti-DIG, es capaz de desfosforilar al compuesto 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato de toluidino, que se comercializa con el nombre de BCIP (Roche Diagnostics) y que, en presencia de NBT (cloruro de azul nitro-tetrazoilo, Roche Diagnostics), da lugar a la formación de un precipitado visualizable de color ocre. Se procedió como en el apartado III.8.1.5 pero sustituyendo el sustrato en la solución de detección por 0,375 ng/ml de NBT y 0,19 ng/ml de BCIP. Se incubó en oscuridad, durante al menos 1 h, y se comprobó la aparición de manchas de color ocre que indicaron la posición de los clones positivos. III.8.3.- RT-PCR semicuantitativa (SQRT-PCR). La RT-PCR semicuantitativa o SQRT-PCR (Semiquantitative RT-PCR) permite tener una estima grosso modo de los niveles de expresión de un determinado transcrito en momentos previos al efecto meseta (plateau) que se produce durante una reacción de PCR. En este punto existe teóricamente una relación lineal entre la cantidad de RNA (input) y el producto final de amplificación por PCR. Resulta una técnica sustitutiva de la hibridación northern (Kolls et al., 1993) en ciertos aspectos. Como molde de la reacción de retrotranscripción para la obtención de la hebra de cDNA se utilizaron 5 µg de RNA total (apartado III.7.2.1). Se emplearon las condiciones descritas en el apartado III.7.9.4 con la salvedad de que sólo se realizaron 20 ciclos de amplificación por PCR. Se sometió a electroforesis 1 µl de una dilución 1/250 de cada una de las reacciones de PCR. Tras la separación en agarosa se transfirieron los ácidos nucleicos a una membrana de nailon tal y como se describe en el apartado III.8.1.2. Se siguieron las pautas descritas en III.8.4 para prehibridación, hibridación y lavados de la membrana. La sonda utilizada se generó mediante PCR y se marcó con digoxigenina (III.8.1.1). Se efectuó detección quimioluminiscente como en el aparatado III.8.1.4. Materiales y Métodos 88 III.8.4.- Análisis de la expresión mediante hibridación in situ en tejidos vegetales. III.8.4.1.- Obtención y marcaje con digoxigenina de la sonda de RNA. El plásmido pGEM-T posee los promotores para las polimerasas de RNA de los bacteriófagos SP6 y T7, por lo que se usó como molde de transcripción in vitro tras clonar en él el inserto deseado. Se linearizó el plásmido recombinante (5 µg) con la enzima apropiada, se precipitó con acetato sódico 3,2 M pH 5,2 y etanol, y se resuspendió en agua. Se usaron 2 µg de plásmido cortado como molde para una reacción de 20 µl en presencia de digoxigenina-11-dUTP de la mezcla DIG-RNA labelling mix (Roche Diagnostics), 1 µl (40 U) de inhibidor de RNasas, 2 µl de la polimerasa de RNA (T7 o SP6 10U/µl, Roche Diagnostics) y 2 µl del tampón 10X de la enzima correspondiente (Roche Diagnostics). La reacción tuvo lugar a 37ºC durante 90 min. Paralelamente, se realizaron reacciones control en las mismas condiciones pero sin digoxigenina. Ambos tipos de reacción se verificaron mediante electroforesis. Tras la incubación se añadió 1 µl de DNasaI libre de RNasas (10 U/µl, Roche Diagnostics) a la mezcla de reacción y se mantuvo 15 min a 37ºC. Se analizó una alícuota mediante electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE, 6%, III.8.7.1.2). Se precipitó la sonda con tRNA de levadura (1 µg/µl, Roche Diagnostics); acetato amómico 0,6 M y 220 µl de etanol absoluto, y se almacenó a –20ºC hasta el momento de cuantificar el rendimiento del marcaje de la sonda. III.8.4.2.- Cuantificación de la sonda. Se centrifugó la sonda a 4ºC y 13.000 rpm durante 15 min, se eliminó el sobrenadante, se lavó el precipitado con etanol 70%, se dejó secar al aire y se resuspendió en 10 µl de agua tratada con DEPC. Con 1 µl de esta disolución se prepararon las diluciones empleadas en la cuantificación (1/20, 1/250, 1/1000 y 1/2500). Determinamos empíricamente la concentración de sonda a utilizar en cada caso. De cada una de las diluciones anteriores se aplicó 1 µl a una membrana de nailon (dot blot) que, tras secarse, se irradió con luz UV. El revelado de esta membrana se realizó junto con una tira control con distintas concentraciones de RNA marcado con digoxigenina (RNA scripts Test, Roche Diagnostics). Se mojaron las tiras en 1X TBS durante 2 min y 10 min en solución bloqueante con 1X TBS (apartado III.4.2.9). Materiales y Métodos 89 Tira control * Figura III.4.- Cuantificación simultánea de distintas ribosondas. En la parte superior aparece una tira control que contiene cantidades estandarizadas de RNA marcado con digoxigenina que nos sirven para determinar la concentración de la sonda a utilizar. La concentración de sonda cuya mancha se aproxime al penúltimo punto de la tira (asterisco rojo) es, en principio, la más adecuada. III.8.4.3.- Obtención y procesamiento histológico de las muestras. Se fijaron inflorescencias, con el fin de poder estudiar la expresión en distintos estadios del desarrollo de la flor y del pistilo, así como frutos en diferentes etapas tras la fertilización. Los procedimientos histológicos se detallan en el apartado III.5.2.2., salvo que, en lugar de portaobjetos convencionales en esta ocasión se emplearon portaobjetos ProbeOn-Plus (Fisher), tratados en origen de forma que el tejido queda fuertemente adherido. Los moldes de parafina con las muestras, se almacenaron a 4ºC hasta su utilización. III.8.4.4.- Prehibridación e hibridación de la sonda. En esta etapa tiene lugar el acceso de la ribosonda al interior celular mediante la desparafinización de las muestras, hidratación y permeabilización parcial de la membrana y la pared celular. Se desparafinó el tejido con dos tratamientos sucesivos con Histoclear (10 min cada uno). Se rehidrataron los tejidos con series decrecientes de etanol de 2 min cada una: dos veces en etanol absoluto, una vez en etanol 95%, 70%, 50%, 30%, y dos en agua. En este punto se realizó la hidrólisis ácida del tejido con HCl 0,2 N durante 20 min a temperatura ambiente. Se prosiguió con un lavado de 5 min con agua, 5 min en 2X SSC y nuevamente 5 min con agua. A continuación, se incubaron los portaobjetos con el tejido en presencia de proteinasa K (1µg/µl) durante 15 min a 37ºC. Se lavaron durante 2 min con 1X PBS y se bloqueó la acción de la proteinasa K incubando 2 min en 1X PBS con glicina (0,2% m/v). Tras dos lavados con 1X PBS de 2 min cada uno, se refijó el tejido con una solución de 1X PBS y formaldehído (3,7% v/v) a temperatura ambiente durante 10 min, seguido de dos Materiales y Métodos 90 pasos de 5 min con 1X PBS. Se prosiguió con la deshidratación del tejido en series crecientes de etanol de 2 min cada paso hasta llegar al etanol absoluto. Tras secar un poco los portas, se sometieron a vacío durante 20 min a una presión de 100 mb. Para la hibridación, se precalentaron los portas con el tejido en una placa calefactora (Selecta) a 45ºC durante unos minutos. Mientras tanto, se prepararon las diluciones de la sonda en tampón de hibridación, desnaturalizando a 80ºC. Se aplicaron 300 µl de la solución de hibridación a cada porta con su muestra correspondiente, disponiéndose éstos enfrentados dos a dos. Gracias al sistema Probe-On-Plus, entre los tejidos de ambos portas se genera un espacio donde discurre la solución de hibridación en contacto con el tejido. Los portas apareados se guardaron en una cámara húmeda toda la noche a 52ºC. III.8.4.5.- Lavados e inmunodetección colorimétrica de la señal. Tras realizar dos lavados de 90 min en una solución 2X SSC y formamida (50% v/v), se desarrolló la inmunodetección. Los portas se incubaron en 1X TBS durante 5 min, 1 h con solución bloqueante con 1X TBS, 30 min en 1X TBS, Tritón X-100 (0,3% v/v) y BSA (1% m/v). A continuación, se incubaron 90 min con el anticuerpo anti-DIG (dilución 1:3.000) en esta última solución. Se realizaron tres lavados de 20 min cada uno con la misma solución sin anticuerpo con el fin de eliminar su exceso. Para alcalinizar el medio incubamos con el tampón de detección sin sustratos durante 5-10 min (III.3.2.6.). Esta solución se reemplazó por el tampón de detección con los sustratos. Por cada 100 ml de solución de detección se añadieron 150 µl de NBT (III.8.2.5., 100 mg/ml) y otros 150 µl de BCIP (III.8.2.5., 50 mg/ml). Se incubó en oscuridad durante un periodo que osciló entre 12 y 18h. La reacción se detuvo reemplazando la solución de detección por agua. En el montaje de los portas se deshidrató el tejido en series de etanol crecientes de forma rápida (2 min cada una), tras lo cuál se añadió una gota de Eukitt al portaobjetos y se dispuso el cubreobjetos. Las muestras se visualizaron utilizando un microscopio Eclipse E800 de Nikon con cámara digital ColorViewII (Nikon) conectada a un ordenador con el sistema de análisis de imágenes AnalySiS (Nikon). III.9.- TRANSFORMACIÓN DE Arabidopsis thaliana. Hemos transformado plantas con estirpes de Agrobacterium tumefaciens portadoras de T-DNA modificados como vehículo de introducción de construcciones exógenas. Materiales y Métodos 91 III.9.1.- Transformación con clones de sobreexpresión. El cDNA completo del gen At4g26000 de Arabidopsis thaliana se obtuvo a partir de la colección de clones de cDNA de Arabidopsis thaliana generada en el Instituto RIKEN Biosource Center (Experimental Plant División, Tsukuba, Japón), y se clonó en el plásmido pBINJIT portador de dos copias en tándem del promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor (35SCaMV) en la orientación adecuada para su expresión. Esta construcción se introdujo en la estirpe C58C1 de Agrobacterium tumefaciens mediante electroporación (III.7.6.2). III.9.2.- Transformación con clones genómicos. Mediante PCR con la mezcla de polimerasas High Fidelity (Roche Diagnostics), se obtuvo el fragmento genómico correspondiente al gen At4g26000, que incluye su secuencia estructural y diversas regiones reguladoras adyacentes. Tras verificar su secuencia, el fragmento se clonó en el plásmido pGEM, y de ahí en el plásmido vector pGreenII0179. Éste se introdujo mediante electroporación en la estirpe LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens, portadora del plásmido auxiliar pSOUP. III.9.3.- Infiltración con Agrobacterium tumefaciens. El presente protocolo está basado en el de Clough y Bent (1998) que es, a su vez, una modificación simplificada del desarrollado por Bechtold (1993). Este procedimiento no requiere la utilización de hormonas ni de vacío para llevar a cabo la infiltración. A una bolsa de sustrato esterilizada se le añadió medio ATM hasta humedecerla completamente. El sustrato se dispuso en macetas cuadradas de 12 x 12 x 12 cm (largo x ancho x alto) y se envolvieron por completo con plástico transparente de uso alimentario, al que se le practicaron de 25 a 30 agujeros, donde se trasladaron plántulas de 15 días cultivadas en placas de Petri. Se cultivaron las plantas hasta que se desarrollaron las inflorescencias y aparecieron las primeras flores en antesis y algún fruto en desarrollo, los cuales se eliminaron previamente a la infiltración. Se prepararon cultivos de Agrobacterium tumefaciens de 10 ml con masilla bacteriana del clon de interés, cultivado recientemente en placa de Petri, y se incubó a 28ºC y 270 rpm durante 24-48 h. Se tomó un 1 ml de este cultivo y se inocularon 500 ml de LB enriquecido con glucosa al 0,5% (m/v). Se incubó a 270 rpm y 28ºC hasta llegar a una A600 de entre 0,8 y 1,2. En este momento se centrífugo el cultivo a 7.500 rpm durante 15 min a 4ºC. El precipitado resultante se resuspendió en solución de infiltración (III.4.2.9) hasta Materiales y Métodos 92 obtener una A600 de 0,8. A continuación, se añadió Silwet L-77 (Lehle Seeds). Esta solución se dispuso en bandejas de 15 x 20 x 5 cm (largo x ancho x alto) sumergiendo (floral dipping) y agitando las inflorescencias de las plantas unos segundos. Las plantas infiltradas se trasladaron a la cámara climática hasta completar su ciclo y recoger las semillas. III.9.4.- Selección de transformantes. Con el fin de identificar los individuos transformantes, las semillas resultantes de la plantas infiltradas se sembraron de forma masiva en placas de Petri (1.000-1.500 semillas por placa) con medio de cultivo GM (III.4.1.1.2) en presencia del antibiótico al cual el T-DNA confiriera resistencia. III.10.- CARTOGRAFÍA GÉNICA MEDIANTE ANÁLISIS DE LIGAMIENTO A MARCADORES SSLP. Se obtuvo una población cartográfica a partir de la progenie F2 procedente del cruzamiento entre la planta portadora de la mutación estudiada y un acceso silvestre polimórfico respecto al fondo genético donde se hallara la mutación. Se obtuvieron muestras de DNA genómico de los individuos F2 mutantes (III.6.1). Se han empleado marcadores moleculares polimórficos de tipo SSLP (Simple Sequence Lenght Polymorphisms) diseñados sobre el genoma de Arabidopsis thaliana. Tras la amplificación mediante PCR, los productos se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Utilizamos los SSLP CIW7 (oligonucleótidos CIW7-f y CIW7-r, Tabla III.3) y MNA5 (oligonucleótidos MNA5-1 y MNA5-2, Tabla III.3) correspondientes a los cromosomas IV y V, respectivamente. El marcador CIW7 se localiza en la posición de 81,9 cM del cromosoma IV. A partir de DNA genómico de Col-0 el producto de amplificación mediante PCR es de 130 pb. En el caso de Ws-2, de 150, y en el de Ler de 123 pb. El SSLP MNA5 (Dr. J. L. Micol) genera un producto de amplificación en Ws-2 de 148 pb y de 165 pb en el caso de Ler. Este SSLP recibe el nombre del BAC donde se localiza. III.11.- GENOTIPADO MOLECULAR DE ESTIRPES DE Arabidopsis thaliana. III.11.1.- Genotipado molecular de los alelos pep1. Como consecuencia de las inserciones de T-DNA de cada uno de los alelos de pep1, se generaron polimorfismos moleculares de tipo SSLP. En el caso de los alelos pep1-2, Materiales y Métodos 93 pep1-3 y pep1-4 se diseñaron dos cebadores que flanquean el punto de inserción, y otro situado en el borde izquierdo de cada T-DNA. De esta manera, en los individuos heterocigóticos se amplifican dos bandas (Tabla III.6). El mutante pep1-1 es portador de una reorganización cromosómica. En este caso, utilizamos dos oligonucleótidos que amplifican el gen de resistencia a la kanamicina (nptII) del T-DNA, y dos oligonucleótidos pertenecientes a la secuencia genómica perturbada por la reorganización cromosómica, de forma que estos últimos sólo rinden producto de amplificación sobre un cromosoma silvestre (Tabla III.6.). Tabla III.6.- Genotipado molecular de los alelos pep1. Alelo Cebadores genómicos Tamaño de los producto de amplificación en pb (silvestre/mutante) 939/1.100 pep1-1 FUP1-1; FUP1-2 Cebador en el T-DNA AT15; AT16 pep1-2 OCF12; OCF16 LBTM1 573/498 pep1-3 OCF12; OCF16 LBTM1 573/495 pep1-4 FUP1-4; FUP1-6 SALKLBb1 598/398 pep1-5 FUP1-34; FUP1-35 SALKLBb1 257/381 III.11.2.- Genotipado molecular de otras estirpes mutantes utilizadas. Hemos utilizado los marcadores polimórficos moleculares de tipo CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) generados en el laboratorio de la Dra. Xuemei Chen, para la identificación de los alelos mutantes hua1-1, hua2-1 y hen2-1 (Tabla III.7). Para la identificación de los alelos de clv3 nos hemos servido del CAPS ERA estrechamente ligado a la mutación (Tabla III.7). Tabla III.7.- Genotipado molecular de estirpes mutantes. MBK21p28; MBK21p31 Tipo de marcador CAPS Producto de PCRa 1.150 hua2-1 MKD15p31; MKD15p7-2 CAPS hen2-1 T4E14p50; T4E14p51 clv3 flk Enzima Silvestre/Mutanteb HphI 500+300+350/800+350 330 PstI 275+55/330 CAPS 400 AciI 200+200/400 ERA1; ERA2 CAPS 500 DdeI 500/360+140 K3-1; K3-2; SALKLBb1 SSLP - - 235/478 Alelo Cebadores hua1-1 a, b Tamaño en pb del fragmento o fragmentos. Materiales y Métodos 94 En el caso de la identificación del alelo flk-3, generamos un marcador de tipo SSLP en nuestro laboratorio (Tabla III.7). III.12.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE χ2. El valor de χ2 se obtuvo tras contrastar los datos obtenidos en las segregaciones con las hipótesis de partida. No se rechazaron las hipótesis cuyo valor de χ2 fue inferior al existente con un grado de significación del 95%. En la Tabla III.8 se muestran los valores del estadístico para distintos grados de libertad, correspondiendo éstos a las clases fenotípicas menos uno. Tabla III.8.- Valores del estadístico χ2 con distintos grados de libertad (GL). χ20,95 Grados de Libertad 1 2 3 3,84 5,99 7,82 IV.- RESULTADOS Resultados 96 IV.- RESULTADOS IV.1.- ESCRUTINIO Y AISLAMIENTO DE MUTANTES DE Arabidopsis thaliana AFECTADOS EN LA MORFOLOGÍA DEL FRUTO. IV.1.1.- Escrutinio de una colección de inserciones de T-DNA. Los hechos de inserción de T-DNA pueden afectar a funciones génicas concretas, derivando ocasionalmente en fenotipos alterados que, comúnmente, se transmiten de manera recesiva. Existen diversos métodos moleculares que permiten, dado que conocemos la secuencia del T-DNA, clonar con relativa facilidad las regiones genómicas adyacentes. Esto permitiría una rápida identificación del gen perturbado por la inserción, hipotéticamente responsable del fenotipo, sin necesidad de un prolongado esfuerzo de clonación posicional. En el momento de iniciar este trabajo, tal era el planteamiento experimental en nuestro grupo, así como en muchos otros laboratorios. Siguiendo este criterio, y como paso inicial en nuestro estudio acerca de la morfogénesis del fruto, decidimos llevar a cabo un escrutinio de mutantes de T-DNA de Arabidopsis thaliana. Utilizamos una colección española (Dr. J. Paz Ares, C.N.B., Madrid) de reciente creación en el momento en que se planteó este trabajo. Durante el escrutinio se adoptaron como criterios de búsqueda la presencia de frutos de morfología anormal, de tamaño reducido, o bien plantas sin frutos. Se examinaron plantas T3 derivadas de semillas sembradas directamente en bandejas de plástico con sustrato (III.5.1.2). Previamente a la siembra, se calculó el porcentaje de germinación en placa de Petri con el fin de someter a escrutinio un mínimo de 1.000 semillas de cada grupo parental. Esto supone el escrutinio de 20 semillas, como promedio, por cada transformante independiente, lo que se traduce en una elevada probabilidad de obtener en homocigosis cualquier alelo recesivo. Analizamos más de 27.000 plantas T3 de un total de 27 grupos parentales cada uno de ellos proveniente de la descendencia de 50 plantas T2 independientes. Eliminamos aquellas plantas que no mostraban rasgos diferentes a los de su ancestro silvestre Ws-2. Se desecharon aquellos individuos cuyo fenotipo, una acusada reducción en el tamaño del fruto, era consecuencia de problemas de androesterilidad. En estos casos, la polinización de los pistilos mutantes con polen silvestre restablece el crecimiento del fruto Resultados 97 hasta su tamaño normal, lo que permite descartar una alteración intrínseca al desarrollo del pistilo o del fruto como causa del fenotipo. Durante esta búsqueda se aislaron una serie de mutantes presumiblemente afectados en el desarrollo del fruto. Se sometieron a un estudio inicial en el que se comprobaron aspectos como la heredabilidad del fenotipo, su modo de herencia, la resistencia a la kanamicina conferida por el T-DNA, la determinación del número de inserciones de T-DNA y el ligamiento ocasional entre mutación e inserción. IV.1.2.- Aislamiento y estudio preliminar de mutantes. Se aislaron inicialmente 21 presuntos mutantes. Dos de ellos se descartaron tras comprobar que se trataba de mutaciones de esterilidad masculina. Las 19 líneas restantes se autofecundaron y se comprobó la heredabilidad del fenotipo analizando varias decenas de individuos de su progenie. De hecho, 6 de estas líneas fueron completamente estériles, mientras que en otras 7 el fenotipo no se heredó o fue muy sutil en la siguiente generación. Ws-2 Frutos mutantes Figura IV.1- Frutos de individuos aislados durante el escrutinio. A la izquierda de la imagen se muestra un fruto del acceso silvestre Ws-2. A la derecha aparecen frutos de distintos individuos aislados durante el escrutinio de la colección de TDNA. Barra de escala 2 mm. Debido a la transmisión de su fenotipo a la siguiente generación sin ningún tipo de ambigüedad, concentramos nuestros esfuerzos en las otras 6 líneas, originalmente denominadas como SJF5-3, SJF8-6, SJF9-9, SJF15-18 SJF20-15 y SJF25-20 (sección III.1.1.2.1 de Materiales y Métodos). Resultados 98 Tabla IV.1.- Estudio de la heredabibilidad del fenotipo y de la resistencia a la kanamicina en los individuos T4. Línea mutante Fenotipo de las plantas T4 SJF1-6 SJF3-2 SJF5-3 SJF5-4 SJF7-12 SJF8-6 SJF8-8 SJF10-5 SJF9-9 SJF9-10 SJF11-4 SJF12-8 SJF12-13 SJF17-13 SJF20-15 SJF20-16 SJF21-17 SJF21-18 SJF22-20 SJF23-19 SJF26-22 Estéril Estéril Heredable Estéril Fenotipo sutil Heredable Fenotipo sutil Androestéril Heredable Estéril Androestéril Fenotipo sutil Estéril Fenotipo sutil Heredable Estéril Fenotipo sutil Heredable Heredable Fenotipo sutil Fenotipo sutil Resistencia a la Kanamicina n.e. n.e. Resistente n.e. n.e. Resistente n.e. n.e. Resistente n.e. n.e. n.e. n.e. n.e. Resistente n.e. n.e. Sensible Sensible n.e. n.e. n.e.: no examinado. Se sembraron varias decenas de descendientes en placas de Petri en presencia de kanamicina. Dos de estas líneas (SJF21-18 y SFJ22-20) mostraron sensibilidad total por lo que, presumiblemente, carecen de T-DNA o presentan una versión truncada o silenciada del mismo. Proseguimos nuestro estudio con las cuatro líneas que sí exhibieron resistencia total al antibiótico. Tras verificar la heredabilidad de los fenotipos y la resistencia a la kanamicina, estas cuatro líneas se cruzaron con su ancestro silvestre Ws-2 para determinar los patrones de herencia de las mutaciones. El análisis de las familias F2 permitió concluir que las cuatro mutaciones se transmiten siguiendo un patrón monogénico recesivo (tres plantas silvestres por cada planta mutante). Los cruzamientos se realizaron en ambos sentidos (resultados no reflejados en la Tabla IV.2) y no se apreció ningún efecto del sexo de los parentales sobre la transmisión de los alelos. Simultáneamente, se cultivaron las familias F2 en presencia de kanamicina. En los cuatro casos se obtuvo una segregación de tres plantas resistentes por cada individuo sensible. Además, dentro de las poblaciones de individuos resistentes, la proporción de plantas silvestres frente a mutantes se ajustó a una relación 2:1, congruente con la presencia, en cada caso, de una inserción única ligada al fenotipo mutante observado. Resultados 99 Tabla IV.2.- Segregaciones fenotípicas de las generaciones F2. F2 Clases fenotípicas Cruzamientoa F1 (fenotipo) Silvestres Mutantes χ2 KanR KanS χ2 SJF5-3 x Ws-2 Silvestre 140 50 0,1908 162 58 0,2181 SJF8-6 x Ws-2 Silvestre 156 42 1,1362 152 52 0,0257 SJF9-9 x Ws-2 Silvestre 155 52 0,0014 170 50 0,6470 SJF20-15 x Ws-2 Silvestre 298 100 0,0033 159 54 0,0139 a En el cruzamiento se anota en primer lugar la estirpe utilizada como parental femenino. Se indica el número de individuos de cada clase fenotípica en la segregación de las familias F2 estudiadas en presencia y ausencia de kanamicina. El valor del estadístico en cada caso indica el ajuste de los datos obtenidos en las poblaciones F2 a la segregación fenotípica esperada 3:1. KanR: resistente a kanamicina. S Kan : sensible a kanamicina. Con objeto de verificar esta observación, se realizaron familias F3, tras la autofecundación de plantas F2 mutantes cultivadas en ausencia de kanamicina. Se cultivó un gran número de individuos F3 en presencia del antibiótico (Tablas IV.3 y IV.4). En tres de las cuatro líneas estudiadas, la ausencia de individuos sensibles indicó el ligamiento total entre el fenotipo y la inserción. Tabla IV.3.- Análisis de las segregaciones de familias F3 en presencia de kanamicina de los mutantes SJF8-6, SJF9-9 y SJF20-15. Línea mutante nº de familias F3 examinadas SJF8-6 SJF9-9 SJF20-15 15 13 20 Se examinaron como promedio 20 individuos de cada familia. En una de las familias F3 correspondientes al mutante SJF5-3 aparecieron cuatro recombinantes resistentes a la kanamicina y de fenotipo silvestre, lo que sugiere que el TDNA, aunque muy cercano, no es responsable de la perturbación molecular que ocasiona el fenotipo de esta línea (Tabla IV.4). Tras este resultado, detuvimos el estudio de la misma. Resultados 100 Tabla IV.4.- Segregación de la resistencia a la kanamicina en la progenie F3 del mutante SJF5-3. Clases fenotípicas Familias F3 Individuos resistentes Individuos sensibles 1 2 3 4 21 18 23 18 0 0 0 4 IV.2.- CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LA LÍNEA SJF20-15. LA MUTACIÓN pepper1-1. IV.2.1. Análisis macroscópico. De entre las tres líneas “supervivientes” de nuestra criba, nos decidimos por el mutante SJF20-15 para llevar a cabo un análisis pormenorizado. Esta decisión se fundamentó en sus características de expresividad poco variable y penetrancia completa y, básicamente, en la singularidad del fenotipo que exhiben sus frutos. Su semejanza con pequeños pimientos (bell pepper) motivó que adquiriera la denominación pepper1 (pep1). En previsión de obtener nuevos alelos en un futuro, precisamos aún más denominándola pep1-1. La mutación pep1-1 es pleiotrópica (Fig. IV.2 A), afectando a diversos aspectos del desarrollo de la planta. Sus frutos son de pequeño tamaño, no llegando en la mayoría de los casos a la mitad de la longitud de un fruto silvestre Ws-2 (Fig. IV.2 B). El estigma es conspicuo a lo largo de gran parte de su desarrollo (Fig. IV.2 D), presumiblemente como consecuencia de una reducción en la fertilidad. Consecuentemente, se llevaron a cabo ensayos de cruces recíprocos con el silvestre. Éstos mostraron que la fertilización con polen silvestre compensa, sólo en parte, la reducción de longitud en el fruto, lo que podría indicar cierto grado de implicación del polen en el fenotipo. Sin embargo, la fertilización de pistilos silvestres con polen pep1-1 da lugar a frutos que se desarrollan normalmente, lo que avala, esencialmente, su viabilidad (Fig. IV.2 C). No obstante, el rasgo fenotípico que más atrajo nuestra atención fue la presencia de más de dos valvas en sus frutos, circunstancia ajena a las silicuas propias del silvestre (Fig. IV.2 B y D). La dehiscencia de estos frutos no parece verse afectada (Fig. IV.2 E). Tras analizar con mayor detalle los mutantes pep1-1, comprobamos que no todos los frutos de una misma planta presentan valvas extra, mostrando expresividad variable a Resultados 101 este respecto. La penetrancia es completa, todas las plantas presentan frutos con valvas supernumerarias. Efectuamos un recuento en el que pudimos comprobar que el número de valvas oscila entre 2 y 6, aunque este último valor se da con muy poca frecuencia (Tabla IV.5 y Fig. IV.3). Ws-2 A B Ws-2 Ws-2 Ws-2 x pep1-1 C pep1-1 x Ws-2 pep1-1 pep1-1 pep1-1 D E Ws-2 pep1-1 * * * * * * Figura IV.2.- Fenotipo de pep1-1. A) Porte de una planta silvestre Ws-2 y otra pep1-1 de 40 días tras la germinación. B) Se observa una acusada diferencia de tamaño de los frutos pep1-1 respecto del silvestre. C) Cruzamientos recíprocos entre Ws-2 y el mutante pep1-1. D) Detalle de ambos lados de un fruto pep1-1 en estadio 17 (según Ferrándiz et al., 1999). Los asteriscos rojos señalan las valvas. E) Frutos del silvestre Ws-2 y de pep1-1 tras haberse producido la dehiscencia. Barras de escala: A) 5 cm; B) y C) 2 mm; D) y E) 1mm. Tabla IV.5.- Recuento del número de valvas en frutos pep1-1. 2 3 número de valvas en los frutos 4 5 6 frutos % frutos % frutos % frutos % frutos % 46 30,67 57 38 40 26,67 4 2,66 3 2 Se examinaron un total de 150 frutos procedentes de 15 plantas pep1-1. Resultados 102 100 90 80 % de frutos 70 60 50 40 30 20 10 0 2 3 4 5 6 nº de valvas Figura IV.3.- Recuento del número de valvas en pep1-1. Se contabilizaron un total de 150 frutos procedentes de 15 plantas pep1-1. Decidimos comprobar si la mutación ocasionaba órganos florales supernumerarios de manera indiscriminada, por lo que también contabilizamos sépalos, pétalos y estambres en el silvestre y en el mutante. No se apreció ninguna diferencia significativa (Tabla IV.6). Por consiguiente, el efecto de la mutación pep1-1 parece restringirse al gineceo, al menos en cuanto a la aparición de órganos extra. Tabla IV.6.- Número de órganos florales en pep1-1 y Ws-2. Número de órganos florales Flores pep1-1 Sépalos Pétalos Estambres 3,97±0,077 3,97±0,076 5,87±0,083 Sépalos 4±0 Flores Ws-2 Pétalos Estambres 4±0 5,95±0,081 Medias obtenidas del recuento en 300 flores de pep1-1 y en 300 flores de Ws-2, respectivamente. Una anomalía que sí afecta usualmente a los frutos pep1-1 es una clara disposición asimétrica de las valvas, muy evidente en frutos con sólo dos (ver Figura IV.10 en sección IV.2.2). Resultados 103 7 6 número 5 4 Mutante Silvestre 3 2 1 0 Sépalos Pétalos Estambres Figura IV.4.