reacciones de identificación y propiedades de los carbohidratos

Prácticas de Bioquímica I
Práctica: Reacciones de identificación y Propiedades de los Carbohidratos
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN Y
PROPIEDADES DE LOS CARBOHIDRATOS
Objetivos
Al finalizar este trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de:
-
Detectar la presencia de carbohidratos en una muestra problema.
-
Identificar carbohidratos según su poder reductor.
-
Aplicar reacciones específicas que permitan la identificación de carbohidratos
en una muestra problema.
-
Caracterizar carbohidratos según los resultados de la marcha analítica
practicada.
Introducción
Los carbohidratos representan un conjunto numeroso de moléculas
distribuidas ampliamente en la naturaleza. Químicamente se definen como aldehídos
o cetonas polihidroxiladas, diferenciándose entre ellos básicamente en el número de
carbonos y en la ubicación espacial de los grupos hidroxilo de cada monómero, así
como en el número de monosacárido que los conforman. Basándose en las diferencias
estructurales que éstos presentan, es posible la identificación de los mismos
utilizando reacciones químicas que demuestren alguna propiedad química específica
del carbohidrato cuya presencia se quiere determinar.
Las pruebas para la determinación de los carbohidratos pueden ser generales
como la reacción de Molisch, la cual no discrimina el tipo de carbohidrato analizado,
o específicas si el resultado final logra la identificación de un carbohidrato en
particular.
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Independientemente de la prueba a que se haga referencia, existen dos
propiedades que sirven de fundamento a la mayoría de éstas. La primera es la
formación en medio ácido de compuestos conocidos como derivados furfúricos.
Estos se producen al “deshidratar” los azúcares mediante la aplicación de calor y la
exposición a un medio fuertemente ácido. A continuación se muestran tres ejemplos
de la reacción de formación de furfurales.
H
+
O
CHO
Pentosas (C5H10O5)
furfural
O
CHO
H2COH
+
H
Hexosas (C6H12O6)
5-hidroximetilfurfural
O
+
H
H3C
CHO
6-Desoxihexosas (C6H12O5)
5-metilfurfural
Estos derivados furfúricos reaccionan con compuestos fenólicos como el α-naftol, el
orcinol, el resorcinol o la antrona, para formar cromógenos que evidencian la
positividad de las reacciones. El tipo de compuesto fenólico utilizado dependerá del
tipo de carbohidrato a determinar y por lo tanto de la reacción que se esté realizando.
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Existe otra propiedad que permite la diferenciación de algunos carbohidratos: el
poder reductor. Existen carbohidratos que al oxidarse permiten la reducción de otros
compuestos. Durante dicha oxidación se libera la energía necesaria para la reducción
de otra molécula, por lo que se conoce este proceso como oxido-reducción y ocurre
como una reacción acoplada. La mayoría de los reactivos que permiten evidenciar
esta propiedad contienen cobre. Este metal se reduce (gana electrones) y se hace
insoluble originando un precipitado rojo, lo que demuestra que el carbohidrato
analizado es reductor.
A pesar de que estas sean las propiedades más importantes en las que se basan
muchas
pruebas
para
la
determinación
de
carbohidratos,
existen
otras
determinaciones como la capacidad de rotar la luz polarizada, la formación de
osazonas, entre otras, que nos abren nuevas posibilidades y recursos, útiles en la
identificación de estas biomoléculas.
MATERIALES Y EQUIPOS
- Tubos de ensayo.
- Gradillas.
- Pipetas graduadas.
- Baño de María a 100°C.
- Goteros.
- Pinzas para tubos de ensayo.
REACTIVOS
-
α -naftol al 0,5% en etanol.
-
Ácido sulfúrico concentrado.
-
Glucosa, fructosa, almidón, sacarosa, maltosa, muestra problema
-
Reactivo de Benedict: preparar combinando las siguientes soluciones:
Solución A: 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio se
disuelven en 800 mL de agua destilada
Solución B: disolver 17,3 g de CuSO4: 5 H2O en 100 mL de agua destilada.
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Mezclar ambas soluciones y aforar a 1 L con agua.
-
Reactivo de Barfoed: disolver 66,6 g de acetato de cobre en 800 mL de agua
destilada. Agregar 9 mL de CH3COOH glacial y filtrar en caliente. Aforar a
1L
-
Reactivo de Bial: disolver 0,3 g de orcinol en 100 mL de HCl concentrado.
