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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
aAguilar
Martínez, Lizbeth Evelyn; aGranados Patiño, Nephtali Alicxy; aMendoza
Salgado Evelyn Lizbeth; aNavarrete Acevedo, Elisa Merari; aOnofre Martínez, Delmy
del Carmen; bIbarra Vega Rodrigo, aPREFECO Andrés Quintana Roo, Chamilpa, 62210
Cuernavaca, Mor. bInstituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México,
UNAM. Apartado Postal 510-3, Cuernavaca Morelos, 62250, Mexico.
INTRODUCCIÓN
RESULTADOS
El ADN es la molécula que almacena la información de los organismos vivos, se sabe que esta
molécula es un polímero formado por monómeros llamados nucleótidos, los cuales están constituidos por el
azúcar desoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada (Adenina, Timina, Citocina o Guanina). El
ADN del humano tiene un tamaño aproximado de 3200 millones de pares de bases, la molécula contiene la
información de sus características, tiene información que da identidad como seres humanos únicos,
información sobre enfermedades hereditarias, información que nos permite establecer parentesco con
familiares.
En 1985 el Bioquímico estadounidense Kary Mullis desarrolló una técnica científica muy poderosa
conocida con Reacción en Cadena de la Polimeras PCR (Por sus siglas en inglés Polimerase Chain
Reaction), esta técnica permite amplificar pequeñas regiones específicas del ADN en el laboratorio. Es decir,
consigue que un pequeño segmento de ADN que pasaría desapercibido en un análisis cualquiera se
multiplique millones de veces y así sea fácil de detectar.
Los elementos importantes en la reacción son el ADN, la enzima ADN polimerasa, los
oligonucleótidos, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: Adenina, Timina, Citosina y Guanina), el
ión magnesio (Mg2+), una solución amortiguadora o buffer y H2O. Todos estos elementos interactúan en tres
etapas principales de las que se compone la PCR:
Desnaturalización: Se aumenta la temperatura para romper los puentes de hidrógeno que une a las dos
cadenas de ADN (95ºC).
Hibridación: Se disminuye la temperatura a 40-60ºC donde los oligonucleótidos se unirán a sitios que
flaquean el segmento de la secuencia de ADN de interés.
Extensión: Se lleva la reacción a 72ºC donde la Taq ADN polimerasa (De Termophillus aquaticus) se une a
los oligonucleótidos cortos y empieza a unir bases para sintetizar una nueva cadena complementaria.
Los equipos en donde se realiza la reacción de PCR son llamados termocicladores, los cuales están
diseñados para establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo
necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para corroborar si se amplificó
la secuencia blanco de interés, los productos de la PCR o también llamados amplicones son analizados en
El gel de la electroforesis que se corrió se muestra a continuación; en el
carril 1 se cargó el Marcador molecular (Del lado izquierdo está la referencia
de este), en el carril 2 se cargó el ADN plasmídico (Molde para la PCR) y en
los carriles 3-8 los productos de la reacción de PCR.
geles de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa.
Nucleótido
HIPOTESIS:
La reacción en cadena de la polimerasa nos permite realizar muchas copias
de un segmento de DNA específico.
OBJETIVO
Comprender y realizar una reacción en cadena de la polimerasa así como
conocer algunas de las aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa.
METODOLOGIA
Se amplificó un gen del alacrán Tityus serrulatus, el cual estaba contenido
en un vector comercial pET22b System de la empresa NOVAGEN, que se utiliza
en biotecnología para producir la proteína correspondiente a este gen. Se
utilizaron los oligonucleótidos T7 directo y T7 reverso que reconocen los
extremos del gen dentro del vector. Los componentes de la reacción fueron los
siguientes:
•Buffer de reacción 1X
•200 μM dNTP´s,
•200 nM Oligonucleótido T7 Directo TAATACGACTCACTATAG
•200 nM Oligonucleótido T7 Reverso GATCAATAACGAGTCGCC
•1U de enzima Taq ADN polimerasa/100µL
•1 ng DNA/100µL de reacción. (Plásmido ̴ 6165pb)
•Agua tetradestilada c.b.p. 100µL
Las reacciones se realizaron en un Termociclador Applied Biosystems 2720
con las siguientes condiciones:
CARRILES
1 2 3 4
5
6
7
8
6165 pb
882 pb
Los carriles 3-8 presentan una banda que tiene una migración proxima al
fragmento de 1000 pares de bases del marcador, el producto de amplificación
esperado es de un tamaño de 882 pb, por lo que se puede decir que el
amplificado corresponde con el tamaño teórico esperado.
En el carril 2 donde se cargó el AND molde, se observan dos bandas,
esto es debido a los diferentes niveles de superenrrollamiento del plásmido,
este fenómeno ocasiona dos distintos tipos de migración.
CONCLUSIÓN
En el desarrollo del proyecto fue posible realizar una reacción
en cadena de la polimerasa de un gen contenido en un plásmido
bacteriano, se comprendió que al igual que esta amplificación es
posible hacer muchas copias de cualquier segmento del ADN de
diversos organismos.
Se entendió que el ADN es una molécula grande que posee
mucha información. Dentro del estudio del ADN, la reacción en
cadena de la polimerasa permite restringir y simplificar el análisis de
sitios específicos.
Los experimentos realizados nos permitieron relacionar la teoría
con la práctica en el proceso de la reacción en cadena de la
polimerasa. La importancia de cada uno de los componentes y las
etapas de la reacción.
Además el proyecto nos permitió conocer algunas de las
aplicaciones de esta reacción, como lo es la identificación de
personas por semejanza con familiares, la detección de enfermedades
genéticas, la obtención de genes para su estudio entre muchas otras.
REFERENCIAS
Espinosa-Asuar L, Guía práctica sobre la técnica de la PCR, Capitulo 17,
517-540 http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/530/cap17.pdf
pET system manual (2003) Novagen, 10 edición 1-68.
Somma M, Querci M, Análisis de la Presencia de Organismos
Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos, Sesión no. 6 Reacción
en cadena de la Polierasa, JRC, European commission 1-34 http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n
6.pdf
AGRADECIMIENTOS:
realizó una
electroforesis en un gel de agarosa al
1%, en el gel se cargaron 7uL (5uL
de cada reacción + 2uL de buffer de
carga), el gel se corrió a 80V por 40
minutos y se reveló con GelRed y se
visualizó con luz ultravioleta.
Por
último
Se
Al Dr. Lourival D. Possani por facilitar el uso de equipos para
realizar los experimentos en su laboratorio. A la Dra. Juana María
Jiménez Vargas por el apoyo técnico en el proyecto.