- Representación del recuento del número de sépalos, pétalos y estambres en individuos pep1-1 y Ws-2. Se examinaron 30 plantas del mutante y 30 plantas del silvestre analizando 10 flores en cada individuo. No se apreció ningún tipo de transformación homeótica entre órganos pertenecientes a distintos verticilos florales. Ocasionalmente, en las plantas pep1-1 se observan alteraciones en la disposición de las flores, como la aparición de flores y frutos pedunculados que surgen en un verticilo exterior sin sustituir a ningún órgano (Fig. IV.5), o el desarrollo de dos frutos desde un mismo botón floral, estando fusionados por la base (ver Fig. IV.16 D en sección IV.2.4) Figura IV.5.- Flores del silvestre y de pep1-1. A la izquierda de la imagen se ve una flor silvestre Ws-2 con un fruto en desarrollo en estadio 17. A la derecha, una flor pedunculada en el mutante pep1-1 que surge desde una posición correspondiente a un verticilo exterior de otra. Barra de escala 2 mm. Otras características reseñables de este mutante se relacionan, básicamente, con su desarrollo vegetativo. Las plantas pep1-1 presentan, generalmente, menor porte que el silvestre y reducción de la dominancia apical (Fig. IV.2 A). En ocasiones, tanto el tallo principal como las coflorescencias secundarias aparecen fasciados. Asociadas a estas anomalías aparecen, a veces, inflorescencias terminales anormales (Fig. IV.6). Un rasgo definitivamente característico de las plantas pep1-1 es la abundancia de situaciones anómalas en el patrón de filotaxia. Las plantas pep1-1 presentan gran Resultados 104 profusión de alteraciones en la disposición de las ramificaciones (inflorescencias secundarias), así como de flores y frutos (Fig. IV.7). A Figura IV.6.- Tallos fasciados y alteraciones en las inflorescencias de pep1-1. A) Alteraciones de las inflorescencias (flecha amarilla) y tallos faciados (flecha roja). B) Aparición de flores en ramillete (flecha amarilla) en la inflorescencia de un tallo fasciado (flecha roja). Barras de escala, 1 cm. B El patrón filotáctico de Arabidopsis thaliana es de tipo decusado durante la etapa vegetativa juvenil, siendo sustituido por una disposición helicoidal durante la fase vegetativa adulta y la fase reproductiva. Sin embargo, en el mutante encontramos inflorescencias secundarias que surgen a partir del mismo nudo, al igual que ocurre en numerosas ocasiones con dos flores o frutos. A veces, surgen del mismo nudo una inflorescencia secundaria junto con una flor o fruto. Ocasionalmente son tres o más órganos laterales los implicados en la anomalía. También se observan inflorescencias sin la aparición concomitante de una hoja caulinar en su base (Fig. IV.7). A B Figura IV.7. Comparación entre la disposición de órganos en el silvestre y en el mutante pep1-1. A) Silvestre. En B) se muestran algunas de las alteraciones filotácticas de pep1-1 descritas en el texto. Barras de escala 5 mm. Resultados 105 En placas de Petri pudimos comprobar que las plantas pep1-1 poseen una roseta basal de menor tamaño que el silvestre, con hojas más lanceoladas y un color algo menos intenso (Fig. IV.8). La presencia de kanamicina en el medio induce en ocasiones la aparición de fenotipos no heredables por lo que repetimos el cultivo en placas sin este antibiótico, corroborando la apreciación anterior. También observamos la presencia circunstancial de plantas con sólo un cotiledón o con una única hoja terminal tras la expansión de los cotiledones. Advertimos un cierto retraso en la aparición de las hojas respecto al silvestre. Esta alteración heterocrónica persiste durante la formación de los primeros pares de hojas, pero se atenúa progresivamente, a medida que se desarrolla la roseta basal. De hecho, el mutante acaba invirtiendo más tiempo en florecer que el silvestre, lo que se ve acompañado por la generación de un mayor número de hojas en el momento en el que surge la primera inflorescencia. No se llevó a cabo un estudio sistemático del tiempo de floración por tratarse de una tarea que excedía los planteamientos iniciales de este trabajo. A B Figura IV.8.- Rosetas de Ws-2 y pep1-1. A) Roseta de Ws-2 20 días tras la germinación. B) Roseta de pep1-1 de la misma edad. Barras de escala 2 mm. IV.2.2.- Estudio morfológico de los frutos pep1-1 mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Para examinar con mayor precisión el fenotipo de los frutos del mutante pep1-1, los analizamos mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Verificamos de nuevo la aparición de frutos con valvas supernumerarias (Fig. IV.9 B, F y H). En muchos de los frutos pep1-1 examinados se puede observar como las valvas extra se extienden a lo largo de todo el fruto, como ocurre con las valvas de los frutos silvestres (Fig. IV.9 B). En otras ocasiones, estas valvas adicionales se extienden en menor medida a lo largo del eje Resultados 106 longitudinal del fruto (Fig. IV.9 F), alcanzando tan sólo la mitad de éste o menos. En cualquier caso, siempre se inician desde el extremo apical, nunca desde abajo, una circunstancia común a otros mutantes con fenotipos comparables descritos en la bibliografía (Clark et al., 1993; Wilkinson y Haughn, 1995; Fletcher et al., 1999; Jeong et al., 1999). B A * * * C * D * * * * * * * * * * I E F * * v H G * r * * * * v J v r v Figura IV.9.- Microscopía electrónica de barrido de los frutos pep1-1. A) Fruto silvestre Ws-2, 3 dpa (días post antesis). B) Frutos pep1-1, 3 dpa. C) Detalle de la región apical de un fruto silvestre. D) Detalle de la región apical de un fruto pep1-1. E) Fruto pep1-1 con dos valvas. F) fruto pep1-1 con tres valvas, donde la tercera valva no recorre toda la longitud del fruto. La flecha roja señala un replum ensanchado atípico. El recuadro rojo delimita la región donde convergen los repla. G) Detalle de la convergencia de los repla. H) Fruto pep1-1 con, al menos, cinco valvas. I) Magnificación de un fruto silvestre donde pueden observarse las regiones del replum y de la valva. J) Magnificación de un fruto pep1-1 equivalente a la del panel I. Los asteriscos violeta indican la presencia de valvas mientras que los de color azul señalan la posición de los repla. v, valva; r, replum. Barras de escala: A), B), E), F) y H) 1mm; C), D) y G) 100 µm; I) y J) 50 µm. Resultados 107 La zona del replum, es mucho más ancha en la región donde finaliza la valva ectópica y se produce la convergencia de lo que, en realidad, son dos repla que discurren en paralelo hasta ese punto (Fig. IV.9 F y G). Las células que conforman el replum en los frutos silvestres se caracterizan por poseer, por norma general, una forma más o menos rectangular además de presentar una mayor compacidad que las de la valva. En cambio, las células de la superficie de la valva exhiben formas más irregulares y es típica la aparición de estomas entre ellas. El examen de las células de la valva en pep1-1 no mostró diferencias significativas a excepción de su menor tamaño y sus formas aún más irregulares. Las células del replum en pep1-1 aparecen menos compactadas que en el silvestre y con una morfología normal (Fig. IV.9 I y J). Nunca se observó la aparición de estomas en los repla de los frutos pep1-1 examinados. La asimetría en la disposición de las valvas, de modo particular en los frutos con sólo dos, se observa claramente en las micrografías de barrido. En la Figura IV.10 se aprecia como las valvas pueden incluso situarse por encima del estilo. El tamaño, así como el aspecto general, que presentan las semillas de pep1-1 no revela diferencias respecto a las semillas de su ancestro silvestre Ws-2 (Fig. IV.11). A B Figura IV.10.- Asimetría en la disposición de las valvas en pep1-1. A) Se muestra la región apical de un fruto pep1-1 con dos valvas. Las valvas se disponen ocupando la región del estilo. B) Región inferior de un fruto pep1-1 donde se evidencia la disposición asimétrica de las valvas. Barras de escala 100 µm. A B Figura IV.11.- Semillas Ws-2 y pep1-1. Semillas de frutos silvestres Ws-2 (A) y de pep1-1 (B). No se aprecian diferencias entre ambos tipos de semillas. Barras de escala 100 µm. Resultados 108 IV.2.2.1.- Estudio comparativo de la ontogenia de los pistilos silvestres y de pep1-1. Con objeto de comprobar a partir de qué etapa se manifiestan las anomalías que diferencian a los frutos de pep1-1 de los del silvestre, decidimos estudiar la ontogenia de los pistilos de ambas estirpes. El pistilo silvestre presenta, durante las etapas tempranas de su desarrollo, una morfología similar a un tubo cilíndrico abierto en su parte superior (Fig. IV.12 A-D), la cual se cierra completamente hacia el estadio 10. En esta etapa, las papilas estigmáticas son más evidentes y comienza a percibirse la sectorialización del ovario asociada a las dos futuras valvas (Fig. IV.12 E). Con el alargamiento posterior del pistilo se distingue con más claridad la región del estilo (Fig. IV.12 G y H). A B C D E F G H Figura IV.12.- Distintos estadios en el desarrollo del pistilo en plantas silvestres Ws-2. A) Pistilo en estadio 9 (Smyth et al., 1990; Bowman, 1994; Ferrándiz et al., 1999). B) Detalle de la región apical abierta del fruto mostrado en A). C) Pistilo en estadio 10, se inicia el desarrollo de las papilas estigmáticas y el cierre de la zona apical. D) Detalle del fruto mostrado en C). E) y F) Estadio 11 de desarrollo. El estilo comienza a diferenciarse claramente de la región del ovario. G) y H) Estadio 12. Barras de escala: A, B, C, E, F, G y H 100 µm; D 50 µm. Resultados 109 En los pistilos de plantas pep1-1, la aparición de valvas extra se percibe desde etapas muy tempranas de su desarrollo, particularmente en la zona superior (Fig. IV.13 BD). A B C D E F G H I J K L Figura IV.13.- Distintos estadios en el desarrollo del pistilo en plantas pep1-1. A) Estadio 8 de desarrollo (Smyth et al., 1990, Bowman, 1994; Ferrándiz et al., 1999). B) Estadio 9. Se comienzan a apreciar las valvas extra. C) y D) Pistilo en estadio 10 con cuatro valvas en desarrollo. E) y F) Estadio 11. Se observan claramente las papilas estigmáticas. La aparición de valvas extra dificulta el cierre en la región apical del pistilo. G) y H) Estadio 12. Aún se aprecia un orificio en la región central del estigma. I)-L) Distintos ejemplos de frutos pep1-1 donde el cierre apical del pistilo no se ha producido correctamente, observándose en algunos de ellos una pequeña cavidad en la zona superior. Barras de escala 100 µm. Resultados 110 Esta situación, presumiblemente, interfiere con la coordinación normal en el desarrollo del pistilo, de manera que dificulta la fusión de órganos en su zona apical. Como resultado, se produce un retraso en la oclusión final del ápice del pistilo pep1-1 con respecto al silvestre. En la Figura IV.13 H, se observa como en un pistilo en el estadio 12, con valvas supernumerarias, aún no se ha producido una fusión completa y todavía se puede apreciar una cavidad entre las papilas estigmáticas en desarrollo. Esta rápida manifestación de los rasgos que caracterizan al gineceo de pep1-1, desde luego muy anteriores a la etapa posterior a la fertilización, indica de manera evidente que se trata de una mutación que afecta a la ontogenia del pistilo, predeterminando el posterior desarrollo del fruto tras la polinización. IV.2.3.- Análisis histológico de las silicuas de pep1-1. Con la intención de complementar las observaciones sobre el fenotipo externo, llevamos a cabo un análisis de la organización tisular en los frutos de pep1-1. Se examinaron secciones transversales de frutos mutantes y del silvestre (Ws-2). Se recolectaron silicuas de 5 dpa y se incluyeron en resina JB-4 para efectuar los cortes histológicos (sección III.6.2.1). También en su estructura interna se aprecia la singularidad del fruto de pep1-1. La Figura IV.14 muestra la presencia de valvas extra, delimitadas cada una de ellas por repla adicionales. En las valvas de los frutos silvestres de Arabidopsis thaliana es típica la presencia de 6 capas de células con distintas morfologías (sección I.5.5.1; Fig. IV.14 A). Las células del exocarpo de pep1-1 presentan tamaños algo más irregulares que en el silvestre (Fig. IV.14 B-D). Este hecho podría relacionarse con la irregularidad de formas existente en la superficie de la valva (sección IV.2.2; Fig. IV.9). En el clorénquima encontramos el mismo número de capas celulares que en el silvestre, pero con un menor grado de compacidad. Queda por establecer si esta situación es debida a un menor número de células o a un tamaño inferior de éstas. Las células de la capa más externa del endocarpo no presentan una morfología distinta a las del silvestre, mientras que las células más internas parecen en ocasiones más oblongas. En las valvas supernumerarias de los frutos pep1-1, los vasos conductores discurren, al igual que en las valvas del silvestre, a través del clorénquima, localizándose en posiciones similares. El número de valvas en el mutante se corresponde con el número de territorios ocupados por un replum. De este modo, encontramos tres repla flanqueando a tres valvas (Fig. IV.14 B), o cuatro repla delimitando cuatro zonas de valva (Fig. IV.14 C y D). De Resultados 111 igual forma sucede con los frutos con más valvas. La estructura de estos repla no parece ser distinta de la que se genera en el silvestre, y vimos que la dispersión de las semillas en los frutos pep1-1 tiene lugar mediante una dehiscencia normal (sección IV.2.1, Fig. IV.2 E). Esto indica una correcta especificación de las zonas de lignificación en las regiones situadas entre replum y valva. R A B V R S V V V x n c R R V R C V R V D V R R V R * R R R V V V V R Figura IV.14.- Histología de frutos de 5 dpa silvestres (Ws-2) y mutantes pep1-1. A) Corte transversal de un fruto silvestre. En B), C) y D) frutos pep1-1 con 3 y 4 valvas respectivamente. En C se indica, con un asterisco rojo, la formación de un gran lóculo central. V: valva; R: replum; S: septum; x: exocarpo; c: clorénquima; n: endocarpo. Barra de escala 200 µm. Resultados 112 El replum se prolonga hacia el interior del fruto por medio del septum, formando dos lóculos en el fruto silvestre. Debido a la existencia de septa extra es lógica, por tanto, la aparición en pep1-1 de más de dos lóculos (Fig. IV.14 B-D). En ocasiones los lóculos adicionales no aparecen como compartimentos completamente separados. El septum extra aparece como una estructura discontinua, tal vez fragmentado por la presión ejercida por la semilla durante su crecimiento (Fig. IV.14 C y D). Como norma general, en los frutos pep1-1 con cuatro o más valvas, se observa un gran lóculo central, presumiblemente como consecuencia de la ruptura de cada uno de los septa (Fig. IV.14 C). Sin embargo, el funículo, la estructura que conecta el óvulo con el septum, así como los propios óvulos, no presentan irregularidades en pep1-1 (Fig. IV.14 C y D). A B * * Figura IV.15.- Fruto pep1-1 con dos repla fusionados. A) Corte transversal de un fruto pep1-1 de tres valvas. En la parte superior se muestran dos repla adyacentes y dos septa que se proyectan casi paralelamente hacia el interior del fruto. B) Detalle de los dos repla adyacentes que aparecen en A), indicados por asteriscos de color violeta. Barras de escala: A) 200 µm y B) 50 µm. Algunos cortes de frutos examinados muestran dos repla unidos y aparentemente normales (Fig. IV.15). Este hecho tiene su origen en la confluencia de dos repla en aquellos frutos en los que el crecimiento de las valvas extra no es total y sólo alcanza parte de su longitud (Figura IV.9 F y G apartado IV.2.2). Es muy probable que la imagen mostrada en la Figura IV.15 se corresponda con una de esas zonas de convergencia IV.2.4.- Introgresión de pep1-1 en otros fondos silvestres. El fenotipo ocasionado por las mutaciones es, en muchas ocasiones, estrechamente dependiente del fondo genético de la estirpe utilizada (Koornneef et al., 1995; Sanda y Amasino, 1996; Nadeau, 2003). Mediante series sucesivas de cruzamientos con otros accesos, se puede trasladar la mutación original a un entorno Resultados 113 genómico que cada vez se asemeje más al de la estirpe “destinataria” de dicha mutación. Idealmente, la mutación se considera finalmente trasladada a un fondo homogéneo perteneciente a la segunda estirpe. El término introgresión hace referencia a este traslado progresivo de un fondo genético a otro. La colección de mutantes insercionales de T-DNA donde se aisló pep1-1 se generó utilizando el acceso silvestre Ws-2. Entre otras diferencias, este fondo genético presenta una deleción de 15 nucleótidos y una inserción de una G en el gen que codifica la apoproteína del fitocromo D (PHYTOCHROME D, PHYD) de Arabidopsis thaliana (Aukerman et al., 1997). Debido al comportamiento pleiotropico de la mutación pep1-1, decidimos examinar el efecto del fondo genético mediante su introgresión en estirpes silvestres de uso común en los estudios con Arabidopsis, como son Col-0 y Ler. Por otra parte, la mayoría de los mutantes de Arabidopsis se encuentran en fondo Col-0 o Ler. También la mayoría de colecciones de mutantes de T-DNA se han realizado sobre un fondo Col-0, sobre todo las de dominio público, por lo que la aparición de nuevas mutaciones insercionales, alélicas a pep1-1, cabría esperarlas sobre este fondo. Ya desde el primer cruzamiento con Col-0, los individuos pep1-1 presentaron como promedio un mayor porte, la aparición de tallos fasciados se vio drásticamente reducida y aumentó su fertilidad. Este último rasgo se correlacionó con una reducción del estigma y un mayor tamaño de los frutos, aún cuando no se alcanzaran las dimensiones del silvestre (Fig. IV.16 A y E). La presencia de valvas extra persiste (Fig. IV.16 F), no apreciándose diferencias cuantitativas con los datos expuestos anteriormente (apartado IV.2.1). Tampoco se observa ningún efecto del proceso de introgresión sobre los errores en el patrón de filotaxia, o el desarrollo de flores fusionadas (Fig. IV.16 A, D). Sin embargo, el fenotipo de las rosetas sí disminuyó (Fig. IV.16 B, C) en relación al observado inicialmente en un fondo Ws-2 homogéneo (Fig. IV.8). No obstante, se conservan la aparición heterocrónica de las primeras hojas y un cierto retraso en la floración. Hasta el momento de la realización de esta memoria, hemos efectuado un total de 5 series de cruzamientos con el fondo silvestre Col-0 (pep1-1 5XCol). Resultados 114 A B Ws-2 E Ws-2 Col pep1 (3xCol) Col pep1-1 C pep1-1 (3xCol) F D pep1-1 * * * Figura IV.16.- Introgresión de pep1-1 en Col-0. A) Comparación del porte de plantas silvestres y pep1-1 antes y después de 3 cruzamientos con Col-0. La flecha roja indica una clara alteración en la filotaxia. B) Roseta Col-0 de 14 días. C) Roseta de pep1-1 (3xCol) de 20 días. D) Aparición de dos frutos a partir de un mismo botón floral. E) Incremento en la longitud de los frutos pep1-1 tras 3 cruzamientos con Col-0. F) Fruto pep1-1 (3xCol) con tres valvas (asteriscos rojos). Barras de escala: en A 5 cm y B-F 1 mm. Tras el primer cruzamiento de pep1-1 con Ler, las plantas mutantes alcanzaron un porte mucho menor que el observado originalmente (no mostrado). No resulta sorprendente ya que la faceta más característica de este fondo es la mutación erecta (er; Torii et al., 1996), la cual compromete el número de divisiones celulares en determinados ejes, produciendo un acortamiento de los entrenudos y de los órganos laterales (Torii et al., 1996). El fenotipo de pep1-1 en la roseta se atenuó considerablemente (no mostrado) hasta el punto de dificultar en ocasiones su identificación en esta etapa del desarrollo de la planta. Los frutos, más cortos y con el ápice romo, como es característico de los frutos Ler, conservan la aparición de valvas extra (Fig. IV.17). El estilo es algo más alargado que en Ler. Hasta el momento de la elaboración de esta memoria, realizamos 2 cruzamientos con Ler. Resultados 115 A B Figura IV.17.- Introgresión de pep1-1 en Ler. A) Fruto Ler. Estos frutos son de menor tamaño y más romos que en Ws-2 o que en Col-0. B) Aparición de valvas extra (flecha roja) en los frutos de plantas pep1-1 (2xLer). Barras de escala 1 mm. Conjuntamente, el comportamiento de la mutación pep1-1 sugiere que parte de su fenotipo se debe a variantes en genes modificadores dependientes de la estirpe silvestre utilizada. IV.3.- CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL MUTANTE pep1-1. IV.3.1.- Determinación del número de copias de T-DNA en el mutante. Los datos obtenidos durante el análisis de las poblaciones F2 y F3 sugieren la presencia en pep1-1 de una única inserción ligada al fenotipo. No obstante, y previamente al intento de clonación de las secuencias genómicas, realizamos experimentos de hibridación Southern (sección III.8.1) con el propósito de determinar el número de copias de T-DNA. Llevamos a cabo digestiones enzimáticas de DNA genómico de plantas pep1-1 con EcoRI y KpnI. En la Figura IV.18 se muestra una estructura esquemática del T-DNA presente en pep1-1, donde se indican las posiciones relativas de las dianas de estas enzimas. La sonda, obtenida por PCR, comprende la región situada entre los oligos AT10 y AT11 (fragmento de 1,1 Kb, Tabla III.3), localizados en el gen de resistencia a kanamicina (nptII). La obtención de una única banda en ambos casos habría corroborado sin ambigüedades la presencia de una inserción simple. Sin embargo, tanto con EcoRI como con KpnI detectamos tres bandas. Este resultado apunta a la presencia de al menos tres copias del gen de resistencia a la kanamicina y, por lo tanto, de al menos tres T-DNA. Resultados 116 pGKB5 A KanR GUS BastaR RB LB nos 3’ ocs 3’ uidA 1 2 XbaI EcoRV EcoRV BamHI 3 EcoRI B 1,636 Kb bar nptII P nos P 35S 4 5 sonda 3’g7 6 7 Kb KpnI EcoRV KpnI HindIII C ~ 8,5 Kb ~ 5,2 Kb ~ 4,1 Kb ~ 12,5 Kb ~ 10 Kb ~ 6 Kb 1,636 Kb Figura IV.18.- Detección del T-DNA en pep1-1 mediante hibridación Southern. A) Esquema del T-DNA pGKB5 en el que se indican algunas de las dianas para enzimas de restricción, así como la posición relativa de la sonda utilizada. B) Hibridación Southern. De izquierda a derecha, carril correspondiente a los marcadores de peso molecular, DNA genómico de Ws-2 digerido con EcoRI, y DNA genómico de pep1-1 digerido con EcoRI. C) Hibridación Southern. De izquierda a derecha, calle correspondiente a los marcadores de peso molecular y DNA genómico de pep1-1 digerido con KpnI. Los datos de segregación de la resistencia encajan con la existencia de un sólo hecho insercional. La presencia de varias copias de T-DNA en tándem, o diversos hechos de inserción en loci muy próximos explicarían esta aparente discrepancia con los estudios de segregación de la resistencia al antibiótico. La identificación de las secuencias genómicas adyacentes a la inserción debiera contribuir a aclarar esta cuestión. IV.3.2.- Clonación de las regiones genómicas adyacentes a la inserción. Con la intención de clonar las regiones genómicas adyacentes a los bordes de TDNA, empleamos PCR inversa (I-PCR, III.7.9.3, Ochman et al., 1988; Triglia et al., 1988; Hartl y Ochman, 1996) y PCR de asimetría térmica entrelazada (TAIL-PCR, III.7.9.2, Liu et al., 1995; Singer et al., 2003). Para IPCR se utilizaron dos cebadores adyacentes en orientación divergente en el borde derecho (RB) denominados AT4 y AT5 (Tabla III.3; Fig. IV.19), y otros dos en el borde izquierdo (LB), denominados AT2 y AT15 (Tabla III.3; Fig. IV.19). Para la clonación Resultados 117 de las regiones genómicas de pep1-1 adyacentes al borde derecho, su DNA se digirió con EcoRI. En el caso del borde izquierdo, la digestión se realizó con HindIII. Simultáneamente, se llevaron a cabo reacciones de TAIL-PCR con tres oligonucleótidos imbricados correspondientes a secuencias del borde derecho (AT3, AT4 y AT6, Tabla III.3) y otros tres del borde izquierdo (AT1, AT2 y AT7; Tabla III.3). GUS pGKB5 KanR BastaR RB LB uidA nos 3’ ocs 3’ Cebadores TAIL-PCR: nptII P nos P 35S bar 3’g7 Cebadores IPCR: Figura IV.19.- Esquema de las posiciones relativas, respecto al T-DNA pGKB5, de los cebadores utilizados en TAIL-PCR e IPCR. Mediante el análisis de los distintos fragmentos amplificados, comprobamos que las secuencias contiguas a los bordes del T-DNA pertenecían a dos cromosomas distintos de Arabidopsis thaliana, en concreto a los cromosomas IV y V. Verificamos este extremo tras amplificar con cebadores de los bordes del T-DNA y de las regiones genómicas adyacentes reveladas por los ensayos de IPCR y TAIL-PCR, y secuenciar los fragmentos obtenidos. Este resultado podría significar la presencia de varios hechos de inserción independientes. Sin embargo, los datos de segregación de la resistencia a la kanamicina y el ligamiento total entre ésta y el fenotipo contradicen tal posibilidad. Las secuencias pertenecientes al cromosoma IV se corresponden a la posición de 15.499 Kb del BAC F20B18. Las del cromosoma V corresponden a la posición 25.465 Kb del BAC MNA5. Teniendo en cuenta todos los datos obtenidos, la explicación más verosímil para la mutación pep1-1 parece una reorganización cromosómica generada por el hecho insercional, como una translocación recíproca entre ambos cromosomas (Fig. IV.20 y IV.21). Resultados 118 A IV V B IV-V V-IV Figura IV.20.- Estructura esquemática de los cromosomas IV y V de Arabidopsis thaliana. En A) se representan los cromosomas de individuos silvestres. B) Cromosomas translocados IV-V y V-IV en pep1-1. Los rectángulos amarillos indican los puntos de translocación. Los centrómeros se representan en negro. Las translocaciones recíprocas son las reorganizaciones cromosómicas más comunes, consistentes en un intercambio de segmentos entre dos cromosomas no homólogos (Griffith et al., 2002). Este hecho concuerda con el ligamiento entre el fenotipo mutante y las distintas copias de T-DNA evidenciadas mediante el experimento de Southern. El patrón de bandas obtenido podría surgir de una disposición de copias de TDNA en cada cromosoma como la que se muestra en el esquema hipotético de la Figura IV.21. La inviabilidad de las plantas que heredan en homocigosis sólo uno de los cromosomas derivados explicaría el ligamiento entre el fenotipo y la resistencia a la kanamicina. IV-V RB LB LB LB RB RB RB LB V-IV Figura IV.21.- Esquema hipotético de la estructura de los T-DNA en los cromosomas derivados en pep1-1. El rectángulo amarillo marca el punto de la translocación. Los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) del T-DNA se marcan en rojo y verde respectivamente. Resultados 119 IV.3.3.- Ligamiento de pep1-1 a marcadores moleculares de tipo SSLP. Con objeto de disipar dudas acerca de posibles artefactos en nuestros resultados moleculares, y para verificar o no la presencia de una translocación, emprendimos un análisis de ligamiento de la mutación pep1-1 a marcadores moleculares de tipo SSLP localizados en los cromosomas IV y V. V MNA5 IV CIW7 Figura IV.22.- Localización de los marcadores SSLP utilizados en pep1-1. En negro se indica el centrómero del cromosoma. El rectángulo amarillo en cada cromosoma indica los puntos de translocación entre ambos cromosomas. Se generó una población cartográfica F2 mediante el cruce entre el mutante pep1-1 (en fondo Ws-2) y Ler. Se genotiparon 55 individuos mutantes (110 cromosomas) para los marcadores CIW7 (cromosoma IV; Fig. IV.22) y MNA5 (cromosoma V; Fig. IV.22). La mutación mostró ligamiento absoluto a ambos marcadores, lo que refuerza la presencia de una translocación recíproca entre ambos cromosomas. IV.3.4.- Estudio de la fertilidad en heterocigotos pep1-1. En los individuos portadores de una translocación recíproca en homocigosis no se producen, en principio, problemas en su fertilidad, ya que poseen una dotación completa del material genético propio de su especie. Sin embargo, es característico en los individuos heterocigóticos la existencia de semiesterilidad. Esto es debido a que la mitad de los productos meióticos presentan duplicaciones de unas regiones y deleciones de otras, dando lugar a productos inviables. El resto de los gametos es viable, o bien se trata de gametos normales, o bien de gametos balanceados (Griffith et al., 2002). El examen directo de silicuas de plantas heterocigóticas para la mutación pep1-1 mostró que en su interior aparecían semillas abortadas en una proporción muy cercana al 50% (156 de 300; Fig. IV.23). La disminución en la fertilidad también se produce en individuos heterocigóticos que presentan otros tipos de aberraciones cromosómicas (deleciones e inversiones) aunque una reducción del 50% es característica de Resultados 120 translocaciones recíprocas (Griffith et al., 2002). Verificamos estos resultados examinando silicuas F1 (PEP1/pep1-1) de cruzamientos con el silvestre, reforzándose la interpretación de una reorganización cromosómica como la descrita para pep1-1. A B * * Figura IV.23.