Ensayo de inhibición de la germinación y del alargamiento radicular

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Ensayo de inhibición de la
germinación y del alargamiento
radicular en semillas de cebolla
Allium cepa y Soya Glycine max
Raúl Uribe Hernández
C lasificación
del ensayo :
E
Principio de la prueba
En los bioensayos de toxicidad aguda con semillas se evalúan los efectos
adversos de un compuesto puro o de una mezcla compleja en el proceso de
germinación y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de
crecimiento. Como respuesta se determina la inhibición en la germinación y
de la elongación de la radícula y del hipocótilo. Es importante destacar que
durante la germinación y los primeros días de desarrollo de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia
tóxica puede interferir, alterando la supervivencia y desarrollo normal de las
plántulas.
Una de las etapas más importantes del desarrollo de una planta es la germinación de las semillas y la emergencia del primer cotiledón. En la germinación
ocurren cuatro procesos: la imbibición o toma física de agua, la formación
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Con experiencia
Ensayos de inhibición de la germinación
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de los sistemas enzimáticos e inicio de la síntesis de proteínas y de RNA, la
emergencia de la radícula y la iniciación del crecimiento.
La activación de la semilla es inhibida ante la presencia de compuestos
tóxicos, afectando la germinación de la misma. La división celular de los
meristemos radiculares puede afectarse, retardando el proceso de mitosis o
alterando el proceso de alargamiento radicular, por lo que la fitotoxicidad
de un compuesto puede ser determinada a través de la medición de éste
parámetro.
Material
Papel filtro Whatman de fibra de vidrio, frascos de vidrio de 250 mL, cajas
Petri de 210 mm, papel aluminio, parafilm, micropipetas (10-1,000 µL), pipetas
serológicas de 1, 5 y 10 mL, regla o Bernier y probetas de 50 y 100 mL.
Equipo
Cámara ambiental o incubadora, balanza analítica y campana de extracción.
Reactivos
Diclorometano grado HPLC (frasco con 4 L), 2-cloroacetamida, hipoclorito
de sodio 5% y agua destilada.
Organismos de prueba
Semillas certificadas de cebolla Allium cepa (monocotiledonea) y de soya
Glycine max (dicotiledonea), con viabilidad probada mayor del 95% y libres
de plaguicidas.
Procedimiento de la prueba
Pruebas exploratorias o de tamiz
Estas pruebas se realizan con el extracto del suelo contaminado o con una
solución del compuesto tóxico, desde una concentración al 100%. Para ello, se
seleccionan y escarifican las semillas con hipoclorito de sodio al 5% durante 15
minutos y luego se enjuagan con agua de la llave y con agua destilada durante
Ensayos de inhibición de la germinación
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10 minutos. Se colocan discos de papel filtro Whatman de fibra de vidrio dentro
de la caja Petri de 110 mm. Estos discos deben ser proporcionales al diámetro
de la caja (aproximadamente 9 cm). Sobre el papel filtro se adicionan 2 mL de
cada una de las disoluciones preparadas del extracto original del compuesto
tóxico, en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica), distribuyéndolo de forma homogénea. Como control del disolvente se utiliza una
caja a la que se le agregan 2 mL de diclorometano o del disolvente utilizado
para la extracción. Además, se utiliza un control positivo de 2-cloroacetamida
a una concentración 35 mg/L y un control negativo de agua destilada. Se deja
evaporar el disolvente durante 10 minutos dentro de la campana de extracción
y luego se colocan 10 semillas por cada caja, distribuyéndolas aleatoriamente
y de tal forma que se permita un adecuado crecimiento. Se preparan 3 réplicas por tratamiento. Las semillas se incuban dentro de una cámara ambiental
con temperatura controlada (22 ± 2 ºC) y en total oscuridad, hasta que el 65%
de las semillas del testigo negativo haya germinado. Después de ese período,
se registra el número de semillas germinadas, siguiendo como criterio de
germinación una longitud de radícula mayor de 5 mm (figura 18.1). Adicionalmente, se registra el crecimiento o alargamiento de la radícula, como un
posible efecto tóxico adicional, por medio de la medición de la longitud al
término de la prueba (figura 18.2).
Pruebas definitivas
Las pruebas definitivas se llevan a cabo utilizando un intervalo de concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionando aquellos tratamientos en los que se observe efecto adverso, para insertar entre alguno de
ellos este nuevo intervalo de concentraciones (por ejemplo 100, 50, 25, 12.5,
6.25 y 3.125%). Al final se elabora la curva dosis-respuesta de las diferentes
concentraciones en un intervalo reducido y se calculan los valores de CI50
(concentración inhibitoria media), por medio del método Probit.
Expresión de resultados
La prueba de inhibición de la germinación en plantas superiores determina el
potencial de toxicidad agudo en el cultivo, expresado como la concentración
inhibitoria del cincuenta por ciento de los individuos utilizados en la prueba
(CI50) y su precisión o intervalo de confianza. Se utiliza el método Probit, también
conocido como método de unidades probabilísticas, para evaluar la relación
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Figura 18.1. Germinación y brote radicular de Glycine max
Tabla 18.1. Condiciones recomendadas para las pruebas de inhibición de la germinación con
semillas de Allium cepa y Glycine max
Tipo de ensayo
Temperatura
Calidad de luz
Tamaño del recipiente
Volumen de la solución de prueba
Edad del cultivo usado como inóculo
Número de individuos
Número de réplicas
Incubación Medio de cultivo Factor de dilución
Duración de la prueba
Efecto medido
Resultado final
Criterios para la aceptación de la prueba
Control positivo
USEPA, 1996; OECD; 1984; ISO, 1993.
Estático
22 ± 2 °C
Oscuridad
Cajas petri de 110 mm
2.0 mL
Semillas certificadas
10 semillas por frasco
3
Con 60 % de humedad relativa
Agua destilada
Según la dilución
Hasta la germinación de 65% del control
Inhibición de la germinación (< 5 mm de
radícula)
CI50
Germinación en el testigo > 90 %
2- Cloroacetamida a 35 mg/L
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Figura 18.2. Medición del crecimiento del sistema radicular de Glycine max
de dosis-respuesta de un contaminante sobre un organismo. Se asigna el valor
Probit de tablas a los porcentajes de mortalidad obtenido para cada concentración (Loomis, 1978), para posteriormente efectuar el análisis de regresión lineal
mediante el método de mínimos cuadrados, y utilizando los valores obtenidos
de la ecuación de la recta se calcula la CI50, considerando el valor de la “y” a la
mitad del número de individuos utilizados en cada lote o tratamiento. Finalmente, se calcula el intervalo de confianza del 95% por medio de la desviación
estándar y el valor de tablas del estadístico “t” de student.
Bibliografía
International Organization for Standarization (ISO). 1993. Soil Quality- Determination
of the effects of Pollutants on Soil Flora. Part 1. Method for the Measurement of
Inhibition of Root Growth. 9 pp.
Loomis, TA, 1978. Fundamentos de Toxicología. 1era edición. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 274 pp.
Organization of Economical Co-operation and Development (OECD). 1984. Terrestrial Plants, Growth test. Guideline for Testing of Chemicals 208l. 15 pp.
United States Environmental Protection Agency (USEPA). 1996. USEPA 712-C-96154. OPPTS 850.4200. 17 pp.