Agregar 0,3 mL de cloruro férrico (FeCl3) al 10%.
-
Reactivo de Seliwanoff: disolver 0,05 g de resorcinol en 33 mL de HCl
concentrado. Aforar a 100 mL con agua destilada.
-
Solución diluida de yodo-yoduro de potasio en agua.
Experimento Nº 1: Reacción de Molisch
Detecta la presencia de carbohidratos en general, se basa en la formación de derivados
furfúricos en medio ácido a temperatura ambiente o en caliente, los cuales reaccionan
con un compuesto aromático (α-naftol) para dar como productos compuestos
coloreados. La reacción de Molisch ocurre al condensarse dos moléculas de α-naftol
con la función aldehído del 5-hidroximetilfurfural
producido al calentarse el
carbohidrato en medio fuertemente ácido, como se muestra a continuación.
O
OH
alfa-naftol
OH
+
H
2
HC
O
R
C
R
+
RCHO
OH
intermediario
4
OH
Cromógeno violeta
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Prueba de Molisch:
1.- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)
2.- Coloque en el tubo de ensayo N°1 2 mL del carbohidrato, y en el tubo N°2 vierta 2
mL del compuesto desconocido.
3.- Agregar a cada tubo 4 gotas de solución alcohólica de α - naftol al 15%.
4.- Agregar con cuidado 1 mL de ácido sulfúrico concentrado por las paredes de
ambos tubos de ensayo.
5.- La formación de un anillo violáceo indica la presencia de carbohidratos.
Experimento Nº 2: Reacción de Bial
Esta reacción detecta la presencia del furfural producido en medio ácido por las
pentosas. El reactivo de Bial contiene orcinol disuelto en HCl concentrado. El ácido
provoca la formación del furfural y el orcinol se condensa con este último para
producir cromógenos de color verde-azul.
CH3
O
CHO
+
+
HO
furfural
FeCl3
H+
Compuestos de
color verde-azul
OH
orcinol
Prueba de Bial:
1.- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)
2.- Agregar 2 mL del carbohidrato al tubo 1 y 2 mL del compuesto desconocido al
tubo 2.
3.- Colocar 2 mL de reactivo de Bial a los dos tubos.
4.- Calentar los tubos en baño de agua hirviente por 5 minutos.
4.- La reacción es positiva cuando aparece una coloración azul-verdosa que indica la
presencia de pentosas.
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Experimento Nº 3: Reacción de Seliwanoff
Con el mismo principio de la reacción anterior, esta se basa en la formación de
derivados furfúricos. En este caso el 5-hidroximetilfurfural, producto de la
deshidratación de las cetohexosas, es detectado por un derivado fenólico conocido
como resorcinol. El resultado es positivo tanto para las cetohexosas en forma
monomérica, como para oligosacáridos que contengan cetohexosas en su estructura.
OH
O
HOH2C
CHO
H+
+
Compuestos de
color rojo
OH
5-hidroximetilfurfural
resorcinol
Prueba de Seliwanoff:
1.- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)
2.- Agregar con la ayuda de una pipeta 4 gotas del carbohidrato al tubo 1 y 4 gotas del
desconocido al tubo 2.
3.- Colocar 5 mL de reactivo de Seliwanoff en ambos tubos de ensayo.
4.- Calentar en agua hirviente.
5.- La reacción es positiva al aparecer un color rojo intenso en forma de precipitado,
indicando la presencia de cetohexosas.
Pruebas para la detección de carbohidratos o azúcares reductores:
Como se mencionó en la introducción de esta práctica, existen varias pruebas que
permiten determinar si los carbohidratos presentan poder reductor y así, junto a los
resultados de todas las pruebas en conjunto, lograr su identificación. El principal
grupo de pruebas de azúcares reductores incluyen: Benedict, Barfoed, Fehling,
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Trommens, entre otras. En el presente trabajo práctico se hará referencia a las dos
primeras.