- Semiesterilidad en los heterocigotos pep1-1. Fotografías de LTSEM. A) Semillas de una silicua silvestre Ws-2. B) Semillas abortada (asterisco rojo) junto a una que se desarrolla normalmente (asterisco blanco) en pep1-1. Barras de escala: A) 200 µm; B) 100 µm. IV.3.5.- pep1-1 es una mutación compleja que puede afectar a diversas funciones génicas. En su conjunto, los resultados expuestos en las secciones IV.3.1 a IV.3.4 indican que, muy probablemente, el fenotipo de la mutación pep1-1 es el resultado de una constelación de alteraciones genéticas, lo que dificulta la identificación de su naturaleza molecular de forma inequívoca y, sobre todo, directa. En sintonía con esta situación, hemos comprobado un efecto importante de factores genéticos modificadores dependientes del fondo genético utilizado. De forma paralela a la realización de nuestro trabajo, se acumuló información, cada vez más frecuente en la bibliografía, relativa a importantes reorganizaciones cromosómicos originados por las inserciones, (Nacry et al., 1998; Laufs et al., 1999; Tax y Vernon, 2001), lo que ha contribuido a aminorar la predilección por el T-DNA como agente mutagénico. En cualquier caso, nos propusimos iniciar una búsqueda de funciones génicas responsables de aquellos aspectos del fenotipo de pep1-1 que nos resultaban más interesantes, fundamentalmente el mayor número de carpelos en sus pistilos. Resultados 121 IV.4.- ESTUDIO DE GENES POTENCIALMENTE AFECTADOS POR LA TRANSLOCACIÓN. Las secuencias adyacentes a los bordes del T-DNA de pep1-1 se localizan en los cromosomas IV y V. En el cromosoma V, la inserción se sitúa en una región comprendida entre dos genes en orientación divergente, a 660 pb del punto de inicio de la traducción del gen AGP7, que codifica un pequeño polipéptido de pared o membrana (Kreuger y Van Holst, 1996; Schultz et al., 1998; Majeskawa-Sawka y Nothangel, 2000), y a 1.200 pb de un gen que codifica una proteína de función desconocida. En el cromosoma IV las secuencias obtenidas desde los bordes del T-DNA se sitúan entre dos genes que, al igual que en el caso anterior, se encuentran en orientación divergente. La inserción está a tan sólo 18 pb del codón de inicio de un gen que codifica un polipéptido con tres dominios de unión a RNA del tipo KH, y a 3,7 kb del otro gen, la función de cuyo producto se desconoce. Aún con dicha información, no se podían descartar otros genes más alejados, pues existen precedentes de mutaciones ocasionadas por el T-DNA al margen de la mera interrupción de secuencias (Tax y Vernon, 2001). Se confeccionó una lista inicial de genes a explorar, compuesta por los genes mencionados, más el gen SHEPHERD, alejado del punto de inserción pero cuyas mutaciones también generan pistilos con valvas supernumerarias (Ishiguro et al., 2002) y un gen próximo que codifica una peroxidasa. Ambos genes pertenecen al cromosoma IV (Tabla IV.7). Esta selección no pretendía ser definitiva sino tan sólo reunir un conjunto preliminar de genes a analizar. Tabla IV.7.- Líneas de inserción analizadas y utilizadas en el ensayo de complementación con el mutante pep1-1. Cromosoma IV IV IV IV IV IV IV IV IV V V V V a Gen At4g24.190 At4g24.190 At4g24.190 At4g26000 At4g26000 At4g26000 At4g26000 At4g26.010 At4g26.010 At5g65.390 At5g65.390 At5g65.390 At5g65.390 Línea Colección de T-DNA SALK_048558 (SHDa) SALK SALK_076031(SHDa) SALK SALK SALK_076127(SHDa) SAIL F09_517 (KHb) G12_1249 (KHb) SAIL SALK SALK_055265 (KHb) SALK SALK_081555 (KHb) SALK_058288 (POXc) SALK SALK_058547(POXc) SALK SALK_036321(AGP7d) SALK SALK_036324 (AGP7d) SALK SALK_099106 (AGP7d) SALK SALK_039285 (AGP7d) SALK b c SHEPHERD, Ishiguro et al., (2002); proteína con dominios KH, esta tesis; presunta d peroxidasa; ARABINOGALACTAN-PROTEIN 7, Majewska-Sawka y Nothangel (2000). Resultados 122 Realizamos una búsqueda de líneas de inserción de T-DNA correspondientes a dichos genes a partir de distintas colecciones de dominio público (Tabla IV.7). IV.4.1.- Estudio fenotípico de líneas de inserción correspondientes a genes potencialmente afectados por la translocación de pep1-1. Nuevos alelos de pep1. Se sembraron las líneas de inserción mostradas en la Tabla IV.7 y seleccionamos supuestos homocigotos para las inserciones correspondientes, en función de la segregación o no de plantas sensibles al herbicida Basta (líneas F09_517 y G12_1249), o a la kanamicina (resto de líneas). Mediante cruzamiento con Col-0, obtuvimos segregaciones F2 que indicaban la presencia de una única inserción en todos los casos. Este dato fue confirmado por la presencia de una única banda en hibridaciones Southern (datos no mostrados). Se utilizaron sondas complementarias al gen de resistencia a kanamicina (nptII) o al de resistencia a Basta (BaR), generadas por PCR con los cebadores AT10 y AT11 en el primer caso, y AT16 y AT17 en el segundo (Tabla III.3). El examen de los homocigotos para las líneas de inserción del gen SHEPHERD y el gen que codifica una presunta peroxidasa no reveló ningún fenotipo destacable. Las líneas correspondientes al gen AGP7 mostraron un fenotipo consistente en un menor tamaño y un color verde menos intenso que el silvestre Col-0 (datos no mostrados). Examinamos cuatro líneas homocigóticas para inserciones en el gen que codifica una presunta proteína de unión a RNA con tres dominios KH (At4g26000). Las líneas F09_517 y G12_1249 se nombraron como pep1-2 y pep1-3, respectivamente, ya que observamos en ellas frutos con valvas extra (Fig. IV.24), aunque con una penetrancia bastante menor que en pep1-1. Un rasgo consistente fue la presencia de alteraciones en el patrón de filotaxia, de carácter muy similar a las detectadas en pep1-1 (Fig. IV.24 y Fig. IV.25 A-C). En plantas pep1-2 observamos, al igual que en pep1-1, algunos frutos con disposición asimétrica de las valvas o bien, con un mayor crecimiento de una respecto a la otra (Fig. IV.24 C y D). Resultados 123 A C B D * * * * E F * * G Figura IV.24.- Fenotipo de los alelos pep1-2 y pep1-3. A) Fruto con más de dos valvas en pep1-2 (estadio 14; Ferrándiz et al., 1999). B) y C) Detalles de valvas extra en pep1-2. Se indican las valvas con asteriscos rojos. D) Valvas de muy distinta longitud en un fruto pep1-2 (estadio 15, Ferrándiz et al., 1999). E) Disposición asimétrica de las valvas en pep1-3 (estadio 15). Las flechas rojas indican el término de cada una de las valvas. Alteraciones en las inflorescencias de pep1-2 (F) y de pep1-3 (G). Barras de escala: A) 2mm. B) y C) 0,5mm. D) y E) 200 µm. F) 1 mm G) 300 µm. Las líneas SALK_055265 y SALK_081555 se denominaron como pep1-4 y pep1-5, respectivamente. Estas plantas muestran frutos, de fenotipo Pep1, con una penetrancia muy baja, menor incluso que en pep1-2. Sin embargo, los errores en el patrón de filotaxia son consistentes (Fig. IV.25 D-F). Ocasionalmente, también en pep1-4 se han podido detectar frutos con una disposición asimétrica de sus valvas. El tamaño de los frutos en los nuevos alelos es muy similar al que presenta el silvestre Col-0, y no se aprecia ninguna diferencia de fertilidad respecto a éste. Tanto los individuos pep1-2 como los pep1-4 mostraron un moderado retraso en la floración con respecto al silvestre, así como una aparición heterocrónica de los primeros pares de hojas de la roseta, siendo más pronunciado este efecto en el alelo pep1-2 (Tabla IV.8). Estos rasgos reflejan una clara similitud con el alelo original pep1-1 y refuerzan el Resultados 124 punto de vista según el cual el gen At4g26000, que codifica una proteína con dominios KH, está relacionado con el fenotipo observado en el mutante original. A B C E F D Figura IV.25.- Alteraciones en el patrón de filotaxia en los alelos pep1. A) pep1-2. B) Aparición de dos inflorescencias y un fruto desde un mismo punto en pep1-2. C) Desarrollo de dos frutos desde un mismo nudo en pep1-2. D) La misma alteración que en C) en pep1-4. E) y F) crecimiento de varias inflorescencias desde un mismo punto en pep1-4. Barras de escala: A) 1 cm. B) 2 cm. En C), D), E) y F) 5 mm. Tabla IV.8.- Aparición de las hojas de la roseta en plantas Col-0 y pep1-2. Días tras la siembra 9 días 14 días a Col-0 pep1-2 Col-0 pep1-2 46 40 40 40 3,95±0,72 1,84±0,67 7,97±0,65 5,77±0,57 Moda 4 2 8 6 Valores extremos 2-5 0-3 6-9 4-6 Individuos examinados Media (nº de hojas por individuo) a Se contabilizaron como plantas sin ninguna hoja aquellas que germinaron y desplegaron los cotiledones Otro rasgo común entre pep1-1 y otros alelos pep1, particularmente pep1-2, es la aparición ocasional de plantas con un sólo cotiledón o con una única hoja terminal. Este alelo muestra además un fenotipo en la roseta claramente distinguible del silvestre (Fig. IV.26) y que también guarda cierta reminiscencia con el de las plantas pep1-1 (Fig. IV.8 y IV.16). Sus hojas son más puntiagudas y exhiben marcadas protuberancias laterales correspondientes a los hidatodos u órganos de gutación. Su vasculatura, de un color Resultados 125 verde más intenso, destaca en la superficie del limbo, la cual muestra un color más pálido (Fig. IV.26). Cuando son muy jóvenes, las hojas se muestran algo más recurvadas hacia la superficie adaxial que en el caso del silvestre y, a medida que crecen, esta diferencia se reduce. De hecho, todos estos rasgos propios de la roseta basal de pep1-2 disminuyen a medida que ésta se desarrolla, asemejándose cada vez más a Col-0. A B Figura IV.26.- Diferencias en la roseta basal entre plantas Col-0 y pep1-2. A) Rosetas de 10 días de Col-0 (a la derecha, cuatro hojas) y pep1-2 (izquierda, 3 hojas). B) Rosetas de 14 días de plantas Col-0 (derecha) y pep1-2 (derecha), donde se aprecian 7 y 6 hojas respectivamente. En pep1-2 las hojas son puntiagudas, con protuberancias laterales y una venación marcada. Barras de escala 0,5 mm. En conjunto, los indicios aportados por los diversos alelos del gen At4g26000, denominados pep1-2 a pep1-5, sugieren que la interferencia en su actividad es uno de los factores capitales del fenotipo en las plantas pep1-1. A la espera de una cuantificación exhaustiva, los rasgos fenotípicos señalados (valvas extra, alteraciones filotácticas, fenotipo en la roseta, etc.) señalan al alelo pep1-2 como el más fuerte de la serie, si exceptuamos a la mutación compleja pep1-1. Analizamos, mediante RT-PCR, la expresión de At4g26000 (PEP1) en las plantas pep1-1. El gen ACTIN2 (ACT2), de expresión constitutiva en Arabidopsis (An et al., 1996), se utilizó como control. La inserción de T-DNA en pep1-1 interrumpe el gen PEP1 a tan sólo 18 pb del inicio de la traducción (Sección IV.4 y Fig. IV.33), por lo que resulta muy verosímil que impida su transcripción. La Figura IV.27 muestra, efectivamente, la ausencia del transcrito PEP1 en plantas pep1-1. Este dato señala a pep1-1 como un alelo nulo respecto a PEP1, lo que resulta coherente con su intervención en el fenotipo mutante de esta estirpe. Resultados 126 Ws-2 pep1-1 DNA genómico DNA genómico PEP1 cDNA PEP1 DNA genómico ACT2 cDNA ACT2 Figura IV-27.- Análisis de la expresión, mediante RT-PCR, de At4g26000 (PEP1) y ACT2 en plantas pep1-1 y su ancestro silvestre Ws-2. Como molde para la síntesis de cDNA se utilizó RNA poliadenilado de inflorescencias de Ws-2 y de pep1-1 (apartado III.7.2.1). La PCR se efectuó según III.7.9.4. Se utilizaron los oligonucleótidos FUP1-17 y FUP1-18 (Tabla III.3), que rinden un fragmento de 283 pb a partir del cDNA silvestre. El producto genómico de amplificación presenta un tamaño de 422 pb debido a la presencia del exón 5. La amplificación del gen ACT2 genera un fragmento de 260 pb a partir del cDNA, y de 343 pb a partir del DNA genómico. Los cebadores utilizados fueron ACT2-f y ACT2-r (Tabla III.3). IV.4.2.- Análisis de complementación entre pep1-1 y líneas de inserción procedentes de las colecciones de dominio público. Efectuamos cruzamientos entre pep1-1 y algunas de las líneas expuestas en la Tabla IV.7. Los individuos F1 mostraron características silvestres en los cruces con las líneas representantes de los genes SHD, AGP7 y el que codifica una hipotética peroxidasa (Tabla IV.7). El cruce entre pep1-1 y pep1-2 tuvo como resultado la obtención de individuos F1 transheterocigóticos que mostraban muchas de las anomalías descritas para el primer alelo. El patrón de filotaxia exhibió el mismo tipo de alteraciones y el fenotipo de la roseta basal fue muy similar al de pep1-2 (datos no mostrados). Sin embargo, el dato más elocuente es la presencia en todas las plantas de frutos con valvas extra, de un tamaño igual o algo inferior al silvestre (Fig. IV.28). La expresividad de este rasgo es variable, pero la penetrancia se puede considerar completa. La descendencia F2 de este cruzamiento no reveló ninguna sorpresa, rindiendo plantas pep1-2 sensibles a kanamicina, mientras que las plantas de genotipo pep1-1 y los transheterocigotos pep1-1/pep1-2 se seleccionaron en este antibiótico. Tras verificar molecularmente el genotipo de estas últimas, comprobamos que reproducían los rasgos de sus progenitores. Resultados 127 B A C D * * * E Figura IV.28- Fenotipo de los frutos en los transheterocigotos pep1-1/pep1-2. A) Fruto pep1-1/pep1-2. Los asteriscos y las líneas discontinuas señalan y delimitan las valvas, respectivamente. Micrografía electrónica de barrido de las zonas apical (B) y basal (C). D) Sección transversal E) Detalle de la región del replum, donde se observa uno de los septa extra interrumpido. Barra de escala: A) 1 mm. B) y C) 100 µm. D) y E) 500 µm. A la espera de una confirmación definitiva mediante la recuperación del fenotipo silvestre con una construcción transgénica, la no complementación entre pep1-1 y pep1-2 supone un importante aval para considerar a las mutaciones en el gen At4g26000 o PEP1 como un agente causal del fenotipo observado. IV.5.- ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN At4g26000 (PEP1). IV.5.1.- Estructura del gen PEP1. El gen At4g26000 se encuentra en la posición 88,7 cM del cromosoma IV, estando incluido en el clon F20B18 (codón de inicio de la traducción en la posición 35.058 pb y codón de parada en la posición 37.317 pb). Las distintas bases de datos (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; y TAIR, http://www.arabidopsis.org/) indican que la unidad de transcripción de este gen presenta un tamaño de 2.590 pb, en la que se incluyen 6 exones y 5 intrones, así como una secuencia líder de 24 pb en 5’ y otra de 304 pb en su región 3’ no traducida (Fig. IV.29). Adquirimos clones de cDNA completo del gen (RAFL08-13-K20 y RAFL09-64-E03; RIKEN Biosource Center, Experimental Plant Division, Tsukuba, Japón). Estos clones corroboran las posiciones de todas las facetas estructurales anteriormente descritas. La región codificante de PEP1 tiene un tamaño de 1.485 pb. El correspondiente producto proteico cuenta con 495 aa y un peso molecular de 54,02 kDa. Resultados 128 A atcttttttgtgttaccggttcaa ATG GCC GCC GTC GCA GAT TCC GTT GAG AAC AAC GGT TCC ATA AAC M A A V A D S V E N N G S I N 69 15 CTC CCT GAG AAT GAA AAC CTT ATA CCG GCG GGA TTC AGT GCC GCC GCA TTG CTT GAC GAA AAC L P E N E N L I P A G F S A A A L L D E N 132 36 TCT GGC GCT TTC CCT GAA TTG AAT CAG CCC GAT AGC TTA GCT GCT GCT GAG ACT ACC TTC CCC S G A F P E L N Q P D S L A A A E T T F P 195 57 GAT ACG AAC GAT TCC GCG GAG GAG AGG TGG CCA GGT TGG CCT GGT GAT TGC GTG TTT CGT ATG D T N D S A E E R W P G W P G D C V F R M 258 78 ATC GTT CCG GTG ACT AAA GTC GGA GCT ATT ATT GGA CGC AAA GGT GAC TTT ATA AAG AAG ATG I V P V T K V G A I I G R K G D F I K K M 321 99 TGT GAG GAG ACT CGT GCT CGT ATC AAA GTC CTT GAT GGT CCT GTT AAT ACT CCC GAT CGC ATC C E E T R A R I K V L D G P V N T P D R I 384 120 gttagtatctctatctccttctacgtgatttactgtgttcaaagctaattcgaatttggggatttttaatttctatttctaggg 468 tttcttaatcataagtaggaagattcttgagttgtgatcattaaagttgtgaacttttatcccctagttgtgcaatttgattac 552 tttatggttccaattatagtttgaagtgttcactaagttaattacttgctcaatgttatgttttag GTG TTA ATA TCT V L I S 630 124 GGT AAG GAA GAA CCA GAG GCC TAC ATG TCA CCG GCA ATG GAC GCA GTG TTG AGG GTG TTT AGA G K E E P E A Y M S P A M D A V L R V F R 693 145 CGT GTT TCA GGG TTG CCT GAT AAT GAT GAT GAT GAT GTT CAA AAC GCT GGA AGT GTC TTC TCT R V S G L P D N D D D D V Q N A G S V F S 756 166 TCA GTG CGT TTA TTA GTT GCT TCA ACG CAG GCG ATT AAT TTG ATT GGA AAA CAA GGA TCT TTG S V R L L V A S T Q A I N L I G K Q G S L 819 187 ATT AAG TCT ATA GTA GAG AAC TCT GGT GCA TCA GTT CGT ATT TTA TCA GAA G gtattatctatcat I K S I V E N S G A S V R I L S E E 885 205 ctgcagttttctgtttttacctaattgatctctttgtttgtgattgttaaagtttagtttttgctatttcaattcatgtctgtt 969 tttttttctaaaattggtgtctttgttgccagtttcttatttctctacttttttctgccag AG GAA ACA CCG TTT TAT E T P F Y 1.047 210 GCT GCA CAG GAT GAG AGG ATA GTG GAT TTG CAA GGG GAA GCT TTA AAG ATT CTT AAA GCA TTA A A Q D E R I V D L Q G E A L K I L K A L 1.110 231 GAA GCC ATT GTT GGA CAC CTT AGG AGA TTT TTA GTT GAC CAT ACT GTT GTC CCT CTC TTC GAG E A I V G H L R R F L V D H T V V P L F E 1.173 252 AAG CAA gtaagcttgcttgtttcaatcgagattattcctttcccttttttttcttttctgaattattgttatcttttcttat K Q 1.255 254 cttcag TAT CTA GCT AGG GTC TCT CAA ACT CGC CAG GAA GAA CCG TTA GCT GAA AGC AAG TCA Y L A R V S Q T R Q E E P L A E S K S 1.318 273 TCT CTG CAT ACT ATT TCG TCA AAT CTA ATG GAG CCT GAT TTC TCC CTC TTA GCA CGG AGG GAA S L H T I S S N L M E P D F S L L A R R E 1.381 294 CCT TTG TTT CTG GAG CGC GAT TCT CGG GTG GAC TCA CGT GTT CAG CCT TCG GGA GTT TCT ATC P L F L E R D S R V D S R V Q P S G V S I 1.444 315 TAC AGT CAG GAT CCT GTA CTG TCT GCC AGA CAC TCC CCA GGT CTT GCT CGG GTT TCT TCT GCT Y S Q D P V L S A R H S P G L A R V S S A 1.507 336 Resultados 129 TTT GTG ACA CAG gtagattcccttaaatacaacatcagctcctgaaaacgagtttagcgatatcatcttacttgttatg F V T Q 1.586 340 attagtcttccagcagtgattttgatcttaacacatctaacttgtttctctgaactagtagtgacgtttctataatggattctc 1.670 ttactag GTA TCT CAA ACG ATG CAA ATA CCA TTC TCC TAT GCA GAG GAT ATT ATT GGT GTA GAA V S Q T M Q I P F S Y A E D I I G V E 1.734 359 GGA GCT AAT ATA GCC TAT ATC CGT CGA AGA AGC GGA GCT ACC ATA ACC ATT AAA GAG AGT CCG G A N I A Y I R R R S G A T I T I K E S P 1.797 380 CAT CCT GAT CAA ATC ACA GTG GAA ATC AAA GGC ACA ACT TCT CAA GTA CAA ACT GCT GAG CAA H P D Q I T V E I K G T T S Q V Q T A E Q 1.860 401 CTA ATT CAA gtaagaacacattcgatctgtatatatatatatatactttctgcgacgtggcattgtataaacactaagatt L I Q 1.941 404 atgcttgctttgcatcctaccccgcctgcttcatcataaccgtattcttttgtttacgtgtgtgtag GAG TTC ATC ATC E F I I 2.020 408 AAT CAC AAG GAA CCA GTT TCG GTA TCA GGG GGA TAT GCC AGA ATC GAC TCT GGA TAT GTA CCT N H K E P V S V S G G Y A R I D S G Y V P 2.083 429 GCA TAT CCT CCT CAG CTA AGT AAC CGT CAA GAG CCG CTC CCG AGC ACC TAC ATG GGC ACA GAG A Y P P Q L S N R Q E P L P S T Y M G T E 2.146 450 CCG GTG CAG TAC AGA CCA ACA GCA TAC TCT CAG CTG GGG GGT CCT TCT ACC TAC ACA CCG ACC P V Q Y R P T A Y S Q L G G P S T Y T P T 2.209 471 CTG ACT GGG CAA ACT TAT GGT TCG GAA TAT AGA CCA GCT TCT GAT GTT GGT GGC TAC AGC AGT L T G Q T Y G S E Y R P A S D V G G Y S S 2.272 492 TAT AAT CTT TGA attggttgctgtgtttaagtttatttgcagattaatttctctttagagaaaggctcatttataatata Y N L * 2.352 495 atagagagggaaaaggaacaagttctagagagccaatgtagttgttggaatgtgtaatgtaaatctaggtgccctttttttttt 2.436 tttttttcatacctcgatatatgtcacactacgtttctggtcaaataagaacatgttttttctttcttttttgtatgaatttgt 2.520 ttatcagaagtcagaatgattcagttttaagaaatttttagttaacgttttacaacaata 2.590 B 100 pb 5’ 3’ ATG TGA Figura IV.29.- Secuencia y estructura del gen PEP1. A) Secuencia nucleotídica y peptídica del gen PEP1. Los exones se indican en mayúscula y los intrones en minúscula. Los aminoácidos aparecen debajo de la secuencia codificante. La numeración aparece a la derecha de la secuencia. B) Estructura esquemática de la unidad de trancripción de PEP1. Los exones se representan en azul. La orientación de la flecha indica el sentido de la transcripción. Resultados 130 IV.5.2.- PEP1 es una proteína con dominios KH. El análisis bioinformático de la secuencia proteica de PEP1 indica la existencia de tres dominios de unión a ácidos nucleicos del tipo KH (K homology, Aasheim et al., 1994). El dominio KH, inicialmente identificado en la ribonucleoproteína heterogénea nuclear humana (hnRNP-K, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-K, Aasheim et al., 1994), es el segundo motivo más abundante de unión a RNA (Lorkovic y Barta, 2002). Los dominios KH comprenden regiones de alrededor de 70 aa donde se sitúa una secuencia consenso de 9 aa. Esta estructura se conserva entre los distintos miembros de esta familia de proteínas (Fig. IV.30; Burd y Dreyfuss, 1994; Musco et al., 1997; Adinolfi et al., 1999; Grishin, 2001). Existen dos tipos de dominio KH (tipo I y II), en función de la estructura terciaria que la proteína adopta (Castiglione et al., 1995). En PEP1, los dominios KH pertenecen a la clase I y se sitúan entre las posiciones aminoacídicas 73 a 140, 165 a 234, y 340 a 403, respectivamente (Fig. IV.30). NH3 KH KH COOH KH 1 495 aa 73 140 165 340 403 234 VIGXXGXXI Figura IV.30.- Estructura esquemática de la proteína PEP1. Los dominios KH se representan como recuadros verdes, indicando su posición en la proteína. En el recuadro inferior aparece la secuencia consenso del dominio KH. Encontramos miembros de esta familia de proteínas tanto en procariotas (Yersinia pestis, Streptomyces coelicolor; http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov) como en eucariotas (Sacharomyces cerevisiae, Tripanosoma brucei, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Danio rerio, Xenopus laevis, Mus musculus, Homo sapiens, inter alia; Chekanova et al., 2002). Un ejemplo notable lo constituye la proteína FMR-1 (Familial Mental Retardation), cuya deficiencia genera el síndrome del X-frágil (Gibson et al., 1993; Siomi et al., 1994), una de las causas más frecuentes de retraso mental (Cummings, 2002). Mediante ensayos in vitro, se comprobó que las proteínas KH mayoritariamente se unen a RNA (Musco et al., 1997; Baber et al., 1999), aunque existe un caso descrito de Resultados 131 unión a DNA de cadena sencilla (Braddock et al., 2002a; Braddock et al., 2002b), y la proteína hnRNP K, que interacciona con la cromatina (Bomsztyk et al., 2004). Tabla IV.9.- Proteínas que presentan dominios KH en Arabidopsis thaliana. Gen At2g03110 At1g09660 At5g06770 At3g12130 At2g38610 At5g04430 At5g56140 At3g08620 At5g08420 At1g33680 At1g14170 At4g26000 At4g26480 At5g09560 At5g15270 At3g04610 At3g32940 At4g18375 At1g51580 At2g25970 At5g46190 At2g22600 At5g53060 At4g10070 At5g51300 At5g64390 a b Tamaño de la proteína 155 163 240 248 286 313 315 319 391 407 479 495 555 567 568 577 590 606 621 632 644 649 660 748 804 833 Tipo de dominios y organización KHa KH C3Hb; KH; C3H C3H; KH; C3H KH 3 KH KH KH KH KH 3 KH 3 KH KH 2 KH 4 KH 3 KH KH 5 KH 5 KH 2 KH 5 KH 4 KH 3 KH 2 KH KH; 2C2HCc; RRMd 4 KH/5 KH c Producto Referencia PEP1 Esta Tesis FLK Lim et al., 2004 HEN4 Cheng et al., 2003 d Motivo KH. Dedos de zinc de tipo C3H. Dedos de zinc de tipo 2C2HC Motivo de reconocimiento de RNA (RNA Recognition Motif). Los dominios KH se han descrito en proteínas implicadas en distintos procesos del metabolismo del RNA regulando su estabilidad, transporte, represión traduccional o procesamiento de intrones (Gibson et al., 1997; Ostareck-Lederer et al., 1998; Krecic y Swanson, 1999; Lee y Schedl, 2001; Cheng et al., 2004). Las mutaciones en algunos de los genes correspondientes pueden provocar importantes alteraciones en distintos procesos del desarrollo animal (Ebersole et al., 1996; Aaron et al., 1997; Nabel-Rosen et al., 1998; Zhu y Chen, 2000; Lee y Schedl, 2001; Labourier et al., 2002; Nancy et al, 2002; Perrone-Bizzozero y Bolognani, 2002; Pilotte et al., 2001; Marin y Evans, 2003). Las proteínas KH también son ubicuas en las plantas, aparecen tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. En Arabidopsis thaliana se han descrito 26 Resultados 132 miembros de la familia (Tabla IV.9; Lorkovic y Barta, 2002), las cuales deben cumplir papeles muy similares a los ya descritos en otros organismos, aunque sólo a dos de estas proteínas se les ha asignado una función. La proteína HEN4 regula postranscripcionalmente a AG (Cheng et al., 2003) y el producto del gen FLOWERING LOCUS K (FLK) modula el procesamiento del mRNA de FLOWERING LOCUS C (FLC), un regulador del tiempo de floración (Lim et al., 2004). FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY474 MAEAEDQQNFVAHNGDQVPDQGSDELHNGLPYQVHDETLVHQPYEVEDPILEPQQYEVPD ------------MDG-LVENFDADDLG-EMPQNHYNEEQLIPYSDVSHPYNE-------------------------MAAVADSVENNGSINLPENENLIPAGFSAAALLD----------------------------MADPA----------------AAAAAAEFGD-------:* : 60 38 34 15 FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 PTLEPQQYEVPDQTLEPQQYEVDDQLEYHQYQLQDQANEDVQDHSQDDLQYQPQNQEQFQ 120 ---EPD--------------NMDNVEEGNPYIQQ------VSLYSEE-----PENQ---- 66 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 LQDEAHDQAQYQAQGDVQDHNGDEVQDKVEDEEGIPEHLESLQKSEPEEDATVGGEEKRW 180 YNEEPSNPYQEESD---NAYNG-----EVKQQDSLPVEAD-----------------KKW 101 -ENSGAFPELNQPDS--LAAA----------ETTFPDTNDS--------------AEERW 67 -PDSPPAPAAEEAEA--AAAVG---------EEAVPAAEAA--------------AAKRW 49 :. :.: : .* ::* FLK OSQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 PGWPGETVFRMLVPAQKVGSIIGRKGDVIKKIVEETRARIKILDGPPGTTERAVMVSGKE PGWPGESVFRILIPAQKVGAIIGRKGEFIKKMCEESKARIKILDGPPGVPERTVMISAKD PGWPGDCVFRMIVPVTKVGAIIGRKGDFIKKMCEETRARIKVLDGPVNTPDRIVLISGKE PGWPGDSVFRLVVPVLKVGSIIGRKGELIKRLVEETKAKVRVLEGPVGATERIVLVSGKE *****: ***:::*. ***:******:.**:: **::*::::*:** ...:* *::*.*: 240 161 127 109 FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 EPESSLPPSMDGLLRVHMRIVDGLDGEASQAPP-PS-KVS-TRLLVPASQAGSLIGKQGG EPDAPISPAMDGLFRVYKRITDGSDGDSGQPERNIS-NVGPTRLLVPASQAGSLIGKQGA EPEAYMSPAMDAVLRVFRRVSGLPDNDDDDVQNAGS-VFSSVRLLVASTQAINLIGKQGS DPALELPPAMDALMRVFKRVSGITDGAAEGTQAATAPGVCAARLLVPGAQAINLIGKQGA :* :.*:**.::**. *: . *. : . .****..:** .******. 297 220 186 169 FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 TVKAIQEASACIVRVLG--SEDLPVFALQDDRVVEVVGEPTSVHRALELIASHLRKFLVD TIKSIQDSSKSIVRIV----ETLPLVALNDDRVVEIQGEPVGVQKALESIASHLRKFLVD LIKSIVENSGASVRILS--EEETPFYAAQDERIVDLQGEALKILKALEAIVGHLRRFLVD SIKAIQEGTGATIRVISIDERERPFYVIEDERIVEIQGETEKVLKALQAVSNHLRKFLVD :*:* : : . :*:: . *. . :*:*:*:: **. : :**: : .***:**** 355 276 244 229 FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 RSIIPFFENQMQKPTRQMDHMPPPHQSWGPPQ--GHAPS-VGGGGYGHNPPPYMQPPPRH RSVLPLFEGQMKMHNAQREQAMAAPQPWGPPQPWGPPPSHLPPGGPGYGGHPQFMPPRPQ HTVVPLFEKQYLARVSQTRQEEPLAESKSSLH---TISSNLMEP--------DFSLLARR HSVLPLFEKTN-ATVTQDRSTDAWTD-ISHPS---IVSAQINQPPPVVD---EYILPMKR ::::*:** * . : . .: : : 412 336 293 281 FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 DSYYPPPEMRQPPMEKQPHQGISAYGREPPMNVHVS--SAP----PMVAQQVTQQMQIPL DNYYPPPDV--PSMEKQPHYGISAYGREAPTGVSASGNQPP----SHVASQVTHNMQIPL EPLFLERDS--RVDSRVQPSGVSIYSQDPVLSARHSPGLAR--VSSAFVTQVSQTMQIPF DPLFLEREP--LIDHNIHRSGVSLYGRDPALSTLRTSGIHGGGPGGPLLSQITQTMQIPL : : : . *:* *.::. .. : . *::: ****: 466 390 349 339 Resultados 133 FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 SYADAVIGTSGSNISYTRRLSGATVTIQETRGVPGEMTVEVSGTGSQVQTAVQLIQNFMA SYADAVIGAAGASISYIRRHSGATVTIQESRGAPGEMTVEIIGSASQVQTAQQLVQNFMA SYAEDIIGVEGANIAYIRRRSGATITIKESP-HPDQITVEIKGTTSQVQTAEQLIQEFII TYAEDIIGVKGANIAYIRANSGAVVTIQESLGSPDDITVEMKGTSSQVQAAYQLIQDSLA :**: :**. *:.*:* * ***.:**:*: *.::***: *: ****:* **:*: : 526 450 409 399 FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 EA--GAPAP-------AQPQTVAPEQQG------YNPY----------ATHGSVYAAAPT EAPQGPPPP-------ASNPPAPAVDLS------YGSYPPPY-----GASYGSAASGAGP NHKEPVSVSGGYARIDSGYVPAYPPQLSNRQEPLPSTYMGTEPVQYRPTAYSQLGGPSTY AHRDSVRSS--YAGLDPVYRPSYSQYGS-------STYPSSS-----LPSYSSMDGGGYS . . . . . ..* .::.. . . 561 492 468 445 FLK OsQ8W5C2 PEP1 OsQ9AY47 NPP--G-GYATDYSSG---YGY-------------------------------------APHNGG-SYGGTTYPS---YGY-------------------------------------TPTLTGQTYGSEYRPASDVGGYSSYNL--------------------------------SSGLGG--YGSSYR-------Y-------------------------------------. * *. * 577 510 495 458 Figura IV.31.- Alineamiento de las secuencias peptídicas de PEP1, FLK y sus respectivos ortólogos en arroz. Con letras blancas sobre fondo negro se anotan los aminoácidos idénticos en las cuatro proteínas, y los similares en negro sobre fondo gris. Las proteínas de arroz aparecen con su número de acceso en las bases de datos. PEP1 posee un ortólogo en arroz (Q9AY47) cuya similitud es superior al 75%, con una identidad cercana al 48%. Posee una gran semejanza estructural con 3 dominios KH situados en posiciones equivalentes. Su gen también presenta 6 exones y 5 intrones. Este elevado índice de conservación entre monocotiledóneas y dicotiledóneas debe constituir el reflejo de una importante función que necesita ser preservada (Fig. IV.31 y IV.32). KH PEP1 KH KH 495 1 OsQ9AY47 KH (48%) KH 1 458 KH FLK (42,4%) KH KH KH 1 577 OsQ8W5C2 (38%) KH 1 KH KH 510 Figura IV.32.- Alineamiento estructural de PEP1, FLK y sus respectivos ortólogos. Se ordenan de arriba abajo en función de su grado de identidad con PEP1. En los 4 polipéptidos, los dos primeros motivos KH se sitúan en posiciones cercanas. Resultados 134 El parálogo más cercano a PEP1 en el genoma de Arabidopsis thaliana es precisamente FLK (Lim et al., 2004), el cual posee un ortólogo en arroz con una relación estructural muy similar a la que existe entre PEP1 y su ortólogo en esta misma especie (Fig. IV.31 y IV.32). FLK también presenta 3 motivos KH, 6 exones y 5 intrones, pero su grado de homología con PEP1 es menor (42,4% de identidad) que con respecto a su ortólogo en arroz. El grado de semejanza de PEP1 con otras proteínas KH de Arabidopsis thaliana es mucho menor. Con respecto a HEN4, la identidad es de tan sólo el 23%. Con respecto a las proteínas KH de metazoos, PEP1 presenta grados de homología inferiores al 30%. IV.6.- LOCALIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN LOS ALELOS DE pep1. El gen PEP1 presenta 6 exones y 5 intrones. En la Figura IV.33 se representa, de forma esquemática, la localización de las inserciones de T-DNA en cada una de las líneas examinadas. Las posiciones exactas de las inserciones se verificaron mediante PCR y secuenciación. pep1-3 PEP1 T-DNA Borde izquerdo (LB) Borde derecho (RB) * pep1-4 pep1-5 pep1-2 Figura IV.33.- Localización de las inserciones de los alelos pep1 en el gen PEP1. Se señala la orientación del T-DNA en cada caso. La flecha y el asterisco rojos indican el punto de la inserción en pep1-1. La orientación de la flecha de trazo grueso indica el sentido de la trancripción. IV.6.1.- Expresión de PEP1 en los alelos mutantes. Llevamos a cabo experimentos de RT-PCR para comprobar la expresión de PEP1 en los alelos pep1-2 y pep1-4. Se realizaron reacciones en paralelo a partir de cDNA de Col-0 y pep1-1. Utilizamos el mismo control de expresión que en el apartado IV.4.1 (Fig. IV.34). Resultados 135 -1 1-2 1-4 0 1 p p p l Co pe pe pe 0 ep1-1 ep1-2 ep1-4 l p p Co p 500 pb PEP1 ACT2 Figura IV.34.- Análisis de la expresión en los alelos pep1-2 y pep1-4. A la izquierda, expresión de PEP1 en pep1-1, pep1-2, pep1-4 y Col-0. A la derecha, expresión de ACT2. Se utilizaron como molde 5 µg de RNA total de inflorescencias. Los cebadores utilizados en la amplificación por PCR fueron FUP1-37 y FUP1-38 (Tabla III.3) que dan lugar a un fragmento de cDNA de 244 pb. De nuevo, no detectamos expresión en el alelo pep1-1 (Fig. IV.34), así como en pep1-4, lo que indica que debe tratarse de un alelo nulo. Por el contrario, se detecta la presencia del transcrito en el RNA de pep1-2. La inserción de T-DNA en este alelo se localiza a tan sólo 15 pb antes del codón de parada (Fig. IV.33), no impidiendo la transcripción del correspondiente mRNA. Ignoramos si esta situación provoca un transcrito funcional, o si compromete su estabilidad o su traducción. Resulta paradójico que el alelo aparentemente más débil de los examinados, pep1-4, es con toda probabilidad nulo, mientras que no podemos precisar acerca de pep1-2, supuestamente el alelo más fuerte con la excepción de pep1-1 (sección IV.4.1). Tal vez, el alelo pep1-2 dé origen a una cierta cantidad de un producto con propiedades ligeramente antimorfas, lo que podría explicar su fenotipo. IV.7.- OBTENCIÓN DE CONSTRUCCIONES Y GENERACIÓN DE PLANTAS TRANGÉNICAS. Para confirmar que las mutaciones en At4g26000 son responsables del fenotipo Pep1 planteamos ensayos de complementación funcional o rescate fenotípico. Resultados 136 IV.7.1.- Generación de las contrucciones. IV.7.1.1.- Construcción genómica de PEP1. Mediante PCR, obtuvimos un fragmento de 5.111 pb a partir del BAC F20B18 (cebadores OCF11 y OCF12; Tabla III.3). Este fragmento contiene la región codificante del gen At4g26000, así como 2.656 pb de la región 5’ y 195 pb del extremo 3’ no traducido, incluyendo el sitio de poliadenilación. Se utilizó una mezcla de polimerasas de DNA con actividad correctora de prueba (High-Fidelity, Roche Diagnostics). Inicialmente, estos fragmentos se clonaron en el vector pGEM-3Zf(+) utilizando las enzimas SalI y XbaI, presentes tanto en el plásmido como en el extremo 5’ de los cebadores utilizados. Se seleccionaron clones positivos de E. coli y se verificó su identidad mediante secuenciación. Uno de los 15 clones resultantes se denominó pGEM:gOCF11~12, se liberó su inserto con SalI y XbaI, y se introdujo en el plásmido pGreenII0179 previamente digerido con las mismas enzimas. Los nuevos clones en E. coli se denominaron pGreenII0179:gOCF11~12 (Fig. IV.35). Con su DNA plasmídico, se transformó la estirpe LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens, portadora del plásmido pSOUP (Sección III.2). Mediante PCR determinamos la integridad del transgén en los clones positivos de Agrobacterium tumefaciens, utilizando los cebadores M13F y M13R. En todos los casos, el producto de PCR presentó el tamaño esperado. IV.7.1.2.- Construcción de sobreexpresión 35S::PEP1. Amplificamos mediante PCR toda la región codificante comprendida entre los oligonucleótidos FUP1-27 y FUP1-31 (Tabla III.3) a partir del clon RAFL08-13-K20 (AY056288), portador del cDNA de PEP1. El fragmento resultante de 1.715 pb contenía una porción de 32 pb anteriores al codón de inicio y 136 pb de la región 3’. El fragmento se clonó directamente en pGEM-T y se secuenciaron distintos clones obtenidos en E. coli, denominándolos pGEM-T:cFUP1-27~31. El inserto se liberó con SalI y SmaI, presentes en los cebadores utilizados en la amplificación, y se clonó en el T-DNA del plásmido pBINJIT (Sección III.2), con el que se transformó la estirpe C58C1 de Agrobacterium tumefaciens. En este caso, identificamos los clones positivos mediante hibridación en colonia. La sonda utilizada (región del cDNA entre los cebadores FUP1-17 y FUP1-18; Tabla III.3) se generó mediante PCR. Los clones positivos obtenidos (pBINJIT:cFUP127~31, Fig. IV.35) se verificaron mediante secuenciación. Resultados 137 2,48 Kb A SalI XbaI OCF11 OCF11 Diana para SalI Diana para XbaI B SalI SmaI FUP1-27 FUP1-31 Diana para SalI Diana para SmaI Figura IV.35.- Esquemas de las construcciones transgénicas. A) Esquema de la construcción con el clon genómico pGreenII0179:gOCF11~12. B) Esquema de la construcción de sobreexpresión génica pBINJIT:cFUP1-27~31. Las flechas negras indican el sentido de la transcripción. Resultados 138 IV.7.2.- Transferencia de transgenes y selección de transformantes. Se infectaron entre 100 y 250 plantas (individuos T1) mediante inmersión floral (floral dipping). Se sembraron semillas descendientes de las plantas T1 (semillas T2) en placas de Petri con una densidad media de 2.500 semillas por placa. El medio se enriqueció con higromicina en el caso de la construcción pGreenII0179:gOCF11~12, y con kanamicina en el de pBINJIT:cFUP1-27~31. Se obtuvieron un total de 22 individuos transformantes pep1-2 y 8 Col-0, portadores de la construcción genómica pGreenII0179:gOCF11~12, de entre cerca de 30.000 y 13.000 semillas examinadas, respectivamente. En el caso del clon de sobreexpresión pBINJIT:cFUP1-27~31 se obtuvieron 6 líneas en fondo Col-0 y 4 líneas en pep1-2 a partir, en cada caso, de 15.000 semillas sembradas. IV.7.3.- Fenotipo de las plantas transgénicas. IV.7.3.1.- Fenotipo de las plantas transformadas con el clon genómico. Se transformaron plantas mutantes pep1-2 y de su ancestro silvestre Col-0. En ambos casos se transmitió a la progenie la resistencia a la higromicina. La presencia de esta construcción en el silvestre no parece inducir la aparición de ninguna anomalía detectable, mientras que su presencia en pep1-2 determina la desaparición de su fenotipo mutante. Desde el inicio del desarrollo vegetativo, estas plantas muestran características silvestres, recuperando el aspecto y el ritmo de aparición de las hojas de su roseta (plastocrono), tal como se aprecia en la Figura IV.36. Tampoco se detectan errores en la filotaxia ni frutos con valvas extra (resultados no mostrados), aunque la ausencia de este último rasgo se debe interpretar con cautela debido a su penetrancia incompleta en este mutante. Todas estas características se transmitieron a la descendencia. De estas observaciones se desprende el funcionamiento de nuestra construcción y que At4g26000 es PEP1. Una verificación adicional obvia a este punto es la recuperación del fenotipo silvestre en plantas pep1-1. Hemos realizado cruces entre diversas líneas pep1-2, portadoras de la construcción genómica, y pep1-1. En el momento de elaboración de esta memoria, podemos atestiguar el fenotipo silvestre de las plantas F1 de estos cruzamientos. La roseta, a diferencia de lo ocurrido en el transheterocigoto pep1-1/pep1-2 (sección IV.4.2), no presenta fenotipo mutante, ni tampoco se observan alteraciones en la filotaxia o en los frutos. Queda para un examen posterior el análisis del fenotipo de las plantas F2 pep1-1/pep1-1 portadoras de esta construcción transgénica. Resultados 139 B A Figura IV.36.- Fenotipo de las plantas pep1-2 portadoras de la construcción genómica. A) A la izquierda una roseta pep1-2 de 10 días tras la germinación, portadora de la construcción genómica, con una clara recuperación del ritmo de aparición de las hojas. A la derecha una roseta de la misma edad de pep1-2. B) Rosetas de 14 días tras la germinación. A la izquierda una planta transgénica y a la derecha una roseta de pep1-2. Barras de escala 1 cm. IV.7.3.2.- Fenotipo de las plantas transformadas con el clon de sobreexpresión. Las líneas pep1-2 portadoras de la construcción de sobreexpresión manifiestan fenotipo silvestre, en unos términos equivalentes a los descritos para el clon genómico (sección IV.7.3.1 y datos no mostrados). En el momento presente ignoramos el grado de expresión del transgén en estas construcciones, por lo que no podemos establecer comparaciones con los transformantes con el clon genómico. En cualquier caso, la resistencia al antibiótico kanamicina se transmitió a la progenie, sugiriendo la estabilidad de los transformantes. Como en el caso anterior, la transformación de plantas silvestres con el transgén no indujo la aparición de ningún rasgo particular. Una excepción notable la constituye una línea que mostró un fenotipo consistente en diversas alteraciones del desarrollo vegetativo (roseta con muchas hojas pálidas y picudas), inflorescencias ahiladas y frutos diminutos muy poco fértiles, rasgos que en su conjunto recuerdan el fenotipo del aislado original pep1-1 (Fig. IV.37). Una interpretación verosímil para el fenotipo de esta línea es un fenómeno de cosupresión desencadenado por la sobreexpresión de PEP1. Las líneas transgénicas portadoras del vector sin la correspondiente construcción, no presentan ningún fenotipo aparente. Resultados 140 Figura IV.37.- Selección de transformantes resistentes a la kanamicina (plantas Col-0 portadoras de la construcción para la sobreexpresión de PEP1). A) Transformante rodeado de individuos sensibles. Escala 1 mm. B) Posible efecto de cosupresión en una de las líneas transformantes. Barra de escala 1 cm. B A IV.8.- ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL GEN PEP1. IV.8.1.- Detección del transcrito de PEP1 en distintos órganos de la planta mediante RT-PCR semicuantitativa (SQRT-PCR). Para tener una estima de los niveles relativos de expresión de PEP1 en distintos órganos de la planta realizamos ensayos de SQRT-PCR (III.7.9.5). Se analizó su expresión en raíces, tallo, hojas, flores y frutos de Col-0 (Fig. IV.38). A Col-0 R T H Fl Fr PEP1 ACT2 Figura IV.38.- Niveles de expresión de PEP1 en distintos órganos del silvestre. Se efectuó SQRT-PCR a partir de 5 µg de RNA total y amplificando con los cebadores FUP1-37 y FUP1-38, que generan un fragmento de cDNA de 244 pb. Como control, utilizamos el gen ACT2. Ambos productos (PEP1 y ACT2) se amplificaron independientemente y se usaron como sondas. R: raíz; T: tallo; H: hoja; Fl: Flores; Fr: fruto. El transcrito de PEP1 se detecta en la raíz y en todas las zonas aéreas examinadas, aunque sus niveles difieren. Su expresión en las raíces es aparentemente menor que en el resto de órganos examinados. Tanto en el tallo principal, como en las flores, su abundancia es mayor y similar entre sí. En hojas y frutos, PEP1 se expresa en Resultados 141 menor medida. La expresión ubicua de este gen es consistente con el grado de pleiotropía observado en el fenotipo Pep1. IV.8.2.- Localización del mRNA de PEP1 mediante hibridación in situ. Analizamos la expresión de PEP1 mediante hibridación in situ en flores y frutos silvestres, tal como se describe en el apartado III.8.4 de Materiales y Métodos. Las ribosondas sentido y antisentido se obtuvieron tras clonar en pGEM-T una secuencia de 368 pb correspondiente al cDNA entre los cebadores FUP1-4 y FUP1-6 (Tabla III.3). El mRNA de PEP1 se detecta en las regiones laterales del meristemo floral. Durante el desarrollo de la flor, detectamos el transcrito en los estambres y carpelos en crecimiento (Fig. IV.39 A). Tras la antesis, la expresión se localiza en regiones correspondientes al replum (Fig. IV.39). A B r v s r Figura IV.39.- Localización del mRNA de PEP1. A) Flores silvestres. B) Sección transversal de un fruto silvestre. Las flechas señalan las regiones donde se detecta la señal. v: valva, r: replum, s: septum. El tamaño de las barras de escala se indica en cada una de las imágenes. IV.9.- ANÁLISIS DE LAS INTERACCIONES GENÉTICAS DE PEP1 El análisis genético nos permite realizar inferencias acerca de las funciones génicas implicadas en un determinado proceso biológico. Con la intención de obtener indicios sobre cuáles son los mecanismos y vías de desarrollo en los que participa PEP1, estudiamos las interacciones de sus alelos mutantes con los de otros genes que actúan en distintos procesos del desarrollo de Arabidopsis thaliana. La elección inicial se basó en criterios de supuesta afinidad de acción molecular, similitud de secuencia y fenotipo observado en dichos mutantes, particularmente en el Resultados 142 pistilo. Analizamos posibles interacciones entre alelos pep1 y mutaciones en los genes CLV1 (Clark et al., 1993) CLV2 (Kayes y Clark, 1998), CLV3 (Fletcher et al., 1999), WUS (Laux et al., 1996), FUL (Gu et al., 1999), HEN2 (Western et al., 2002), HUA1 (Liu et al., 2001), HUA2 (Chen y Meyerowitz, 1999) y FLK (Lim et al., 2004) IV.9.1.- Dobles y triples mutantes con hua1, hua2 y hua enhancer2 (hen2). Los genes HUA1 y HUA2 (Chen y Meyerowitz, 1999; Liu et al., 2001) participan en la ruta de maduración del mRNA de AGAMOUS (AG), y se demostró la capacidad de HUA1 de unirse a RNA (Cheng et al., 2003). Las mutaciones hua, por separado, no generan ningún fenotipo destacable en la planta. En cambio, los dobles mutantes hua1-1 hua2-1 presentan ciertas interacciones florales muy leves y una gran reducción de su porte, lo que evidencia su papel en el desarrollo vegetativo (Chen y Meyerowitz, 1999). Los dobles mutantes hua1-1 pep1-2, así como hua2-1 pep1-2, no muestran ningún fenotipo reseñable. En el triple mutante, no obstante, se aprecia una cierta reducción adicional del porte de la planta con respecto al doble mutante hua1-1 hua2-1 (resultados no mostrados), lo que insinúa una interacción de PEP1 con estos genes durante el desarrollo vegetativo. La mutación hen2 causa una disminución en el tamaño de la planta, mayor número de flores en las inflorescencias y errores ocasionales de filotaxia (Western et al., 2002). En las flores se observa un aumento en el número de pétalos, y frutos más pequeños y ensanchados que en el silvestre. El gen HEN2 codifica una helicasa de tipo DExH. Se ha argumentado que las proteínas con dominios KH requieren la función de una helicasa para poder llevar a cabo su actividad. Teniendo en cuenta este razonamiento, obtuvimos el doble mutante pep1-2 hen2-1. No se observó ningún indicio de interacción entre ambas mutaciones, salvo una incidencia en las alteraciones de la filotaxia ligeramente superior a cualquiera de los mutantes simples (no mostrado). IV.9.2.- Doble mutante con fruitfull (ful). Las plantas ful presentan frutos de reducido tamaño como resultado de la supresión del alargamiento de las células de la valva y, como consecuencia, el replum de estos frutos se dispone en zig-zag (Gu et al., 1999). El gen FUL, codifica un factor de transcripción de tipo MADS-box. Su función principal es la especificación de la identidad de las células de la valva, especialmente tras la polinización. Resultados 143 ful-1 es un alelo producido por la inserción de un transposón y confiere resistencia a la kanamicina. Usando plantas ful-1 como parental masculino, realizamos cruzamientos con pep1-2. El cultivo posterior en kanamicina nos permitió verificar la autenticidad de la generación F1 y seleccionar en la generación F2 individuos portadores de este alelo. El doble mutante se identificó mediante el genotipado molecular de pep1-2 (Tabla III.6) y la observación del fenotipo Ful. La progenie F3 de estos individuos fue homogénea. Estas plantas muestran la aditividad de fenotipos como errores de filotaxia, roseta típica de pep1-2, y la aparición de frutos Ful. No se aprecian diferencias entre los frutos ful-1 y los del doble mutante (Fig. IV.40). Este resultado puede indicar la falta de interacción entre ambas actividades génicas, o bien la existencia de otras funciones redundantes con PEP1. A B Figura IV.40.- Fenotipo del doble mutante ful-1 pep1-2. A) Fruto ful-1. B) Fruto ful-1 pep1-2. Barras de escala 1 mm. IV.9.3.- Doble mutante con flowering locus K (flk). El parálogo más cercano a PEP1 es el gen FLK (sección IV.5.2 y Fig. IV.31 y IV.32). Recientemente se ha descrito su papel durante la inducción floral a través de la ruta autónoma (Lim et al., 2004). El rasgo fenotípico más característico de estos mutantes es un retraso muy acusado de la floración (Lim et al., 2004). La similitud estructural se corresponde en muchas ocasiones con fenómenos de redundancia o solapamiento funcional (Liljegren et al., 2000b; Hawley y Walker, 2003). Con esta idea, decidimos construir el doble mutante flk pep1. Utilizamos una línea de inserción en el gen FLK (SALK_001523; Tabla III.2) procedente de la colección SALK de Resultados 144 T-DNA, a la que hemos denominado flk-3 de manera provisional. La inserción se localiza en el primer exón, a pocos nucleótidos del inicio de la traducción, por lo que resulta muy verosímil que se trate de un alelo nulo. De hecho, el fenotipo de retraso de la floración que muestran los individuos homocigóticos es totalmente acorde al descrito en Lim et al. (2004). No obstante, un rasgo no descrito con anterioridad y observado en nuestro laboratorio consiste en la aparición ocasional de anomalías en la disposición filotáctica, no observándose alteraciones en sus frutos. El alelo pep1-4 manifiesta un fenotipo más suave que pep1-2 respecto al patrón de filotaxia, además de facilitar la selección de individuos mediante el cultivo en kanamicina, razones por las que elegimos este alelo para construir el doble mutante con flk-3. Los genotipos de los individuos en la segregación F2 se establecieron mediante genotipado molecular (Tablas III.6 y III.7). A B C D E Figura IV.41.- Interacción entre flk y pep1-4. A) De izquierda a derecha, plantas flk-3, dos individuos FLK/flk-3 pep1-4 y un individuo pep1-4. Los individuos flk-3 muestran un retardo muy acusado de la floración. Las plantas FLK/flk-3 pep1-4 presentan un menor retraso de la floración. B) Planta flk-3 (izquierda) y FLK/flk-3 pep1-4 (derecha). Se recuadra una alteración muy aparente de la filotaxia de la que se muestra una ampliación en (C). D) Disposición filotáctica anormal de los frutos en un individuo FLK/flk-3 pep1-4. E) Distintas alteraciones (flechas rojas) en el patrón de filotaxia en una planta FLK/flk-3 pep1-4. En todos los casos, plantas de 50 días tras la germinación.Barras de escala: A y B 5 cm; C-E 1 cm. Los individuos flk-3 manifiestan una gran demora en la transición floral (Fig. IV.41 A y B), mientras que el comportamiento de los individuos heterocigotos FLK/flk-3 es Resultados 145 completamente silvestre, en consonancia con datos anteriores (Lim et al., 2004). Sin embargo, en un fondo mutante pep1-4 la mutación flk-3 parece seguir una pauta semidominante. Los individuos FLK/flk-3 pep1-4 presentan un retraso moderado de la floración (Fig. IV.41 A), alcanzando finalmente un porte comparable con el silvestre. No obstante, el rasgo más llamativo de estas plantas es la gran profusión de perturbaciones en su filotaxia (Fig. IV.41 C-F), mucho más numerosas que las que presentan cada uno de los mutantes simples. Este resultado sugiere la existencia de una interacción entre ambas proteínas KH en la determinación de las posiciones de aparición de los órganos laterales. Por otro lado, algunos frutos presentan una diferencia de tamaño muy evidente entre una valva y otra (Fig. IV.42). A B Figura IV.42.- Fenotipo de los frutos en individuos FLK/flk-3 pep1-4. A) Frutos de FLK/flk-3 pep1-4 con una clara diferencia entre el tamaño de sus dos valvas. B) Se muestra la diferencia de las valvas en la zona basal. C) Disposición de las valvas en el silvestre. Barras de escala 1 mm. C Los alelos pep1 y flk son absolutamente recesivos (esta memoria; Lim et al., 2004). Un indicio suplementario de interacción entre dos genes en un mismo proceso biológico es la manifestación de haploinsuficiencia combinada (Hawley y Walker, 2003). Por tanto, examinamos el fenotipo de los dobles heterocigotos, comprobando la presencia ocasional de alteraciones filotácticas (datos no mostrados). Este resultado se basa en la observación de un número limitado de plantas, por lo que debe interpretarse con cautela. Debido al retraso en la floración, tan acusado en los individuos de genotipo flk/flk, no ha sido posible estudiar el fenotipo de los individuos flk-3 pep1-4 durante el transcurso del presente trabajo. El alelo pep1-4 produce un retraso leve en el tiempo de floración, por lo que es plausible que la mutación flk-3 sea epistática sobre aquella en este aspecto del fenotipo, aunque a priori no se pueden descartar otros tipos de interacción. Resultados 146 IV.9.4.- Interacciones de pep1 con los genes de la ruta de los genes CLAVATA. Los genes CLAVATA (CLV1, CLV2 y CLV3) intervienen en la ruta de señalización que lleva su nombre restringiendo el número de células en estado indiferenciado en los meristemos apical y floral (Rojo et al., 2002). Las mutaciones de pérdida de función en cualquiera de estos genes produce meristemos agrandados, lo que provoca un aumento del número de hojas en la roseta, errores de filotaxia, flores adicionales y órganos florales supernumerarios, siendo su rasgo más característico la aparición de frutos con un número de valvas superior al silvestre (Clark et al.,1993, 1995; Kayes y Clark, 1998). El gen CLV3 codifica un pequeño péptido de localización extracelular que activa a receptores de tipo LRR codificados por los genes CLV1 y CLV2, iniciando la transmisión de señal que regula el crecimiento del meristemo (Rojo et al., 2002). Por consiguiente, analizamos las interacciones entre alelos de pep1 y los de clv1, clv2 y clv3. IV.9.4.1.- Interacciones con clavata3 (clv3). Efectuamos el cruzamiento de pep1-4 con plantas clv3-2 como donante de polen. El alelo clv3-2 es el más fuerte de su serie y es completamente recesivo (Clark et al.,1995). Seleccionamos en kanamicina individuos F2 resistentes, con fenotipo Clv3 y cuya progenie F3 no segregara individuos sensibles al antibiótico. El fenotipo de las plantas clv3-2 pep1-4 es indistinguible del mutante simple clv3-2 (Fig. IV.43). Figura IV.43.- Fenotipo de los dobles mutantes clv3-2 pep1-4. Barra de escala 1 mm. clv3-2 clv3-2 pep1-4 Sin embargo, advertimos la presencia de frutos con valvas extra en plantas CLV3/clv3-2 en un fondo mutante pep1-4, lo que podría sugerir que esta mutación intensifica el efecto del alelo clv3-2. Analizamos individuos de la siguiente generación, corroborando la observación anterior. El ancestro silvestre del mutante clv3-2 es Ler. Los Resultados 147 genes CLV3 y ER se encuentran a tan solo 2,6 cM en el cromosoma II, por tanto utilizamos el marcador ERA asociado a la mutación er (TABLA III.7) para identificar la presencia de este alelo, como un indicio de la presencia del alelo clv3-2. La segregación de plantas Clv3 y silvestres en la siguiente generación confirmó su genotipo. En estas plantas detectamos un número considerable de frutos con más de dos valvas (Fig. IV.44) y una incidencia de alteraciones filotácticas superior a la observada en plantas pep1-4 (datos no mostrados). A B Figura IV. 44.- Frutos de individuos CLV3/clv3-2 pep1-4. A) A la izquierda un fruto de Col-0. A la derecha un fruto CLV3/clv3-2 pep1-4. B) Fruto CLV3/clv3-2 pep1-4. La flecha roja indica la aparición de la valva extra. Barras de escala 1mm. Durante este análisis, aislamos un individuo recombinante clv3-2/clv3-2 ER/er, a partir del cual se obtuvieron plantas clv3-2/clv3-2 ER/ER. El fenotipo de estas plantas evidencia el efecto de la mutación er sobre clv3-2. En su ausencia, los frutos, aún con varias valvas, son más estilizados, guardando cierta similitud con los frutos de los individuos CLV3/clv3-2 ER/er pep1-4 (Fig. IV.45). El alelo clv3-2 es considerado un alelo totalmente recesivo (Clark et al.,1995). A pesar de ello, cruzamos plantas Col-0 con clv3-2 y seleccionamos heterocigotos CLV3/clv3-2 entre los individuos F2 para comparar la incidencia de frutos con valvas supernumerarias con respecto a los heterocigotos en un fondo homocigótico pep1-4 (Tabla IV.10). Resultados 148 A B C D Figura IV.45.- Ausencia de la mutación er en plantas clv3-2. A) Fruto Col-0. B) Fruto de una planta F2 CLV3/clv3-2 procedente del cruzamiento Col-0 x clv3-2. No se observa la aparición de valvas extra. C) Fruto clv3-2 ER. D) Fruto de un individuo CLV3/clv3-2 ER/er pep1-4. Barra de escala 1 mm. Tabla IV.10.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV3/clv3-2 PEP1 y CLV3/clv3-2 pep1-4. Genotipos analizados CLV3/clv3-2 PEP1 Nº de frutos en cada clase Porcentaje (%) CLV3/clv3-2 pep1-4 2 valvas 3 o más valvas 2 valvas 3 o más valvas 475 5 178 22 98,95 1,05 89 11 Total de frutos examinados 480 200 Nº de plantas analizadas 10 6 Los datos de la Tabla IV.10 indican que la aparición ocasional de frutos con valvas extra en plantas CLV3/clv3-2 es un hecho, a pesar de la información disponible (Clark et al.,1995). No obstante y pese al discreto número de plantas examinadas, de la tabla se desprende que la aparición de frutos con más valvas es un suceso más probable si la heterocigosis del alelo clv3-2 tiene lugar en un fondo homocigótico pep1-4. Aunque de manera moderada, la pérdida de función de PEP1 parece inducir o incrementar una tenue semidominancia para la mutación clv3-2. IV.9.4.2.- Interacciones con clavata2 (clv2). El alelo clv2-1 se encuentra en fondo Ler y es completamente recesivo (Kayes y Clark, 1998). Realizamos cruzamientos entre este mutante y plantas pep1-4 como Resultados 149 parental femenino, de manera análoga a la descrita en la sección anterior. Simultáneamente, efectuamos cruzamientos entre el silvestre Col-0 y clv2-1. En este caso, las mutaciones clv y er segregan con facilidad dado que CLV2 se encuentra en el cromosoma I, por lo que pudimos observar la interacción entre clv2-1 y pep1-4 en presencia y en ausencia de la mutación erecta (Fig. IV.46), si bien se debe esperar una generación para confirmar el genotipo con respecto al gen CLV2. En ambos casos, no se observa diferencia alguna entre el mutante simple clv2-1 (Fig. IV.46 A) y el doble mutante clv2-1 pep1-4 (datos no mostrados). Por contra, el heterocigoto (CLV2/clv2-1) sí difiere dependiendo de la presencia o no del alelo pep1-4 en homocigosis. En las plantas CLV2/clv2-1 pep1-4 se apreció la presencia de un número considerable de frutos con valvas supernumerarias (Fig. IV.46 y Tabla IV.11). A B Ler CLV2/clv2-1 pep1-4 C clv2-1 Figura IV.46.- Interacciones entre clv2-1 y pep1-4. A) Fenotipo de un fruto Ler, frutos CLV2/clv2-1 pep1-4 y del mutante simple clv2-1. Los individuos CLV2/clv2-1 pep1-4 presentan frutos con varias valvas. Todas las plantas son homocigóticas para la mutación er. B) Fruto de un individuo CLV2/clv2-1 pep1-4 ER. C) Detalle del fruto mostrado en B en el que se aprecian las valvas extra. Barras de escala 1 mm. Pudimos comprobar que la presencia de frutos con valvas extra en el heterocigoto CLV2/clv2-1 es comparable a la de plantas silvestres, mientras que en un fondo homocigótico para pep1-4 se incrementa hasta un 15% su aparición (Tabla IV.11). Estos datos son más sólidos que los observados respecto a clv3-2, pero cualitativamente coincidentes. Resultados 150 Tabla IV.11.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV2/clv2-1 PEP1 y CLV2/clv2-1 pep1-4. Genotipos analizados CLV2/clv2-1 PEP1 CLV2/clv2-1 pep1-4 2 valvas 3 o más valvas 2 valvas 3 o más valvas Nº de frutos en cada clase 1297 3 275 50 Porcentaje (%) 99,76 0,24 84,61 15,39 Total de frutos examinados 1300 325 Nº de plantas analizadas 27 11 IV.9.4.3.