Experimento Nº 4: Reacción de Benedict
Esta reacción nos indica si un azúcar es o no reductor. Para tal fin el carbohidrato se
hace reaccionar con el ión cúprico (Cu++) en medio alcalino y a una temperatura de
100°C. El carbohidrato, a través de su hemiacetal libre en el carbono 1, se oxida
favoreciendo la reducción del cobre a oxido cuproso (Cu2O) el cual se presenta como
un precipitado rojo.
RCHO
+ 2Cu++ + 4OH-
RCOOH
+
Cu2O
+ 2H2O
precipitado rojo
Prueba de Benedict:
1.- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)
2.- Añadir 8 gotas del carbohidrato al tubo 1 y 8 gotas del compuesto desconocido al
tubo 2.
3.- Colocar 5 mL de reactivo de Benedict en ambos tubos.
4.- Calentar en agua hirviente durante 5 minutos.
La reacción es positiva al aparecer un precipitado rojo ladrillo, indicando ésto la
presencia de sustancias reductoras.
Experimento Nº 5: Reacción de Barfoed
Aunque el fundamento de la reacción de Barfoed es similar al de la reacción de
Benedict, la primera nos permite diferenciar si estamos en presencia de un
monosacárido o un disacárido reductor. Para lograr esta diferenciación el cobre se
encuentra disuelto en un medio ligeramente ácido, retardando la aparición del Cu2O
unos cinco minutos en el caso de los monosacáridos. La tardanza será mayor para los
disacáridos, que puede llegar a ser de 15 minutos o más.
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RCHO
+
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2Cu++ +
RCOOH
2H2O
+
Cu2O
+
4H+
precipitado rojo
Prueba de Barfoed:
1.- Rotule tres tubos de ensayo (1, 2 y 3)
2.- Colocar 2 mL de una solución de monosacárido reductor en el tubo 1, 2 mL de una
solución de disacárido reductor en el tubo 2 y 2 mL del desconocido en el tubo 3.
3.- Agregar 2 mL de Reactivo de Barfoed a todos los tubos.
4.- Calentar en baño de agua hirviente. Tome nota del tiempo y observe los tubos
cada 5 minutos.
5.- La reacción es positiva, al observarse un precipitado rojizo en el fondo del tubo.
Los monosacáridos dan la reacción con mayor rapidez que los disacáridos.
Experimento Nº 6: Reacción de Lugol
Se emplea para comprobar la presencia de polisacáridos y nos permite tener una idea
de cual de ellos se trata. Se basa en poner en contacto el carbohidrato con yodo; si se
obtiene un color azul intenso, se trata de almidón, dicha coloración desaparece
calentando a ebullición y reaparece al enfriar debido a que la estructura helicoide del
polisacárido se desordena por efecto del calor y se reordena al enfriarse. De esto se
deduce que la relación entre el yodo y el almidón es de adhesión y no hay formación
de enlaces químicos permanentes. Si la coloración obtenida es rojiza el polisacárido
presente es el glucógeno.
Prueba de Lugol:
1.- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)
2.- Colocar 5 mL del carbohidrato en el tubo 1 y 5 mL del desconocido en el tubo 2.
3.- Añadir 2 gotas de una solución diluida de yodo-yoduro de potasio a ambos tubos.
Mezclar.
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4.- Observe la coloración. Si ésta es azul, caliente el tubo en agua hirviente por 2 min.
y observe. Deje enfriar y observe nuevamente.
AUTOEVALUACIÓN
1. ¿Qué utilidad tiene la reacción de Molisch en la identificación inicial de una
muestra desconocida?
2. Existen reacciones que permiten identificar polisacáridos. Mencione una de ellas e
indique su fundamento bioquímico.
3. Realice un esquema donde indique la conducta a seguir en la identificación de un
carbohidrato desconocido.
4. Al calentar el tubo donde se realizó la prueba del yodo y se obtuvo un resultado
positivo desaparece el color azul que se forma durante la misma. ¿Por qué ocurre
dicho fenómeno?
5. La formación de furfurales es determinante en algunas reacciones de identificación
de carbohidratos, ¿qué condiciones son necesarias para que se formen dichos
compuestos? ¿Pueden formarse furfurales a partir de otro tipo de biomoléculas
distintas a los carbohidratos? Razone su respuesta.
BIBLIOGRAFÍA
Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Edit Alhambra. España, 1983.
J.M. Clark. Bioquímica experimental. 1966.
Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory
techniques. Saunders editores. 1976.
Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987.
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