- Interacciones con clavata1 (clv1). Las observaciones realizadas en el estudio de interacciones entre pep1-4 y los mutantes clv2 y clv3 nos impulsaron a extender este análisis al gen CLV1, situado también en el cromosoma I. Utilizamos inicialmente el alelo clv1-1 (fondo Ler), definido como el más fuerte de su serie (Diévart et al., 2003). De hecho se le ha atribuido un carácter semidominante (Clark et al., 1995), recientemente asignado a un efecto dominante negativo (Diévart et al., 2003). A B C D E F Figura IV.47.- Interacciones entre clv1-1 y pep1-4. A) pep1-4. B) CLV1/clv1-1. C), D) y E) CLV1/clv1-1 pep1-4. F) clv1-1 er. Barra de escala 1 mm. Por este motivo, reviste particular importancia el análisis previo del alelo clv1-1 en heterocigosis en ausencia de cualquier otra mutación. Como en las secciones anteriores Resultados 151 (IV.9.4.1 y IV.9.4.2), se efectuaron cruzamientos entre plantas clv1-1 como donantes de polen, y el silvestre Col-0 y el mutante pep1-4 como parentales femeninos. Al igual que en el caso de clv2, verificamos la segregación en la descendencia confirmando el genotipo con respecto al gen CLV1. Como sucede con clv3-2 y clv2-1, el doble mutante clv1-1 pep1-4 es indistinguible del mutante simple clv1-1, con un fenotipo equiparable al de los frutos clv3-2 (Fig. IV.43 y datos no mostrados). Igualmente, la aparición de frutos con valvas extra fue mucho mayor en el caso de las plantas CLV1/clv1-1 pep1-4 que en las plantas CLV1/clv1-1 (Fig. IV.47 y Tabla IV.12). Tabla IV.12.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV1/clv1-1 PEP1 y CLV1/clv1-1 pep1-4. Genotipos analizados CLV1/clv1-1 PEP1 Nº de frutos en cada clase Porcentaje (%) CLV1/clv1-1 pep1-4 2 valvas 3 o más valvas 2 valvas 3 o más valvas 864 6 165 95 99,31 0,69 63,43 36,57 Total de frutos examinados 870 260 Nº de plantas analizadas 17 8 Los datos de la Tabla IV.12 muestran una elevada proporción de frutos de más de dos valvas en los individuos heterocigóticos para clv1-1 y homocigóticos para pep1-4. Estos resultados se deben interpretar con precaución debido al carácter semidominante atribuido con anterioridad a clv1-1 (Clark et al., 1995; Diévart et al., 2003). Esta propiedad de clv1-1 podría estar contribuyendo al elevado número de frutos anómalos detectados en CLV1/clv1-1 pep1-4. Sin embargo, los datos del heterocigoto simple CLV1/clv1-1 no se ajustan a lo esperado para un alelo claramente semidominante (Diévart et al., 2003). Una posibilidad para explicar esta aparente discrepancia podría radicar en el comportamiento de esta mutación tras un cruzamiento con el acceso Col-0. En cualquier caso, su comportamiento es análogo al descrito en las secciones IV.9.4.1 y IV.9.4.2 para clv3-2 y clv2-1, respectivamente. Una aproximación complementaria al estudio de la interacción entre los genes CLV1 y PEP1 fue la utilización de uno de los alelos más débiles, clv1-6, de carácter recesivo (Diévart et al., 2003). Las plantas portadoras de este alelo se cruzaron, como donantes de polen, con plantas pep1-2. Se seleccionaron aquellas plantas F2 cuya Resultados 152 homocigosis para pep1-2 se determinó mediante genotipado molecular (Tabla III.6), y mostraban fenotipo Clv en todos sus frutos. Como muestra la Figura IV.48 el fenotipo moderado de los mutantes simples clv1-6 se incrementa, aparentemente como consecuencia de la homocigosis para pep1-2. No obstante, este es un resultado preliminar donde aún no se ha podido descartar el efecto de un fondo genético heterogéneo (Ler/Col-0) sobre las mutaciones. A Ler clv1-6 pep1-2 B Figura IV.48.- Interacción entre clv1-6 y pep1-2. A) Fenotipo del mutante simple clv1-6, del doble mutante clv1-6 pep1-2 y del acceso silvestre Ler. B) Ampliación de uno de los frutos clv1-6 mostrados en A. Todos los frutos mostrados en esta Figura se encuentran en homocigosis para la mutación er. Barras de escala 1 mm. clv1-6 Conjuntamente, los resultados de las interacciones entre los alelos pep1, clv1, clv2, y clv3 están en consonancia con el desempeño de algún tipo de función por parte de PEP1 en la ruta de señalización de los genes CLAVATA. Sobre qué punto de la ruta actúa PEP1 y si esta acción es directa o indirecta, o qué otras funciones génicas adicionales se requieren son cuestiones completamente abiertas. IV.9.5.- Doble mutante con wuschel-1 (wus-1). El gen WUSCHEL codifica un factor de transcripción con homeodominios (Mayer et al., 1998) necesario para el mantenimiento de la población de células indiferenciadas en el meristemo, siendo sus mutaciones epistáticas sobre las de los genes CLAVATA (Laux et al., 1996; Schoff et al., 2000). En estos mutantes, las células del meristemo apical son incapaces de proliferar provocando una terminación prematura del mismo y la incapacidad de generar órganos laterales. La actividad de otros genes acaba induciendo la aparición adventicia de órganos (Laux et al., 1996; Mayer et al., 1998; Lenhard et al., 2002). Debido a las interacciones descritas entre las mutaciones clv y pep1, examinamos la interacción entre las mutaciones wus-1 y pep1-1 por producir esta última un fenotipo fuerte y completamente penetrante. Se realizó el cruzamiento utilizando plantas Resultados 153 heterocigóticas wus como parental masculino. Como cabría esperar, comprobamos que la mutación wus-1 es epistática sobre pep1-1 salvo en las hojas, que presentan el fenotipo característico de pep1-1. Los dobles mutantes exhiben el típico crecimiento alternativo (stop and go) característico del mutante wus-1 (Fig. IV.48; Laux et al., 1996). A B Figura IV.48.- Interacción wus-1 pep1-1. A) Planta mutante wus-1 de 90 días tras la germinación. B) Planta doble mutante wus-1 pep11 de 47 días tras la germinación. Figura A tomada de Laux et al., 1996. Barras de escala 2 cm. V.- DISCUSIÓN Discusión 155 V.- DISCUSIÓN V.1.- ESCRUTINIO DE MUTANTES DE Arabidopsis thaliana AFECTADOS EN EL DESARROLLO DEL FRUTO EN UNA COLECCIÓN ESPAÑOLA DE INSERCIONES DE T-DNA. Durante la realización de esta Tesis se ha llevado a cabo un escrutinio de mutantes de Arabidopsis thaliana a partir de una colección española de inserciones de TDNA. Se ha estudiado una nueva mutación compleja, caracterizada por la presencia de más de dos valvas en sus frutos, identificando un gen con motivos de unión a RNA de tipo KH, cuyas disfunciones están involucradas en este fenotipo. La utilización del T-DNA como agente mutagénico viene avalada por la caracterización de numerosos hechos de inserción en cromosomas de varias especies vegetales como arroz, tabaco o Arabidopsis thaliana, y la existencia de un gran número de mutantes aislados (Castle et al., 1993; Feldmann et al., 1994; Ohba et al., 1995; Takano et al., 1997). La generación de alelos mutantes, mayoritariamente nulos, mediante este agente ha permitido asignar funciones a secuencias génicas concretas (Roe et al., 1993; Torii et al., 1996; Zeidler et al., 2001; Ishiguro et al., 2002; Smith y Hake, 2003; Lee et al., 2004; Yoo et al., 2004). Otro factor que ha contribuido a popularizar este sistema ha sido el desarrollo de técnicas moleculares progresivamente más eficaces en la identificación de las secuencias adyacentes a la inserción (Ochman et al. 1988; Triglia et al., 1988; Liu et al., 1995; Hartl et al., 1996; Krysan et al., 1999; Singer et al., 2003). En el caso de Arabidopsis thaliana, estas estrategias se ven facilitadas por la disponibilidad de la secuencia de su genoma (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Además, las colecciones de inserciones de T-DNA de dominio público se han convertido en un recurso rápido para la genética inversa y la obtención de nuevos alelos (Sessions et al. 2001; Alonso et al., 2003; Rosso et al., 2003; Strizhov et al., 2003) Idealmente, los mutantes de T-DNA presentarían hechos de inserción únicos con sólo una copia de T-DNA, lo que facilitaría la asignación de una función a un gen específico (Krysan et al., 1999). Pese a estas bondades, existen numerosos casos en los que este análisis se ve dificultado como consecuencia de la generación de alteraciones cromosómicas estructurales asociadas a la inserción del T-DNA. En la mayoría de estos Discusión 156 casos, están involucradas varias copias de T-DNA que pueden dar lugar a deleciones, inversiones, duplicaciones y translocaciones (Nacry et al., 1998; Laufs et al., 1999; Tax y Vernon, 2001). La influencia de estos eventos, en un cromosoma o varios, puede traducirse en una modificación de la actividad de uno o más genes, produciendo mutaciones complejas, difíciles de analizar (Nacry et al., 1998; Tax y Vernon, 2001). De hecho, el T-DNA empleado en la generación de la colección estudiada en este trabajo (pGKB5, III.2) ha propiciado una publicación específica sobre las aberraciones cromosómicas que produce este vector (Nacry et al., 1998). V.2.- EL MUTANTE pep1-1 ES PORTADOR DE UNA TRANSLOCACIÓN RECÍPROCA Y PRESENTA ALTERACIONES EN LA MORFOLOGÍA DEL FRUTO. Mediante diversos métodos moleculares y genéticos, hemos demostrado que las plantas pep1-1 son portadoras de una translocación recíproca en la que se ven implicados los cromosomas IV y V de Arabidopsis thaliana. Como en la mayoría de los casos donde se producen reorganizaciones cromosómicas, los resultados de Southern en pep1-1 (Fig. IV.18) indican la participación de varias copias de T-DNA. Los frutos del mutante pep1-1 son de reducido tamaño y presentan valvas extra con una histología aparentemente normal. Esta situación es análoga a la observada en los mutantes clv, entre otros (Clark et al., 1993, Kayes y Clark, 1998; Trotochaud et al., 1998; Clark, 2001). Este rasgo tiene un origen muy temprano durante el desarrollo del pistilo (Fig. IV.13) predeterminando la estructura del fruto tras la fertilización. Resulta muy problemático diferenciar entre genes cuya deficiencia afecta exclusivamente al desarrollo del pistilo, de aquellos relacionados únicamente con el desarrollo del fruto (Bowman et al., 1999). Por lo general, las mutaciones que afectan a la morfogénesis del pistilo tienen consecuencias en el posterior desarrollo del fruto. Así, por ejemplo, las mutaciones en el gen CRC perturban el desarrollo del gineceo desde etapas muy tempranas de su desarrollo, lo que se traslada como una anomalía evidente en el fruto (Bowman y Smyth, 1999). El resto de los órganos florales de pep1-1 parecen silvestres tanto en número como en apariencia. Sin embargo, presenta un fenotipo pleiotrópico que se detecta desde el inicio de su desarrollo vegetativo, con una morfología y ritmo de aparición foliar característicos, así como alteraciones en la filotaxia (Fig. IV.6 y 7). Esta situación no es privativa de pep1-1. En Arabidopsis, las mutaciones implicadas en un único proceso del Discusión 157 desarrollo son muy escasas (Bowman et al., 1999). Diversas mutaciones que afectan a genes implicados en el desarrollo del pistilo también muestran alteraciones en órganos vegetativos de la planta. El mutante ful, al margen de frutos anormales, presenta alteraciones en las hojas caulinares y en la arquitectura general de la planta (Gu et al., 1999; Ferrándiz et al., 2000a). En lugar de la pérdida de identidad del replum, la filotaxia anormal es tal vez la carácterística más visible de rpl (Byrne et al., 2003; Roeder et al., 2003; Smith y Hake., 2003). Los mutantes sty muestran hojas algo aserradas (Kuusk et al., 2002); y las mutaciones en los genes CLV provocan filotaxia alterada y tallos fasciados (Clark, 2001). En nuestro caso, el grado de pleiotropía de pep1-1 puede estar también influido por la reorganización cromosómica detectada. En una translocación recíproca pueden verse afectados varios genes presentes en las regiones implicadas. Por consiguiente, resulta de una gran dificultad asignar el fenotipo observado a la disfunción de una actividad génica en particular. Sin embargo, una situación como ésta puede revelar fenotipos no observables por la perturbación de una única función génica. En cierto modo, esta circunstancia sería análoga a la que se persigue en las mutagénesis sobre fondos mutantes establecidos (second site mutagenesis) que revelan interacciones génicas desconocidas (Page y Grossniklaus, 2002; Hawley y Walker, 2003). Por otra parte, la actividad de genes modificadores propios de una estirpe de referencia concreta puede influir, ostensiblemente, sobre el efecto fenotípico de muchas mutaciones (Koornneef et al., 1994; Sanda y Amasino, 1996; Nadeau, 2001; Buchner et al., 2003; Nadeau, 2003). Hemos comprobado que existe un importante grado de modulación del fenotipo de la mutación pep1-1, identificada en un fondo Ws-2, cuando se realiza su introgresión en Col-0 o Ler. V.3.- NUEVOS ALELOS DE pep1. En pep1-1, el análisis de las secuencias genómicas interrumpidas por el T-DNA señaló a varios genes como potencialmente afectados por la translocación, tanto en el cromosoma IV como en el cromosoma V. Buscamos presuntos mutantes simples de estos genes, siendo la vía más directa las colecciones de T-DNA de dominio público (SALK, Alonso et al., 2003; SAIL, Sessions et al., 2002). Tras crear los correspondientes homocigotos para las diversas inserciones, realizamos cruzamientos entre estas líneas y pep1-1. Estos ensayos de complementación arrojaron un dato muy significativo. El Discusión 158 mutante pep1-1 es completamente recesivo, sin embargo el cruzamiento con la línea F09_517 produjo plantas F1 con frutos con valvas supernumerarias, errores de filotaxia y hojas vegetativas anormales (sección IV.4.1; Fig. IV.24 y IV.25), lo que sugiere que esta línea es portadora de una mutación implicada en el fenotipo de pep1-1. El gen afectado, situado en el cromosoma IV (At4g26000), codifica un polipéptido con tres dominios KH de unión a RNA (Grishin, 2001). Denominamos a esta línea como pep1-2. El fenotipo de pep1-2 per se, es semejante al de la mutación pep1-1. Ambos mutantes poseen hojas vegetativas con características similares que surgen de manera heterocrónica, presentan cierto retraso en la floración, sus errores de filotaxia son equivalentes y, aunque con menor penetrancia, pep1-2 también presenta frutos con valvas extra. Además, pep1-1 es un mutante amorfo para el gen At4g26000, como revela la ausencia de su transcrito en experimentos de RT-PCR (Fig. IV.27), una circunstancia coherente con estas observaciones. Se obtuvieron nuevos alelos pep1 mediante la adquisición y análisis de otras líneas de inserción en el gen At4g26000. Al igual que en pep1-2, estas líneas muestran retraso en la floración, fallos en el patrón de filotaxia y ocasionalmente frutos con más de dos valvas, aunque con menor penetrancia. El alelo pep1-4 es hipotéticamente nulo en virtud de la posición del T-DNA (interrumpe el segundo exón; Fig. IV.33) y de la ausencia de su transcrito (Fig. IV.34). Sin embargo, su fenotipo es notoriamente más débil que el de pep1-2, cuyo transcrito es detectable (Fig. IV.34). El producto proteico de pep1-2 podría poseer un carácter antimorfo, lo que explicaría su fenotipo más severo que el de un alelo nulo, pero de una forma muy moderada, congeniando así con su carácter recesivo. PEP1 es un polipéptido con dominios de unión a RNA y que presumiblemente actúa formando complejos con otras proteínas requeridas para la ejecución o modulación del mismo proceso (Tarun y Sachs, 1996; Fedoroff, 2002). La mutación pep1-2 consiste en la interrupción del gen a falta de tan sólo 15 pb antes del codón de parada, perdiendo únicamente 5 aa. Es concebible, por tanto, la transcripción a partir de un lugar críptico de poliadenilación, seguida de la producción de una proteína ligeramente alterada en su extremo carboxilo terminal. Esta nueva versión de PEP1 podría causar perturbaciones en aquellos complejos de los que forme parte. No obstante, este efecto debe ser moderado, puesto que una única dosis de la versión normal del gen es suficiente para subvertir esta situación y retornar al fenotipo silvestre, como demuestra el fenotipo del heterocigoto. Otro factor que tal vez contribuye a explicar este comportamiento, a la par recesivo y moderadamente antimorfo, es el solapamiento funcional que caracteriza a muchos Discusión 159 genes implicados en el metabolismo del RNA (Lorkovic y Barta, 2002; Chkheidze y Liebhaber, 2003; Cheng y Chen, 2004). Es razonable, no obstante, que la redundancia funcional se refleje más claramente en el fenotipo suave de los alelos nulos de PEP1. V.4.- RESCATE FENOTÍPICO DE pep1. El rescate fenotípico, o complementación funcional, mediante la transformación del organismo mutante con una copia silvestre del gen candidato se considera la prueba definitiva para documentar que se ha clonado el gen definido por ese mutante. Idealmente, se ha de disponer de diversos transformantes independientes con el mismo efecto sobre líneas homocigóticas de más de un alelo (Hawley y Walker, 2003). En el momento de elaborar esta memoria disponemos de 30 líneas independientes de transformantes con el clon genómico de PEP1, tanto en un fondo silvestre Col-0, como en un fondo mutante pep1-2. Simultáneamente, se han generado 10 líneas independientes de transformantes con el clon de sobreexpresión en los mismos fondos. La transformación de plantas pep1-2 con un clon genómico correspondiente al gen At4g26000 recupera el fenotipo silvestre en este mutante de una manera estable, lo que demuestra el funcionamiento adecuado de la construcción utilizada. Podemos concluir, por tanto, que Atg426000 es PEP1. Estas plantas presentan una morfología normal tanto en las hojas de la roseta como en la arquitectura general de la planta, restaurándose el ritmo silvestre de aparición de las hojas de la roseta. Sus frutos no muestran valvas extra pero, como ya se comentó en la sección IV.4.1 de resultados, la escasa penetrancia del rasgo en esta estirpe no aconseja adoptar este aspecto del mutante como una referencia en experimentos de rescate fenotípico. La caracterización del gen PAUSED (PSD) de Arabidopsis guarda cierto paralelismo. El mutante psd carece de la función de una exportina-t, lo que causa un incremento del fenotipo en alelos débiles de ag, aunque como mutante simple resulta complicado detectar sus anomalías en el gineceo. También produce errores de filotaxia. Sin embargo, el criterio utilizado para evaluar la recuperación del fenotipo silvestre mediante una construcción transgénica fue la pérdida de la heterocronía en la aparición de sus hojas, así como la eliminación del fenotipo de éstas (Hunter et al., 2003; Li y Chen, 2003). La transformación directa de plantas pep1-1 no se intentó, debido a su baja fertilidad. Aún el heterocigoto no es adecuado para un esfuerzo de este tipo ya que, como se recordará, la presencia de la translocación recíproca reduce drásticamente la Discusión 160 producción de semillas viables, comprometiendo las posibilidades de lograr transformantes. Por estos motivos, decidimos transformar la estirpe pep1-2, así como el silvestre Col-0 para, posteriormente, introducir el transgén en pep1-1 mediante cruzamientos. La confirmación definitiva de la recuperación del fenotipo silvestre en los frutos de pep1-1 deberá esperar a la consecución de individuos F2 portadores de ambos cromosomas derivados y de una copia del transgén (verificable en la generación F3). Debido precisamente a la translocación, es razonable prever dificultades en la obtención de recombinantes en los cromosomas IV y V (Atherly et al. 1999; Griffith et al., 2002). Esto no debe suponer un inconveniente, ya que resulta inverosímil que el creciente número de transformantes independientes obtenidos porten en estos cromosomas todos los hechos de inserción. En cualquier caso, la recuperación del fenotipo silvestre en los frutos se comprobará en breve. Un resultado alentador proviene del análisis de las plantas F1 del cruzamiento entre pep1-1 y un homocigoto pep1-2 portador de un transgén con el clon genómico de PEP1. Estas plantas no se distinguen en absoluto del silvestre, a diferencia de los resultados obtenidos en los ensayos de complementación entre estas dos estirpes sin el concurso del transgén (sección IV.4.2 y Fig. IV.28). En opinión de Hawley y Walker (2003), la prueba de rescate fenotípico por transgénesis, a fin de cuentas, sólo es un caso particular del ensayo de complementación. En la transformación de plantas con la construcción de sobreexpresión dependiente del promotor 35S, procedimos de igual forma. Transformamos individuos silvestres (Col-0) y mutantes pep1-2. La apariencia de estos últimos es silvestre, en concordancia con los resultados obtenidos con el clon genómico, lo que también es un argumento a favor del funcionamiento del transgén. Las plantas Col-0 transformadas, pese a la expresión ectópica o a la sobreabundancia del transcrito de PEP1, no manifiestan ningún rasgo fenotípico que las distinga de sus progenitores. Sin embargo, uno de los transformantes mostró un fenotipo pleiotrópico consistente en una roseta con mayor número de hojas de apariencia lanceolada y de un color más pálido, menor estatura y una considerable reducción del tamaño de sus frutos y de su fertilidad. Este conjunto de rasgos se asemeja al fenotipo de pep1-1 y, en menor medida, al de pep1-2. Es tentador especular que este fenotipo se deba a un efecto de cosupresión, motivado por la sobreexpresión de PEP1 (Cluster et al., 1996; Jorgensen et al., 1996; Gallie, 1998; Matzke y Matzke, 1998; McConnell et al., 2001). No obstante, una cuantificación de los niveles de expresión de PEP1 en las distintas líneas de sobreexpresión podría aportar Discusión 161 una información relevante a este respecto. La influencia del lugar de inserción del transgén puede afectar a sus niveles de expresión. Las regiones conocidas como de unión a la matriz nuclear (Matrix attachment regions), son ricas en AT (más del 70%) y suelen circundar a genes que se expresan activamente (Gallie, 1998). La inserción de un transgén en una de estas regiones puede contribuir a una mayor estabilibilidad de su expresión (Matzke y Matzke, 1998), pero también puede provocar un incremento en los niveles de su RNA de hasta 140 veces (Gallie, 1998). No se puede descartar, al menos desde un punto de vista formal, que el fenotipo observado sea producto de una mera mutación insercional, aunque esto sea mucho menos probable. En cualquier caso, habrá que esperar a la obtención de más líneas transgénicas. V.5.- PAPEL DE LAS PROTEÍNAS CON DOMINIOS KH EN EL DESARROLLO. Los factores de transcripción se han considerado tradicionalmente como los elementos principales de la regulación de la expresión génica. No obstante, en los últimos años se han descrito una gran cantidad de proteínas con actividad de unión a RNA, que desempeñan un papel crítico en el desarrollo, determinando los niveles de expresión de un elevado número de genes (Perrone-Bizzozero y Bolognani, 2002). Una vez que el RNA se transcribe, las proteínas de unión a RNA controlan todos los pasos posteriores en la expresión génica, desde la escisión alternativa de intrones hasta la traducción, o su estabilidad y transporte (Fedoroff, 2002; Perrone-Bizzozero y Bolognani, 2002; Cheng y Chen, 2004). Este tipo de regulación adquiere una importancia especial en algunos procesos de desarrollo tan relevantes como el establecimiento de los patrones espacial y temporal de expresión génica durante el desarrollo neuronal (Perrone-Bizzozero y Bolognani, 2002), o el control del tiempo de floración (Cheng y Chen, 2004). Una categoría especial de proteínas con capacidad de unión a RNA son las proteínas con dominios KH (K Homology). El dominio KH es ubicuo por su presencia desde procariotas hasta mamíferos y, junto con el dominio RRM (RNA Recognition Motif), es el más frecuente en las proteínas de unión a RNA (Lorkovic y Barta, 2002; Bomsztyk et al., 2004). El gen PEP1 codifica una proteína con tres dominios KH, presumiblemente implicada en el control postranscripcional, y muy conservada en especies tan alejadas filogenéticamente como Arabidopsis thaliana y arroz (Oryza sativa L.), lo que induce a pensar que su función no es irrelevante (sección IV.5.2). Pertenece a una familia de 26 Discusión 162 miembros identificados en Arabidopsis thaliana (Lorkovic y Barta, 2002), algunos de los cuales también cuentan con claros ortólogos en otras especies vegetales (esta Tesis). El más claro ejemplo es el gen FLK, el parálogo más cercano a PEP1 y cuya función es fundamental en la ruta autónoma de floración (Lim et al., 2004), en la que, de hecho, las actividades clave en su control son reguladores postranscripcionales (Macknight et al., 1997; Schomburg et al., 2001; Simpson et al., 2003; Quesada et al., 2003). Es llamativo que, tanto en el caso de PEP1 como en el de FLK, exista un mayor grado de homología entre ortólogos que entre parálogos (sección IV.5.2). Esta situación pone de manifiesto la importancia funcional de estas moléculas. En Arabidopsis thaliana o, por extensión en las plantas, existen escasos ejemplos en los que se haya podido asignar una función concreta a una proteína KH. Una de estas proteínas fue identificada, mediante ensayos bioquímicos, como parte integrante del exosoma de Arabidopsis thaliana (Chekanova et al., 2002), aunque se carece de información procedente de una estirpe mutante. Sin embargo, se ha demostrado que HEN4 (HUA ENHANCER4), una proteína con 5 dominios KH, participa en el mantenimiento de la función C en el desarrollo de la flor de Arabidopsis a través de la regulación de la escisión de intrones del transcrito de AG (Cheng et al., 2003). Es destacable que las plantas mutantes simples hen4 no muestren ningún fenotipo, siendo el efecto de esta mutación observable sólo en compañía de otras mutaciones en genes que también participan en el mismo proceso (Cheng et al., 2003; Cheng y Chen, 2004). Dos de estos genes son HUA1 y HUA2. El primero de ellos codifica una proteína con dominios de unión a RNA de distinta naturaleza al dominio KH, mientras que se desconoce la función molecular concreta de HUA2 (Chen y Meyerowitz, 1999; Liu et al., 2001). Por separado, la pérdida de función en ambos genes no produce ningún fenotipo observable, y en el doble mutante el fenotipo floral resultante es muy sutil, pero se produce una reducción importante del porte de la planta (Chen y Meyerowitz, 1999; Liu et al., 2001). Una interpretación obvia para estos resultados es la existencia de redundancia o solapamiento funcional con otras actividades génicas. Esta interpretación se adapta también al moderado efecto fenotípico de la pérdida de función de PEP1, como se manifiesta en el alelo pep1-4 (sección IV.4.1). Los genes SHP1 y SHP2 son completamente redundantes en la especificación de la zona de dehiscencia, requiriéndose la pérdida de función de ambos para producir un fenotipo en el fruto (Liljegren et al., 2000). Otro ejemplo de redundancia funcional lo constituyen los genes STY1 y STY2, que participan en la formación de tejidos apicales durante el desarrollo del fruto. El mutante Discusión 163 sty1 presenta un fenotipo muy moderado y sty2 es completamente silvestre, mientras que el doble mutante muestra un fenotipo mucho más intenso (Kuusk et al., 2002). En la maduración del transcrito de AG participan distintas proteínas que interaccionan con este mRNA, entre ellas HUA1, HEN4 y la helicasa HEN2 (Cheng et al., 2003). PEP1 puede estar participando en complejos multiproteicos donde otros factores, con dominios KH o sin ellos, serían capaces de suplir total o parcialmente la pérdida de su función. El hipotético producto, moderadamente antimorfo, de pep1-2 supondría una perturbación adicional sobre el complejo multiproteico que tendría un mayor efecto en el fenotipo. El mutante hen2 carece de fenotipo en los órganos reproductivos pero es fácilmente identificable por su fenotipo vegetativo (Western et al., 2002). Esta situación es semejante a la descrita anteriormente para el mutante psd, inicialmente denominado hen5 (Hunter et al., 2003; Li y Chen, 2003). La conjunción de rasgos fenotípicos en el desarrollo vegetativo y reproductivo de los mutantes psd, hen2, hua1 hua2 y pep1 indica que estos genes están participando en diversas rutas de desarrollo (Western et al., 2002; Hunter et al., 2003; Li y Chen, 2003; esta Tesis). V.6.- INTERACCIONES DE pep1 CON OTROS MUTANTES. Uno de los objetivos de partida era la determinación de las vías o procesos de desarrollo en que pudieran participar las funciones génicas caracterizadas en el transcurso de este trabajo. Para obtener una información preliminar acerca del papel de PEP1, seguimos una estrategia basada en el análisis de las interacciones de los alelos pep1 con otros mutantes previamente caracterizados. PEP1 es un gen que codifica, hipotéticamente, una proteína de unión a RNA, y cuyos mutantes están afectados en la morfología del fruto. Por tanto, realizamos cruzamientos con genes que alteran el desarrollo del pistilo o bien presentan una gran similitud estructural con PEP1. V.6.1.- Interacciones con ful, hua1, hua2 y hen2. FUL es un factor de transcripción de tipo MADS que confiere la adquisición de identidad de valva en el fruto, cuya deficiencia provoca una severa reducción de su tamaño (Gu et al., 1999). El doble mutante ful-1 pep1-2 es indistinguible del mutante simple ful-1. Por otra parte, los mutantes hua1, hua2 y hen2 participan en el mantenimiento de la función C a través de la regulación de la maduración del transcrito de AG (Jack, 2002). Los dobles mutantes entre hua1, hua2 y hen2 y los alelos pep1 no Discusión 164 ofrecieron ningún fenotipo informativo. Una excepción la constituye el triple mutante hua1 hua2 pep1-2 que muestra una importante reducción del tamaño general de estos individuos. Ya hemos mencionado que los mutantes simples hua1, hua2, hen2 y el propio pep1 carecen de fenotipo en el fruto o éste es muy suave. A tenor de estos precedentes, no se puede excluir el requerimiento de combinaciones de orden superior entre estos mutantes para observar un fenotipo más severo. V.6.2.- Interacciones con flk. Un candidato obvio para explorar posibles interacciones de un gen determinado es aquél que guarda con él una mayor homología estructural y de secuencia. FLK es la molécula más parecida a PEP1 en el genoma de Arabidopsis thaliana. Durante el análisis de la población F2 de un cruce entre flk-3 y pep1-4, observamos que el alelo flk-3 se comporta de forma semidominante en homocigosis para pep1-4. Las plantas FLK/flk-3 pep1-4 presentan un tiempo de floración intermedio entre el homocigoto flk-3 y el silvestre, y mucho más acusado que el del mutante simple pep1-4. Además, las plantas FLK/flk-3 pep1-4 exhiben muchas más alteraciones en la arquitectura de la planta que cualquiera de los mutantes simples, sugiriendo una interacción sinérgica en este aspecto del fenotipo. Estos resultados, per se, son claramente sugerentes de una relación funcional entre ambos genes. La primera demostración de la implicación de los genes HUA en la ruta de AG se obtuvo a través de la comprobación de que los alelos débiles de AG se comportan como alelos fuertes en homocigosis para hua1 y hua2, mientras que el alelo fuerte ag-1 se convierte en semidominante en el mismo fondo (Chen y Meyerowitz, 1999; Jack, 2002; Cheng y Chen, 2004). Un indicio previo de la interacción entre FLK y PEP1 se advierte en la aparición de errores en el patrón filotáctico del doble heterocigoto. Este resultado puede estar señalando un fenómeno de haploinsuficiencia combinada. En Arabidopsis thaliana una situación de haploinsuficiencia combinada se produce entre los genes CLV1 y CLV3, donde en el doble heterocigoto entre los alelos fuertes clv1 y clv3 se produce un fenotipo similar al de los alelos débiles en homocigosis (Clark et al., 1995; Fletcher, 2002). En Antirrhinum majus, los genes CYCLOIDEA (CYC) y RADIALIS (RAD) participan secuencialmente en la ruta que establece la asimetría dorso ventral de su flor zigomorfa. Las mutaciones de pérdida de función cyc y rad se comportan conjuntamente de forma ligeramente semidominante (Revisado en Hudson, 2000). Discusión 165 El estudio de la interacción entre FLK y PEP1 es una tarea inconclusa puesto que, en el momento de elaborar esta memoria, carecemos de información del doble mutante. Podemos especular que las mutaciones flk deben ser epistáticas sobre los alelos pep1 respecto al tiempo de floración, aunque no podemos descartar otros tipos de interacción. Las plantas FLK/flk-3 pep1-4 muestran perturbaciones del patrón filotáctico muy acusadas, por lo que es previsible que el fenotipo del doble mutante sea, al menos, como el de aquellas, si no más intenso. Algunos frutos de las plantas FLK/flk en un fondo pep14 muestran una perturbación del crecimiento de una de sus valvas que conduce a una diferencia de tamaño entre ambas. El examen del doble mutante permitirá verificar la existencia o no de una interacción también en el fruto. V.6.3.- Interacciones con los mutantes clv. Las mutaciones de pérdida de función en los genes CLAVATA (CLV1, CLV2 y CLV3) provocan la aparición de frutos con valvas supernumerarias debido a la producción masiva de células indiferenciadas en el meristemo floral (Clark et al., 1993, 1995; Kayes y Clark, 1998). Las interacciones entre la mutación pep1-4 y las mutaciones clv1-1, clv2-1 y clv3-2 respectivamente, ofrecieron unos trazos comunes en los tres casos. Los alelos clv2-1 y clv3-2 están descritos como recesivos (Clark et al., 1995; Kayes y Clark, 1998), mientras que clv1-1 está considerado como un alelo dominante negativo (Diévart et al., 2003). Cada uno de los dobles mutantes con pep1-4 es indistinguible del correspondiente mutante simple clv. Sin embargo, la condición de homocigosis para este alelo de pep1 induce un comportamiento semidominante o incrementa el efecto de éste en los tres mutantes clv mencionados (sección IV.9.4). Estos resultados, junto con la similitud del efecto fenotípico en el fruto producido por las mutaciones en los cuatro genes, sugieren una interacción de PEP1 con algún elemento de la ruta de transducción de señal de los genes CLV. PEP1 podría actuar sobre el producto de alguno de los genes CLV u otros componentes que participan en esta vía. SHEPHERD es una proteína de choque térmico (heat shock protein) que supuestamente actúa promoviendo el correcto plegamiento de las proteínas CLV. Las mutaciones en este gen también provocan la aparición de frutos con valvas extra (Ishiguro et al., 2002). Otros factores que actúan en esta vía de desarrollo tan sólo han sido caracterizados bioquímicamente y se desconoce el efecto producido por la pérdida de su función (Li et al., 1998; Trotochaud et al., 1999; Li et al., 2001). En cualquier caso, el mantenimiento de esta ruta debe contar con genes que aseguren la correcta modulación postranscripcional de sus elementos, tal como se ha Discusión 166 demostrado en el control de la floración, en el mantenimiento de la función C y en la señalización por ácido abscísico (Cheng y Chen, 2004). Nuestros resultados indican que, en heterocigosis y en ausencia de la mutación pep1-4, clv3-2 ejerce un efecto más severo que la mutación clv1-1, a pesar del efecto dominante negativo de esta última (Diévart et al, 2003). El mutante pep1-4 se encuentra en fondo Col-0, el cual debilita los fenotipos Clv (Dr. Steve Clark, comunicación personal; Diévart et al., 2003). Sin embargo, el doble mutante entre pep1-2 y clv1-6, uno de los alelos más débiles de su serie, presenta un fenotipo similar al de los alelos fuertes (Fig. IV.48). Aún así, no podemos descartar un efecto del fondo genético. Alternativamente, se trataría de un efecto fenotípico del alelo pep1-2. V.7.- PEP1, UN PRESUNTO REGULADOR POSTRANSCRIPCIONAL INVOLUCRADO EN LA ONTOGENIA DEL PISTILO Y EN OTROS PROCESOS DEL DESARROLLO DE Arabidopsis thaliana. La ontogenia del gineceo comprende un complejo conjunto de operaciones genéticas, y cada vez son más los genes identificados que participan en su organización espacial y diferenciación regional, dando lugar a la formación de los distintos tejidos que componen este órgano (Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999). Ya en la formación de su meristemo, se pone de manifiesto que la generación del patrón de la flor y, por ende del pistilo, es una adaptación evolutiva del mecanismo general del meristemo apical, sistema ya presente en las plantas antes de que aparecieran las flores (Lenhard et al., 2001; Lohmann et al., 2001). El gen AG establece un vínculo de retroalimentación negativa con respecto a WUS, el cuál especifica el estado indiferenciado de ciertas células del meristemo (stem cell identity) y activa al propio AG (Lenhard et al., 2001; Lohmann et al., 2001). Parte de este circuito son los genes CLV y el resto de genes que participan en su ruta (Fletcher, 2002; Sharma y Fletcher, 2002; Zik y Irish, 2003), involucrados en este mantenimiento de células indiferenciadas en el meristemo y su posterior incorporación a los primordios de los órganos (Clark, 2001). La perturbación de su función produce un mayor número de órganos en la flor, característicamente carpelos (Clark et al., 1997; Kayes y Clark, 1998; Fletcher et al., 1999, Clark, 2001). La coincidencia de fenotipos en el pistilo y la aparente interacción genética con estos genes señalan a PEP1 como parte integrante de esta ruta, muy probablemente participando en la modulación postranscripcional de alguno (o algunos) de sus elementos. Discusión 167 Curiosamente, incluso en pep1-1 no se detectan alteraciones en el número de otros órganos florales al margen del pistilo. Es posible que PEP1 no participe en la determinación del número de sépalos, pétalos y estambres y su acción en la flor esté restringida a los carpelos. No obstante, parece improbable porque, al menos en los estambres, se puede detectar la presencia de su transcrito (Fig.IV.39). Una explicación alternativa sería una mayor presencia en los primordios de estos órganos de otras actividades génicas solapantes con PEP1. Una posibilidad que resulta muy atractiva es que esa diferencia se deba a una interacción adicional entre PEP1 y AG. Ciertos fenotipos débiles Ag se manifiestan con la aparición de valvas extra (Sieburth et al., 1995). Esta es una cuestión abierta que merece un próximo análisis. Además de su efecto en el pistilo, PEP1 está involucrado en diversos procesos de desarrollo. Esta noción se sustenta en la pleiotropía de su fenotipo, la ubicuidad de su expresión y la diversidad de sus interaciones génicas. Sin embargo, el denominador común de todos (o casi todos) los rasgos fenotípicos de las mutaciones pep1 es que sugieren su vinculación con el funcionamiento de los meristemos, desde la aparición ocasional de aberraciones tales como plantas con un solo cotiledón, cotiledones fusionados o una única hoja terminal (Li y Chen, 2003; Para y Sundas-Larsson, 2003). La formación heterocrónica de las hojas también puede estar ocasionada por mutaciones que afectan a los meristemos (Hunter et al., 2003; Li y Chen, 2003). El gen SQUINT (SQN) codifica un homólogo de la ciclofilina 40, un regulador del ciclo celular, cuyos mutantes sqn presentan un retraso en la emergencia de sus hojas, ligeras alteraciones en el patrón de filotaxia y la aparición ocasional de frutos con valvas extra (Berardini et al., 2001). El retraso en la floración, en ocasiones, puede ser reflejo de un mal funcionamiento del meristemo apical (Simpson y Dean, 2002; Poethig, 2003). De todas formas, hemos visto que PEP1 interacciona con FLK. Esto no es sorprendente ya que son numerosos los ejemplos de reguladores postranscripcionales implicados en el control de la transición floral (Macknight et al., 1997; Schomburg et al., 2001; Simpson et al., 2003; Quesada et al., 2003; Cheng y Chen, 2004). Las causas que subyacen a la generación de errores de filotaxia en las mutaciones pep1 pueden ser de origen muy diverso, pero no necesariamente excluyentes. Por un lado, las alteraciones en el tiempo de floración pueden tener como consecuencia una distorsión en la arquitectura general de la planta, lo que puede incluir errores de filotaxia (Sung et al., 2003). Por otra parte, la interferencia de las mutaciones pep1 con la ruta de transducción de señal de los genes CLV puede Discusión 168 producir un incremento en la cantidad de células indiferenciadas, lo que se traduce en un aumento del número de primordios de órganos laterales en posiciones anómalas (Fletcher, 2002). Al margen de pep1-1, la incidencia de los distintos rasgos fenotípicos Pep1 difiere considerablemente entre los distintos alelos. Como ya se ha discutido, parte de esta variabilidad se puede atribuir a la distinta naturaleza de las respectivas lesiones moleculares. Salvo en pep1-1, la aparición de errores filotácticos tiene una mayor penetrancia que las alteraciones en la morfogénesis del fruto. La participación de PEP1 en diferentes complejos multiproteicos en distintos órganos o etapas del desarrollo también puede ser causa de este comportamiento. Los diversos complejos multiproteicos en los que PEP1 participe contarán con varios elementos, unos comunes y otros específicos. Una consecuencia de ello puede ser la variación en el grado de solapamiento funcional entre los polipéptidos integrantes de cada complejo. En el control transcripcional se ha comprobado que la combinación de un número limitado de factores puede hacer frente a las necesidades de transcripción requeridas en los distintos procesos que tienen lugar durante el desarrollo de un organismo (Hodgkin, 1998). Como ejemplo podemos citar a los factores de transcripción de tipo MADS box (West et al., 1997; Messenguy y Dubois, 2003), que en Arabidopsis thaliana o Antirrhinum majus están implicados en la construcción de los órganos florales, entre otras actividades (Jack, 2001; Ng y Yanofsky, 2001; Lohmann y Weigel, 2002). Distintas combinaciones de estos factores activan las diferentes rutas que finalmente darán lugar a la formación de los órganos florales, pudiendo algunos de ellos formar parte de distintos complejos (Riechmann y Meyerowitz, 1997; West et al., 1998; Egea-Cortines et al., 1999; Yang et al., 2003; Fig. I.20 de la sección I.5.4.2.1). Todo ello permite que una unidad de un complejo determinado pueda presentar distintas funciones, dependiendo de los elementos que le acompañen en el complejo (Hodgkin, 1998). Por tanto, resulta bastante verosímil que esta estrategia haya sido también adoptada en los procesos de regulación postranscrional. VI.- CONCLUSIONES Conclusiones 170 VI.- CONCLUSIONES I.- El número de genes identificados que participan, de una u otra forma, en el desarrollo del pistilo y del fruto se encuentra en expansión. Pese a ello, aún son muchas las funciones génicas relacionadas con el proceso que quedan por caracterizar. II.- Se ha efectuado el escrutinio de una colección local de mutantes de inserción mediante T-DNA de Arabidopsis thaliana. Los resultados que se han derivado de dicho esfuerzo arrojan un pobre balance respecto al número de supuestos mutantes aislados frente al total de individuos examinados. III.- Como inconveniente adicional, en ocasiones, los individuos aislados son portadores de reorganizaciones cromosómicas que causan mutaciones complejas difíciles de abordar. IV.- Durante este trabajo se identificó un mutante, denominado como pepper1-1 (pep1-1), con un patrón de herencia recesivo ligado a la resistencia al antibiótico kanamicina, aportada por un hecho de inserción aparentemente único. Este mutante presenta un fenotipo pleiotrópico que incluye la aparición de pequeños frutos con valvas adicionales. Este rasgo comienza a observarse desde etapas muy tempranas en el desarrollo del pistilo, predeterminando la posterior morfología del fruto tras la polinización. V.- El fenotipo de las plantas pep1-1 es el resultado de una mutación compleja generada por una translocación recíproca entre los cromosomas IV y V e influida por genes modificadores dependientes del fondo genético, como se ha puesto de manifiesto a través de distintas estrategias moleculares y genéticas. VI.- En el fenotipo de la línea pep1-1 desempeña un papel primordial la pérdida de función del gen At4g26000, denominado PEP1 en este trabajo, tal como se desprende de los ensayos de complementación funcional. Conclusiones 171 VII.- El gen PEP1 codifica una proteína de unión a RNA con módulos KH de tipo I, presuntamente implicada en procesos de control postranscripcional. VIII.- Las relaciones de PEP1 con respecto a sus ortólogos en otras especies vegetales indican un alto grado de conservación entre monocotiledóneas y dicotiledóneas, lo que muy probablemente es un reflejo de la importancia de su función. IX.- PEP1 se expresa de forma ubicua en toda la planta, lo que es coherente con el grado de pleiotropía observado en sus mutantes. X.- Las interacciones génicas estudiadas sugieren que PEP1 participa en la morfogénesis de la planta a través de distintos procesos de desarrollo, como la vía de transducción de señales CLAVATA, o la ruta autónoma de control del tiempo de floración. VII.- BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 173 BIBLIOGRAFÍA Aaron, M; Zorn, A. M. y Krieg, P. A. (1997). The KH domain protein encoded by quaking functions as a dimer and is essential for notochord development in Xenopus embryos. Genes Dev. 11:2176–2190. Aasheim, H. C.; Loukianova, T.; Deggerdal, A. y Smeland, E. B. (1994). Tissue specific expression and cDNA structure of a human transcript encoding a nucleic acid binding [oligo(dC)] protein related to the pre-mRNA binding protein K. Nucleic Acids Res. 22: 959-964. Adams, M. D.; Celniker, S. E.; Holt, R. A.; Evans, C. A.; Gocayne, J. D.; Amanatides, P. G. et al. (2000). The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 287:21852195. Adinolfi, S.; Bagni, C.; Castiglione-Morelli, M. A.; Fraternali, F.; Musco, G. y Pastore, A. (1999). Novel RNA-Binding Motif: The KH Module. Biopolymers 51: 153–164. Al Shehbaz, I. A. (1984). The tribes of Cruciferae (Brassicaceae) in the south-eastern. J. Arnold Arbor 65: 343-373. Alberts, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K. y Watson, J. D. (1996). Biología Molecular de la Célula. 3ª ed. Omega, Barcelona. Alonso, J. M. y Stepanova, A. N. (2003). T-DNA mutagenesis in Arabidopsis. Methods Mol. Biol. 236:177-88 Alonso, J. M.; Stepanova, A. N.; Leisse, T. J.; Kim, C. J.; Chen, H.; Shinn, P.; Stevenson, D. K.; Zimmerman, J.; Barajas, P.; Cheuk, R.; Gadrinab, C.; Séller, C.; Jeske, A.; Koesema, E.; Meyers, C. C.; Parker, H.; Prednis, L.; Ansari, Y.; Coy, N.; Deen H.; Geralt M.; Hazari N.; Hom E.; Karnes M.; Mulholland C.; Ndubaku R.; Schmidt, I.; Guzmán, P.; Aguilar-Henonin, L.; Schmid, M.; Weigel, D.; Carter, D. E.; Marchand, T.; Risseeuw, E.; Brogden, D.; Zeko A.; Crosby, W. L.; Berry, C. C. y Ecker, J. R. (2003). Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science 301: 653-657. Alonso-Blanco, C. y Koornneef, M. (2000). Naturally occurring variation in Arabidopsis: an underexploited resource for plant genetics. Trends Plant Sci. 5: 22-29. Altschul, S. F.; Madden, T. L.; Schaffer, A. A.; Zhang, Z.; Miller, W. y Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of proteins database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Álvarez, J. y Smyth, D. R. (1999). CRABS CLAW and SPATULA, two Arabidopsis genes that control carpel development in parallel with AGAMOUS. Development 126: 23772386. An, Y. Q; McDowell, J. M.; Huang, S.; McKinney, E, C.; Chambliss, S. y Meagher R. B. (1996). Strong constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. 10: 107-121 Anderson, M. y Roberts, J. A. (1998). Arabidopsis. Annual Plant Reviews, Volume 1. Sheffield Academic Press. Sheffield. Bibliografía 174 Angenent, G. C.; Franken, J.; Busscher, M.; Van Dijken, A.; Van Went, J. L, Dons, H. J. y Van Tunen, A. J. (1995). A novel class of MADS box genes is involved in ovule development in petunia. Plant Cell 7: 1569-1582. Artherly, A. G.; Girton, J. R. y McDonald, J. F. (1999). The Science of Genetics. Suanders Collage Publishing. Aukerman, M. J.; Hirschfeld, M.; Wester, L.; Weaver, M.; Clack, T.; Amasino, R. M. y Sharrock, R. A.(1997). A deletion in the PHYD gene of the Arabidopsis Wassilewskija ecotype defines a role for phytochrome D in red/far-red light sensing. Plant Cell 9: 1317-1326. Azpiroz-Leehan, R. y Feldman, K. A. (1997). T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth. Trends Genet. 13: 152-156. Baber, J. L.; Libutti, D.; Levens, D. y Tjandra, N. (1999). High precision solution structure of the C-terminal KH domain of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K, a c-myc transcription factor. J. Mol. Biol. 289: 949-962. Bairoch, A. (1991). PROSITE: a dictionary of sites and patterns in proteins. Nucleic Acids Res. 19: 2241-2245. Bancroft, I. y Dean C. (1993). Transposition pattern of the maize element Ds in Arabidopsis thaliana. Genetics 134: 1221-1229. Bancroft, I.; Bhatt, A. M.; Sjodin, C.; Scofield, S.; Jones, J. D. y Dean, C. (1992). Development of an efficient two-element transposon tagging system in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 233: 449-461. Barendse, G. W. M.; Kepczynski, J.; Karssen, C. M. y Koornneef, M. (1986). The role of endogenous giberellins during fruit and seed development: studies on giberellindeficient genotypes of Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant. 67: 315-319. Barton, M. K. (1998). Cell type specification and self renewal in the vegetative shoot apical meristem. Curr. Opin. Plant Biol. 1: 37-42. Bassiri, A.; Irish, E. E. y Poethig, R. S. (1992). Heterochronic effects of TEOPOD 2 on the growth and photosensitivity of the maize shoot. Plant Cell 4: 497-504. Baulcombe, D. C.; Saunders, G. R.; Bevan, M. W.; Mayo, M. A.; Harrison, B. D. (1986). Expression of biologically-active viral satellite RNA from the nuclear genome of transformed plants. Nature 321: 446-449. Bäurle, I. y Laux, T. (2003). Apical meristems: the plant’s fountain of youth. Bioessays 25: 961-970. Bechtold, N. y Pelletier, G. (1998) In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods Mol. Biol. 82: 250266. Bechtold, N.; Ellis, J. y Pelletier, G. (1993). In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. 316: 11941199. Benjamins, R.; Quint, A.; Weijers, D.; Hooykaas, P. y Offringa, R. (2001). The PINOID protein kinase regulates organ development in Arabidopsis by enhancing polar auxin transport. Development 128: 4057-4067. Benson, D. A.; Karsch-Mizrachi, I.; Lipman, D. J.; Ostell, J.; Rapp, B. A. y Wheeler, D. L. (2002). GenBank. Nucleic Acid Res. 30: 17-20. Bent, A. F. (2000). Arabidopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects for transformation of other species. Plant Physiol. 124: 1540-1547. Bibliografía 175 Berardini, T. Z.; Bollman, K.; Sun, H. y Poethig R. S. (2001). Regulation of vegetative phase change in Arabidopsis thaliana by cyclophilin 40. Science 291: 2405-2407. Berná, G.; Robles, P. y Micol, J. L. (1999). A mutational analysis of leaf morphogenesis in Arabidopsis thaliana. Genetics 152: 729-742. Bevan, M. W. y Chilton, M. D. (1982). T-DNA of the Agrobacterium Ti and Ri plasmids. Annu. Rev. Genet. 16: 357-384. Bevan, M.; Mayer, K.; White, O.; Einsen, J. A.; Preuss, D.; Bureaus, T.; Salzberg, S. L. y Mewes, H. (2001). Sequence and analysis of the Arabidopsis genome. Curr. Opin. Plant Biol. 4: 101-110. Blázquez, M. A. y Weigel, D. (2000) Integration of floral inductive signals in Arabidopsis. Nature. 404: 889-892. Blázquez, M. A.; Koornneef, M. y Putterill, J. (2001). Flowering on time: Genes that regulate the floral transition. EMBO Rep. 2: 1078-1082. Bolker, J. A. (1995). Model systems in developmental biology. Bioessays 17: 451-455. Bollman, K. M.; Aukerman, M. J.; Park, M. Y.; Hunter, C.; Berardini, T. Z. y Poethig R. S. (2003). HASTY, the Arabidopsis ortholog of exportin 5/MSN5, regulates phase change and morphogenesis. Development 130: 1493-1504. Bomsztyk, K.; Denisenko, O. y Ostrowski, J. (2004). hnRNP K: one protein multiple processes. Bioessays 26: 629-638. Bouchez, D.; Camilleri, C. y Caboche, M. (1993). A binary vector based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana. C. R. Acad. Sci. Paris, Science de la vie/Life sciencies 316: 1188-1193. Boutet, S.; Vazquez, F.; Liu, J.; Beclin, C.; Fagard, M.; Gratias, A.; Morel, J. B.; Crete, P.; Chen, X. y Vaucheret, H. (2003). Arabidopsis HEN1: a genetic link between endogenous miRNA controlling development and siRNA controlling transgene silencing and virus resistance. Curr. Biol. 13: 843-848. Bowman J. L.; Baum, S. F.; Eshed, Y.; Putterill, J. y Álvarez, J. (1999). Molecular genetics of gynoecium development in Arabidopsis. Curr. Top. Dev. Biol. 45: 155-205. Bowman, J. L. y Eshed, Y. (2000). Formation and maintenance of the shoot apical meristem. Trends Plant. Sci. 5: 110-115. Bowman, J. L. y Smyth, D. R. (1999). CRABS CLAW, a gene that regulates carpel and nectary development in Arabidopsis, encodes a novel protein with zinc finger and helix-loop-helix domains. Development 126: 2387-2396. Bowman, J. L. Smyth, D. R. y Meyerowitz, E. M. (1989). Genes directing flower development in Arabidopsis. Plant Cell 1: 37-52. Bowman, J. L.; Álvarez, J.; Weigel, D.; Meyerowitz, E. M. y Smyth, D. R. (1993). Control of flower development in Arabidopsis thaliana by APETALA1 and interacting genes. Development 119: 721-743 Bowman, J. L.; Smyth, D. R. y Meyerowitz, E. M. (1988). Arabidopsis thaliana: a review. Plant Molec. Cell Biol. 5: 57-87. Bowman, J. L.; Smyth, D. R. y Meyerowitz, E. M. (1991). Genetic interactions among floral homeotic genes of Arabidopsis. Development 112: 1-20. Bowman, J. L. (1994). Arabidopsis. An atlas of morphology and development. Springer Verlag. Singapur. Braddock, D. T.; Baber, J. L.; Levens, D.; Clore, G. M. (2002a). Molecular basis of sequence-specific single-stranded DNA recognition by KH domains: solution structure Bibliografía 176 of a complex between hnRNP K KH3 and single-stranded DNA. EMBO J. 21: 34763485. Braddock, D. T.; Louis, J. M.; Baber, J. L.; Levens, D. y Clore G. M. (2002b). Structure and dynamics of KH domains from FBP bound to single-stranded DNA. Nature 415: 1051-1056. Brand, U.; Fletcher, J. C.; Hobe, M.; Meyerowitz, E. M.; Simon, R. (2000). Dependence of stem cell fate in Arabidopsis on a feedback loop regulated by CLV3 activity. Science 289: 617-619 Brand, U.; Hobe, M. y Simon, R. (2001). Functional domains in plant shoot meristems. Bioessays 23: 134-141. Browder, L. W.; Jeffery, W. R.; Erickson, C. A. (1997). Developmental Biology. Saunders College Publishing. Philadelphia.. Brown, W. R.; Hubbard, S. J.; Tickle, C. y Wilson, S. A. (2003). The chicken as a model for large-scale analysis of vertebrate gene function. Nat. Rev. Genet.4: 87-98. Brunaud, V.; Balzergue, S.; Dubreucq, B.; Aubourg, S.; Samson, F.; Chauvin, S.; Bechtold, N.; Cruaud, C.; De Rose, R.; Pelletier, G.; Lepiniec, L.; Caboche, M. y Lecharny, A. (2002). T-DNA integration into the Arabidopsis genome depends on sequences of preinsertion sites. EMBO Rep. 12:1152-1157. Buchanan, B.; Gruissem, W. y Johnes, R. L. (2000). Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists Eds. Buchner, D. A.; Trudeau, M; Meisler, M. H. (2003). SCNM1, a putative RNA splicing factor that modifies disease severity in mice. Science 15: 967-969. Burd, C. G.; Dreyfuss, G. (1994). Conserved structures and diversity of functions of RNAbinding proteins. Science 265: 615-621. Busch, M. A.; Bomblies, K. y Weigel, D. (1999). Activation of a floral homeotic gene in Arabidopsis. Science 285: 585-587. Byrne, M. E.; Groover, A. T.; Fontana, J. R. y Martienssen, R. A. (2003). Phyllotactic pattern and stem cell fate are determined by the Arabidopsis homeobox gene BELLRINGER. Development 130: 3941-3950. Byrne, M. E.; Simorowski, J. y Martienssen, R. A. (2002). ASYMMETRIC LEAVES1 reveals knox gene redundancy in Arabidopsis. Development 129: 1957-1965. Calvin, N. M. y Hanawalt, P. C. (1988) High-efficiency transformation of bacterial cells by electroporation. J. Bacteriol. 170: 2796-2801. Campisi, L.; Yang, Y.; Yi, Y.; Heilig, E.; Herman, B.; Cassista, A. J.; Allen, D. W.; Xiang, H. y Jack, T. (1999). Generation of enhancer trap lines in Arabidopsis and characterization of expression patterns in the inflorescence. Plant J. 17: 699-707. Candela Antón, H. (2001). Análisis genético de la formación del patrón de venación en la hoja de Arabidopsis thaliana. Tesis Doctotal. Universidad Miguel Hernández. Candela, H.; Martínez-Laborda, A. y Micol, J. L. (1999). Venation pattern formation in Arabidopsis thaliana vegetative leaves. Dev. Biol. 205: 205-216. Carles, C. C. y Fletcher, J. C. (2003). Shoot apical meristem maintenance: the art of a dynamic balance. Trends Plant Sci. 8: 394-401. Carpenter, R. y Coen E. S. (1990). Floral homeotic mutations produced by transposonmutagenesis in Antirrhinum majus. Genes Dev. 9:1483-1493. Carpenter, R.; Copsey, L.; Vincent, C.; Doyle, S.; Magrath, R. y Coen, E. (1995). Control of flower development and phyllotaxy by meristem identity genes in Antirrhinum. Plant Cell 7: 2001-2011. Bibliografía 177 Castelli-Gair, J. E. (1998). Implications of the spatial and temporal regulation of Hox genes on development and evolution. Int. J. Dev. Biol. 42: 437-444. Castiglone-Morelli, M. A.; Stier, G.; Gibson, T.; Joseph, C.; Musco, G.; Pastore, A. y Trave, G. (1995). The KH module has an alpha beta fold. FEBS Lett. 358(2): 193-198. Castle, L. A.; Errampalli, D.; Atherton, T. L.; Franzmann, L. H.; Yoon, E. S. y Meinke D. W. (1993). Genetic and molecular characterization of embryonic mutants identified following seed transformation in Arabidopsis. Mol. Gen. Genet. 241: 504-514. Chekanova, J. A.; Dutko, J. A.; Mian, S. y Belostotsky, D. A. (2002). Arabidopsis thaliana exosome subunit AtRrp4p is a hydrolytic 3’→5’ exonucleases containing S1 and KH RNA-binding domains. Nucleic Acids Res 30: 695-700. Chen C., Xu Y., Zeng M and Huang H. (2001) Genetic control by Arabidopsis genes Leunig and Filamentous Flower in gynoecium fusion. J. Plant Res. 114: 465-469 Chen, C.; Wang, S. y Huang, H. (2000). LEUNIG has multiple functions in gynoecium development in Arabidopsis. Genesis 26: 42-54. Chen, X. (2004). A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science 303: 2022-2025. Chen, X. y Meyerowitz, E. M. (1999). HUA1 and HUA2 are two members of the floral homeotic AGAMOUS pathway. Mol. Cell 3: 349-360. Chen, X.; Liu, J.; Cheng, Y. y Jia, D. (2002). HEN1 functions pleiotropically in Arabidopsis development and acts in C function in the flower. Development 129: 10851094. Cheng, Y. y Chen, X. (2004). Posttranscriptional control of plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 7: 20-25. Cheng, Y.; Kato, N.; Wang, W.; Li, J. y Chen, X. (2003). Two RNA binding proteins, HEN4 and HUA1, act in the Processing of AGAMOUS pre-mRNA in Arabidopsis thaliana. Dev. Cell 4: 53-56. Chkheidze, A. N. y Liebhaber, S. A. (2003). A novel set of nuclear localization signals determine distributions of the alphaCP RNA-binding proteins. Mol. Cell Biol. 23: 8405-8415. Choi, S.; Creelman, R. A.; Mullet, J. y Wing, R. A. (1995). Construction and characterization of bacterial artificial chromosome library of Arabidopsis thaliana. Weeds World 2: 17-20. Clark, S. E. (2001). Cell signalling at the shoot meristem. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 276284. Clark, S. E.; Running, M. P. y Meyerowitz, E. M. (1993). CLAVATA1, a regulator of meristem and flower development in Arabidopsis. Development 119: 397-418. Clark, S. E.; Williams, R. W. y Meyerowitz E. M. (1997). The CLAVATA1 gene encodes a putative receptor kinase that controls shoot and floral meristem size in Arabidopsis. Cell 89: 575-585. Clough, S. J. y Bent, A. F. (1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-743. Cluster, P. D.; O’Dell, M.; Metzlaff, M. y Flavell, R. B. (1996). Details of T-DNA estructural organization from a transgenic Petunia population exhibiting cosuppression. Plant Mol. Biol. 32: 1197-1203. Cock, J. M.; Vanoosthuyse, V. y Gaude; T. (2002). Receptor kinase signalling in plants and animals: distinct molecular systems with mechanistic similarities. Curr. Op. Cell Biol. 14: 230-236. Bibliografía 178 Coen, E. S. (1992). Flower development. Curr. Opin. Cell Biol. 6: 929-933. Coen, E. S. y Meyerowitz, E. M. (1991). The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development. Nature 353: 31-37. Coen, E.; Romero, J. M.; Doyle, S.; Elliott, R.; Murphy, G. y Carpenter, R. (1990). floricaula: A homeotic gene required for flower development in Antirrhinum majus. Cell 63: 1311-1322. Conner, J. y Liu, Z. (2000). LEUNIG, a putative transcriptional corepressor that regulates AGAMOUS expression during flower development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12902-12907. Cummings, M. (2002). Human Heredity: Principles and Issues. Brooks Cole Press. Davidson, E. H. (1994). Molecular biology of embryonic development: how far have we come in the last ten years? Bioessays 16: 603-615. Davidson, E. H. (2001). Genomic Regulatory Systems: Developmental and Evolution. San Diego, Academic Press. De Young, B. J. y Clark, S. E. (2001) Signaling through the CLAVATA1 receptor complex. Plant Mol. Biol. 46: 505-513. Desfeux, C.; Clough, S. J. y Bent, A. F. (2000). Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol. 123: 895-904. Diévart, A.; Dalal, M.; Tax, F. E.; Lacey, A. D.; Huttly, A.; Li, J. y Clark, S. E. (2003). CLAVATA1 dominant-negative alleles reveal functional overlap between multiple receptor kinases that regulate meristem and organ development. Plant Cell 15: 11981211. Doerner P. (2000). Plant stem cells: the only constant thing is change. Curr. Biol. 16: 826829. Drews, G. N.; Bowman, J. L. y Meyerowitz, E. M. (1991). Negative regulation of the Arabidopsis homeotic gene AGAMOUS by the APETALA2 product. Cell 65: 991-1002 Driesch, H. (1898). Über rein-mütterliche Charaktere and Bastardlaven von Echiniden. Wilhelm Roux Arch. Entwicklungdmech. Org. 7: 65-102. Egea-Cortines, M.; Saedler, H. y Sommer, H. (1999). Ternary complex formation between the MADS-box proteins SQUAMOSA, DEFICIENS and GLOBOSA is involved in the control of floral architecture in Antirrhinum majus. EMBO J. 18: 5370-5379. Ehsan, H.; Reichheld, J. P.; Durfee, T. y Roe, J. L. (2004). TOUSLED kinase activity oscillates during the cell cycle and interacts with chromatin regulators. Plant Physiol. 134: 1488-1499. Endrizzi, K.; Moussian, B.; Haecker, A.; Levin, J. Z. y Laux, T. (1996). The SHOOT MERISTEMLESS gene is required for maintenance of undifferentiated cells in Arabidopsis shoot and floral meristems and acts at a different regulatory level than the meristem genes WUSCHEL and ZWILLE. Plant J. 10:967-979. Eshed, Y.; Baum, S. F. y Bowman, J. L. (1999). Distinct mechanisms promote polarity establishment in carpels of Arabidopsis. Cell 99: 199-209. Estelle, M. A. y Somerville, C. R. (1992). The mutants of Arabidopsis. Trends Genet. 2: 89-193. Evans, M. S. y Barton M. K. (1997). Genetics of angiosperm shoot apical meristem development. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 673-708. Evans, M. W. y Grover, F. O. (1940). Developmental morphology of the growing point of the shoot and the inflorescence in grasses. J. Agric. Res. 61: 481-520. Bibliografía 179 Fedoroff, N. V. (2002). RNA-binding proteins in plants: the tip of an iceberg? Curr. Opin. Plant Biol. 5: 452-459. Ferguson, E. y Horvitz, H. R. (1985). Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of Caenorhabditis elegans. Genetics 110: 17-72. Ferrándiz, C. (2002). Regulation of fruit dehiscence in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 53: 20312038. Ferrándiz, C.; Gu, Q.; Martienssen, R. y Yanofsky, M. F. (2000a). Redundant regulation of meristem identity and plant architecture by FRUITFULL, APETALA1 and CAULIFLOWER. Development 127: 725-734. Ferrándiz, C.; Liljegren. S. J. y Yanofsky, M. F. (2000b). Negative regulation of the SHATTERPROOF genes by FRUITFULL during Arabidopsis fruit development. Science 289: 436-438. Ferrándiz, C.; Pelaz, S. y Yanofsky, M. F. (1999). Control of carpel and fruit development in Arabidopsis. Annu. Rev. Biochem. 68: 321-354. Flanagan, C. A.; Hu, Y. y Ma, H. (1996). Specific expression of AGL1 MADS-box gene suggests regulatory functions in Arabidopsis gynoecium and ovule development. Plant J. 10: 343-353. Fletcher, J. C. (2002). Shoot and floral meristem maintenance in arabidopsis. Annu. Rev. Plant. Biol. 53: 45-66. Fletcher, J. C. y Meyerowitz, E. M. (2001). Cell signaling within the shoot meristem. Curr. Opin. Plant Biol. 3: 23-30. Fletcher, J. C.; Brand, U.; Running, M. P.; Simon, R. y Meyerowitz, E. M. (1999) Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science 283: 1911-1914. Fletcher, J. C.; y Meyerowitz, E. M. (2000). Cell signalling within the shoot meristem. Curr. Op. Plant Biol. 3: 23-30. Fornara, F.; Marziani, G.; Mizzi, L.; Kater, M. y Colombo, L. (2003). MADS-box genes controllimg flower development in rice. Plant Biol. 5: 16-22. Forsbach, A.; Schubert, D.; Lechtenberg, B.; Gils, M. y Schmidt R. (2003) A comprehensive characterization of single-copy T-DNA insertions in the Arabidopsis thaliana genome. Plant Mol. Biol. 52:161-176. Fosket, D. E. (1994). Plant Growth and Development. A Molecular Approach. Academic Press, Inc. Friml, J.; Benkova, E.; Blilou, I.; Wisniewska, J.; Hamann, T.; Ljung, K.; Woody, S.; Sandberg, G.; Scheres, B.; Jürgens, G. y Palme, K. (2002). AtPIN4 mediates sinkdriven auxin gradients and root patterning in Arabidopsis. Cell 108: 661-673. Fukui, A. y Asashima, M. (1994). Control of cell differentiation and morphogenesis in amphibian development. Int. J. Dev. Biol. 38: 257-266. Furner, I. J. y Pumfrey, J. E. (1992). Cell fate in the shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana. Development 115: 755-764. Gallie, D. R. (1998). Controlling gene expression in transgenics. Curr. Opin. Plant Biol. 1: 166-172. Gallois, J. L.; Woodward, C.; Reddy, G. V. y Sablowski, R. (2002). Combined SHOOT MERISTEMLESS and WUSCHEL trigger ectopic organogenesis in Arabidopsis. Development 129: 3207-3217. Bibliografía 180 Gibson, T. J.; Rice, P. M.; Thompson, J. D. y Heringa, J. (1993). KH domains within the FMR1 sequence suggest that fragile X syndrome stems from defects in RNA metabolism. Trends Bichem. Sci. 18: 331-333. Gilbert, S. F. (2000). Developmental Biology. Sinauer Associates. Goff, S. A.; Ricke, D.; Lan, T. H.; Presting, G.; Wang, R.; Dunn, M.; et al. (2002). A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science 296: 92-100. Goto, K. y Meyerowitz, E. M. (1994). Function and regulation of the Arabidopsis floral homeotic gene PISTILLATA. Genes Dev. 8: 1548-1560. Goto, K.; Kyozuka, J. y Bowman, J. L. (2001). Turning floral organs into leaves, leaves into floral organs. Curr. Opin. Genet. Dev. 11: 449-456. Griffing, B. y Scholl, R. L. (1991). Qualitative and quantitative genetic studies of Arabidopsis thaliana. Genetics 129: 605-609. Griffith, A. J. F.; Miller, J. H.; Suzuki, D. T.; Lewontin, R. C.; Gelbart, W. M. (2002) Genética. 7ª ed. McGraw-Hill-Interamericana. Grishin, N. V. (2001). KH domain: one motif, two folds. Nucleic Acids Res. 29: 638-643. Grunwald, D. J. y Eisen, J. S. (2002). Headwaters of the zebrafish-emergence of a new model vertebrate. Nat. Rev. Genet. 3: 717-724. Gu, Q.; Ferrándiz, C.; Yanofsky, M. F. y Martienssen, R. (1999). The FRUITFULL MADS-box gene mediates cell differentiation during Arabidopsis fruit development. Development 125: 1509-1517. Haecker, A.; Laux, T. (2001). Cell-cell signaling in the shoot meristem. Curr. Opin. Plant Biol. 4: 441-446. Haffter P, Nüsslein-Volhard C. (1996). Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int. J. Dev. Biol. 40: 221-227. Haffter, P.; Granato, M.; Brand, M.; Mullins, M. C.; Ham-Merschmidt, M.; Kane, D. A.; Odenthal, J.; Van Eeden, F. J.; Jiang, Y. J.; Heisenberg, C. P.; Kelsh, R. N.; FurutaniSeiki, M.; Vogelsang, E.; Beuchle, D.; Schach, U.; Fabian, C. y Nüsslein-Volhard, C. (1996). The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development 123: 1-36. Hake, S. y Freeling, S. (1985). Developmental genetics of mutants that specify Knotted leaves in maize. Genetics 111: 617-634. Hall, A. E.; Fiebig, A. y Preuss, D. (2002). Beyond the Arabidopsis genome: opportunities for comparative genomics. Plant Physiol. 129: 1439-1447. Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580. Hartl, D. L. y Ochman, H. (1996) Inverse polymerase chain reaction. Methods Mol. Biol. 58:293-301. Hawley, R. S. y Walker, M. Y. (2003). Advanced Genetic Analisys. Finding meaning in a genome. Blackwell Science Ltd. Heisler, M. G.; Atkinson, A.; Bylstra, Y. H.; Walsh, R. y Smyth, D. R. (2001). SPATULA, a gene that controls development of carpel margin tissues in Arabidopsis, encodes a bHLH protein. Development 128: 1089-1098. Hellens, R. P.; Edwards, E. A.; Leyland, N. R.; Bean, S. y Mullineaux P. M. (2000a). pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 42: 819-832. Hellens, R. P.; Mullineaux, P. M. y Klee, H. (2000b). A guide to Agrobacterium binary Tivectors. Trends Plant Sci. 10: 446-451. Bibliografía 181 Hempel, F. D.; Weigel, D.; Mandel, M. A.; Ditta, G.; Zambryski, P. C.; Feldman, L. J. y Yanofsky, M. F. (1997). Floral determination and expression of floral regulatory genes in Arabidopsis. Development 124: 3845-3853. Hempel, F. D.; Welch, D. R. y Feldman, L. J. (2000). Floral induction and determination: where is flowering controlled? Trends Plant Sci. 5: 17-21. Higgins, D. G.; Thompson, J. D. y Gibson, T. J. (1996). Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods Enzymol. 266: 383-402. Hill, T. A.; Day, C. D.; Zondlo, S. C.; Thackeray, A. G. y Irish, V. F. (1998). Discrete spatial and temporal cis-acting elements regulate transcrip-tion of the Arabidopsis floral homeotic gene APETALA3. Development 125: 1711-1721. Hodgkin, J. (1998). Seven types of pleiotropy. Int. J. Dev. Biol. 42: 501-505. Hoekema, A.; Hirch, P. R.; Hooykaas, P. J. y Schilperoot, R. A. (1983). A binary plant vector based on separation of vir and T-region of the A. tumefaciens Ti plasmid. Nature 303: 178-180. Honma, T. y Goto, K. (2000). The Arabidopsis floral homeotic gene PISTILLATA is regulated by discrete cis-elements responsive to induction and maintenance signals. Development 127: 2021-2030. Honma, T. y Goto, K. (2001). Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs. Nature 409: 525-529. Howell, S. H. (1998). Molecular Genetics of Plant Development. Cambrige University Press. Huala, E.; Dickerman, A. W.; Garcia-Hernandez, M.; Weems, D.; Reiser, L.; LaFond, F.; Hanley, D.; Kiphart, D.; Zhuang, M.; Huang, W.; Mueller, L. A.; Bhattacharyya, D.; Bhaya, D.; Sobral, B. W.; Beavis, W.; Meinke D. W.; Town, C. D. y Somerville, C.; Rhee, S. Y. (2001) The Arabidopsis Information Resource (TAIR): a comprehensive database and web-based information retrieval, analysis, and visualization system for a model plant. Nucleic Acids Res. 29:102-105. Hudson, A. (2000). Development of symmetry in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51:349-370. Hulo, N.; Sigrist, C. J.; Le Saux, V.; Langendijk-Genevaux, P. S.; Bordoli, L.; Gattiker, A.; De Castro, E.; Bucher, P. y Bairoch, A. (2004). Recent improvements to the PROSITE database. Nucleic Acids Res. 32: 134-137. Hunter, C. A.; Aukerman, M. J.; Sun, H.; Fokina, M. y Poethig, R. S. (2003). PAUSED encodes the Arabidopsis exportin-t ortholog. Plant Physiol. 132: 2135-2143. Innan, H.; Terauchi, R. y Miyashita, N. T. (1997). Microsatellite polymorphism in natural populations of the wild plant Arabidopsis thaliana. Genetics 146: 1441-1452. International Human Genome Mapping Consortium. (2001). A physical map of the human genome. Nature 409: 934-941. Irish, V. F. (1991). Cell lineage in plant development. Curr. Opin. Cell Biol. 3: 983-987. Irish, V. F. y Sussex, I. M. (1992). A fate map of the Arabidopsis embryonic shoot apical meristem. Development 115: 745-753. Jack, T. (2001). Plant development going MADS. Plant Mol. Biol. 46: 515-520. Jack, T. (2002). New members of the floral organ identity AGAMOUS pathway. Trends Plant Sci. 7: 286-287. Jack, T. (2004). Molecular and genetic mechanisms of floral control. Plant Cell 16: S1-S17. Bibliografía 182 Jack, T.; Brockman, L. L. y Meyerowitz, E. M. (1992). The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens. Cell 68: 683-697. Jander, G.; Norris, S. R.; Rounsley, S. D.; Bush, D. F.; Levin, I. M. y Last, R. L. (2002). Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129: 440-450. Jeong, S.; Trotochaud, A. E y Clark, S. E. (1999). The Arabidopsis CLAVATA2 gene encodes a receptor-like protein required for the stability of the CLAVATA1 receptorlike kinase. Plant Cell 11: 1925-1934. Jofuku, K. D.; Den Boer, B. G.; Van Montagu, M. y Okamuro, J. K. (1994). Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene APETALA2. Plant Cell 6: 1211-1225. Jorgensen, R. A.; Cluster, P. D.; English, J.; Que, Q. y Napoli, C. A. (1996). Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol. Biol. 31:957-973. Jürgens, G.; Mayer, U.; Torres-Ruiz, R. A.; Berleth, T. y Miséra, S. (1991). Genetic analysis of pattern formation in the Arabidopsis embryo. Dev. Suppl. 1: 27-38. Jürgens, G.; Torres-Ruiz, R. A. y Berleth, T. (1994) Embryonic pattern formation in flowering plants. Annu. Rev. Genet. 28: 351-371. Justice, M. J. (2000). Capitalizing on large-scale mouse mutagenesis screens. Nat. Rev. Genet. 1: 109-115. Kandasamy, M. K.; Nasrallah, J. B. y Nasrallah, M. E. (1994). Pollen-pistil interactions and developmental regulation of pollen tube growth in Arabidopsis. Development 120: 3405-3418. Kapoor, M.; Tsuda, S.; Tanaka, Y.; Mayama, T.; Okuyama, Y.; Tsuchimoto, S. y Takatsuji, H. (2002). Role of petunia pMADS3 in determination of floral organ and meristem identity, as revealed by its loss of function. Plant J. 32:115-127. Kayes, J. M. y Clark, S. E. (1998). CLAVATA2, a regulator of meristem and organ development in Arabidopsis. Development 125: 3843-3851. Kerstetter, R. A.; Bollman, K.; Taylor, R. A.; Bomblies, K. y Poethig, R. S. (2001). KANADI regulates organ polarity in Arabidopsis. Nature 411: 706-719. Klucher, K. M.; Chow, H.; Reiser, L. y Fischer, R. L. (1996). The AINTEGUMENTA gene of Arabidopsis required for ovule and female gametophyte development is related to the floral homeotic gene APETALA2. Plant Cell 8: 137-153. Koncz, C.; Nemeth, K.; Redei, G. P. y Schell J. (1992). T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis. Plant Mol. Biol. 5: 963-976. Koorneef, M. y Stam, P. (1992). Genetic analysis. en Methods in Arabidopsis research. pp: 83-99. Koncz, C.; Chua, N. H. y Schell, J. (eds.). World Scientific. Koornneef, M.; Blankestijn-de Vries, H.; Hanhart, C. J.; Soppe, W. y Peeters A. J. M. (1994). The phenotype of some late-flowering mutants is enhanced by a locus on chromosome 5 that is not effective in the Landsberg erecta wild-type. Plant J. 6: 911919. Krecic, A. M. y Swanson, M. S. (1999). hnRNP complexes: composition, structure and function. Curr.Opin. Cell Biol. 11: 363-371. Kreuger, M. y Van Holst, G.-H. (1996). Arabinogalactan proteins and plant differentiation. Plant Mol. Biol. 30: 1077-1086. Bibliografía 183 Krizek, B. A. y Meyerowitz, E. M. (1996). The Arabidopsis homeotic genes APETALA3 and PISTILLATA are sufficient to provide the B class organ identity function. Development 122: 11-22. Krizek, B. A.; Prost, V. y Macias A. (2000). AINTEGUMENTA promotes petal identity and acts as a negative regulator of AGAMOUS. Plant Cell 12: 1357-1366. Krysan, P. J.; Young, J. C. y Sussman M. R. (1999). T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell 12: 2283-2290. Kumaran, M. K.; Bowman, J. L. y Sundaresan, V. (2002). YABBY polarity genes mediate the repression of KNOX homeobox genes in Arabidopsis. Plant Cell 14: 2761-2770. Kuromori, T.; Hirayama, T.; Kiyosue, Y.; Takabe, H.; Mizukado, S.; Sakurai, T.; Akiyama, K.; Kamiya, A.; Ito, T. y Shinozaki, K. (2004). A collection of 11.800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis. Plant J. 37: 897-905. Labourier, E.; Blanchette, M.; Feiger, J. W.; Adams, M. D. y Rio, D. C. (2002). The KHtype RNA-binding protein PSI is required for Drosophila viability, male fertility, and cellular mRNA processing. Genes Dev. 16: 72–84. Laibach, F. (1943). Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. als Objekt für genestiche und entwicklungsphysiologische. Laufs, P.; Autran, D. y Traas J. (1999). A chromosomal paracentric inversion associated with T-DNA integration in Arabidopsis. Plant J. 18: 131-139. Laufs, P.; Grandjean, O.; Jonak, C.; Kieu, K. y Traas, J. (1998). Cellular parameters of the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell 10: 1375-1390. Laux, T. (2003). The stem cell concept in plants: a matter of debate. Cell 113: 281-283. Laux, T.; Mayer, K. F.; Berger, J. y Jürgens, G. (1996). The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis. Development 122: 87-96 Laux, T.; Wurschum, T. y Breuninger, H. (2004). Genetic regulation of embryonic pattern formation. Plant Cell. 16 : S190-202. Lee, M. H. y Schedl, T. (2001).Identification of in vivo mRNA targets of GLD-1,a maxiKH motif containing protein required for C.elegans germ cell development. Genes Dev. 15: 2408–2420. Lenhard, M. y Laux, T. (1999). Shoot meristem formation and maintenance. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 44-50. Lenhard, M. y Laux, T. (2003). Stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot meristem is regulated by intercellular movement of CLAVATA3 and its sequestration by CLAVATA1. Development 130: 3163-3173. Lenhard, M.; Bohnert, A.; Jurgens, G.; Laux, T. (2001). Termination of stem cell maintenance in Arabidopsis floral meristems by interactions between WUSCHEL and AGAMOUS. Cell 105: 805-814. Lenhard, M.; Jurgens, G.; Laux, T. (2002). The WUSCHEL and SHOOTMERISTEMLESS genes fulfil complementary roles in Arabidopsis shoot meristem regulation. Development 129: 3195-3206. Leutwiler, L. S.; Hough-Evans, B. R. y Meyerowitz, E. M. (1984). The DNA of Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 194: 15-23. Leyser, O. (2003). Regulation of shoot branching by auxin. Trends Plant. Sci. 8: 541-545. Li, F.; Flanagan, C. A.; Zaho, Y.; Ma, H. y Huang, H. (1999). Assignment of 44 Ds insertions to the linkage map of Arabidopsis. Plant Mol. Biol.Rep. 17: 109-122. Li, H.; Shen, J. J.; Zheng, Z. L.; Lin, Y. y Yang, Z. (2001). The Rop GTPase switch controls multiple developmental processes in Arabidopsis. Plant Physiol. 126:670-684. Bibliografía 184 Li, H.; Wu, G.; Ware, D.; Davis, K. R. y Yang, Z. (1998). Arabidopsis Rho-related GTPases: differential gene expression in pollen and polar localization in fission yeast. Plant Physiol. 118(2):407-417. Li, J. y Chen, X. (2003). PAUSED, a putative exportin-t, acts pleiotropically in Arabidopsis development but is dispensable for viability. Plant Physiol. 132: 1913-1924. Li, Y.; De Fatta, R.; Anthony, C.; Sunavala, G. y De Benedetti, A. (2001). A translationally regulated Tousled kinase phosphorylates histone H3 and confers radioresistance when overexpressed. Oncogene 20: 726-738. Liljegren, S. J.; Ditta, G. S.; Eshed, Y.; Savidge, B.; Bowman, J. L. y Yanofsky, M. F. (2000). SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature 404: 766-770. Liljegren, S. J.; Roeder, A. H. K.; Kempin, S. A.; Gremski, K.; Østergaard, L.; Guimil, S.; Reyes, D. K. y Yanofsky, M. F. (2004). Control of fruit patterning in Arabidopsis by INDEHISCENT. Cell 116: 843-853. Lim, M. H.; Kim, J.; Kim, Y. S.; Chung, K. S.; Seo, Y. H.; Lee, I.; Kim, J; Hong, C. B.; Kim, H. J. y Park, C. M. (2004). A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K Homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell 3: 731-740. Lin, W. C.; Shuai, B. y Springer, P. S. (2003). The Arabidopsis LATERAL ORGAN BOUNDARIES-domain gene ASYMMETRIC LEAVES2 functions in the repression of KNOX gene expression and in adaxial-abaxial patterning. Plant Cell 15: 2241-2252. Lindsey, K.; Topping, J. F.; Muskett, P. R.; Wei, W. y Horne, K. L. (1998). Dissecting embryonic and seedling morphogenesis in Arabidopsis by promoter trap insertional mutagenesis. Symp. Soc. Exp. Biol. 51: 1-10. Liu, J.; Jia, D. y Chen, X. (2001). HUA1, a Regulator of Stamen and Carpel Identities in Arabidopsis, Codes for a Nuclear RNA Binding Protein. Plant Cell 13: 2269–228. Liu, Y. G.; Mitsukawa, N.; Oosumi, T. y Whittier, R. F. (1995). Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR. Plant J. 8: 457-63. Liu, Z.; Franks, R. G. y Klink, V. P. (2000). Regulation of gynoecium marginal tissue formation by LEUNIG and AINTEGUMENTA. Plant Cell 12: 1879-1892. Lohmann, J. U. y Weigel, D. (2002). Building beauty: the genetic control of floral patterning. Dev. Cell 2: 135-42. Lohmann, J. U.; Hong, R. L.; Hobe, M.; Busch, M. A.; Parcy, F.; Simon, R. y Weigel, D. (2001). A molecular link between stem cell regulation and floral patterning in Arabidopsis. Cell 105: 793-803 Long, D.; Martin, M.; Sundberg, E.; Swinburne, J.; Puangsomlee, P. y Coupland, G. (1993). The maize transposable element system Ac/Ds as a mutagen in Arabidopsis: identification of an albino mutation induced by Ds insertion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10370-10374. Long, J. A.; Moan, E. I.; Medford, J. I. y Barton, M. K. (1996). A member of the KNOTTED class of homeodomain proteins encoded by the STM gene of Arabidopsis. Nature. 379: 66-69. Lorkovic, Z. J. y Barta, A. (2002). Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homolgy (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30: 623-635. Bibliografía 185 Lu, P.; Porat, R.; Nadeau, J. A. y O’Neill, S. D. (1996). Identification of a meristem L1 layer-specific gene in Arabidopsis that is expressed during embryonic pattern formation and defines a new class of homeobox genes. Plant Cell 8: 2155-2168. Lucas W. J.; Bouche-Pillon, S.; Jackson, D. P.; Nguyen, L.; Baker, L.; Ding, B. y Hake S. (1995). Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science 270:1980-1983. Lyndon, R. F. (1990). Plant Development. Unwin Hyman. Ma, H. (1994). The unfolding drama of flower development: recent results from genetic and molecular analyses. Genes Dev. 8: 745-756. Ma, H.; Yanofsky, M. F. y Meyerowitz, E. M. (1991). AGL1-AGL6, an Arabidopsis gene family with similarity to floral homeotic and transcription factor genes. Genes Dev. 5: 484-495. Macknight, R.; Bancroft, I.; Page, T.; Lister, C.; Schmidt, R.; Love, K.; Westphal, L.; Murphy, G.; Sherson, S.; Cobbett, C. y Dean, C. (1997). FCA, a gene controlling flowering time in Arabidopsis, encodes a protein containing RNA-binding domains. Cell 89: 737-745. Majewska-Sawka, A. y Nothangel, E. A. (2000). The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiol. 122: 3-9. Mandel M. A.; Gustafson-Brown C.; Savidge B. y Yanofsky M. F. (1992). Molecular characterization of the Arabidopsis floral homeotic gene APETALA1. Nature 360: 273277. Mandel, M. A. y Yanofsky, M. F. (1999). A gene triggering flower formation in Arabidopsis. Nature 377: 522-524. Mandel, M. A.; Gustafson-Brown, C.; Savidge, B. y Yanofsky, M. F. (1992). Molecular characterization of the Arabidopsis floral homeotic gene APETALA1. Nature 360: 273277. Mange, E. J. y Mange, A. P. (1999). Basic Human Genetics, 2nd edition. Sinauer Associates Inc. Marin, V. A. y Evans, T. C. (2003). Translational repression of a C. elegans Notch mRNA by the STAR/KH domain protein GLD-1. Development 130: 2623-2632. Martínez, M. C.; Jørgenson, J. E.; Lawton, M.; Lamb, C. J.; Doerner, P. W. (1992). Spatial pattern of cdc2 expression in relation to meristem activity and cell proliferation during plant development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7360-7364. Martínez-Zapater, J.M., y Somerville, C.R. (1990). Effect of light quality and vernalization on late-flowering mutants of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 92: 770–776. Matzke, A. J y Matzke, M. A. (1998). Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes. Curr. Opin. Plant Biol. 1: 142-148. Mayer K. F.; Schoof, H.; Haecker, A.; Lenhard, M.; Jurgens, G.; Laux, T. (1998). Role of WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem. Cell 95: 805-815. McConnell, J. R. y Barton, M. K. (1998). Leaf polarity and meristem formation in Arabidopsis. Development 125: 2935-2942. McConnell, J. R.; Emery, J.; Eshed, Y.; Bao, N.; Bowman, J. y Barton, M. K. (2001). Role of PHABULOSA and PHAVOLUTA in determining radial patterning in shoots. Nature 411: 709-713. Bibliografía 186 Medford, J. I.; Behringer, F. J.; Callos, J. D. y Feldmann, K. A. (1992). Normal and abnormal development in the Arabidopsis vegetative shoot apex. Plant Cell 4: 631643. Meinke D. W. (1995). Genetic nomenclature guide. Arabidopsis thaliana. Trends Genet. 11: 22-23. Meinke, D. W.; Cherry, J. M.; Dean, C.; Rounsley, S. D. y Koornneef, M. (1998). Arabidopsis thaliana: a model plant for genome analysis. Science 282: 679-682. Meinke, D. y Koornneef, M. (1997). Community standards for Arabidopis. Plant J. 12: 247-253. Mena, M.; Ambrose, B. A.; Meeley, R. B.; Briggs, S. P.; Yanofsky, M. F. y Schmidt, R. J. (1996). Diversification of C-function activity in maize flower development. Science 274: 1537-1540. Messenguy, F. y Dubois, E. (2003). Role of MADS box proteins and their cofactors in combinatorial control of gene expression and cell development. Gene. 16: 316:1-21. Mewes, H. W.; Albermann, K.; Bähr, M.; Frishman, D.; Gleissner, A.; Hani, J.; Heumann, K.; Kleine, K.; Maierl, A.; Oliver, S. G.; Pfeiffer, F. y Zollner, A. (1997). Overview of the yeast genome. Nature 387: 7-65. Meyerowitz, E. M. (1987). Arabidopsis thaliana. Annu. Rev. Genet. 21: 93-111. Meyerowitz, E. M. (1989). Arabidopsis, a useful weed. Cell 56: 263-269. Meyerowitz, E. M. (1994a). Pattern formation in plant development: four vignettes. Curr. Op. Genet. Dev. 4: 621-624. Meyerowitz, E. M. (1994b). Plant developmental biology: Green genes for the 21st century. BioEssays 16: 621-625. Meyerowitz, E. M. (1997). Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell 88: 299-308. Meyerowitz, E. M. (2001). Prehistory and history of Arabidopsis research. Plant Physiol. 125: 15-19. Meyerowitz, E. M.; Bowman, J. L.; Brockman, L. L.; Drews, G. N.; Jack, T.; Lieburth, L. E. y Weigel, D. (1991). A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev. Suppl. 1: 157-167. Meyerowitz, E.M. y Pruit, R. E. (1985). Arabidopsis thaliana and plant molecular genetics. Science 229: 1214-1218. Meyerowitz, E.M. y Somerville, C. R. (1994). Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Nueva York. Michaels, S. D. y Amasino, R. M. (1999). FLOWERING LOCUS C encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering. Plant Cell 11: 949-956. Michaels, S. D. y Amasino, R. M. (2001). Loss of FLOWERING LOCUS C activity eliminates the late-flowering phenotype of FRIGIDA and autonomous pathway mutations but not responsiveness to vernalization. Plant Cell 13: 935-941. Miyoshi, K.; Ahn, B. O.; Kawakatsu, T.; Ito, Y.; Itoh, J.; Nagato, Y. y Kurata, N. (2004) PLASTOCHRON1, a timekeeper of leaf initiation in rice, encodes cytochrome P450. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 875-880. Mizukami, Y. y Ma, H. (1997). Determination of Arabidopsis floral meristem identity by AGAMOUS. Plant Cell 9: 393-408. Mizukami, Y. y Ma, H.(1995). Separation of AG function in floral meristem determinacy from that in reproductive organ identity by expressing antisense AG RNA. Plant Mol. Biol. 28: 767-784. Bibliografía 187 Mouradov, A.; Cremer, F. y Coupland, G. (2002). Control of flowering time: interacting pathways as a basis for diversity. Plant Cell 14: 111-130. Mozo, T.; Fischer, S.; Shizuya, H. y Altmann, T. (1998). Construction and characterization of the IGF Arabidopsis BAC library. Mol. Gen. Genet. 258: 562-570. Mullis, K.; Faloona, F.; Scharf, S.; Saiki, R.; Horn, G. y Erlich, H. (1986). Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51: 263-273. Murashige, T. y Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay, witj tobacco tisuue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497. Musco, G.; Kharrat, A.; Stier, G.; Fraternali, F.; Gibson, T. J.; Nilges, M. y Pastore, A. (1997). The solution structure of the first KH domain of FMR1, the protein responsible for the fragile X syndrome. Nat. Struct. Biol. 4: 712-716. Nabel-Rosen, H.; Dorevitch, N.; Reuveny, A. y Volk, T. (1999). The balance between two isoforms of the Drophila RNA-binding protein how controls tendon cell differentiation. Mol. Cell 4: 573-584. Nacry, P.; Camilleri, C.; Courtial, B.; Caboche, M. y Bouchez, D. (1998). Major chromosomal rearrangements induced by T-DNA transformation in Arabidopsis. Genetics 149: 641-650. Nadeau, J. H. (2001). Modifier genes in mice and humans. Nat. Rev. Genet. 2: 165-174. Nadeau, J. H. (2003). Modifier genes and protective alleles in humans and mice. Curr. Opin. Genet Dev. 13: 290-295. Nakajima, K.; Sena, G.; Nawy, T. y Benfey, P. N. (2001). Intercellular movement of the putative transcription factor SHR in root patterning. Nature 413: 307-311. Nancy, N. Huang, N. N.; Mootz, D. E.; Walhout, A. J. M.; Vidal M. y Hunter C. P. (2002). MEX-3 interacting proteins link cell polarity to asymmetric gene expression in Caenorhabditis elegans. Development 129: 747-759. Negruk, V.; Eisner, G. y Lemieux, B. (1996). Addition-deletion mutations in transgenic Arabidopsis thaliana generated by the seed co-cultivation method. Genome 39: 11171122. Nemhauser, J. L: Feldman, L. J. y Zambryski, P. C. (2000). Auxin and ETTIN in Arabidopsis gynoecium morphogenesis. Development 127: 3877-3888. Ng, M. y Yanofsky, M. F. (2001). Function and evolution of the plant MADS-box gene family. Nat. Rev. Genet. 2: 186-195. Nole-Wilson, S. y Krizek, B. A. (2000). DNA binding properties of the Arabidopsis floral development protein AINTEGUMENTA. Nucleic Acids Res. 28: 4076-4082. Nüsslein-Volhard, C. y Wieschaus E. (1980). Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature 287: 795-801 Ochman, H.; Gerber, A. S. y Hartl, D. L. (1988). Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120:621-623. Ogas, J.; Kaufmann, S.; Henderson, J. y Somerville, C. (1999). PICKLE is a CHD3 chromatin-remodeling factor that regulates the transition from embryonic to vegetative development in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 13839-13844. Ohba, T.; Yoshioka, Y.; Machida, C. y Machida, Y. (1995). DNA rearrangement associated with the integration of T-DNA in tobacco: an example for multiple duplications of DNA around the integration target. Plant J. 7: 157-164. Bibliografía 188 Okamuro J. K, Den Boer, B. G. W.; Lotys-Prass, C.; Szeto, W. y Jofuku, K. D. (1996). Flowers into shoots: photo and hormonal control of a meristem identity switch in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13831-13836. Ori, N.; Eshed, Y.; Chuck, G. y Bowman, J. L.; Hake, S. (2000). Mechanisms that control knox gene expression in the Arabidopsis shoot. Development 127: 5523-5532. Ostareck-Ledere, A.; Ostareck, D. H. y Hentze, M. W. (1998). Cytoplasmic regulatory functions of the KH-domain proteins hnRNPs K and E1/E2. Trends Biochem. Sci. 23: 409-411. Page, D.R. y Grossniklaus, U. (2002). The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nat. Rev. Genet. 3: 124-136. Paniagua, R.; Nistal, M.; Sesma, P.; Álvarez-Uría, M.; Fraile, B.; Anadón, R.; Sáez, F. J. y de Miguel, M. P. (1997). Citología e Histología Vegetal y Animal. 2ª ed. MacGrawHill Interamericana. Para, A. y Sundas-Larsson, A. (2003). The pleiotropic mutation dar1 affects plant architecture in Arabidopsis thaliana. Dev. Biol. 254: 215-225. Park, W.; Li, J.; Song, R.; Messing, J. y Chen, X. (2002). CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol. 12: 1484-1495. Pearson, W. R. (1994). Using the FASTA program to search protein and DNA sequence databases. Methods Mol. Biol. 24:307-331. Pelaz, S.; Ditta, G. S., Baumann, E.; Wisman, E. y Yanofsky, M.F. (2000). B and C floral organ identity functions require SEPALLATA MADS-box genes. Nature 405: 200-203. Pelaz, S.; Gustafson-Brown, C.; Kohalmi, S. E.; Crosby, W. L. y Yanofsky, M. F. (2001a). APETALA1 and SEPALLATA3 interact to promote flower development. Plant J. 26: 385-394. Pelaz, S.; Tapia-Lopez, R.; Álvarez-Buylla, E. R. y Yanofsky, M. F. (2001b). Conversion of leaves into petals in Arabidopsis. Curr. Biol. 11: 182-184. Pérez Pérez, J. M. (2003). Caracterización genética y molecular de los mutantes ultracurvata de Arabidopsis thaliana. Tesis Doctoral. Universidad Miguel Hernández. Perrone-Bizzozero, N. y Bolognani, F. (2002). Role of HuD and Other RNA-Binding proteins in neural developmentand plasticity. J. Neur. Res. 68: 121–126. Pilotte, J.; Larocque, D. y Richards, S. (2001). Nuclear translocation controlled by alternatively spliced isoforms inactivates the QUAKING apoptotic inducer. Genes. Dev. 15: 845-858. Pnueli, L.; Hareven, D.; Rounsley, S. D.; Yanofsky, M. F. y Lifschitz E. (1994). Isolation of the tomato AGAMOUS gene TAG1 and analysis of its homeotic role in transgenic plants. Plant Cell 6: 163-173. Poethig, R. S. (1997). Leaf morphogenesis in flowering plants. Plant Cell 9: 1077-1087. Poethig, R. S. (2003) Phase change and the regulation of developmental timing in plants. Science 301: 334-336. Poethig, R. S.; Coe, E. H. y Johri, M. M. (1986). Cell lineage patterns in maize embryogenesis: A clonal analysis. Dev. Biol. 117: 392-404. Ponce Molet M. R. (1996). Aislamiento y caracterizacion molecular de genes de la superfamilia del TGF-β que se expresan en el embrion de Strongylocentrotus purpuratus. Tesis Doctoral. Universidad de Alicante. Pouteau, S.; Nicholls, D.; Tooke, F.; Coen, E. S y Battey, N. (1997). The induction and maintenance of flowering in Impatiens. Development 124: 3343-3351. Bibliografía 189 Presting, G. G. (2003). Mapping multiple co-sequenced T-DNA integration sites within the Arabidopsis genome. Bioinformatics 19:579-586. Pruitt, R. E y Meyerowitz, E. M. (1986). Characterization of the genome of Arabidopsis thaliana. J. Mol. Biol. 187: 169-183. Prusinkiewicz, P. (2004). Modelling plant growth and development. Curr. Op. Plant Biol. 7: 79-83. Quesada Pérez, V. (1999). Aislamiento y caracterización de mutantes halotolerantes en Arabidopsis thaliana. Tesis Doctoral. Universidad Miguel Hernández. Quesada, V.; Macknight, R.; Dean, C. y Simpson, G. G. (2003). Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22: 3142-3152. Quesada, V.; Ponce, M. R.; Micol, J. L. (2000). Genetic analysis of salt-tolerant mutants in Arabidopsis thaliana. Genetics 154: 421-436. Rajani, S. y Sundaresan, V. (2001). The Arabidopsis myc/bHLH gene ALCATRAZ enables cell separation in fruit dehiscence. Current Biol. 11: 1914-1922. Ralston, E.; English, J. y Dooner, H. K. (1989). Chromosome-breaking structure in maize involving a fractured Ac element. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9451-9455. Rédei, G. P. (1970). Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. A reviewof the genetics and the Biology. Bibliogr. Genet. 20: 1-151. Rédei, G. P. (1975). Arabidopsis as a genetic tool. Annu. Rev. Genet. 9: 111-127. Rédei, G. P. y Koncz, C. (1992). Classical mutagenesis. En Methods in Arabidopsis research. pp: 16-82. Koncz, C.; Chua, N. H. y Schell, J. (eds.). World Scientific. Reinhardt, D.; Pesce, E. R.; Stieger, P.; Mandel, T.; Baltensperger, K.; Bennett, M.; Traas, J.; Friml, J. y Kuhlemeier, C. (2003). Regulation of phyllotaxis by polar auxin transport. Nature 426: 255-260. Reinholz, E. (1947a). Auslösungvon Röntgenmutationen bei Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. und ihre Bedeutung die Pflanzenzüchtung un Evolutionstheorie. Field Inf. Agency Tech. Rep. 1006: 1-70. Reinholz, E. (1947b). Röntgenmutationen bei Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Naturwissenschaften 34: 26-28. Riechmann, J L.; Wang, M. y Meyerowitz, E. M. (1996). DNA-binding properties of Arabidopsis MADS domain homeotic proteins APETALA1, APETALA3, PISTILLATA and AGAMOUS. Nucleic Acids. Res. 24 :3134-3141. Riechmann, J. L. y Meyerowitz, E. M. (1998). The AP2/EREBP family of plant transcription factors. Biol. Chem. 379: 633-646. Robles Ramos, P. (1999). Análisis genético de mutantes de Arabidopsis thaliana con alteraciones en la morfología de la hoja. Tesis Doctoral. Universidad Miguel Hernández. Rodríguez-Tome, P. (2001). EBI databases and services. Mol. Biotech. 18: 199-212. Roe, J. L.; Nemhauser, J. L. y Zambryski, P. C. (1997). TOUSLED participates in apical tissue formation during gynoecium development in Arabidopsis. Plant Cell 9: 335-353. Roe, J. L.; Rivin, C. J.; Sessions, R. A.; Feldmann, K. A. y Zambryski, P. C. (1993). The Tousled gene in A. thaliana encodes a protein kinase homolog that is required for leaf and flower development. Cell 75: 939-950. Roeder, A. H.; Ferrándiz, C. y Yanofsky, M. F. (2003). The role of the REPLUMLESS homeodomain protein in patterning the Arabidopsis fruit. Curr. Biol. 13: 1630-1635. Bibliografía 190 Rojo, E.; Sharma, V. K.; Kovaleva, V.; Raikhel, N. V. y Fletcher, J. C. (2002). CLV3 is localized to the extracellular space, where it activates the Arabidopsis CLAVATA stem cell signaling pathway. Plant Cell 14: 969-977. Rosso, M. G.; Li, Y.; Strizhov, N.; Reiss, B.; Dekker, K. y Weisshaar, B. (2003). An Arabidopsis thaliana T-DNA mutagenized population (GABI-Kat) for flanking sequence tag-based reverse genetics. Plant Mol. Biol. 53: 247-259 Rox, W. (1887). Beiträge zur Entwicklungs-mechanik des Embryo. Arc. Mikrosk. Anat. 29: 157-212. Sakamoto, T.; Kamiya, N.; Ueguchi-Tanaka, M.; Iwahori, S. y Matsuoka, M. (2001). KNOX homeodomain protein directly suppresses the expression of a gibberellin biosynthetic gene in the tobacco shoot apical meristem. Genes Dev. 15: 581–590. Sambrook, J. y Russell D. W. (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. 3ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. San Miguel, P.; Tikhonov, A.; Jin, Y. K.; Motchoulskaia, N.; Zakharov, D.; MelakeBerhan, A.; Springer, P. S.; Edwards, K. J.; Lee, M.; Avramova, Z. y Bennetzen J. L. (1996) Nested retrotransposons in the intergenic regions of the maize genome. Science 274: 765-768. Sanda, S. L. y Amasino, R. M. (1996). Interaction of FLC and late-flowering mutations in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 251: 69-74. Savidge, B.; Rounsley, S. D. y Yanofsky, M. F. (1995). Temporal relationship between the transcription of two Arabidopsis MADS box genes and the floral organ identity genes. Plant Cell 7: 721-733. Schomburg, F. M.; Patton, D. A.; Meinke, D. W. y Amasino, R. M. (2001). FPA, a gene involved in floral induction in Arabidopsis, encodes a protein containing RNArecognition motifs. Plant Cell 13: 1427-1436. Schoof, H.; Lenhard, M.; Haecker, A.; Mayer, K. F.; Jürgens, G. y Laux, T. (2000). The stem cell population of Arabidopsis shoot meristems in maintained by a regulatory loop between the CLAVATA and WUSCHEL genes. Cell 100: 635-644. Schultz, C.; Gilson, P.; Oxley, D.; Youl, J. y Bacic, A. (1998). GPI-anchors on arabinogalactan-proteins: implications for signalling in plants. Trends Plant Sci. 3: 426-431. Schwarz-Sommer, Z.; Davies, B. y Hudson, A. (2003). An everlasting pioneer: the story of Antirrhinum research. Nat. Rev. Genet. 8: 657-666. Sessions, A.; Burke, E.; Presting, G.; Aux, G.; McElver, J.; Patton, D.; Dietrich, B.; Ho, P.; Bacwaden, J.; Ko, C.; Clarke, J. D.; Cotton, D.; Bullis, D.; Snell, J.; Miguel, T.; Hutchison, D.; Kimmerly, B.; Mitzel, T.; Katagiri, F.; Glazebrook, J.; Law, M y Goff, S. A. (2002). A high-throughput Arabidopsis reverse genetics system. Plant Cell. 14: 2985-2994. Sessions, A.; Nemhauser, J. L.; McCall, A.; Roe, J. L.; Feldmann, K. A. y Zambryski, P. C. (1997). ETTIN patterns the Arabidopsis floral meristem and reproductive organs. Development 124: 4481-4491. Sessions, A.; Yanofsky, M. F. y Weigel, D. (2000). Cell-cell signaling and movement by the floral transcription factors LEAFY and APETALA1. Science 289: 779-782. Sessions, R. A. (1997). Arabidopsis (Brassicaceae) flower development and gynoecium patterning in wild type and ettin mutants. Amer. J. Bot. 84: 1179-1191. Sessions, R.A. y Zambryski, P. C. (1995). Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development 121: 1519-1532. Bibliografía 191 Shalom, S. y Don, J. (1999) Tlk, a novel evolutionarily conserved murine serine threonine kinase, encodes multiple testis transcripts. Mol. Reprod. Dev. 52: 392-405. Sharman, B. B. (1942). Developmental anatomy of Zea mays L. Ann. Bot. 6: 245-284. Sheldon, C. C.; Rouse, D. T.; Finnegan, E. J.; Peacock, W. J. y Dennis, E. S. (2000). The molecular basis of vernalization: the central role of FLOWERING LOCUS C (FLC). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3753-3758. Shirley, B. W.; Hanley, S. y Goodman, H. M. (1992). Effects of ionizing radiation on a plant genome: analysis of two Arabidopsis transparent testa mutations. Plant Cell 4: 333-347. Shizuya H, Birren B, Kim UJ, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M. (1992) Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8794-8797. Shpak, E. D.; Berthiaume, C. T.; Hill, E. J. y Torii, K. U. (2004). Synergistic interaction of three ERECTA-family receptor-like kinases controls Arabidopsis organ growth and flower development by promoting cell proliferation. Development 131: 1491-1501. Shuai, B.; Reynaga-Pena, C. G. y Springer, P. S. (2002). The lateral organ boundaries gene defines a novel, plant-specific gene family. Plant Physiol 129: 747-761. Sieburth, L. E.; Running, M. P. y Meyerowitz, E. M. (1995). Genetic separation of third and fourth whorl functions of AGAMOUS. Plant Cell 7: 1249-1258. Simpson G. G.; Dijkwel, P. P.; Quesada, V.; Henderson, I. y Dean, C. (2003). FY is an RNA 3' end-processing factor that interacts with FCA to control the Arabidopsis floral transition. Cell 113: 777-787. Simpson, G. G. y Dean, C. (2002) Arabidopsis, the Rosetta stone of flowering time? Science 296: 285-289. Singer, T. y Burke, E. (2003). High-throughput TAIL-PCR as a tool to identify DNA flanking insertions. Methods Mol. Biol. 236: 241-272. Siomi, H.; Choi, M; Siomi, M. C.; Nussbaum, R. L. y Dreyfuss, G. (1994). Essential role for KH domains in RNA binding: impaired RNA binding by a mutation in the KH domain of FMR1 that causes fragile X síndrome. Cell 77: 33-39. Smith H. M. S. y Hake, S. (2003). The interaction of two homeobox genes, BREVIPEDICELLUS and PENNYWISE, regulates internode patterning in the Arabidopsis inflorescence. Plant Cell, Vol. 15: 1717-1727. Smyth, D. R.; Bowman, J. L. y Meyerowitz, E. M. (1990). Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell 2: 755-767. Somerville, C. y Koornneef, M. (2002). A fortunate choice: the history of Arabidopsis as a model plant. Nat. Rev. Genet. 3: 883-889. St Johnston, D. (2002). The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 3: 176-188. Steeves, T. A. y Sussex, I. M. (1989). Patterns in Plant Development. Cambridge Univ. Press UK. Stone, J. M.; Collinge, M. A.; Smith, R. D.; Horn, M. A. y Walker, J. C. (1994). Interaction of a protein phosphatase with an Arabidopsis serine-threonine receptor kinase. Science 266: 793-795. Stone, J. M.; Trotochaud, A. E.; Walker, J. C. y Clark, S. E. (1998). Control of meristem development by CLAVATA1 receptor kinase and kinase-associated protein phosphatase interactions. Plant Physiol. 117: 1217-1225. Bibliografía 192 Strasburger, E.; Noll, F.; Schenck, H. y Schimper, A. F. W. (1994). Tratado de Botánica. 8ª ed. Editorial Omega. Strizhov, N.; Li, Y.; Rosso, M. G.; Viehoever, P.; Dekker, K. A. y Weisshaar, B. (2003). High-throughput generation of sequence indexes from T-DNA mutagenized Arabidopsis thaliana lines. BioTechniques 35: 1164-1168. Sundaresan, V.; Springer, P.; Volpe, T.; Haward, S.; Jones, J. D.; Dean, C.; Ma, H. y Martienssen, R. (1995). Patterns of gene action in plant development revealed by enhancer trap and gene trap transposable elements. Genes Dev. 9: 1797-1810. Taguchi-Shiobara, F.; Yuan, Z.; Hake, S. y Jackson D. (2001). The fasciated ear2 gene encodes a leucine-rich repeat receptor-like protein that regulates shoot meristem proliferation in maize. Genes Dev. 15: 2755-2766. Takano, M.; Egawa, H.; Ikeda, J. E. y Wakasa, K. (1997). The structures of integration sites in transgenic rice. Plant J. 11: 353-361. Tarun, S. Z. y Sachs, A. B. (1996). Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation initiation factor eIF-4G. EMBO J. 15: 7168-7177. Tatusova, T. A. y Madden, T. L. (1999). BLAST 2 Sequences, a new tool for comparing protein and nucleotide sequences. FEMS Microbiol. Lett. 174: 1577-1588. Tax, F. E. y Vernon, D. M. (2001). T-DNA-associated duplication/translocations in Arabidopsis. Implications for mutant analysis and functional genomics. Plant Physiol. 126: 1527-1538. Telfer, A. y Poethig, R. S. (1998). HASTY: a gene that regulates the timing of shoot maturation in Arabidopsis thaliana. Development 125: 1889-1898. The Arabidopsis Genome Initiative. (2001). Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: 796-815. The Caenorhabditis elegans Sequencing Consortium. (1998). Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science 282: 2012-2018. Theissen, G. (2001). Development of floral organ identity: Stories from the MADS house. Curr. Opin. Plant Biol. 4: 75-85. Theissen, G. y Saedler, H. (2001). Floral quartets. Nature 409: 469-471. Thompson, J. D.; Gibson, T. J.; Plewniak, F.; Jeanmougin, F. y Higgins, D. G. (1997). The CLUSTAL-X windows interface: flexible strategies fro multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 25: 4876-4882. Thompson, J. D.; Higgins, D. G. y Gibson, T. J. (1994). CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 46734680. Till, B. J.; Reynolds, S. H.; Greene, E. A.; Codomo, C. A.; Enns, L. C.; Johnson, J. E.; Burtner, C.; Odden, A. R.; Young, K.; Taylor, N. E.; Henikoff, J. G.; Comai, L. y Henikoff, S. (2003). Large-scale discovery of induced point mutations with highthroughput TILLING. Genome Res. 13: 524-530. Tilly, J.; Allen, D. W. y Jack, T. (1998). The CArG boxes in the promoter of the Arabidopsis floral organ identity gene APETALA3 mediate diverse regulatory effects. Development 125: 1647-1657. Topping, J. F. y Lindsey K. (1997). Promoter trap markers differentiate structural and positional components of polar development in Arabidopsis. Plant Cell 9: 1713-1725. Bibliografía 193 Torii, K.U.; Mitsukawa, N.; Oosumi, T.; Matsuura, Y.; Yokoyama, R.; Whittier, R.F. y Komeda, Y. (1996). The Arabidopsis ERECTA gene encodes a putative receptor protein kinase with extracellular leucine-rich repeats. Plant Cell 8: 735-746. Triglia, T.; Peterson, M. G. y Kemp, D. J. (1988). A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res. 25: 8186-8192. Trotochaud, A. E, Hao, T.; Wu, G.; Yang, Z. y Clark, S. E. (1999) The CLAVATA1 receptor-like kinase requires CLAVATA3 for its assembly into a signaling complex that includes KAPP and a Rho-related protein. Plant Cel 11: 393-406. Valentine, L. (2003). Agrobacterium tumefaciens and the plant: the David and Goliath of modern genetics. Plant Physiol. 133: 948-955. Van Engelen, F. A.; Molthoff, J. W.; Conner, A. J.; Nap, J. P.; Pereira, A. y Stiekema, W. J. (1995). pBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4: 288-290. Veit, B. (2004). Determination of cell fate in apical meristems. Curr. Opin. Plant Biol. 7: 57-64. Verakasa, A.; Del Campo, M. y McGinnis, W. (2000). Developmental patterning genes and their conserved functions: from model organisms to humans. Mol. Genet. Metab. 69: 85-100. Vignali, R.; De Lucchini, S.; Kablar, B. y Barsacchi, G. (1994). Genetic control of development in Xenopus laevis. Genetica 94: 235-248. Vollbrecht, E.; Veit, B.; Sinha, N. y Hake, S. (1991). The developmental gene Knotted-1 is a member of a maize homeobox gene family. Nature 350: 241-243. Von Goethe, J. W. (1790). Versuch die Metamorphose der Pflanzen zu Erklären. Gotha: C. W. Ettinger. Wagner, D.; Sablowski R. W. y Meyerowitz, E. M. (1999). Transcriptional activation of APETALA1 by LEAFY. Science 285: 582-584. Washburn, C. F. y Thomas J. F. (2000). Reversion of flowering in Glycine max (Fabaceae). Am. J. Bot. 87: 1425-1438. Weigel, D. (1995). The genetics of flower development: from floral induction to ovule morphogenesis. Annu. Rev. Genet. 29: 19-39. Weigel, D. y Glazebrook, J. (2002). Arabidopsis: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Weigel, D. y Meyerowitz, E. M. (1994). The ABCs of floral homeotic genes. Cell 78: 203209. Weigel, D.; Ahn, J. H.; Blázquez, M. A.; Borevitz, J. O.; Christensen, S. K.; Fankhauser, C.; Ferrándiz, C.; Kardailsky, I.; Malancharuvil, E. J.; Neff, M. M.; Nguyen, J. T.; Sato, S.; Wang, Z. Y.; Xia, Y.; Dixon, R. A.; Harrison, M. J.; Lamb, C. J.; Yanofsky, M. F. y Chory, J. (2000). Activation tagging in Arabidopsis. Plant Physiol. 122:10031013. Weigel, D.; Álvarez, J.; Smyth, D. R.; Yanofsky, M. F. y Meyerowitz, E. M. (1992). LEAFY controls floral meristem identity in Arabidopsis. Cell 69: 843-859. West, A. G.; Causier, B. E.; Davies, B. y Sharrocks, A. D. (1998). DNA binding and dimerisation determinants of Antirrhinum majus MADS-box transcription factors. Nucleic Acids Res. 26: 5277-5287. Bibliografía 194 West, A. G.; Shore, P. y Sharrocks, A. D. (1997). DNA binding by MADS-box transcription factors: a molecular mechanism for differential DNA bending. Mol. Cell Biol. 17: 2876-2887. Western, T. L.; Cheng, Y.; Liu, J. y Chen, X. (2002). HUA ENHANCER2, a putative DExH-box RNA helicase, maintains homeotic B and C gene expression in Arabidopsis. Development 129: 1569-1581. Westhoff, P.; Jeske, H.; Jürgens, G.; Kloppstech, K. y Link, G. (1998). Molecular Plant Development, from gene to plant. Giorg Thieme Verlag Press. Weterings, K.; Apuya, N. R.; Bi, Y.; Fischer, R. L.; Harada, J. J. y Goldberg, R. B. (2001). Regional localization of suspensor mRNAs during early embryo development. Plant Cell 13: 2409-2425. Wilhelmi, L. K. y Preuss, D. (1996). Self-sterility in Arabidopsis due to defective pollen tube guidance. Science 274: 1535-1537. Williams, R. W.; Wilson, J. M. y Meyerowitz, E. M. (1997). A possible role for kinaseassociated protein phosphatase in the Arabidopsis CLAVATA1 signaling pathway. Proc Natl. Acad. Sci. USA 94:10467-1072. Wolpert, L.; Beddington, R.; Brockes, J.; Jessell, T.; Lawrence, P. y Meyerowitz, E. M. (1998). Principles of development. Oxford University Press. Wu, X, Dinneny, J. R.; Crawford, K. M.; Rhee, Y.; Citovsky, V.; Zambryski, P. C. y Weigel D. (2003) Modes of intercellular transcription factor movement in the Arabidopsis apex. Development 130:3735-3745. Xu, Y.; Sun, Y.; Liang, W. y Huang, H. (2002). The Arabidopsis AS2 gene encoding a predicted leucine-zipper protein is required for the leaf polarity formation. Acta Bot. Sin. 44: 1194-1202. Yamakawa, A.; Kameoka, Y.; Hashimoto, K.; Yoshitake, Y.; Nishikawa, K.; Tanihara, K. y Date, T. (1997) cDNA cloning and chromosomal mapping of genes encoding novel protein kinases termed PKU-a and PKU-b ,which have nuclear localization signal. Gene 202: 193-201. Yang, Y.; Fanning, L. y Jack, T. (2003). The K domain mediates heterodimerization of the Arabidopsis floral organ identity proteins, APETALA3 and PISTILLATA. Plant J. 33: 47-59. Yanofsky, M. F.; Ma, H.; Bowman J. L.; Drews, G. N.; Feldmann, K. A. y Meyerowitz, E. M. (1990). The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene AGAMOUS resembles transcription factors. Nature 346: 35-39. Yoo, S. Y.; Kardailsky, I.; Lee, J. S.; Weigel, D. y Ahn, J. H. (2004). Acceleration of flowering by overexpression of MFT (MOTHER OF FT AND TFL1). Mol. Cells 17: 95-101. Yu, D.; Kotilainen, M.; Pollanen, E.; Mehto, M.; Elomaa, P.; Helariutta, Y.; Albert, V. A. y Teeri, T. H. (1999). Organ identity genes and modified patterns of flower development in Gerbera hybrida (Asteraceae). Plant J. 17: 51-62. Yu, J.; Hu, S.; Wang, J.; Wong, G, K.; Li, S.; Liu, B.; et al. (2002). A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Science 296: 79-92. Yu, L. P.; Miller, A. K. y Clark, S. E. (2003). POLTERGEIST encodes a protein phosphatase 2C that regulates CLAVATA pathways controlling stem cell identity at Arabidopsis shoot and flower meristems. Curr. Biol. 13:179-88. Bibliografía 195 Yu, L. P.; Simon, E. J.; Trotochaud, A. E. y Clark, S. E. (2000). POLTERGEIST functions to regulate meristem development downstream of the CLAVATA loci. Development 127: 1661-1670. Zambryski, P. C.; Joos, H.; Genetello, C.; Lesmansm, J.; Van Montagu, M. y Scheel, J. (1983). Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. EMBO J. 2: 2143-2150. Zhang, S. y Liu, Y. (2001) Activation of salicyclic acid-induced protein kinase, a mitogenactivated protein kinase, induces multiple defense responses in tobacco. Plant Cell 13: 1877-1889. Zhu, J. y Chen, X. (2000). MCG10, a novel p53 target gene that encodes a KH domain RNA-binding protein, is capable of inducing apoptosis and cell cycle arrest in G2-M. Mol. Cell. Biol. 20: 5601-5618. Zik, M. y Irish, V. F. (2003). Flower development: initiation, differentiation, and diversification. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19:119-140. Zupan, J.; Muth, T. R.; Draper, O. y Zambryski, P. (2000). The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant J. 23: 1128. VIII.- GLOSARIO Glosario 197 VIII.- GLOSARIO %: por ciento h: Horas ºC: Grados centígrados Hygr: Resistencia a higromicina µF: Microfaradios Ka o KA: Kanamicina µg: Microgramos KanR o KanR: Resistencia a kanamicina µJ: Microjulios kb: Kilobases µl: Microlitros kDa: Kilodaltones µM: Micromolar kg: Kilogramos Ω: Ohmios LTSEM: Low Temperatura Scanning Electron A: Adenina Microscopy aa: Aminoácidos lx: Luxes A. C.: Antes de Cristo m/v: Masa por volumen Amp: Ampicilina m: Metros Ampr: Resistencia a ampicilina M: Molar Arabidopsis: Arabidopsis thaliana Mb: Megbases C: Citosina mb: Milibares cDNA: DNA complementario mg: Miligramos cm: Centímetros min: Minutos cM: Centimorgans ml: Mililitros DEPC: Dietilpirocarbonato mm: Milímetros DNA: Ácido desoxirribonucleico mM: Milimolar DNasa: Desoxirribonucleasa mRNA: RNA mensajero dNTP: Desoxinucleósidos trifosfato ms: Milisegundos dpa: Días postantesis N: Normal Ed. o ed.: Edición ng: Nanogramos Eds. o eds: Editores nm: Nanómetros et al.: Y otros nM: Nanomolar Fig.: Figura OD: Densidad óptica g: Gramos pág.: Página G: Guanina pb: Pares de bases Glosario 198 PCR: Reacción en cadena de la SEM: Scanning Electron Microscopy polimerasa T: Timidina pM: Picomolar TAE: Tris-acético-EDTA pp: Páginas TBE: Tris-borato-EDTA RNA: Ácido ribonucleico TE: Tris-EDTA RNasa: Ribonucleasa Tetr: Resistencia a tetraciclina rNTPs: Ribonucleósidos trifosfato tRNA: RNA de transferencia rpm: Revoluciones por minuto U: Unidades RT-PCR: Retrotranscripción y PCR UV: ultravioleta SQRT-PCR: Retrotranscripción y PCR v/v: Volumen por volumen semicuantitativa V: Voltios s: Segundos W: Vatios SDS: Dodecil sulfato sódico